VỀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC .... Bên cạnh công tác điều tra, thống kê các loài cây có tác dụng làm thuốc, các nhà khoa học đã đi sâu tìm hiểu, nghiên cứu thành phần h
TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU VỀ HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE)
Họ Cà phê (Rubiaceae) là một họ thực vật lớn và đa dạng, bao gồm cây gỗ, bụi cây, cỏ và dây leo Các đặc điểm nổi bật của chúng là lá đơn, nguyên, mọc đối với lá kèm có thể dính lại với nhau, tạo thành hình dạng giống như phiến lá với 4 hoặc 8 lá vòng Hoa của họ này thường mọc đơn độc hoặc tụ họp thành xim, có cấu trúc đều và lưỡng tính, với mẫu hoa 4-5 Đài hoa ít phát triển và dính với bầu, trong khi tràng hoa cũng 4-5, dính nhau và có hình dạng đặc trưng Nhị hoa xen kẽ với các thùy của tràng và dính vào ống hoặc họng tràng Bộ nhụy gồm hai noãn dính nhau tạo thành bầu dưới với hai hoặc nhiều ô, mỗi ô chứa từ một đến nhiều noãn Quả của họ này có thể là quả nang, quả mọng hoặc quả hạch, với hạt có phôi nhỏ nằm trong nội nhũ.
Phân bố: Trên thế giới có 450 chi với 7000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở Việt Nam có trên 90 chi [2], [6].
GIỚI THIỆU VỀ CHI AN ĐIỀN (HEDYOTIS L.)
1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Chi Hedyotis thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) là một trong những chi lớn với khoảng 500 loài được ghi nhận trên toàn cầu, phân bố chủ yếu ở khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, đặc biệt tại châu Phi và châu Á Các loài Hedyotis thường phát triển trong rừng hoặc ven rừng, nơi có đất ẩm, từ vùng núi cao đến bờ biển cát Chúng có thân thảo hơi vuông, cao từ 30-85 cm, với lá nhỏ, phiến lá hẹp và gân giữa rõ ràng, trong khi gân phụ không nổi bật Hoa của chúng có màu trắng hoặc vàng, thường mọc thành từng cụm ở nách lá hoặc đỉnh nhánh.
Theo Phạm Hoàng Hộ, chi An điền nước ta có khoảng 70 loài, chia làm 7 thứ, phân bố rải rác khắp cả nước [7]:
H ovatifolia (An điền lá xoan), H oligocephala, H pachycarpa, H corymbosa (Cóc mẵn), H diffusa (An điền lan), H herbacea (An điền cỏ), H heynii (An điền lữ đồng), H arguta (An điền tinh), H labialis (An điền môi), H biflora (An điền hai hoa), H precox (An điền sớm), H contracta (An điền ngắn),
H valerianelloides, H crassiflolia (An điền lá dày), H dichotoma (An điền lƣỡng phân), H justiciformis (An điền xuân tiết), H glabra (An điền không lông), H lineata (An điền lằn), H pierrei (An điền pierre), H chereevensis (An điền cheo- reo), H racemose (An điền chúm), H scandens (An điền leo), H elegans (An điền thanh), H scoparia (An điền chổi), H chevalierii (An điền Chevalier), H ternate (An điền chụm ba), H tetrangularis (An điền bốn cạnh), H wallichii (An điền wallichii), H havilandii (An điền Haviland), H effuse (An điền tràn), H ampliflora (An điền hoa rộng), H umbellata (An điền tán), H capitellata (An điền đầu), H macrosepala, H simplicissima (An điền đơn giản), H pterita (An điền cánh), H hedyotidea, H krewanhensis (An điền Krewanh), H lecomtei (An điền Lecomte),
H petelotii (An điền Pếtlot), H rudis (An điền nhám), H brachiate (An điền nhánh), H vestita (An điền áo), H auricularia (An điền tai), H fraternal, H grandis, H hispida (An điền phún), H acutangula (An điền cạnh nhọn), H hirsutula (An điền phún), H leptoneura (An điền gân mảnh), H lindleyana (An điền lindley), H capitellata var mollis (Dạ cẩm), H nigrescens (An điền đen), H philippinensis(An điền Philippin), H tonkinensis (An điền Bắc bộ), H pinifolia (An điền lá thông), H merguensis (Răm núi), H microcephala (An điền đầu nhỏ), H mouretii (An điền mouret), H quocensis (An điền Phú Quốc), H ovata (An điền trứng), H pressa (An điền sát), H symplociformis (An điền dung), H multiglomerulata (An điền nhiều chụm), H equisetiformus, H trinervia (An điền ba gân), H pruinosa, H bracteata, H tenelliflora (An điền hoa nhỏ), H uncinella var mekonggensis (An điền Cửu Long)
Nghiên cứu đầu tiên về chi Hedyotis đƣợc công bố năm 1933 ở Ấn Độ bởi
According to Dey and Lakshminarayan, the chemical composition of the Hedyotis genus includes various groups of compounds such as alkaloids, flavonoids, anthraquinones, saponins, sterols, iridoids, and lignans.
