Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan hồng hoàng sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Phần 1: Mở đầu

Đặt vấn đề

Nghề trồng hoa cây cảnh đang phát triển mạnh mẽ cùng với nền kinh tế, mang lại hiệu quả kinh tế cao và góp phần chuyển dịch cơ cấu nông nghiệp Sản xuất hoa lan không chỉ có giá trị kinh tế mà còn mang lại giá trị thẩm mỹ, trở thành sản phẩm chủ yếu trên thị trường Các quốc gia như Thái Lan, Singapore và Malaysia đã thúc đẩy sản xuất hoa lan, với kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành của Thái Lan đạt 30 triệu USD vào năm 1991 và Singapore thu lợi nhuận 10 triệu USD mỗi năm Trên toàn cầu, kim ngạch xuất khẩu hoa lan hàng năm đạt 1,8 tỷ USD.

Việt Nam sở hữu một hệ thống rừng phong phú với độ che phủ lớn và khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, tạo điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của nhiều loài lan quý Đất nước chúng ta nằm trong trung tâm khởi nguồn của nhiều loài lan quý hiếm, với tiềm năng lớn từ nguồn cây dại và quỹ gen đa dạng Các vùng như Sapa, cao nguyên Mộc Châu, Ba Vì và Đà Lạt rất thích hợp cho việc phát triển và chọn tạo giống cây lan Tuy nhiên, chúng ta đang đối mặt với nhiều thách thức như thiên tai bất thường, nạn khai thác rừng tràn lan và nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài lan quý, dẫn đến sự cạn kiệt tài nguyên sinh thái Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) là một trong những loài lan nổi bật với vẻ đẹp tự nhiên, hoa lớn bền, màu sắc nâu tím và cánh môi vàng sẫm, có thể cho tới 15,5 hoa trên một chùm, thu hút sự quan tâm của người tiêu dùng cả trong và ngoài nước.

Việc nghiên cứu nhân giống in-vitro cho loài địa lan Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides) vẫn chưa được thực hiện đầy đủ, mặc dù loài này có tầm quan trọng trong việc khôi phục và bảo tồn nguồn gen lan bản địa Để đáp ứng nhu cầu bảo tồn và phát triển các loài đặc hữu tại Việt Nam, việc nghiên cứu và triển khai nhân giống nhanh loài địa lan này là rất cần thiết Do đó, chúng tôi đã bắt đầu nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.

Mục đích yêu cầu đề tài

Xác định các khâu kỹ thuật quan trọng trong quy trình nhân giống địa lan bản địa, từ đó phát triển kỹ thuật trồng và công nghệ nhân nhanh giống địa lan bản địa Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides).

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

Giai đoạn nhân nhanh in - vitro

- Nghiên cứu của việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến sự nảy mầm của hạt.

- Nghiên cứu nhân nhanh bằng phơng pháp cắt lát mỏng.

- Nghiên cứu ảnh hởng của các chất điều tiết sinh trởng.

- Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa đến chất lợng của chồi

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu ảnh hởng của than hoạt tính đến quá trình ra rÔ.

- Nghiên cứu ảnh hởng của α - NAA đến quá trình ra rễ.

Giai đoạn sau nuôi cấy in vitro

K9 – Khoa Công nghệ sinh học

- Nghiên cứu ảnh hởng của xử lý giá thể của cây ở giai đoạn vờn ơm.

- Nghiên cứu ảnh hởng của biện pháp che tối khi cây đa ra vờn ơm.

- Nghiên cứu ảnh hởng của một số dinh dỡng đến sự sinh trởng và phát triển của cây ở giai đoạn vờn ơm.

Phần Tổng quan tài liệu

Sơ lợc về cây hoa lan

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thùc vËt

Cây hoa lan thuộc họ Orchidaceae, bộ Orchidales, lớp một lá mầm Monocotyledoneae Được biết đến lần đầu tiên ở phương Đông, cây lan đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ thời vua Thần Nông (2800 trước Công Nguyên) Với vẻ đẹp và tác dụng chữa bệnh, hoa lan ngày càng được ưa chuộng Robut Bron (1773 – 1858) là người đầu tiên phân biệt rõ ràng giữa họ lan và các họ khác.

Joanlind (1979 – 1985) là người tiên phong trong nghiên cứu về lan, với việc công bố hệ thống phân loại các tông họ lan vào năm 1836, vẫn được sử dụng cho đến nay Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên thế giới, nhưng khoảng 80% tập trung ở các vùng nhiệt đới, đứng thứ hai sau họ cúc với khoảng 15.000-35.000 loài, phân bố từ 68 độ vĩ bắc đến 56 độ vĩ nam Phân bố chính của họ lan nằm ở các khu vực nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á Loài lan đầu tiên được biết đến ở Trung Hoa là kiến lan (Cymbidium ensifolium), một loài bán địa lan Từ thế kỷ 18, châu Âu bắt đầu chú ý đến phong lan, nhờ vào những chuyến đi của các thủy thủ, phong lan đã được giới thiệu rộng rãi trên toàn cầu.

Khoa Công nghệ sinh học đã đưa cây lan vào ngành hoa cây cảnh toàn cầu cách đây 400 năm Tại Việt Nam, Gioalas Noureiro, một nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, được xem là người đầu tiên khảo sát về lan vào năm 1789 trong cuốn “Flora cochin chinensis”, mô tả các loại lan như aerides, phaius và sarcopodium Những nghiên cứu đáng kể về cây lan chỉ xuất hiện sau khi người Pháp đặt chân đến Việt Nam, với các công trình của F Gagne Pain và A Gui Ilaumin mô tả 70 chi lan khác nhau.

101 loài cho cả 3 nớc Đông Dơng trong bộ “thực vật Đông D- ơng chí” (Flora Genera Indochine) do H Leconte chủ biên xuất bản từ những năm 1932 – 1934.

2.1.2 Đặc tính thực vật học của địa lan

Cây lan, giống như các loại thực vật khác, bao gồm 6 bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Theo tác giả Trần Hợp (1990), cây lan được mô tả với những đặc điểm riêng biệt, phản ánh sự đa dạng và phong phú của loài thực vật này.

Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, có thể phát triển ở đất hoặc trên vách đá vôi Địa lan thường có củ giả và rễ mập, xum xuê, với rễ bò dài hoặc ngắn Chúng phát triển thân rễ nạc, có thể dài, ngắn, mập hoặc mảnh tùy thuộc vào từng loài, tạo thành các bụi dày hoặc lan xa Hệ rễ của chúng nhỏ và đan thành búi, khác với các loài phong lan có kích thước lớn hơn.

Các loài phong lan có hệ rễ khí sinh phát triển mạnh mẽ, với rễ dài, mập và khỏe, giúp giữ cho cây vững vàng trước gió và hấp thụ dinh dưỡng Ở một số loài có thân và lá kém phát triển, rễ phát triển dày đặc và còn thực hiện chức năng quang hợp Rễ thường có dạng dẹt, bò dài và có màu xanh nhạt Đặc biệt, các loài phong lan sống hoại bộ có rễ độc đáo, có thể dài đến vài chục mét và có khả năng leo cao.

Phong lan có thể có thân ngắn hoặc dài, đôi khi phân nhánh và có thể mang hoặc không mang lá Theo M.E.Pfizer (1882), phong lan chủ yếu thuộc loại sinh trưởng hợp trụ, với hệ thống nhiều nhánh lâu năm và bộ phận nằm ngang, bò trên giá thể hoặc ẩn sâu trong lòng đất Ngược lại, các loài phong lan sinh trưởng đơn trục ít gặp hơn, thường khó duy trì thế thẳng đứng và cần rễ chống đỡ để vươn cao Các loài phong lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả, là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng cho cây trong điều kiện khô hạn Đa số củ giả có màu xanh bóng, cùng với lá, thực hiện chức năng quang hợp.

Có ba loại lá lan: lá đứng, lá nửa đứng và lá cong rũ Địa lan chủ yếu là cây tự dưỡng, sử dụng quá trình quang hợp để tạo ra chất dinh dưỡng, do đó chúng phát triển hệ thống lá phong phú Lá có thể mọc đơn độc hoặc xếp chồng lên nhau.

K9 là một loại cây có công nghệ sinh học đặc trưng với sự dày đặc ở gốc và cách xếp lá theo hình thức khác nhau trên thân và củ giả Hình dáng lá rất đa dạng, từ lá mọng nước, dài hình kim, đến lá phiến mỏng và dài Số lượng lá trên mỗi nhánh cũng biến động lớn, như Đông lan chỉ có 2,6 lá/nhánh, trong khi Bạc lan có thể có tới 9,1 lá/nhánh Độ dày và độ rộng của lá cũng khác nhau, với Bích ngọc có lá dài khoảng 1cm và Thanh ngọc có lá dài từ 40-80 cm.

Về màu sắc, phiến lá thờng có màu xanh bóng nh các chi Lan kiếm (Cymbidium SW), chi lan Bầu rợu (Calanthe

R.Br), có loài có màu xanh đậm nh Hạc Đính Vàng (P. flavum).

Hoa lan có cấu tạo phong phú và đa dạng, với nhiều loài chỉ nở một bông hoa trong một mùa hoặc nhiều cụm hoa, mỗi cụm chỉ có một bông Dù có hình dáng khác nhau, tất cả các loài hoa lan đều có tổ chức đồng nhất với hoa mẫu 3, một đặc trưng của lớp một lá mầm, nhưng đã trải qua nhiều biến đổi để đạt được sự đối xứng qua một mặt phẳng.

Mầm hoa của địa lan đợc hình thành từ đốt thứ 3, thứ

Ở gần đáy của các giả hành, hoa thường mọc thẳng hoặc cong, có chiều dài đáng kể và mang nhiều bông hoa Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách ra từ các bẹ già.

Mỗi giả hành thường chỉ cho hoa một lần, với chồi hoa xuất hiện đồng thời cùng chồi thân Chồi hoa có hình tròn, trong khi chồi thân lại hơi dẹp Các lá đầu tiên của chồi thân mọc ra hai phía giống hình đuôi cá, còn ở chồi hoa, các lá bao hoa ôm chặt quanh phát hoa.

Cọng phát hoa của hoa Cymbidium không phân nhánh, có chiều dài từ 10 cm đến hơn 100 cm, mang từ vài đến hàng chục búp hoa xếp theo đường xoắn ốc Khi búp hoa đủ lớn, chúng bắt đầu dang xa khỏi cọng Hoa có 5 cánh gần giống nhau, nhưng thực tế chỉ có 2 cánh hoa bên trong và 3 lá đài bên ngoài Cánh hoa thứ 3 biến đổi thành cánh môi, với màu sắc rực rỡ và chia thành 3 thuỳ, tạo hình nửa ống, giúp thu hút côn trùng thụ phấn Giữa 2 cánh môi có 2 gờ dọc màu vàng và bên trong có đĩa mật Hoa Cymbidium lưỡng tính, với nhị đực và nhị cái gắn chung trên một trụ nhị, nhụy hình bán trụ cong về phía trước Nhị trên cùng chứa 2 khối phấn màu vàng, được bao phủ bởi nắp màu trắng ngà Cấu trúc này giúp hoa chỉ thụ phấn nhờ côn trùng, và sau khi thụ phấn, bầu noãn phình to tạo thành quả.

Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-

Quả có 6 đường nứt dọc, từ hình dạng dài như quả vanilla đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra nhưng mảnh vỏ vẫn dính lại ở phần đỉnh và gốc Một số loài quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt mà hạt chỉ thoát ra khi vỏ bị mục nát.

Hạt lan rất nhỏ, với khối lượng chỉ khoảng 1/10-1/1000 mg, trong đó không khí chiếm 76-96% thể tích Chúng chủ yếu cấu tạo từ một khối chất chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ xốp chứa đầy không khí Thời gian để hạt chín kéo dài từ 2-18 tháng, nhưng phần lớn hạt thường chết do không tìm được nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm Mặc dù hạt có thể bay xa theo gió, việc nảy mầm thành cây lại rất hiếm, chỉ xảy ra trong những khu rừng già ẩm ướt ở vùng nhiệt đới.

