Đang tải... (xem toàn văn)
Chi phí trực tiếp cho y tế của người bệnh Viêm não vi rút tại các cơ sở y tế ở 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018 135 4.3.1 Chi phí trực tiếp cho y tế của người bệnh
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -* - VŨ VI QUỐC án Y tế cộ ng đồ ng THỰC TRẠNG, CĂN NGUYÊN VIÊM NÃO VI RÚT VÀ CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ TRỰC TIẾP CHO NGƯỜI BỆNH TẠI TỈNH TÂY BẮC VIỆT NAM, 2017 - 2018 Lu ận LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG HÀ NỘI – 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -* - VŨ VI QUỐC cộ ng đồ ng THỰC TRẠNG, CĂN NGUYÊN VIÊM NÃO VI RÚT VÀ CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ TRỰC TIẾP CHO NGƯỜI BỆNH TẠI TỈNH TÂY BẮC VIỆT NAM, 2017 - 2018 Lu ận án Y tế Chuyên ngành: Y TẾ CÔNG CỘNG Mã số: 62 72 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN NHƯ DƯƠNG TS HOÀNG MINH ĐỨC HÀ NỘI – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi với hợp tác đồng nghiệp đồng ý Chủ nhiệm đề tài cấp Bộ cho công bố luận án Kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2021 ng Tác giả luận án Lu ận án Y tế cộ ng đồ Vũ Vi Quốc ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn: PGS.TS Trần Như Dương, Phó Viện trưởng, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương TS Hồng Minh Đức, Phó Cục trưởng Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, xây dựng đề cương, thu thập, phân tích số liệu, viết báo cáo hồn thiện luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Khoa Dịch tễ, Khoa Côn trùng Động vật y học, Khoa Vi rút, Trung tâm Đào tạo Quản lý khoa học - Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt trình học tập triển khai nghiên cứu thực địa, phịng thí nghiệm hồn thiện luận ng án đồ Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Sở Y tế, lãnh đạo cán Trung ng tâm kiểm soát bệnh tật, bệnh viện thuộc tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai hỗ trợ, giúp đỡ tơi q trình tổ chức triển khai, thu thập cộ số liệu, tạo điều kiện tốt suốt trình nghiên cứu, h ồn thiện tế luận án Y Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Cục Khoa học công nghệ Đào án tạo, Bộ Y tế hỗ trợ tài cho nghiên cứu Tơi xin tri ân tình cảm vơ bờ bà, bố mẹ, vợ Lu ận bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ động viên ngày tháng học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Vũ Vi Quốc iii MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG vi viii DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN ix Một số điểm đại cương Viêm não vi rút 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 Khái niệm hội chứng Viêm não cấp Viêm não vi rút Một số loại Viêm não vi rút thường gặp Nguồn truyền nhiễm với tác nhân truyền qua véc tơ Phương thức lây truyền 3 4 1.1.5 Tính cảm nhiễm 1.1.6 Đặc điểm lâm sàng Viêm não vi rút ng 1.1 cộ ng đồ 1.2 Thực trạng Viêm não vi rút giới Việt Nam 1.2.1 Thực trạng hội chứng viêm não cấp Viêm não vi rút giới 1.2.2 Thực trạng hội chứng viêm não cấp Viêm não vi rút Việt Nam 4 6 16 Tác nhân gây Viêm não vi rút Vi rút arbo gây Viêm não vi rút Vi rút đường ruột gây Viêm não vi rút Vi rút Herpes gây Viêm não vi rút Véc tơ muỗi truyền bệnh Viêm não vi rút Viêm não Nhật Bản 22 23 25 28 33 1.4.1 1.4.2 1.5 1.5.1 Muỗi véc tơ truyền Viêm não vi rút Muỗi véc tơ truyền bệnh Viêm não Nhật Bản Gánh nặng kinh tế chi phí điều trị bệnh Viêm não vi rút Gánh nặng bệnh Viêm não vi rút 33 34 36 36 