Một số alkaloid đã đƣợc phân lập từ một số loài Hedyotis nhƣ: H auricularia, H chrysotrica, H capitellata và H capitellata var mollis
Bảng 1.1 Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis
Alkaloid Loài Bộ phận Hợp chất TLTK
Bis-indole H auricularia Rễ, thân Auricularine (1) [51] β-carboline
Hình 1.1 Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis
Flavonoid là một nhóm hợp chất khác đƣợc tìm thấy phong phú trong Họ Cà phê cũng nhƣ trong một số loài thuộc chi Hedyotis
Bảng 1.2 Flavonoid từ chi Hedyotis
H diffusa - Kaempferol 3-O(2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D- glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside
Bốn anthraquinone đầu tiên đã đƣợc phân lập từ H diffusa từ năm 1986 [26]
Bảng 1.3 Anthraquinone từ chi Hedyotis
Hình 1.2 Anthraquinone từ chi Hedyotis
1.2.2.4 Lớp chất triterpenoid và sterol
Hơn 20 triterpenoid pentacyclic đã đƣợc phân lập từ chi Hedyotis, hầu hết đƣợc phân lập từ H lawsoniae và H acutangula [27], [38]
Ba saponin triterpenoid mới, nudicaucin A, -B, -C đã đƣợc phân lập từ H nudicaulis cùng với một saponin đã biết, guaiacin D [40]
Bảng 1.4 Một số triterpenoid và sterol từ chi Hedyotis
Loài Tên của triterpenoid TLTK
H lawsoniae - 3β,23-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid
Bên cạnh flavonoid, iridoid cũng đƣợc tìm thấy phổ biến trong một số loài thuộc chi Hedyotis
Tính đến nay, người ta đã phân lập được hơn 30 iridoid từ 5 loài thuộc chi
Hedyotis bao gồm H diffusa, H corymbosa, H tenelliflora, H chrysotricha và H hedyotidea, trong đó có khoảng 25 hợp chất mới tại thời điểm đƣợc phân lập [39],
Bảng 1.5 Những hợp chất iridoid phổ biến từ chi Hedyotis
Cấu trúc Tên của Iridoid
Lignan compounds are exclusively found in the species H lawsoniae, including the newly identified sesquilignans hedyotol A, -B, -C, -D, and their acetyl derivatives Additionally, this species contains (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-syringaresinol, (-)-dehydrodiconiferyl alcohol, as well as the novel dilignan hedyotisol A, -B, -C.
Một số chất chuyển hóa thứ cấp khác cũng đƣợc phân lập từ chi Hedyotis bao gồm coumarins, scopoletin và fraxin từ H dichotoma và arbutin, hydroquinone monoglucoside từ H herbacea [51]
Các nhà khoa học đã nghiên cứu khoảng 15 trong tổng số 500 loài thuộc chi Hedyotis, chiếm khoảng 3% tổng số loài, cho thấy vẫn còn nhiều loài chưa được khám phá Điều này chứng tỏ chi Hedyotis là nguồn tài nguyên tiềm năng trong việc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới, phục vụ cho quá trình phát triển thuốc mới.
1.2.3 Tác dụng dƣợc lý và hoạt tính sinh học
Qua các nghiên cứu đã báo cáo các loài thuộc chi Hedyotis có hoạt tính sinh học phong phú và có ý nghĩa quan trọng
1.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào
Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
Dịch chiết ethanol từ lá - Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu ở người (k562)
Oldenlandoside - Chống ung thƣ bạch cầu [51]
Dịch chiết methanol toàn cây
- Hiệu ứng độc tế bào chống lại MCF-7 (Tế bào ung thƣ biểu mô vú người) với IC 50 là 22,67mg/ml
- Chống ung thƣ bạch cầu [51]
2-hydroxy-3- methylanthraquinone và methoxy-2- hydroxyanthraquinone
- Ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ SPC-1A, Bcap37 và HepG2
- Thúc đẩy quá trình apoptosis ở tế bào THP-1 thông qua hoạt hóa caspase-8 và ở tế bào U937 thông qua hoạt hóa caspase-3, p- p38MAPK và giảm biểu hiện của p-ERK1/2
- Gây ra quá trình apoptosis ở tế bào MCF-7 bằng cách hoạt hóa
- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ máu HL-60 và ung thƣ gan SK-HEP-1 trên in vitro
Dịch chiết methanol phần trên mặt đất
- Ức chế dòng tế bào CEM-SS gây bệnh ung thƣ bạch cầu nguyên bào lympho T với giá trị
1.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan
Bảng 1.7 Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
Dịch chiết methanol phần trên mặt đất
Hoạt tính chống oxy hóa của chất này vượt trội hơn so với Vitamin E, với tỷ lệ ức chế đạt từ 89-98% trong thử nghiệm FTC (ferric thio cyanate) và từ 60-95% trong thử nghiệm TBA (thiobarbituric acid).
H herbacea Dịch chiết methanol phần trên mặt đất
- Loại bỏ gốc tự do tốt với IC 50 có giá trị 32àg/ml
H corymbosa Dịch chiết methanol phần trên mặt đất
The strong antioxidant activity was observed in the DPPH (1,1-diphenylpicrylhydrazyl) and ABTS (2,2-azinobis-3-ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid) models, effectively eliminating free radicals OH• and NO• at respective concentrations of 82, 130, 150, and 170 µg/ml.
- Khả năng bảo vệ gan tương đương với silymarin tại liều 200mg/kg thể trọng chuột
H diffusa Quercetin - Ức chế tốt đối với quá trình peroxide hóa linoleic trên mô hình FTC và có khả năng bắt gốc tự do tương đương vitamine C trên mô hình DPPH
1.2.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật
Bảng 1.8 Hoạt tính kháng vi sinh vật của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
Thân cây, rễ và lá
- Tác dụng yếu đến trung bình trên:
Bacillus subtilis B28, Bacillus subtilis B29, Pseudomonas aeruginosa UI 60690 và Tụ cầu kháng methicillin (MRSA)
H corymbosa Dịch chiết methanol toàn cây
- Hiệu quả trên cả vi khuẩn gram âm và gram dương (Bacillus, Klebisella,
Escherichia coli, Proteus, Staphylococcus aureus và Pseudomonas)
- Kháng nấm Candida albicans và
- Ức chế sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét MRC-pf20 và MRC-pf303 trong thử nghiệm in vitro và in vivo
- Tác dụng kháng khuẩn yếu chống lại
1.2.3.4 Hoạt tính giảm đau, kháng viêm
Bảng 1.9 Hoạt tính giảm đau, kháng viêm của chi Hedyotis
Tên loài Thành phần Cơ chế TLTK
Dịch chiết methanol từ phần trên mặt đất
Nghiên cứu cho thấy rằng ức chế quá trình viêm đạt khoảng 40% so với chất chuẩn ibuprofen, với hiệu quả 45% ở cùng mức liều 100mg/kg thể trọng chuột, được thử nghiệm trên mô hình viêm gây ra bởi carrageenan và histamine.