2.1.3 Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa Địa lan Hồng hoàng (Hoàng lan) tên khoa học là

Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nớc

2.2.1 Tình hình sản xuất hoa trên thế giới

Sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển mạnh mẽ, trở thành một ngành thương mại mang lại lợi nhuận cao và đóng góp lớn cho nền kinh tế các quốc gia trồng và xuất khẩu hoa Diện tích trồng hoa ngày càng được mở rộng, với tổng giá trị hoa và cây cảnh toàn cầu đạt 1,8 tỷ đô la vào năm 1989 và tăng lên 20 tỷ đô la vào năm 1996 Trong đó, Nhật Bản đạt 3,731 tỷ đô la, Hà Lan 3,558 tỷ đô la, và Mỹ 3,720 tỷ đô la, theo thống kê từ trung tâm xuất khẩu của Liên hợp quốc ITC.

Các nước nổi bật trong ngành sản xuất và kinh doanh xuất khẩu hoa lan bao gồm Thái Lan, Nhật Bản, Indonesia, Hà Lan, Hungary, Anh, Bulgaria, Costa Rica, Đan Mạch, Bỉ, Italia và Pháp Nhiều tạp chí chuyên về hoa lan cũng đã được xuất bản, phản ánh sự quan tâm ngày càng tăng đối với loại hoa này trên thị trường quốc tế.

Khoa Công nghệ sinh học tại K9 đã tổ chức nhiều hội thảo về hoa, đặc biệt là lan Trước đây, việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu tập trung vào lan rừng, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cho khoảng 13 loài Hiện nay, trồng lan đã trở thành một ngành công nghiệp phát triển, với số lượng xuất khẩu đạt hàng trăm ngàn giò và hàng vạn cành lan mỗi năm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Các nước Châu Á đang phát triển mạnh mẽ ngành trồng hoa, đặc biệt là hoa lan, với 15 quốc gia tham gia xuất khẩu Hồng Kông, Ấn Độ, Indonesia và Thái Lan là những nước nổi bật, với sản lượng hoa cắt xuất khẩu đạt 68,2 triệu đô la, trong đó khoảng 50% được tiêu thụ nội địa Các quốc gia ở Châu Phi và Châu Đại Dương cũng đang chú trọng phát triển ngành kinh tế tiềm năng này.

2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nóng ẩm lý tưởng cho sự phát triển của ngành trồng hoa và cây cảnh, biến đây thành một ngành công nghiệp tiềm năng Tuy nhiên, do thiếu đầu tư thích đáng, ngành trồng hoa, đặc biệt là trồng lan, vẫn chưa phát triển đúng với khả năng của mình.

Kể từ năm 1980, Việt Nam đã bắt đầu xuất khẩu hoa lan sang Liên Xô và Tiệp Khắc Đến năm 1987, thành phố Hồ Chí Minh đã hình thành các vườn lan quốc doanh và tư nhân, cùng với sự ra đời của nhiều hội hoa lan và cây cảnh Nhiều cơ sở nghiên cứu về hoa lan cũng được thành lập trong giai đoạn này.

Theo số liệu điều tra sơ bộ năm 1986, thành phố Hồ Chí Minh có khoảng 15 gia đình trồng lan, với số lượng từ 1.000 đến 7.000 chậu Đến năm 1987, số lượng gia đình trồng lan trong thành phố tiếp tục tăng.

Từ năm 1980, thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức hội hoa xuân hàng năm, thu hút sự chú ý của người dân và du khách Đặc biệt, trong giai đoạn 2005-2006, thành phố dự kiến đầu tư 20 ha cho việc nuôi trồng hoa lan và 20 ha cho cây kiểng, nhằm phát triển dự án hoa và cây kiểng tại khu vực này.

Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã sản xuất hàng vạn giống hoa lan có giá trị kinh tế như Hồ điệp (Phalaenopsis), cát lan (Cattleya), và lan thái (Dendrobium) Bên cạnh đó, viện còn cung cấp dịch vụ tư vấn kỹ thuật và chuyển giao quy trình nuôi trồng các giống lan hiệu quả kinh tế tại các tỉnh như Hải Phòng, Bắc Giang, và Lạng Sơn.

Hiện nay, các tỉnh thành phố phía Bắc đều có phòng nuôi cấy mô tế bào, phục vụ cho nghiên cứu khoa học và sản xuất giống, bao gồm hoa lan Hải Phòng đã xây dựng khu nông nghiệp công nghệ cao tại xã Mỹ Đức, huyện An Lão, với mục tiêu sản xuất 300.000 cây giống hoa lan bằng công nghệ của Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp 1 và Hiệp hội hoa lan Thái Lan, khởi đầu từ năm 2003.

Thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội là hai địa điểm nổi bật ở Việt Nam với nhiệt độ trung bình đạt 23,5°C Tổng lượng mưa hàng năm tại đây là 1.674 mm, trong khi nhiệt độ tối cao có thể lên tới 42,8°C Tháng lạnh nhất trong năm ghi nhận nhiệt độ trung bình khoảng 13,7°C.

K9 – Khoa Công nghệ sinh học, với biên độ nhiệt độ ngày là 6,1°C, rất thích hợp cho sự phát triển của các loài lan nhiệt đới Sapa, nằm ở độ cao 1570 m, có nhiệt độ trung bình 15,2°C và lượng mưa 2833 mm, với nhiệt độ thấp nhất là 5,9°C và cao nhất là 29,8°C, cùng biên độ nhiệt độ ngày đêm trung bình 6,2°C Đà Lạt, ở độ cao 1513 m, có nhiệt độ trung bình 18,2°C và lượng mưa 1865 mm, với nhiệt độ cao nhất 31,5°C và nhiệt độ trung bình tháng thấp nhất 24,6°C, có biên độ ngày trung bình trong năm là 8,9°C, rất hấp dẫn cho sự phát triển của các loài lan ôn đới.