Lu ận án Y tế 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.4 1.5.2 Chi phí điều trị bệnh tật 1.6 Giới thiệu địa điểm nghiên cứu 1.6.1 Tỉnh Sơn La 1.6.2 Tỉnh Điện Biên 1.6.3 Tỉnh Lào Cai CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng Viêm não vi rút tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 38 41 41 42 43 44 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 44 44 44 iv 45 2.1.4 Cỡ mẫu 45 2.1.5 Phương pháp công cụ thu thập thông tin 2.1.6 Các biến số số nghiên cứu 45 46 2.2 Mục tiêu 2: Xác định số tác nhân vi rút gây viêm não có mặt muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 47 2.2.1 Xác định số tác nhân vi rút gây viêm não 47 2.2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.1.3 Thiết kế nghiên cứu 2.2.1.4 Cỡ mẫu 47 47 47 47 2.2.1.5 Phương pháp công cụ thu thập thông tin 2.2.1.6 Tóm tắt quy trình xét nghiệm 47 48 2.2.1.7 Các biến số số nghiên cứu 2.2.2 Xác định có mặt muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản khu vực nghiên cứu 63 2.2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 2.2.2.4 Cỡ mẫu 2.2.1.5 Phương pháp công cụ thu thập thông tin 63 63 64 64 64 2.2.2.6 Các biến số số nghiên cứu 2.3 Mục tiêu 3: Xác định chi phí điều trị trực tiếp cho người bệnh Viêm não vi rút sở y tế tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 65 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2.3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.3.3 Thiết kế nghiên cứu 2.3.4 Cỡ mẫu 2.3.5 Phương pháp công cụ thu thập thông tin 2.3.6 Nội dung phương pháp phân tích chi phí 2.3.7 Các biến số số nghiên cứu 2.4 Xử lý số liệu 66 66 67 67 67 67 68 68 2.5 2.6 69 69 Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng 2.1.3 Thiết kế nghiên cứu Sai số cách hạn chế sai số Đạo đức nghiên cứu 63 66 v CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70 3.1 Thực trạng Viêm não vi rút tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 3.1.1 Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo địa dư 70 70 3.1.2 Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo thời gian 3.1.3 Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo giới tính 3.1.4 Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo nhóm tuổi 73 76 77 3.1.5 Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo nghề nghiệp 78 3.1.6 Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo trình độ học vấn 3.1.7 Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo dân tộc 3.1.8 Một số đặc điểm dịch tễ ca bệnh tử vong Viêm não vi rút 3.2 Một số tác nhân vi rút gây viêm não có mặt muỗi truyền 79 81 82 ng bệnh Viêm não Nhật Bản tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 ng đồ 3.2.1 Một số tác nhân vi rút gây viêm não tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 3.2.2 Sự có mặt muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản khu vực 84 93 án Y tế cộ nghiên cứu 3.3 Chi phí điều trị trực tiếp liên quan đến y tế người bệnh Viêm não vi rút điều trị sở y tế tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 3.3.1 Chi phí trực tiếp cho điều trị Viêm não vi rút 84 Lu ận 3.