Dịch chiết methanol toàn cây
- Giảm đau, kháng viêm trên mô hình gây viêm bằng Carrageenantại liều 400mg/kg thể trọng chuột
- Giảm đau tại hai liều uống thử nghiệm là
250 và 500mg/kg thể trọng chuột
Dịch chiết methanol toàn cây
- Hoạt tính kháng viêm (khoảng 40%) thông qua khả năng ức chế NO tại nồng độ
Năm 2013, nghiên cứu trên mô hình chuột gây loét bằng aspirin cho thấy khi chuột uống dịch chiết cồn và nước từ H corymbosa với liều 400mg/kg trước khi dùng aspirin 45 phút, khả năng ức chế vết loét của dịch chiết cồn đạt 65,7% và dịch chiết nước đạt 33%, so với hiệu quả điều trị của lanzoprazole là 88,89%.
1.2.3.6 Hoạt tính bảo vệ thần kinh
Năm 2001, Youngleem Kim và các cộng sự đã phát hiện ra dịch chiết methanol từ cây H diffusa chứa năm glycosides flavonol và bốn glycosid iridoid O-acylated trong một nghiên cứu thử nghiệm sinh học về các hợp chất bảo vệ thần kinh Chín hợp chất này cho thấy khả năng bảo vệ thần kinh trên tế bào vỏ não chuột bị tổn thương do L-glutamate ở liều 0,1-10 àM.
Theo y học cổ truyền nước ngoài:
Theo y học cổ truyền Malaysia, thân và lá cây H capitellata được sử dụng để điều trị bệnh thận và phục hồi sau sinh Ở Ấn Độ, lá cây H diffusa có tác dụng chữa bệnh lậu và sốt, trong khi lá và rễ cây H umbellata được dùng để trị hen, viêm khớp và lao phổi, cũng như để đắp lên vết thương do côn trùng cắn Cây H herbacea, khi phơi khô và tán thành bột mịn kết hợp với mật ong, có thể trị sốt do viêm khớp và giúp long đờm Lá H biflora được sử dụng để hạ sốt, điều trị viêm nhiễm dạ dày và trầm cảm, trong khi H corymbosa được dùng để chữa sốt, sốt cách nhật, viêm dạ dày, trầm cảm và lo âu Tại Trung Quốc, hơn 20 loài thuộc chi này đã được sử dụng làm thuốc, trong đó H diffusa và H corymbosa là phổ biến nhất, được xem là thành phần chính trong nhiều loại thuốc thảo dược có tác dụng chữa ung thư và nhiều bệnh khác H diffusa cũng được phối hợp với nhiều dược liệu khác trong các chế phẩm thảo dược dành cho bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa, đặc biệt hiệu quả với bệnh ung thư trực tràng.
Theo Y học cổ truyền nước ta:
Theo Phạm Hoàng Hộ, nhiều loài thuộc chi Hedyotis đã được sử dụng làm thuốc ở Việt Nam An điền lan (H diffusa) có tác dụng chống ung thư, trị lậu, sốt, và các bệnh liên quan đến gan An điền cỏ (H herbacea) được dùng để trị suyễn, sốt và tê thấp An điền hai hoa (H biflora) giúp hạ nhiệt, bổ thần kinh và trị ngứa ngáy bao tử Cóc mẵn (H corymbosa) có tác dụng hạ nhiệt, kiện vị, bổ thần kinh, và trị các rối loạn thần kinh Dạ cẩm (H capitellata var mollis) được sử dụng để trị lở miệng và đổ mồ hôi nhiều An điền tai (H auricularia) có tác dụng trị kiết lỵ và hoạt nhuận.
CÂY AN ĐIỀN NÓN HEDYOTIS PILULIFERA (Pit.) T.N.Ninh
An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh (tên đồng nghĩa:
Oldenlandia pilulifera Pit.) thuộc chi An điền (Hedyotis L.), họ Cà phê (Rubiaceae), bộ Long đởm (Gentianales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) và ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [7]
1.3.2 Đặc điểm thực vật – Phân bố
Cây thân cỏ leo với cành có đường kính khoảng 4mm, khi còn non có lông mịn Lá cây có phiến thon dài từ 2-4cm và rộng 1-1,5cm, đầu lá nhọn và đáy tù, cũng như có lông mịn Lá có 3-4 cặp gân phụ và cuống ngắn, trong khi lá bẹ có 5.
Lông gai có hoa đầu mọc trên cọng ở chót nhánh, với đài tròn dài và lông mịn Vành hoa có ống dài, được bao phủ bởi lông dày ở cổ Tiểu nhụy có chỉ dài 1,5mm Quả nang có kích thước 2x1,5mm, chứa nhiều hạt màu đen trong mỗi buồng.
Cây An điền nón phân bố chủ yếu ở Việt Nam, đặc biệt tại các tỉnh như Bắc Kạn, Thái Nguyên, Nghệ An, Hà Tĩnh, Lâm Đồng và Quảng Trị Ngoài ra, loài cây này cũng được ghi nhận có mặt tại Lào.