Việt Nam sở hữu nhiều vùng tiểu khí hậu lý tưởng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của cả ba loại lan: nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Điều này góp phần quan trọng vào sự phát triển nghề trồng lan tại nước ta.

Các nghiên cứu về nhân giống địa lan bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào

ơng pháp nuôi cấy mô tế bào

2.3.1 Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào

Tế bào là đơn vị sinh lý cơ bản của sinh vật, đặc biệt ở sinh vật đơn bào, nơi tất cả chức năng đều tập trung trong một tế bào duy nhất với khả năng sống và phát triển Đối với sinh vật đa bào như cây, nguồn gốc cũng bắt đầu từ một tế bào duy nhất là hợp tử Khi hợp tử phân chia và chuyên hóa thành các mô và cơ quan, các tế bào trở nên khác nhau về hình dạng và chức năng, dẫn đến việc không còn biểu hiện tính toàn năng do ảnh hưởng từ các tế bào khác.

Việc vô hiệu hóa gen giúp tế bào hoạt động như một tế bào non trẻ, cho phép chúng phân chia và phát triển thành cây hoàn chỉnh Khi tách tế bào từ cơ thể sinh vật đa bào, câu hỏi đặt ra là liệu tế bào đó có khả năng sinh sống và sinh sản hay không Nhiều nhà khoa học đã tiến hành tách tế bào và nuôi trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, dẫn đến sự phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào Phương pháp này hiện đang được áp dụng rộng rãi trong nhân giống cây trồng, đặc biệt là hoa lan, và là phương pháp duy nhất có khả năng nhân giống lan trên quy mô công nghiệp, với các cây con hoàn toàn giống nhau từ một cây mẹ ban đầu.

2.3.2 Một số nghiên cứu tiêu biểu

Georges Morel (1956) đã phát triển thành công phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho cây lan, công bố trên tạp chí A.O.S (American Orchid Society, 1960), với giống lan đầu tiên được áp dụng là Cymbidium Năm 1963, Donol E Vimbex cũng đã nghiên cứu thành công trên giống lan khác.

Cymbidium nhng lại nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên môi tr- êng láng.

Năm 1996, Yonco Sagaw và T Shoji đã nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên của Cymbidium trên cả hai môi trường lỏng và đặc Điều này đã đặt nền tảng cho việc nhân giống giống địa lan (Cymbidium) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp này cho phép nhân nhanh giống một cách hiệu quả.

K9 - Khoa Công nghệ sinh học và phục tráng giống trong cây trồng đã có những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu và phát triển giống địa lan Morel (1960) phát hiện rằng Meristem của một loài địa lan hầu như không chứa virus, đồng thời ông cũng thành công trong việc tạo protocorm thông qua nuôi cấy Meristem Tại Việt Nam, từ năm 1999, các nhà nghiên cứu như Nguyễn Xuân Linh và Phạm Thị Liên đã tiến hành nghiên cứu về loài Hạc Đĩnh Nâu và phát triển giống địa lan miền Bắc Nhiều viện nghiên cứu và Sở Khoa học Công nghệ ở các tỉnh như Lạng Sơn, Nghệ An, Nam Định đã xây dựng phòng nuôi cấy mô, tạo ra quy trình nhân giống hoàn chỉnh để cung cấp cây giống cho sản xuất Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội là nơi tiên phong trong nghiên cứu hoa lan, với các dự án như xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan và phát triển công nghệ sản xuất hoa có giá trị kinh tế cao.

Phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào (Thin cell layers - TCL)- -15 1 Khái niệm

Hệ thống lớp mỏng tế bào, được hình thành từ một hoặc nhiều lớp tế bào, là một mô hình thực nghiệm đơn giản, trong đó các tương tác chèn ép giữa các cơ quan và tương tác qua lại giữa các mô, tế bào được duy trì ở mức tối thiểu.

2.4.2 Một số nghiên cứu về phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào

Phương pháp lớp mỏng tế bào, lần đầu tiên được mô tả bởi Trần Thanh Vân trên cây thuốc lá (Nicotina tabacum) vào những năm 1973-1981, tập trung vào nghiên cứu sự phát sinh hình thái của chương trình biệt hóa tế bào như chồi, rễ, hoa và mô sẹo Phương pháp này sử dụng các lớp tế bào cắt mỏng (3-6 lớp tế bào biểu bì) và nghiên cứu sự thay đổi nồng độ đường cùng với tỷ lệ auxin/xytokinin, đã cho thấy hiệu quả trong việc phát sinh phôi vô tính của cây Brassica canapus và khả năng phát sinh chồi của cây Begonia rex, Petrolium (Bùi Văn Lê, 1999) Đặc biệt, phương pháp cắt lớp mỏng tế bào ngang được áp dụng cho các cây một lá mầm để tạo phôi vô tính, trong đó cây Saivit pauliacae có khả năng hình thành chồi từ cuống lá Tại Việt Nam, nghiên cứu về nuôi cấy lớp mỏng tế bào vẫn còn mới mẻ, với một số kết quả từ các tác giả như Trần Thanh Vân, Bùi Thị Ánh Tuyết, Trần Duy Quý và Lê Thị Ánh Hồng, đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây Saivitpaulia.

Vononvhawindhl ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa

2.5 Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl)

2.5.1 Phơng pháp TCL kinh điển

Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986), lớp mỏng tế bào được cắt theo chiều dọc hoặc ngang từ các cơ quan khác nhau với kích thước nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5 mm) giúp bộc lộ tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai trong quá trình cài lồng gen Cắt lớp mỏng tế bào theo chiều dọc (ITCL) thường được sử dụng để phân loại tế bào từ mô rộng, biểu bì, tế bào tầng và tế bào nhu mô, có thể lấy từ thân, gân lá, cuống lá hoặc lá mầm Trong khi đó, cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) có thể sử dụng từ các cơ quan như phiến lá, rễ, hoa thân và mô sinh đỉnh nhằm hình thành mô phân sinh đỉnh, mô sẹo hoặc tái sinh chồi Môi trường cấy thường có dạng đặc hoặc lỏng, và một số loài như cây thuốc lá, cà chua, và lan hồ điệp đã thử nghiệm thành công với TCL Dụng cụ chứa như ống nghiệm hoặc đĩa petri cần được lựa chọn sao cho phù hợp với thể tích môi trường nuôi cấy và không khí cung cấp dinh dưỡng cho mẫu cây.