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chi phí điều trị trực tiếp cho y tế người bệnh Viêm não vi rút CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Thực trạng Viêm não vi rút tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 4.1.1 Tỷ lệ mắc VNVR Tây Bắc, Việt Nam, 2017 - 2018 4.1.2 Diễn biến bệnh Viêm não vi rút tỉnh Tây Bắc, Việt Nam, 2017 – 2018 theo thời gian 4.1.3 Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo số yếu tố dịch tễ (tuổi, giới tính, nghề nghiệp, dân tộc, trình độ học vấn) 4.2 Một số tác nhân vi rút gây viêm não muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 102 105 107 109 109 110 112 124 117 4.2.1 Một số tác nhân vi rút gây viêm não tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 117 vi 4.2.2 Sự có mặt muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản khu vực nghiên cứu 127 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển muỗi véc tơ 4.3 Chi phí trực tiếp cho y tế người bệnh Viêm não vi rút 133 sở y tế tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 4.3.1 Chi phí trực tiếp cho y tế người bệnh Viêm não vi rút 4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chi phí điều trị trực tiếp cho y tế 135 135 người bệnh Viêm não vi rút 137 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Đà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 138 140 Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN Axist ribonucleic CI Khoảng tin cậy Cx Culex CSMĐ Chỉ số mật độ DCCN Dụng cụ chứa nước EBV Vi rút Epstein Barr (vi rút Herpes 4) Epstein Barr Virus ELISA Kỹ thuật miễn dịch gắn men Enzyme-linked Confidence Interval Immunosorbent Assay hCMV Vi rút Cytomegalo HCVNC Hội chứng Viêm não cấp HSV Vi rút Herpes Simplex NPEV Các vi rút đường ruột polio Non-Polio Enterovirus PCR Phản ng đồ khuyếch Herpes Simplex Virus đại ng ứng Human Cytomegalovirus Phịng thí nghiệm PV Phỏng vấn SL Số lượng RdRP ARN polymease phụ thuộc ARN Y án Lu ận TCM Reaction tế PTN TB Chain cộ polymerase chuỗi Polymerase RNR dependent RNR polymerase Trung bình Tay chân miệng TTYTDP Trung tâm Y tế dự phòng VNNB Viêm não Nhật Bản VNVR Viêm não vi rút VRĐR Vi rút đường ruột VSDTTƯ Vệ sinh dịch tễ Trung ương Japanese Encephalitis viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 đồ ng Bảng 3.5 Bảng 3.6 Trang Phân bố ca bệnh hội chứng não cấp VNNB không 16 VNNB Dibrugarh, Ấn Độ, 2015 – 2016 Các tác nhân phổ biến gây viêm não vi rút 23 Các loại mẫu bệnh phẩm, thời gian số lượng, loại xét 73 nghiệm phát tác nhân gây bệnh Tỷ lệ chết/mắc VNVR tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 91 Phân bố ca tử vong VNVR theo tác nhân gây bệnh 92 tỉnh Tây Bắc, 2017 – 2018 Tỷ lệ chết/mắc VNVR theo giới tính tỉnh Tây Bắc, 92 2017 – 2018 Phân bố mẫu bệnh phẩm thu thập theo loại bệnh 93 phẩm Kết xét nghiệm tác nhân vi rút người bệnh VNVR 94 Kết xét nghiệm tác nhân vi rút người bệnh nghiên cứu 95 tỉnh Sơn La, Điện Biên Lào Cai Phân bố loại tác nhân phát mẫu dương 96 tính Phân bố loại tác nhân vi rút phát mẫu 97 dương tính tỉnh Sơn La, Điện Biên Lào Cai, 2017-2018 Phân bố tác nhân mẫu dịch não tuỷ có xét nghiệm dương 98 tính Phân bố tác nhân mẫu huyết có xét nghiệm dương 98 tính Phân bố tác nhân mẫu phân có xét nghiệm dương tính 99 Các lồi muỗi thu thập điểm nghiên cứu 103 Chỉ số mật độ loài muỗi Culex thu thập thực địa, 2018 108 Phân bố bọ gậy muỗi Culex theo thủy vực thu thập 109 ng Bảng 3.7 Lu ận Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Y Bảng 3.10 án Bảng 3.9 tế cộ Bảng 3.8 thực địa, 2018 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 Bảng 3.22 Bảng 3.23 Bảng 3.24 Bảng 3.25 Một số yếu tố liên quan đến số lượng muỗi Culex thu thập thực địa, 2018 Yếu tố liên quan đến số lượng bọ gậy thu thập ruộng lúa nước, 2018 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu Thông tin tình trạng bệnh đối tượng nghiên cứu Số ngày điều trị trung bình theo nơi điều trị Chi phí điều trị theo tuyến điều trị Chi phí trực tiếp cho điều trị VNVR theo hạng mục y tế Chi phí điều trị cho người bệnh VNVR bệnh viện tỉnh Chi phí trực tiếp điều trị theo số yếu tố nhân học Chi phí trực tiếp cho điều trị theo thời gian điều trị Chi phí trực tiếp cho điều trị theo tác nhân 110 111 112 113 113 114 114 115 116 116 117 lxxxii - Bảo quản nơi lấy mẫu: bảo quản bệnh phẩm nơi lấy mẫu từ 2°C - 8°C, vòng ngày mẫu chuyển tới PTN, trình vận chuyển đến PTN giữ 2°C - 8°C - Tiêu chí loại bỏ: khơng đạt yêu cầu thu thập, bảo quản vận chuyển bệnh phẩm + Xem mục Sổ tay thu thập bệnh phẩm (NV05-VR-QT5.4.01) 9.4 Kiểm soát mẫu chứng - Chứng âm: + Chứng âm phản ứng (NTC): phải cho kết âm tính phương pháp realtime RT-PCR DEN 1-4 Y án D3 tế D1 D2 Ct < 35 Ct < 35 Ct < 35 Ct < 35 Lu ận D4 9.5 Realtime RT-PCR cộ Định típ Dengue ng - Chứng dương: đồ ng + Chứng âm tách chiết (NEC): mẫu tách chiết mẫu nước cất đánh mã loạt cho việc thực tách chiết tách chiết mẫu bệnh phẩm: phải cho kết âm tính phương pháp realtime RT-PCR Chương trình ngoại kiểm − Tham gia chương trình ngoại kiểm hàng năm tuân thủ tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới (WHO) − Tham gia đánh giá liên phịng thí nghiệm với trường Đại học Nagasaki- Nhật Bản lxxxiii Nội dung 10 10.1 Lưu đồ Bước Trách nhiệm Trình tự thực Khách hàng Mẫu huyết nghi sốt xuất huyết Khách hàng Không đạt Nhân viên PXN ng Tiếp nhận mẫu Nhân viên PXN Các bước thực Realtime RT-PCR cộ Lặp lại Lu ận án Y tế Nhân viên PXN Nghi ngờ Nhân viên PXN, Trưởng phòng xét nghiệm, Lãnh đạo Viện 10.2 Các bước thực 10.2.1.Quy trình trước xét nghiệm 10.2.1.1 NV05-VRQT5.1.01 đồ NV05-VRSTLM ng Tài liệu Sổ tay thu thập bệnh phẩm NV05VR01QT5.5.03 Kết xét nghiệm Realtime RT- Dương tính Trả kết NV05VR01QT5.5.03 Âm tính NV05QT5.8.01 lxxxiv - Sổ tay thu thập bệnh phẩm mã số NV05-VR-QT5.4.01 + Danh mục xét nghiệm: mục 8.3 + Đóng gói bệnh phẩm: mục 8.4 + Tiêu chuẩn chấp nhận/từ chối bệnh phẩm: mục 8.7 + Yêu cầu xét nghiệm bổ xung: mục 8.8 + Xử lý dụng cụ chất thải: mục - Phiếu yêu cầu xét nghiệm: mã số NV05-VR-5.4.01-BM.01 NV05-VR-5.4.01BM02 10.2.1.2 Tiếp nhận từ chối mẫu ban đầu ng - Hướng dẫn điền phiếu yêu cầu xét nghiệm: mã số NV05-VR-5.4.01-BM.01-HD đồ - PTN vi rút arbo tuân thủ quy định tiêu chuẩn chấp nhận từ chối mẫu ban đầu sổ tay thu thập bệnh phẩm (NV05-VR-QT5.4.01) cộ ng - Nhân viên PTN vi rút arbo kiểm tra tình trạng mẫu, văn bản, thơng tin liên quan (ví dụ: phiếu yêu cầu xét nghiệm) định chấp nhận/từ chối mẫu án Y tế - Nếu tiếp nhận mẫu, nhân viên PTN vi rút arbo phải điền thông tin mẫu vào sổ nhận mẫu mã số NV05-VR-QT5.4.02-BM.01 Nếu từ chối nhận mẫu bệnh phẩm, nhân viên PTN vi rút arbo phải thông báo rõ lý cho đơn vị gửi mẫu tuân thủ quy định tiêu huỷ mẫu Lu ận - PTN vi rút arbo không tiếp nhận mẫu ban đầu thiếu thông tin nhận dạng ngoại trừ số trường hợp mẫu quan trọng, khơng thể thay Trong trường hợp này, PTN tạm thời tiếp nhận tiến hành xét nghiệm mẫu Tuy nhiên, công bố kết xét nghiệm nhận đủ thông tin nhận dạng mẫu 10.2.2.Quy trình xét nghiệm 10.2.2.1 Pha chế hóa chất/sinh phẩm - Mã hóa loạt pha chế Loại pha Ký hiệu Cặp mồi pri Đoạn dò (Probe) Pro Sinh phẩm cho phản ứng Real-time RT-PCR rtm lxxxv - Nhân viên phải ghi lại thông tin thực pha chế vào biểu mẫu “Biểu mẫu pha mồi Dengue” mã số NV05-VR01-QT5.5.03-BM.01 - Nồng độ mồi tính theo đơn vị