1.3.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Cho đến nay, chưa có công bố nào về đặc điểm vi học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài An điền nón tại Việt Nam và trên thế giới.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây An điền nón, được thu thập tại huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị vào tháng 8 năm 2014 Cây có tên khoa học là Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Tiêu bản mẫu cây (kí hiệu VL-01) hiện đang được lưu giữ tại phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cũng như tại Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế.
Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 - 60 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng
Hình 2.1 Hình ảnh cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh)
VẬT LIỆU
Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc Điển Việt Nam IV [3]
Dung môi đƣợc sử dụng bao gồm: methanol, ethanol, n-buthanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, toluen, formic acid, amoniac, dichloromethan, nước cất, acetic acid,
Thuốc thử đƣợc sử dụng gồm có: dung dịch H 2 SO 4 10% (v/v) pha trong ethanol tuyệt đối, dung dịch NH 3 đậm đặc, thuốc thử Dragendoff
Chất nhồi sắc ký: silicagel pha thường (silica gel 60 cỡ hạt 0.040-0.063 mm và 0,020-0,040 mm, Merck) và pha đảo (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20, Diaion HP-20
Ngoài ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM) pha thường (Kielselgel 60
F 254 , Merck) và pha đảo (Rp 18, F 254 , Merck)
Các dụng cụ thủy tinh quan trọng trong phòng thí nghiệm bao gồm cột sắc ký, cốc có mỏ với nhiều thể tích, đũa thủy tinh, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký và pipette Những dụng cụ này đóng vai trò thiết yếu trong việc thực hiện các thí nghiệm và quy trình phân tích hóa học.
Cân phân tích hiện số Sartorius CPA224S, độ chính xác 0,0001 g
Micropipette 100, 200, 500 àl (Human), micropipette 50 àl (Exel monopette
Máy chiết siêu âm Elmasonic S100H, bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.1 Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần
Gộp dịch chiết thu được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao toàn phần
2.3.1.2 Phương pháp chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng
Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng sử dụng bình gạn thủy tinh để tách cao đặc từ dịch chiết dược liệu Quá trình này bắt đầu bằng việc phân tán cao đặc vào nước, sau đó lắc với các dung môi hữu cơ không tan trong nước, với độ phân cực tăng dần, nhằm phân tách các nhóm chất theo độ phân cực của chúng.
2.3.1.3 Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn được thực hiện trên cột sắc ký thủy tinh với kích thước phù hợp với lượng mẫu cần chiết Pha tĩnh thường sử dụng là silica gel, cụ thể là silica gel 60 với kích thước hạt từ 0.040-0.063 mm và 0,020-0,040 mm (Merck) Dược liệu được tẩm với silica gel vừa đủ, sau đó cô loại dung môi để thu được bột khô tơi Bột khô này được đưa lên cột sắc ký và rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột (SKC) bao gồm các cơ chế chính như cột hấp thu, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel Đặc biệt, SKLM được áp dụng để theo dõi quá trình rửa giải hiệu quả.
2.3.2.1 Sắc ký cột hấp phụ
Nguyên tắc của SKC hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp giữa hai pha không trộn lẫn Pha động là chất lỏng chảy qua, trong khi pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Nhờ vào cấu trúc này, SKC có khả năng triển khai liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau, từ có độ phân cực yếu đến mạnh.
Chất nhồi cột là silica gel pha thường (silicagel 60 cỡ hạt 0.040-0.063 mm và 0,020-0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (Silica gel 30-50 àm, FuJisilisa Chemical Ltd.)
2.3.2.2 Sắc ký lọc qua gel
Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20
Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng Quá trình này diễn ra thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại giữa các phân tử chất tan và dung môi pha động, trong khi dung môi tĩnh được giữ lại trong các lỗ xốp của gel Kích thước lỗ của gel đóng vai trò quyết định trong việc xác định kích thước phân tử được phân tách.
Phương pháp nhồi cột ướt được sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại SKC
2.3.2.3 Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion là phương pháp phân tách dựa trên ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch với các nhóm chức hóa học mang điện tích trên pha tĩnh Pha động là chất lỏng, trong khi pha tĩnh là chất rắn cấu tạo từ các hạt polymer hình cầu mang nhóm chức hóa học dạng ion Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion, mang điện tích dương, bắt giữ các ion âm, và nhựa trao đổi cation, mang điện tích âm, bắt giữ các ion dương Quá trình này diễn ra nhờ lực hút tĩnh điện giữa các điện tích trái dấu, với hợp chất mang nhiều điện tích gắn chặt vào pha tĩnh, trong khi hợp chất ít hoặc không mang điện tích sẽ ra khỏi cột trước.
2.3.2.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường (Kielselgel 60 F 254 , Merck) và pha đảo (Rp 18, F 254 , Merck)
Nguyên tắc của phương pháp SKLM là phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ, trong đó lượng chất phân tích di chuyển trên lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hoặc hữu cơ Sự di chuyển này theo một chiều nhất định và phụ thuộc vào hệ dung môi pha động cũng như khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích, từ đó tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau.
Các chất có thể được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch thuốc thử H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol Dung dịch này được phun đều lên bản mỏng và sau đó sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi xuất hiện màu sắc.
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc
Việc xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết được thực hiện thông qua phân tích dữ liệu phổ NMR và so sánh với các chất tham khảo từ các nghiên cứu đã được công bố.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
Phổ đo được thực hiện bằng phương pháp NMR một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng chất chuẩn nội tetramethyl silan (TMS) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc phân tích cấu trúc phân tử thông qua các tín hiệu hạt nhân.
- Hạt nhân trong từ trường:
+ Phổ NMR là một phần của phổ cao tần Tương tác với hạt nhân được tạo ra với sóng radio (108-106 Hz)
Hạt nhân bao gồm proton và neutron, mỗi loại đều có xung quay riêng gọi là spin Spin hạt nhân liên quan đến một momen từ, được xác định qua tỷ lệ hồi chuyển từ Khi không bị tác động bởi từ trường, mức năng lượng của hạt nhân có momen từ là đồng nhất.