2.5.2 Phơng pháp TCL cải tiến

Việc sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế giúp nghiên cứu động lực của các con đường sinh tổng hợp khác nhau, đồng thời giảm thiểu sự biến đổi nội tạng của nhân.

Phương pháp cải tiến của Richard (1987) sử dụng đĩa giếng 24 đĩa với kích thước 1,6 cm làm vật liệu chứa, mỗi đĩa chứa một thể tích môi trường xác định với tỷ lệ không khí phù hợp Màng nhựa mỏng cách li các cá thể, ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa và nhiễm vi sinh vật Đĩa được bịt kín bằng hai lớp màng urgo, giúp phân bố ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL Phương pháp này giảm kích thước đĩa giếng, cho phép tiếp xúc với các điều kiện môi trường đồng nhất như ánh sáng, nhiệt độ, CO2 và O2, từ đó giảm sự biến động.

Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào

Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bớc:

Bớc 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in-vitro, việc chọn lọc cẩn thận các cây mẹ là rất quan trọng Các cây mẹ cần phải sạch bệnh, đặc biệt là virus, và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Trồng cây mẹ trong môi trường thích hợp cùng với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả sẽ giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, từ đó tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu in-vitro.

Bớc 1: Nuôi cấy khởi động

Giai đoạn khử trùng đa mẫu trong nuôi cấy in-vitro là rất quan trọng, yêu cầu tỉ lệ nhiễm thấp và tỉ lệ sống cao, đảm bảo mô tồn tại và sinh trưởng tốt Việc chọn mẫu cần chú ý đến loại mô và giai đoạn phát triển của cây, trong đó đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách là quan trọng nhất, tiếp theo là đỉnh chồi hoa và các đoạn thân, mảnh lá Những phần này thường được sử dụng để nhân nhanh các loại cây như măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá và hoa cúc.

Giai đoạn kích thích mô nuôi cấy nhằm phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua việc hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Để đạt hiệu quả cao nhất, cần xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh phù hợp Môi trường có nhiều xitokynin sẽ kích thích tạo chồi, với chế độ nuôi cấy thường là 25-27 độ C và 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày, cường độ ánh sáng từ 2000-4000 lux Tuy nhiên, mỗi loại đối tượng nuôi cấy yêu cầu chế độ khác nhau; ví dụ, nhân nhanh suplơ cần quang chu kỳ chiếu sáng 9 giờ mỗi ngày, trong khi nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối.

Bớc 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, ngời ta chuyển chồi từ môi trờng nhân nhanh sang môi trờng tạo rễ thờng đợc bổ sung một l- ợng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi tr- ờng không chứa chất điều tiết sinh trởng

Bớc 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên

2 4 Để đa cây từ ống nghiệm ra vờn ơm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm đã đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ, chiều cao cây).

+ Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nớc.

+ phải chủ động điều chỉnh đợc ẩm độ, sự chiếu sáng của vờn ơm cũng nh có chế độ dinh dỡng phù hợp [17].

Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro

2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)

Mục đích của nhân giống in-vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp này cũng có thể gây ra biến dị soma không lặp lại Tần số biến dị khác nhau, và cây từ nuôi cấy tế bào mô sẹo thường có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh Các dạng biến dị phổ biến bao gồm bạch tạng, sọc lá và sự phát triển bất thường của cây, cùng với hệ số nhân in-vitro giảm sút Nhiều cây trồng trên đồng ruộng có thể có hơn 100 lá mà vẫn không ra hoa, trong khi cây bình thường có thể ra hoa khi có khoảng 40 lá.

Quá trình khử trùng mẫu trước khi nuôi cấy thường loại bỏ hầu hết các vi sinh vật như nấm và vi khuẩn Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn nhất định như Agrobacterium, Bacillus và Corynebacterium vẫn có thể tồn tại và phát triển sau khi khử trùng.

Erwinnia và Pseudomonas có khả năng xâm nhập và gây hại cho mô dẫn sau 1 – 2 tuần nuôi cấy khi tế bào bắt đầu phân chia Để ngăn chặn hiện tượng này, việc lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn là rất quan trọng Ngoài ra, một số chất kháng sinh có thể được sử dụng để chống lại nhiễm khuẩn và nấm mốc, tuy nhiên, mô thực vật rất nhạy cảm với kháng sinh và có thể phản ứng theo kiểu di truyền Do đó, cần thận trọng khi sử dụng kháng sinh vì chúng có thể gây hại cho ti thể và lạp thể, ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.

2.7.3 Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds)

Trong nuôi cấy mô, hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu thường xảy ra do mẫu nuôi cấy chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol, như encomicaxit và tyramine, gây hóa nâu ở cây lan Cattleya Để phòng trừ hiện tượng này, có thể bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 0,1 - 0,3%, đặc biệt hiệu quả trên các loài phong lan như Phalenopsis, Cattleya và Aerides Tuy nhiên, cần lưu ý rằng than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác.

+ Bổ sung Poly Vinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt.

+ Sử dụng mô non gây vết thơng nhỏ nhất khi khử trùng.

+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và citric vài giờ trớc khi cÊy.

+ Nuôi cấy mẫu trong môi trờng lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần).

+ Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trờng tơi trong 1 - 2 tuÇn.

2.7.4 Hiện tợng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity)

Trong quá trình nhân nhanh in vitro, hiện tượng cây bị “thuỷ tinh hoá” thường xảy ra, biểu hiện qua việc cây có thân lá mọng nước, trong suốt và khó sống khi ra môi trường bên ngoài do mất nước mạnh Hiện tượng này thường gặp khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc ít agar với sự trao đổi khí thấp Cây bị thuỷ tinh hoá thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp và cấu trúc nhiều phân tử phân cực, dễ hấp thụ nước Ngoài ra, cây in vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng hình tròn và mở liên tục trong quá trình nuôi cấy, dẫn đến mất nước khi chuyển ra môi trường tự nhiên Để khắc phục hiện tượng thuỷ tinh hoá, có thể áp dụng một số giải pháp thích hợp.