nmole (ghi tube mồi đông khô) - Trả lại nước khử ion theo khuyến cáo nhà sản xuất để nồng độ mồi/mẫu dị đạt 100 µM - Nồng độ mồi sử dụng 100 µM Nồng độ mẫu dị sử dụng 10 µM pha lỗng 10 lần từ nồng độ 100 µM - Chia ống tích 50 µl/1 loại mồi (100 µM) 100 100 µl/1 loại mẫu dị (10 µM) bảo quản -30oC ng - Đặt tên cho loạt pha: Loại pha – tên mồi – số cuối năm- số thứ tự pha chế (theo dạng chữ số) – thứ tự số tuýp (theo dạng chữ số) đồ VÍ Dụ: pri.D1F-19.001.01 Pha sinh phẩm cho phản ứng Realtime-RT-PCR ng 10.2.2.2 Sinh phẩm án 2x Reaction mix Nồng độ Y Nước cất tinh tế cộ - Nhân viên phải ghi lại thông tin thực pha chế vào biểu mẫu “Pha hỗn dịch phản ứng realtime RT-PCR Dengue” mã số NV05-VR01-QT5.5.01-BM.02 Lu ận Superscript III RT/Platium Taq Mix D1 D1 F D1C Probe D1 D2 F D2 Probe cặp mồi D2 C Probe D2 D3 F D3 D3 C Probe D3 D4 F D4 D4C Probe D4 100uM 10uM 100uM 10uM 100uM 10uM 100uM 10uM Thể tích (ul)/1 pư 3.7 Số lượng phản ứng (N) 12.5 12.5xN 0.5 0.5xN 0.25 0.25xN 0.25 0.25xN 0.45 0.45xN 0.125 0.125xN 0.125 0.125xN 0.45 0.45xN 0.25 0.25xN 0.25 0.25xN 0.45 0.45xN 0.125 0.125xN 0.125 0.125xN 0.45 0.25xN lxxxvi ARN mẫu Tổng số 25 - Đặt tên cho loạt pha: Loại pha, loại pha– năm.tháng.ngày pha chế (theo dạng số cuối năm, số tháng số ngày) – thứ tự lần pha ngày (theo bảng chữ A, B, C ) VÍ Dụ: rtm.Den-19.10.01A 10.2.2.3 Cài đặt thiết bị - Cài đặt chương trình cho máy Realtime PCR 95 2:00 95 0:10 60 0:30 ng 30:00 x1 Tên chương trình đồ 50 Chu kỳ lặp ng Thời gian cộ Nhiệt độ (oC) x 45 Den 1-4.CDC Thu tín hiệu huỳnh quang tế Dengue 1-4 - Hướng dẫn cài đặt thiết bị xem NV05-VR-QT5.3.08 án Tra mẫu chạy máy Lu ận 10.2.2.4 Y 10 - Chuẩn bị biểu mẫu “Pha hỗn dịch phản ứng realtime RT-PCR Dengue” mã số NV05VR01-QT5.5.01-BM.02 - Cho 5µl mẫu RNA bệnh phẩm vào tube chứa hỗn hợp phản ứng realtime RT-PCR, ly tâm nhanh giữ giá tích lạnh - Khi tra mẫu phải nhập mã số mẫu vào sơ đồ vị trí khung 96 giếng (xem Phụ lục) Chú ý: Nếu chưa chạy nên giữ tube điều kiện 4oC - Đặt tuýp vào máy, khởi động chương trình theo yêu cầu xét nghiệm Tạo tên tệp lưu giữ liệu (NV05-VR-QT5.3.08) - Ghi chép mã thiết bị sử dụng, ngày sử dụng vào (NV05-VR-QT5.3.03-BM02) 11 Kết biện luận - Kết đọc khi: + Chứng âm: khơng có tín hiệu huỳnh quang lxxxvii + Chứng âm tách chiết: khơng có tín hiệu huỳnh quang - Mẫu dương tính: tín hiệu huỳnh quang thu nhận trước chu kỳ thứ 38 phản ứng - Mẫu âm tính: tín hiệu huỳnh quang thu nhận sau chu kỳ thứ 38 - Nếu trường hợp phương pháp Realtime RT - PCR cho kết khơng rõ mẫu bệnh phẩm lặp lại từ bước tách chiết mẫu; PTN yêu cầu lấy lại bệnh phẩm xét nghiệm theo thường quy phòng từ bước nhận bệnh phẩm - Hồn thành kết chẩn đốn sốt Dengue theo Biểu mẫu kết xét nghiệm cho phương pháp Realtime RT-PCR Dengue (NV05-VR01-QT5.5.03-BM03) - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi người bệnh (NV05-VR-QT5.4.02-BM01) ng - Nhập kết vào máy tính chương trình Excel theo định dạng mẫu gửi file kết đồ cho trưởng PTN, sau trưởng PTN đối chiếu kết quả, kết cập nhật ng vào file tổng hợp cộ - Cán phân công nhập kết xét nghiệm vào phiếu trả lời kết NV05- 12.1 Xử lý mẫu Y Xử lý mẫu, dụng cụ, chất thải án 12 tế QT5.8.01-BM01 theo quy trình trả kết xét nghiệm NV05-QT5.8.01 Lu ận 12.1.1.Lưu giữ, bảo quản - Mẫu bệnh phẩm sau xét nghiệm lưu giữ PTN vi rút arbo Xem quy trình lưu giữ mẫu sau xét nghiệm (NV05-QT5.7.01) Thời gian lưu Mẫu Điều kiện Bệnh phẩm -80°C 10 năm RNA vi rút -20°C -80°C 02 năm (sau trả kết quả) - Tùy