+ Phổ NMR nghiên cứu những bước chuyển của mức năng lượng hạt nhân có từ tính bằng cách tạo ra tương tác giữa hạt nhân với từ trường
Điều kiện cộng hưởng xảy ra khi hạt nhân nhận năng lượng từ một điện trường xoay chiều có tần số ν, phù hợp với khoảng cách giữa hai trạng thái năng lượng liền kề.
2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập được xác định thông qua phương pháp pha loãng, sử dụng MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) làm chỉ thị màu Phương pháp này cho phép đánh giá hiệu quả kháng khuẩn một cách chính xác và đáng tin cậy.
Các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP
Sau khi thu thập mẫu cây An điền nón, phần trên mặt đất được rửa sạch, thái nhỏ, phơi sấy khô và xay thành bột thô với khối lượng 2,4 kg Tiếp theo, bột dược liệu được ngâm chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 7 ngày với 10 lít methanol/lần, sau đó gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 50 – 60 độ C để thu được cao chiết methanol (100,5g) Cao chiết này sau đó được phân tán trong 2 lít nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước, để thu được các cao chiết phân đoạn tương ứng, gồm HPH (40,6 g), HPC (19,2 g), HPE (10,5 g) và HPW (20,8 g).
Cao chiết HPH được hòa tan trong methanol tối thiểu, sau đó được tẩm với silica gel theo tỷ lệ 1:1 Khối silica gel ẩm được đưa vào bình cô quay cất để thu hồi dung môi đến khi đạt thể chất tơi mịn Bột khô thu được sẽ được sử dụng cho quá trình chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Cột sắc ký được chuẩn bị bằng cách rửa sạch, sấy khô và lót bông ở đáy, sau đó cố định chắc chắn trên giá Silica gel pha thường được thêm vào cột với chiều cao khoảng 1 cm, và lượng chất đã tẩm được đưa lên cột, gõ nhẹ để phân bố đều Cột được triển khai với hệ dung môi rửa giải n-hexan : aceton theo các tỷ lệ 100:1, 50:1, 5:1, 1:1 (0,5 L cho mỗi hệ) và cuối cùng là aceton 100 % (0,5 L) Các phân đoạn được hứng, sau đó cô quay để thu hồi dung môi, tạo ra các cắn ký hiệu từ H1 đến H5, phục vụ cho việc phân lập hoạt chất tinh khiết trong giai đoạn tiếp theo Quá trình chiết xuất các phân đoạn từ An điền nón Hedyotis pilulifera được minh họa trong Hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây An điền nón 3.1.2 Quá trình phân lập
Qua quá trình khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chúng tôi nhận thấy trên sắc ký đồ của phân đoạn H3 và H4 có các cụm vết tách nhau rõ ràng, với lượng cắn thu được từ hai phân đoạn này khá nhiều Hơn nữa, các cụm vết trên sắc ký đồ của H3 và H4 có sự tương đồng gần như hoàn toàn Vì vậy, cắn của hai phân đoạn H3 và H4 được gộp chung và ký hiệu là H34 để tiến hành phân lập trước.
Phân tán /nước Nhiệt độ, áp suất giảm
Ngâm ở nhiệt độ phòng/ methanol
Tiến hành phân lập phân đoạn H34
Cắn phân đoạn H34 được hòa tan hoàn toàn trong n-hexan tối thiểu và được phân tích bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan – aceton theo tỷ lệ 3:1 (v/v).
Trong quá trình rửa giải bằng SKLM, các phân đoạn tương tự được gộp chung, dẫn đến việc thu hồi được hai phân đoạn H34A và H34B Qua khảo sát sắc ký đồ trên cùng một bản SKLM, phân đoạn H34A cho thấy các cụm vết tách rõ ràng, vì vậy H34A được ưu tiên cho việc phân lập trước.
Phân đoạn H34A (9g) sau khi khảo sát bằng SKLM đã được triển khai bằng SKC pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform – methanol (50:1, v/v) Quá trình rửa giải được theo dõi bằng SKLM, các phân đoạn tương tự được gom lại và thu được 3 phân đoạn ký hiệu là H34A1, H34A2 và H34A3 Phân đoạn H34A2 được lựa chọn để phân lập tiếp do sắc ký đồ của nó có một cụm vết tách khá rõ ràng.
Phân đoạn H34A2 (5g) đƣợc phân tách bằng cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi giải ly là methanol – nước (1:1, v/v) thu được 2 phân đoạn ký hiệu là H34A2A và H34A2B
Phân đoạn H34A2A (2,3 g) được ưu tiên phân tích tiếp theo do vết trên sắc ký đồ tách tương đối rõ và ít tạp chất Phân đoạn này được triển khai bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng hệ dung môi rửa giải là methanol và nước (15:1, v/v) Quá trình rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), và các phân đoạn tương tự được gom lại, sau đó cô quay cất để thu hồi dung môi, tạo ra hai phân đoạn được ký hiệu là H34A2A1 và H34A2A2.
Kiểm tra bằng SKLM cho thấy phân đoạn H34A2A1 (1,9g) có vệt tròn rõ và ít tạp chất Tiến hành tinh chế bằng SKC với hệ dung môi n-hexan – aceton (10:1, v/v) khoảng 300ml, sau đó thay đổi tỷ lệ thành (6:1, v/v) cho đến khi quá trình rửa giải hoàn tất Gộp các đoạn tinh khiết và cô quay để thu hồi dung môi, thu được hợp chất ký hiệu là HP1 (900mg).