+ Giảm sự hút nớc của cây bằng cách tăng nồng độ đờng hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao.

+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trờng.

+ Giảm sự sản sinh etylen trong bình nuôi cấy.

+ Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trởng.

+ Tăng cờng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [17].

2.8 Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô

Việc trồng lan không quá khó khăn, nhưng loài hoa này phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt Đối với cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù được gieo hạt hay nuôi cấy mô, nếu chúng ta xử lý sai ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình phát triển, hoặc không phù hợp với sinh lý và sinh thái của chúng, có thể dẫn đến tình trạng chết hàng loạt, chậm lớn, chậm ra hoa, hoặc thậm chí không ra hoa.

Cây lan được nhân nhanh qua phương pháp in-vitro sẽ được đưa ra vườn ươm, đánh dấu giai đoạn chuyển đổi từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống tự dưỡng Để cây con phát triển tốt nhất, cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp.

2.8.1 Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra Đây là thời điểm mà ngời ta thờng ít chú ý Nhng nếu không làm cẩn thận, nó có thể ảnh hởng xấu đến việc phát triển của cây con sau này.

Khi lấy cây con ra, cần thực hiện một cách nhẹ nhàng để tránh làm dập lá và gãy rễ, đặc biệt là trong quá trình rửa sạch thạch dinh dưỡng bám vào rễ Các giống Vanda với rễ to và cây cứng sẽ dễ dàng hơn trong việc làm sạch thạch so với những giống cây mảnh mai như Cymbidium và Dendrobium Đối với rễ của Cymbidium trong ống nghiệm, do có lông bám chắc vào thạch dinh dưỡng và rễ thường đan xen, nên cần phải tỉ mỉ và cẩn thận trong việc rửa sạch thạch và tách rễ.

2 8 riêng từng cây và loại bỏ những mô callus còn sót nếu không cây sẽ bị nhiễm khuẩn khi đa ra ơm trong vờn [20].

Sau khi rửa sạch cây, hãy ngâm cây con trong nước sạch pha loãng với một ít thuốc trừ nấm và thuốc sát khuẩn (khoảng 1g/lít) để bảo vệ cây khỏi nấm hại, đặc biệt khi cây còn yếu ớt.

2.8.2 Giai đoạn ở trong chậu chung

Giai đoạn ở trong chậu chung là giai đoạn khó khăn và quan trọng nhất trong việc trồng cây lan con, theo Rebecca Tyson Northen, một chuyên gia trồng lan nổi tiếng người Mỹ, trong cuốn "Home Orchid."

Growing” (1974) chỉ dẫn nh sau:

Lan con được lấy từ ống nghiệm và cho vào dung dịch sát khuẩn, sau đó dùng kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung Chất liệu trồng bao gồm ba phần vỏ thông xay nhuyễn và một phần cát, hoặc tám phần Osmunda xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn Tất cả các chất liệu này đều được luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng.

Pha loãng dung dịch phân bón bằng cách sử dụng một phần t muỗng cà phê phân bón với một ga-lông nước (4,5 lít) và phun ngay vào cây sau khi trồng Thời gian hiệu quả của dung dịch này kéo dài trong một năm.

Water Richter, một chuyên gia nổi tiếng trong lĩnh vực trồng lan người Đức, đã chia sẻ trong cuốn sách "Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten" rằng để trồng cây từ ống nghiệm, cần chuẩn bị chất nuôi cây với tỷ lệ bằng nhau giữa than bùn, than củi và cát Hạt giống nên có kích thước nhỏ và độ ẩm cần duy trì ở mức bình thường Đồ đựng cây cũng cần được chú ý để đảm bảo sự phát triển tốt nhất cho cây.

K9 – Khoa Công nghệ sinh học chậu đất hoặc đĩa, 1/3 phía dới ngời ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để khoảng cách từ 2-3 cm.

Giai đoạn ở trong chậu chung là bước đầu tiên quan trọng trong quá trình phát triển của cây lan Thời gian ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế độ che sáng cũng cần được điều chỉnh phù hợp, thường tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây Để đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con, cần đảm bảo cây đạt được các tiêu chuẩn cần thiết.

-Giả banh và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nớc nh khi mới lấy ở ống nghiệm ra.

-Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên xanh đậm rất đẹp.

Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản

2.9.1 Kĩ thuật trồng cây con vào chậu

Trớc khi trồng cần chuẩn bị:

+ Chậu đã đợc rửa sạch.

Giá thể cần được rửa sạch và khử trùng theo công thức phù hợp Đối với các chất liệu như than củi, vỏ cây, và rễ cây dương xỉ, cần chặt nhỏ kích thước khoảng 2-5 mm Xơ dừa nên được xé tơi và cắt thành đoạn khoảng một đốt ngón tay, sau đó ngâm kỹ trong một tuần, rửa sạch, luộc kỹ và rửa lại nhiều lần để loại bỏ chất chát Cuối cùng, xơ dừa cần được phơi khô hoàn toàn và nên chọn xơ dừa già để đảm bảo độ bền lâu mục.

Để đảm bảo thoát nước và thông thoáng bộ rễ, hãy chọn những cục than to hoặc đá, mảnh sành kích thước khoảng 2-3 cm và đặt vào đáy chậu, chiếm khoảng 1/3 dung tích Tiếp theo, trải một lớp giá thể mỏng lên trên và trồng cây con, giữ cho cây đứng thẳng Khi thêm giá thể, cần chú ý đặt nhẹ nhàng để rễ

Khi mới trồng cây vào chậu, cần tránh làm lung lay cây để rễ có thể bám chắc vào xơ dừa và than Nếu gặp thời tiết quá mạnh, cây có thể bị đổ, nghiêng ngả và đầu rễ sẽ bị tổn hại.