theo tình hình thực tế PTN mà lưu giữ hủy mẫu sớm hay muộn thời gian quy định 12.1.2.Hủy mẫu - Mẫu bệnh phẩm hết thời gian bảo quản không dùng xét nghiệm lxxxviii hủy theo tiêu chuẩn an toàn sinh học luật sở (trong nước/nội bộ) theo hệ thống quản lý chất lượng Xem quy trình tiêu hủy bệnh phẩm (NV05-QT5.7.01) 12.2 Xử lý dụng cụ/chất thải sau xét nghiệm Xem hướng dẫn phân loại xử lý chất thải mục 8.3 (STAT) Phụ lục biểu mẫu 13 Stt Tên phụ lục, biểu mẫu Mã số Biểu mẫu pha mồi realtime RT-PCR NV05-VR01-QT5.5.3-BM01 Dengue Biểu mẫu pha sinh phẩm Realtime RT-PCR NV05-VR01-QT5.5.3-BM02 Dengue Biểu mẫu kết xét nghiệm realtime RTNV05-VR01-QT5.5.3-BM03 PCR Dengue Biểu mẫu tách chiết ARN từ mẫu bệnh NV05-VR-QT5.5.02-BM01 phẩm đồ ng cộ Y Tên hồ sơ án Stt tế Hồ sơ 14 15 ng Đơn vị lưu trữ Hồ sơ phiếu yêu cầu xét nghiệm PTN Arbo Hồ sơ xét nghiệm PTN Arbo Hồ sơ phiếu trả kết xét PTN Arbo nghiệm Hồ sơ theo dõi trả kết xét PTN Arbo nghiệm Sổ theo dõi người bệnh Lu ận PTN Arbo Hình thức Thời gian lưu lưu Văn năm Điện tử 10 năm Văn Điện tử Văn Điện tử Văn bản/điện tử Văn Điện tử năm 10 năm năm 10 năm Tài liệu tham khảo - QIAGEN One Step RT-PCR Kit Handbook, 2002 - SuperScript III Platinum One-Step QUantitative RT-PCR system năm năm 10 năm lxxxix - Molecular Virology and reference Laboratory Realtime RT-PCR for detection and serotype identification of dengue virus, 2011 - Application of Reverse Transcriptase – Polymerase chain reaction (RT-PCR) to detection of arboviruses, diagnosis of arbovirus infection and research - Rapid Dection and typing of Dengue Viruses from clinical samples by using Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction - Typing of Dengue viruses in clinical Speciments and Mosquitoes by Single –Tube Multiplex Reverse Transcriptase PCR - Thông tư số 53/2017/TT-BYT quy định thời hạn bảo quản hồ sơ, tài liệu chuyên Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng môn nghiệp vụ ngành y tế ban hành ngày 29/12/2017 xc QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN HSV • Chất lượng sinh phẩm: Sinh phẩm sử dụng nghiên cứu sinh phẩm chuẩn thức, thương mại hóa, có thường quy chuẩn thức cụ thể nhà sản xuất Sinh phẩm đặt mua từ nhà cung cấp có uy tín Thế giới, với sinh phẩm tách chiết ADN Qiagen (Đức), với sinh phẩm cho phản ứng khuếch đại gien Applied Biosystems, với vật liệu tiêu hao đầu côn lọc tube nhựa AB gene, Corning, Eppendorf, tất đạt tiêu chuẩn Quốc tế ng • Trang thiết bị máy móc : Chúng tơi sử dụng trang thiết bị máy móc đồ nhà cung cấp máy móc có uy tín máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hettich, máy khuếch đại gien AB Applied Biosystems 7500 ng • Chứng dương sản xuất theo trình tự chuẩn : từ PCR cổ điển, tạo dịng để cộ có plasmid tái tổ hợp, biến nạp vào hệ thống E.coli, tách chiết plasmid tế tính tốn cụ thể dựa vào cấu trúc ADN để có xác số lượng Y ADN HSV đơn vị thể tích khn mẫu phản ứng án Thường quy thực thử nghiệm phịng thí nghiệm hay chuẩn Lu ận thức hóa thương mại hóa: Khu vực ổn định gien UL30 khu vực đích cần khuếch đại, mục tiêu đề tài phát tỷ lệ có mặt ADN HSV-1 -2 dịch não tủy người bệnh viêm não viêm màng não, vừa góp phần giúp bác sỹ lâm sàng điều trị cho người bệnh, vừa giúp nhà hoạch định sách xây dựng phác đồ giám sát điều trị viêm não, viêm màng não HSV, đoạn gien đích cần khuếch đại vừa có tính ổn định, vừa chung cho HSV-1 HSV-2 nên giúp làm giảm kinh phí thời gian chẩn đoán HSV, giúp phản ứng kịp thời cho điều