2 hệ dung môi khác nhau là n-hexan – aceton (4:1, v/v), methanol – nước (15:1, v/v), cho thấy vệt sắc ký tròn, rõ nét và hiện màu hồng với thuốc thử H 2 SO 4 10% trong ethanol
Tiến hành phân lập phân đoạn H34A1
Phân đoạn H34A1 (600mg) có các vết hiện màu rõ ràng và tách biệt, cùng với lượng tạp chất nhỏ Vì vậy, phân đoạn H34A1 được lựa chọn để tiếp tục quá trình phân lập.
Triển khai bằng SKC pha thường với hệ dung môi n-hexan – chloroform – ethylacetat (5:1:0,1, v/v/v) khoảng 300ml, sau đó điều chỉnh tỷ lệ thành (3:1:0,1, v/v/v) cho đến khi quá trình rửa giải hoàn tất Quá trình rửa giải được theo dõi bằng SKLM, và các phân đoạn tương tự được gom lại, sau đó cô quay cất để thu hồi dung môi, tạo ra hai phân đoạn H34A1A và H34A1B Kiểm tra bằng SKLM cho thấy phân đoạn H34A1A có một vệt tròn rõ ràng, mặc dù còn lẫn một ít tạp chất.
Tiếp tục tinh chế phân đoạn H34A1A (52mg) bằng phương pháp SKC pha đảo với dung môi rửa giải là methanol – nước (1:1, v/v), thu được hợp chất HP2 (8mg) Kiểm tra bằng SKLM với hai hệ dung môi n-hexan – chloroform – ethylacetat (5:1:0,1, v/v/v) và aceton – nước (1:1, v/v) cho thấy vệt sắc ký rõ nét, hiện màu hồng khi sử dụng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol.
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất HP1
The compound HP1 is isolated as a white powder that dissolves well in chloroform, with an Rf value of 0.3 using silica gel and a solvent mixture of n-hexane and acetone in a 4:1 ratio, and an Rf value of 0.25 with Rp 18 in a 15:1 methanol-water solution It produces a pink color when treated with 10% sulfuric acid in ethanol and in a chloroform-methanol mixture at a 50:1 ratio.
SKC pha thường n-hexan – aceton (3:1)
SKC pha thường n-hexan – aceton
(10:16:1) methanol – nước (15:1) SKC pha đảo
SKC pha đảo methanol – nước (1:1) methanol 50%
SKC pha thường n-hexan – chloroform – ethyl acetat (5:1:0,13:1:0,1)
Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP1 và hợp chất tham khảo
# δ C của rotungenic acid [36], a đo trong pyridine-d 5 , b 125 MHz, c 500 MHz, * tín hiệu chập, ** tín hiệu được gán lại bằng 2D-NMR
Phổ 1 H-NMR của hợp chất HP1 chỉ ra các tín hiệu đặc trƣng của 1 proton olefin tại δ H 5,62, 2 proton của nhóm oxymethylene tại δ H 3,68 (d, J = 10,5 Hz),
Bài viết mô tả các tín hiệu NMR của một phân tử với 30 nguyên tử carbon, bao gồm 1 proton của nhóm carbinol tại δ H 3,64 và 6 nhóm methyl với các giá trị δ H khác nhau Hằng số tương tác của H-3 cho phép xác nhận cấu hình α của proton này Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của 1 nhóm carboxylic tại δ C 181,2, 2 carbon nối đôi tại δ C 128,4 và 140,4, cùng với 1 nhóm oxymethine tại δ C 80,7, 1 nguyên tử carbon bậc bốn gắn oxy tại δ C 73,2 và 1 nhóm oxymethylene tại δ C 65,1.
Tương tác HMBC giữa H-23 (δ H 1,56) với C-3 (δ C 80,7)/C-4 (δ C 43,6); giữa H-25 (δ H 0,90) với C-1 (δ C 39,2)/C-5 (δ C 56,9)/C-9 (δ C 48,3); giữa H-26 (δ H 1,09) với C-7 (δ C 34,4)/C-9 (δ C 48,3)/C-14 (δ C 42,5); giữa H-27 (δ H 1,74) với C-13 (δ C 140,4)/C-14 (δ C 42,5)/C-15 (δ C 29,8) chứng tỏ 4 nhóm tertiary methyl định vị tại C-
4, C-8, C-10 và C-14 Tương tác HMBC giữa H-29 (δ H 1,47)/H-30 (δ H 1,14) với C-
19 (δ C 73,2), C-20 (δ C 42,9) đã chứng tỏ hai nhóm methyl còn lại [C-29, C-30] định vị lần lƣợt tại C-19 và C-20
Tương tác HMBC giữa H-18 (δH 3,07) với C-12 (δ C 128,4)/C-13 (δ C 140,4)/C-28 (δ C 181,2) xác nhận vị trí của nhóm carboxyl tại C-17 và liên kết đôi tại C-12/C-13 Đồng thời, tương tác HMBC giữa H-24 (δ H 3,68, 4,51) với C-3 (δ C 80,7)/C-4 (δ C 43,6) chỉ ra sự hiện diện của nhóm oxymethylene tại C-4 Cấu hình β của nhóm này được xác định thông qua việc so sánh giá trị δ C 65,1 với các giá trị tham khảo [δ C 68-71 (C 23 -OH), 63-66 (C 24 -OH)].
Phân tích các tương tác trên phổ HSQC và HMBC cho phép gán giá trị chuyển dịch hóa học cho mọi vị trí trong phân tử Kết quả thu được xác nhận hợp chất HP1 là acid rotungenic.
Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất
Hình 3.4 Tương tác HMBC chính của hợp chất HP1
3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất HP2
Hợp chất HP2 được tách ra dưới dạng dầu màu vàng, tan tốt trong methanol,
R f = 0,5 (Silicagel n-hexan – chloroform – ethyl acetat 5:1:0,1, v/v/v)
Hình 3.5 Cấu trúc hoá học của hợp chất HP2
Hình 3.6 Tương tác HMBC chính của hợp chất HP2
Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP2 và hợp chất tham khảo
# C của α-tocopherolquinone [66] , a đo trong CDCl 3 , b 125MHz, c 500MHz,
Phổ 1 H-NMR của hợp chất HP2 chỉ ra tín hiệu tetra-alkyl benzoquinone Ba nhóm methyl singlet trên vòng quinone xuất hiện tại δ H 2,01 (3H), 1,98 (6H) Tín hiệu singlet còn lại tại δ H 1,21 thuộc về nhóm methyl ở vị trí germinal với nhóm hydroxyl Bốn nhóm methyl bậc hai khác đƣợc ghi nhận tại 0,81 (3H), 0,83 (6H), 0,84 (3H) Phổ 13 C-NMR chỉ ra các tín hiệu của vòng quinone thế và mạch aliphatic loại phytol với 1 nhóm hydroxyl tại C-3 (Bảng 3.2)
Cấu trúc của vòng quinone được xác định thông qua các tương tác HMBC, cụ thể là giữa 2-Me (δ H 1,98) và các carbon C-1 (δ C 187,33), C-2 (δ C 140,52), C-3 (δ C 140,63); giữa 3-Me (δ H 1,98) với C-2 (δ C 140,52), C-3 (δ C 140,63) và C-4 (δ C 187,77); cùng với 5-Me (δ H 2,01) và C-4 (δ C 187,77), C-5 (δ C 140,57), C-6 (δ C 144,57) Mạch nhánh aliphatic tại C-6 được thiết lập qua tương tác giữa H-1 (δH 2,52) và các carbon C-1 (δ C 187,77), C-5 (δ C 140,57), C-6 (δ C 144,57).
Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất HP2 cho phép xác định hợp chất này là
-tocopherolquinone (2,3,5-trimethyl-6-(3-hydroxy)-phytyl-1,4-benzoquinone) (Hình 3.5) với các tính chất phổ hoàn toàn phù hợp với các giá trị tham khảo [66].
KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 hợp chất rotungenic acid và α- tocopherolquinone đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các chất phân lập đƣợc
Hợp chất MIC (àg/mL)
MIC < 10 àg/mL: Hoạt tớnh khỏng khuẩn mạnh
10 < MIC ≤ 100 àg/mL: Hoạt tớnh khỏng khuẩn trung bỡnh
MIC > 100 àg/mL: Hoạt tớnh khỏng khuẩn yếu hoặc khụng cú
MIC (-): Không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh
In this experiment, rotting acid demonstrated strong antibacterial activity against three strains: S aureus, B subtilis, and M smegmatis In contrast, α-tocopherolquinone showed no significant antibacterial activity.
BÀN LUẬN
BÀN LUẬN CHUNG
Trên thế giới hiện có hơn 250.000 loài thực vật bậc cao, nhưng chỉ một tỷ lệ nhỏ trong số đó đã được nghiên cứu kỹ lưỡng về giá trị tiềm năng của chúng như nguồn dược liệu Các sản phẩm tự nhiên không chỉ được sử dụng trực tiếp làm thuốc mà còn cung cấp các hoạt chất quan trọng để thiết kế, tổng hợp và bán tổng hợp các loại thuốc mới nhằm điều trị bệnh cho con người.
Các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất của chúng vẫn chiếm hơn 50% tổng số loại thuốc chữa bệnh Đến năm 2014, khoảng 25-30% sản phẩm tự nhiên không thể thay thế được Từ năm 1981 đến 2014, có 1.562 loại thuốc mới được phát hiện, trong đó 320 loại được chiết xuất từ nguồn gốc tự nhiên Đặc biệt, thuốc chống nhiễm trùng từ tự nhiên chiếm 25,5% và thuốc chống ung thư chiếm 62,25% trong số các hợp chất này.
Với nguồn tài nguyên dược liệu phong phú, nhiều cây thuốc kháng sinh đã được Y học dân tộc sử dụng từ lâu, như hành, tỏi, hẹ, kim ngân, sâm đại hành và lá móng tay, để chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh khác Các cây thuốc như lá vối, lá bòng bong và lô hội cũng được dùng để điều trị vết thương hiệu quả Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nước sắc lá đơn tướng quân có tác dụng tốt trong việc chữa lở loét và viêm họng, trong khi lá trầu không được sử dụng để điều trị bỏng và sát khuẩn vết thương Artemisinin, được phát hiện vào năm 1971, đã trở thành một trong những kháng sinh thực vật quan trọng trong điều trị sốt rét Ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là ít độc hại, không gây ra tai biến nghiêm trọng như các loại kháng sinh tân dược, điều này thúc đẩy việc tìm kiếm và phát triển kháng sinh từ thực vật hiện nay.
QUÁ TRÌNH THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU
Sau khi thu hoạch, cây An điền nón cần được loại bỏ các bộ phận bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo và thực vật ký sinh Tiếp theo, nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô, sấy ở nhiệt độ 50-60 độ C và xay thành bột thô để tiến hành chiết xuất và phân lập các hợp chất.
Làm khô dược liệu là phương pháp hiệu quả để bảo quản chúng khỏi nấm mốc và vi khuẩn, đồng thời hạn chế tác động của enzyme và các biến đổi hóa học như phản ứng thủy phân, oxy hóa, đồng phân hóa và trùng hợp hóa Nếu không có lò sấy, có thể phơi khô dược liệu dưới ánh nắng, nhưng cần tránh ánh nắng gay gắt vì tia UV có thể gây ra phản ứng hóa học tạo ra hợp chất giả tạo Dược liệu khô cũng dễ dàng hơn trong việc xay nghiền và vận chuyển Trong quá trình phơi hoặc sấy, cần thường xuyên đảo dược liệu để đảm bảo khô đều.