Việc chuyển chậu cũng cần đợc chuẩn bị thật tốt nh khi trồng cây con vào chậu nhỏ.

VÒ chËu: cÇn cã kÝch thíc lín Ýt nhÊt gÊp 2,5 lÇn chËu con.

Về giá thể: Đợc khử trùng là tốt nhất Một số loại nh vỏ cây, vỏ dừa kích thớc cần lớn hơn khoảng 5-10 mm.

Khi chuyển chậu cho cây, hãy sử dụng một chậu nhựa lớn và sạch Pha nước với thuốc diệt trùng và diệt nấm theo tỉ lệ 1/1000, sau đó đổ nước vào chậu sao cho mức nước ngang với chiều cao của chậu con Xếp các chậu con vào chậu nước thuốc sát trùng và để ngâm trong khoảng 10-15 phút để tiêu diệt hoàn toàn rệp cây và giá con có thể bò ra từ các chậu.

Khảng 15 phút sau rễ cây bám vào thành chậu đã bong ra hết, ta nhẹ nhàng cầm cây sát gốc rút nhẹ lên, bộ rễ và giá thể sẽ long lên toàn bộ cả cụm, đem rửa sạch bộ rễ Để cây dới ánh nắng tán xạ khoảng 20 phút sau đó đem trồng.

Ta đặt cụm cây đó vào giữa chậu lớn, một tay giữ cây, một tay cho giá thể vào tới sát miệng chậu Kỹ thuật tới nớc cho c©y

Tới nớc cho cây phải căn cứ trên hai nguyên tắc:

- Nhu cầu về nớc của cây mình trồng dựa trên sinh lý, sinh thái cụ thể của chúng.

Tình hình khí hậu hàng tuần và hàng tháng tại khu vực trồng lan rất quan trọng, bao gồm cả khí hậu vùng và điều kiện khí hậu trong vườn lan Việc theo dõi thường xuyên giúp người trồng nắm bắt được sự biến đổi của thời tiết, từ đó điều chỉnh phương pháp chăm sóc cây lan cho phù hợp Khí hậu ổn định và phù hợp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và ra hoa của cây lan, đảm bảo năng suất và chất lượng sản phẩm.

Khi tới, cần hết sức nhẹ nhàng, tránh làm cây bị long gốc, rễ khó bám vào giá thể và thành chậu, nên tới phun mù là tèt nhÊt.

2.9.3 Níc tíi cho lan Đối với lan con, nớc tới phải thật sạch, nớc giếng, nớc ma là tốt nhất Đối với những nơi có hệ thống cống rãnh ngầm, bể phân tự hoại, ta không nên dùng nớc giếng Vùng có nhiều đá vôi, nớc giếng cũng không tốt cho lan Cũng không nên dùng n- ớc ma đầu mùa, vì trong không khí và nhất là mái nhà, máng cha đợc rửa sạch, bản thân nớc ma trong thời gian đầu cũng chứa nhiều bụi và vi khuẩn [15].

Nước máy rất tốt cho sức khỏe, nhưng do chứa hóa chất sát trùng, nên khuyến cáo nên để nước trong bể chứa ít nhất 24 giờ để các hóa chất như Cl2 bay hơi hoàn toàn Trong tự nhiên, pH của nước thường dao động từ 4 đến 9 Nếu nước có pH cao, có thể sử dụng axit oxalic, axit nitric 10% hoặc axit citric để điều chỉnh độ pH, với pH khoảng 5 được coi là lý tưởng cho nước.

2.9.4 Kü thuËt thóc mÇm c©y Đợc thực hiện vào mùa xuân sẽ cho hiệu quả cao hơn nếu thực hiện vào mùa thu Chọn những cây khỏe mạnh để thúc mầm Có thể thực hiện một trong hai biện pháp sau:

Biện pháp cơ giới trong việc tách nhánh ép mầm là một kỹ thuật hiệu quả nhằm thúc đẩy sự phát sinh của mầm mới Nghiên cứu cho thấy, việc tách 2 nhánh hoặc cụm sẽ mang lại kết quả tốt, giúp tăng cường sự phát triển của cây trồng.

Biện pháp hóa học là phương pháp sử dụng chất kích thích như BAP để thúc đẩy sự phát triển của cây Cụ thể, BAP có thể được thấm vào bông và đắp lên giả hành hoặc chọc nhỏ trực tiếp vào đỉnh sinh trưởng Quá trình này nên được thực hiện từ 3 đến 4 lần, mỗi lần cách nhau một tuần để đạt hiệu quả tối ưu trong việc kích thích sự phát triển.

Aspirin, KH2PO4, H3BO3 với nồng độ 1/1000 tới cho cây khoảng cách 2 lần/tuần.

2.9.5 Phòng trừ bệnh cho cây

Khi trồng cây lan con từ ống nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta đã loại bỏ được những bệnh nguy hiểm nhất, đặc biệt là các bệnh do virus.

Để đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh của lan con, cần sử dụng nước sạch và tạo môi trường riêng biệt, sạch sẽ để tránh lây nhiễm bệnh từ lan lớn hoặc cây khác Đặc biệt, để phòng ngừa các bệnh do nấm, nên áp dụng chế độ phun thuốc phòng bệnh nấm định kỳ mỗi tháng.

Trên giàn lan, khi phát hiện triệu chứng của sâu như sâu đo, sâu róm, sâu khoang, rệp dính, dòi đục lá, bọ xít, muỗi và rệp, cần sử dụng thuốc trừ sâu thông thường với liều lượng thấp hơn một chút Nên phun thuốc định kỳ mỗi 2 tháng để tiêu diệt các loại sâu và rệp hại lan Bên cạnh các bệnh do nấm, vi khuẩn và sâu, cũng cần chú ý đến các côn trùng khác như cuốn chiếu, giun, gián (ăn rễ lan), dế và đặc biệt là các loại ốc sên.

Cũng nên nhắc lại là khi lan đang bị bệnh (do nấm hoặc vi khuẩn) tuyệt đối không cung cấp các chất dinh dỡng cho c©y.