trị Trên thực tế, phác đồ điều trị típ HSV hồn tồn giống nên việc phân biệt típ HSV khơng có nhiều ý nghĩa điều trị nghiên cứu Cặp mồi đặc hiệu đầu dị khơng phải phịng thí nghiệm tìm áp dụng lần đầu mà ứng dụng kết nghiên cứu số tác giả có kinh nghiệm xci tiếng lĩnh vực Kessler cộng sự, kết nghiên cứu đăng tải tạp chí đầu sách có uy tín “J Clin Microbiol 38, 2638-42 (2000)” “real-time PCR” (2000) Một điều để chứng minh tính tin cậy cặp mồi đầu dò đặc hiệu có nhiều tác giả, sở nghiên cứu, bệnh viện lâm sàng danh tiếng (của Hoa kỳ Cộng hòa Pháp, Hà Lan…) áp dụng chúng cho nghiên cứu cơng tác chẩn đốn phịng thí nghiệm Độ đặc hiệu phản ứng đánh giá nghiên cứu trước đây, độ nhạy phản ứng đánh giá qua gam chuẩn ngồi Cặp mồi đầu dị khuếch đại đoạn gien đích thuộc khu vực ổn định ADN polymerase, gien có mặt ng vi rút hoạt động nên có tính khẳng định vai trị gây bệnh HSV đồ Chi tiết: ng Quy trình: Tách chiết ADN vi rút theo thường quy sinh phẩm phương pháp ly tâm cộ Bước Bật máy ly tâm Hettich trước tách chiết 15 phút; tế Bước Lấy từ tủ -30oC ống Eppendorf có sẵn 20 μl dung dịch PK, chuẩn Y bị ống cho mẫu bệnh phẩm, làm tan nhanh dung dịch PK Đánh dấu ống theo ký án hiệu mẫu; Lu ận Bước Thêm 200 μl bệnh phẩm cần tách chiết (dịch bọng nước, dịch mắt, dịch não tủy…); Bước Thêm 200 μl dung dịch đệm AL Trộn máy lắc 15 giây; * Chú ý: Nếu bệnh phẩm 200 μl thêm đệm PBS vừa đủ 200 μl, bệnh phẩm nhiều 200 μl tăng lượng PK đệm AL theo tỷ lệ tương ứng Không thêm trực tiếp PK vào đệm AL Bước Ủ ống 10 phút 56oC; Bước Ly tâm nhẹ; Bước Thêm 200 μl ethanol 96-100%, lắc 15 giây ly tâm nhẹ Tổngthể tích ống Eppendorf 20 + 200 + 200 + 200 = 620μl; * Chú ý: Nếu bệnh phẩm nhiều 140 μl tăng lượng ethanol theotỷ lệ tương xcii ứng Bước Bóc cột lọc ghi ký hiệu mẫu (nắp thành ống); Bước Cẩn thận chuyển toàn 620 μl sang cộtlọc ghi số mẫu (nắp thành ống) ly tâm cột 8000 vòng/phút x phút, bỏ dịch ống hứng, giữ lại cột lọc; Bước Đặt cột lọc vào ống hứng thêm 500 µl dung dịch rửaAW1, ly tâm cột 8000 vòng/phút x phút, bỏ dịch ống hứng, giữ lại cột lọc; * Chú ý: Dù bệnh phẩm nhiều 200 μl không cần thiết phải tăng lượng AW1 ng Bước 10 Đặt cột lọc vào ống hứng thêm 500 μl dung dịch đồ rửaAW2, ly tâm cột 14.000 vòng/phút x phút, bỏ dịch ống hứng, giữ lại cột ng lọc; Bước 11 Đặt cột lọc vào ống hứng ly tâm cột 14.000 vòng/phút cộ x1 phút, bỏ ống hứng, giữ lại cột lọc; tế Bước 13 Đặt cột lọc vào ống Eppendorf 1,5ml sạch, tách ADN từ cột lọc Y thêm 200μl dung dịch đệm AE (nếu bệnh phẩm dịch mắt dịch não tủy thêm 50 án μl dung dịch đệm AE), để nhiệt độ phòng thí nghiệm phút ly tâm 8000 vịng/phút x Lu ận phút Bỏ cột lọc, bảo quản ADN -20oC -80oC Quy trình real-time PCR: Bước 1.Pha hỗn dịch phản ứng (mix) cho mẫu hốt sinh học phân tử : Thành phần Master mix x N=1 (µl) 12,5 Mồi xi Mồi ngược Đầu dị 0,5 H2O Khn mẫu Tổng số 25 N=… xciii Bước Xẻ hỗn dịch phản ứng vào ống phản ứng - Cho vào ống phản ứng 20 μl; - Cho mẫu chứng; - Chuyển ống mẫu sang buồng chạy máy (Real-time) Bước Chạy máy Chọn chương trình HSV; - Cho mẫu vào máy; - Nhấnvào “Start”để chương trình bắt đầu chạy; - Lưu thông tin máy./ Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng - xciv QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM CHẨN ĐỐN VI RÚT ĐƯỜNG RUỘT Mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu phân dịch não tủy Mẫu bệnh phẩm xem hợp lệ PTN VRĐR chấp nhận để làm xét nghiệm chẩn đốn VRĐR có phiếu điều tra điền đầy đủ thông tin