Việc xay nhuyễn dược liệu giúp phá vỡ màng tế bào thực vật, tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi và dược liệu Điều này tạo điều kiện cho dung môi thẩm thấu dễ dàng vào bột dược liệu, cho phép các chất tan khuếch tán hiệu quả hơn, từ đó nâng cao khả năng chiết xuất hoạt chất.
4.3 QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP
Methanol là dung môi lý tưởng để chiết xuất hoạt chất từ dược liệu nhờ khả năng thấm qua màng tế bào thực vật và tạo cầu nối liên phân tử với các nhóm phân cực khác Ưu điểm của methanol là có thể chiết được các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu, giúp chiết kiệt hoạt chất có trong dược liệu Ngoài ra, methanol còn có giá thành rẻ, độ nhớt thấp và không quá dễ bay hơi, làm cho nó trở thành lựa chọn hàng đầu cho quá trình chiết xuất Sau khi chiết, methanol được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40 độ C để thu được cao thô ban đầu, tránh làm hỏng các hợp chất kém bền nhiệt khi cô ở nhiệt độ cao hơn.
Việc chiết tách hợp chất từ mẫu cây gặp khó khăn do không xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất có trong cây Các loại cây chứa nhiều hợp chất hữu cơ với độ phân cực khác nhau, vì vậy việc áp dụng sắc ký cột trực tiếp lên cao thô ban đầu thường không mang lại kết quả như mong đợi Để dễ dàng cô lập các hợp chất, người ta thường chuẩn bị các loại cao chiết có tính phân cực tăng dần, mỗi loại chứa ít hợp chất hơn Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau” Nghiên cứu này đã thu được cao từ các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat và nước.
Việc phân lập hoạt chất tinh khiết từ cây An điền nón đòi hỏi nhiều giai đoạn và sử dụng các phương pháp phân tách phổ biến trong phòng thí nghiệm, bao gồm chiết xuất phân đoạn lỏng-lỏng, chiết xuất pha rắn, SKLM, SKC Diaion HP-20, SKC với chất hấp phụ silicagel pha thường và pha đảo, cùng với SKC Sephadex LH-20 Những phương pháp này là chủ đạo trong quá trình tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.
SKC Sephadex LH-20 là một công cụ hiệu quả trong việc tinh chế hợp chất, đặc biệt khi hợp chất cần phân lập có tạp chất màu Điều này đặc biệt quan trọng trong quá trình phân lập hợp chất HP1, giúp đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của sản phẩm cuối cùng.
Việc phối hợp dung môi rửa giải là một quá trình phức tạp, phụ thuộc vào độ phân cực của các chất trong từng phân đoạn Tìm kiếm hệ dung môi rửa giải phù hợp thường tốn thời gian và cần kinh nghiệm của người nghiên cứu Đôi khi, việc sử dụng 3 đến 5 dung môi thay vì chỉ 2 dung môi thông thường là cần thiết để đạt được sự phân tách rõ ràng Một ví dụ điển hình cho điều này là quá trình phân lập chất HP2.
Trước khi tiến hành đo phổ, các hợp chất phân lập cần đạt độ tinh khiết tối thiểu 95%, điều này được xác nhận qua phương pháp SKLM với các pha thường và pha đảo sử dụng hệ dung môi khác nhau Khi phun thuốc thử H2SO4 10% (v/v) trong ethanol và đun nóng từ từ, hợp chất tinh khiết sẽ xuất hiện trên bản mỏng với vết màu sắc đồng đều, hình dạng gần tròn, các mép viền rõ nét và không có vết phụ nào xuất hiện.
Sau khi hoàn tất quá trình phân lập, hai hợp chất HP1 và HP2 được tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc Phổ NMR một chiều 1H-NMR được sử dụng trong nghiên cứu này.
Phương pháp 13C-NMR cùng với hai chiều HSQC và HMBC hiện đang được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc hợp chất tự nhiên Những kỹ thuật này cung cấp thông tin chi tiết và chính xác, giúp xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hữu cơ một cách hiệu quả.
Dựa trên thông tin từ kết quả giải phổ NMR một chiều và hai chiều, cùng với việc so sánh với các phổ chuẩn tham khảo, chúng tôi đã xác định được danh pháp của hợp chất HP1 là axit rotungenic và hợp chất HP2 là α-tocopherolquinone.
4.4 VỀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Sau quá trình phân tích phổ để nhận định cấu trúc, hai hợp chất đã phân lập đƣợc xác định là:
HP1: 3b,19a,24-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid còn đƣợc gọi là rotungenic acid Hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ Ilex rotunda
(Aquifoliaceae) [48], sau đó còn đƣợc tìm thấy trong các loài nhƣ Diospyros kaki, Morinda citrifolia, Morinda oficinallis, Euscaphis japonica, Ilex litseaefolia [17],
HP2: 2,3,5-trimethyl-6-(3 -hydroxy)-phytyl-1,4-benzoquinone còn đƣợc gọi là α-tocopherolquinone Hợp chất này cũng đƣợc phân lập từ loài Solidago virga-aurea var gigantea MIQ, Limnophila geoffrayi [61], [66]
Theo tài liệu hiện có, chưa có công bố nào về rotungenic acid và α-tocopherolquinone được phân lập từ chi Hedyotis và cây An điền nón Do đó, đây là lần đầu tiên hai thành phần này được phân lập từ cây An điền nón (Hedyotis pilulifera) ở Việt Nam cũng như trên thế giới.
Hai hợp chất này có công thức cấu tạo nhƣ Hình 4.1 và Hình 4.2
Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của HP1
Hình 4.2 Cấu trúc hóa học của HP2