kèm Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm Mẫu phân: chuẩn bị hỗn dịch mẫu phân 20% môi trường PBS (+), xử lý cloroform 20 phút, ly tâm thu dịch Mẫu dịch não tủy: sử dụng trực tiếp ng không qua xử lý Mẫu bệnh phẩm xử lý bảo quản -20oC -80oC cho đồ thí nghiệm Các giai đoạn thao tác với mẫu bệnh phẩm phải ng thực tủ ATSH cấp 2, phịng thí nghiệm ATSH cấp cộ Tách chiết vật liệu di truyền RNA vi rút: tế ARN vi rút tách chiết từ dịch bệnh phẩm phẩm xử lý Y từ dịch não tủy, sử dụng sinh phẩm tách chiết thương mại High Pure Viral RNA án Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) Các bước tiến hành thực theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất ARN thu bảo quản -30oC - Lu ận 80oC cho nghiên cứu Xác định VRĐR chung, EV-A71, CV-A6, CV-A10 CV-A16 kỹ thuật RT-PCR đơn đa mồi Phương pháp cho phép xác định VRĐR chung định danh bốn kiểu VRĐR lưu hành trội gây bệnh TCM gồm EV-A71, CV-A6, CV-A10 CV-A16 Phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi thiết kế vùng gen khơng mã hóa 5'UTR, đặc hiệu chung cho VRĐR sử dụng để xác định mẫu dương tính âm tính với VRĐR Mẫu xác định bốn tác nhân EV-A71, CV-A6, CV-A10 CV-A16 phản ứng RT-PCR đa mồi (multi-primer RT-PCR), gồm hai phản ứng riêng lẻ: (1) phản ứng RT-PCR thứ sử dụng mồi phát vật liệu di truyền cho EV-A71 CV-A6; (2) phản ứng thứ hai sử dụng mồi phát CV-A10 xcv CV-A16 Các cặp mồi thiết kế vùng VP1, mang tính đặc hiệu cho kiểu vi rút Trình tự thực phản ứng sau: DNA bổ sung (cDNA) tổng hợp từ RNA, sử dụng mồi ngẫu nhiên nhà sản xuất bổ sung hỗn hợp phản ứng phiên mã ngược có chứa 20 mM dNTP 20 U/ml enzyme phiên mã ngược SuperScriptTM III transcriptase để tạo nên khối lượng cuối 20 µl cDNA tổng hợp theo điều kiện nhiệt độ: 25oC phút; 42oC 60 phút; 70oC 15 phút cDNA tiếp tục sử dụng cho phản ứng PCR để phát VRĐR chung hai phản ứng PCR đa mồi để phát EV-A7, CV-A6, ng CV-A10, CV-A16) Mỗi phản ứng bao gồm 5μl cDNA, 0,6 μM mồi đặc hiệu vi đồ rút cần phát 12,5μl GoTaq® Green Master Mix System (Promega), tổng thể ng tích phản ứng 25 μl Chạy phản ứng máy luân nhiệt theo chu kỳ sau: 95oC/5 cộ phút, 50 chu kỳ PCR 94oC/1 min; 45oC/2 phút; 72oC/3 phút; chu kỳ cuối 72oC/8 phút Các sản phẩm PCR đặc hiệu xác định điện di tế thạch 2% án Y Định danh VRĐR khác phương pháp snRT-PCR/sequencing Lu ận Các mẫu dương tính với VRĐR âm tính với EV-A71, CV-A6, CV-A10 CV-A16 tiếp tục định danh phương pháp snRT-PCR/sequencing vùng gen VP1 Các VRĐR khác bao gồm vi rút Coxsackie nhóm A khác, vi rút Coxsackie B, vi rút ECHO VRĐR phát hiện… Quy trình xét nghiệm sau: cDNA tổng hợp sử dụng mồi ngược đặc hiệu VRĐR, AN32-AN35 cDNA sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi SO222/SO224 chung cho VRĐR thiết kế vùng VP1 tạo sản phẩm PCR khoảng 700 bp Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi thiết kế bên vùng khuyếch đại PCR 1, cặp mồi AN88/AN89, tạo sản phẩm PCR dài khoảng 350 bp Sản phẩm PCR điện di để xác định sau tinh thực phản ứng PCR gắn huỳnh quang sử dụng mồi Sản phẩm gắn huỳnh quang tinh khỏi chất nhuộm thừa giải trình tự chuỗi nucleotide máy ABI 3100-Avant Các trình tự quang xcvi phổ lắp đặt phần mềm Sequencer, kết nối trình tự thực chương trình Lasergene (DNAstar, Inc Madison,WI, USA) Các trình tự gen thu tiến hành định danh trang web phân tích tự động thiết kế cho vi rút Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng đường ruột RIVM (https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/enterovirus/)