Phần 3: vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 27 1 vật liệu

Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến sự nảy mầm của hạt:

- CT1( Đ/C): VW + 100 ml/ lít nớc dừa + 10g/ lít đờng + 1g/ lÝt pepton + 0,65% agar.

3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định môi trờng khởi động thích hợp cho sự phát sinh hình thái của lát cắt

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng ở các nồng độ khác nhau:

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng

- CT1 ( Đ/C): Môi trờng MS + 2% đờng + 0,65 % agar.

3.2.3 Thí nghiệm 3 : Nghiên cứu ảnh hởng của kinetin và BA tới quá trình nhân nhanh thể protocorm

3.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hởng của Kinetin đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorcorm:

- ( Đ/C): Môi trờng MS + 2% đờng + 0,65 % agar.

3.2.4.2 Nghiên cứu ảnh hởng của BA đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorm

- ( Đ/C): Môi trờng MS + 2% đờng + 0,65 % agar.

3.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa( ND) đến hệ số nhân, chất lợng của chồi:

- CT1( Đ/C): Môi trờng MS + 2% đờng + 0,65 % agar.

3.2.5 Thí nghiệm 5 : ảnh hởng của than hoạt tính và

 -NAA đối với sự ra rễ của cây

3.2.5.1 Nghiên cứu ảnh hởng của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây

- CT1( Đ/C): Môi trờng MS+ 2% đờng+ 0,65 % agar.

3.2.5.2 Nghiên cứu ảnh hởng của -NAA đối với sự ra rễ của c©y

- CT1( Đ/C): Môi trờng MS+ 2% đờng+ 0,65 % agar.

3.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vờn ơm

- CT1: Dớn+xơ dừa (1:1): không xử lý

- CT2: Dớn+ xơ dừa (1:1): có xử lý.

3.2.7 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hởng chế độ che đối với cây ra vờn ơm

- CT1: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và có che.

- CT2: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che.

- CT3: Dớn + xơ dứa (1:1 : có xử lý và có che.

- CT4: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che.

3.2.8 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hởng của dinh d- ỡng đến sự sinh trởng và phát triển của cây

- Đối chứng: Phân bón chuyên dụng cho lan của Trung Quốc

- CT1: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 ).

- CT2: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 ).

- CT3: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 )+ vitamin+ vi lợng.

- CT4: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 )+ vitamin+ vi lợng.

3.3.1 Cách bố trí thí nghiệm

+ Thí nghiệm trong phòng: Đợc bố trí tại phòng Công nghệ Sinh học- Viện Sinh học Nông nghiệp, Trờng Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội

- Số giờ chiếu sáng: 16- 18/ 24 giờ.

- Cờng độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux.

- Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy: 25- 27 0 C.

- ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 70%.

+ Thí nghiệm vờn ơm: Đơc bố trí trong điều kiện ánh sáng tán xạ và cây đợc tới dới dạng phun sơng

- Toàn bộ thí nghiệm trong phòng và ngoài vờn ơm đều đợc bố trí ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, số cá thể/ lần lặp lại là 15- 20 cá thể.

- Số mẫu cấy ở mỗi lần lặp lại là: 5 mẫu cấy trên một lần lặp lại Đánh giá thí nghiệm sau 8 tuần theo dõi

- Số cây đợc trồng trên mỗi giá thể là 5 cây trên một lần lặp lại

3.3.2 Phơng pháp tiến hành Để thu đợc kết quả chúng tôi tiến hành làm ở các công thức thí nghiệm nh sau:

Mẫu thí nghiệm là quả địa lan được lấy từ vườn lan Hoàng Liên, cần đảm bảo sạch bệnh và đáp ứng đầy đủ yêu cầu Sau khi chọn lựa, mẫu được rửa sạch bằng nước máy và nước xà phòng, sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng để tránh nhiễm hóa chất Cuối cùng, hạt được gieo trên các môi trường với nồng độ khoai tây khác nhau.

3.3.2.2 Cắt lớp mỏng tế bào

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các thể protocorm đồng nhất làm vật liệu Các thể protocorm được cắt thành lát mỏng có kích thước 0,3-0,5 mm dưới kính hiển vi bằng dao vô trùng Sau đó, các lát mỏng này được cấy vào môi trường MS bổ sung 2% đường, 0,68% agar và kinetin.

3.3.2.3 Tìm hiểu hệ số nhân của thể protocorm Để tìm hiểu tác động của chất điều tiết sinh trởng, môi trờng đến hệ số nhân của thể protocorm Chúng tôi đã tách các protocorm từ một cụm tơng đối đồng đều nhau để cấy trên cùng một nền môi trờng MS có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trởng( BA, kinetin ) ở các nồng độ khác nhau

1 Tỷ lệ sống (%) mÉu sèng mÉu cÊy ban ®Çu x 100

2 Tỷ lệ tạo chồi (%) chồi tạo ra thể protocorm tạo ra x 100

3 Tỷ lệ tạo protocorm (%) =mẫu tạo protcorm mÉu sèng x 100

4 (%) số protocorm/lát cắt Mẫu tạo protcorm

3.3.2.4 Quá trính tạo rễ Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã dùng dao vô trùng tách các chồi có chiều cao từ 5,5- 6,5 cm từ một cụm chồi. Sau đó cắt bỏ hết các phần ở rễ cây Cấy chồi đó trên môi trờng có bổ sung thêm các chất kích thích quá trình tạo rễ(than hoạt tính, α – NAA)

3.3.2.5 Phơng pháp xử lý giá thể, cách che sáng

Xơ dừa và dớn được ngâm theo tỷ lệ 1:1 trong 2-3 ngày, sau đó rửa sạch Tiếp theo, phối trộn với dung dịch thuốc nấm khuẩn và thuốc trừ sâu Deterex cùng với dinh dưỡng chuyên dùng cho lan của Trung Quốc (20:20:20), ngâm trong 1 ngày 1 đêm Sau khi vớt ra, để ráo nước đến độ ẩm khoảng 8% và giữ cho cây không tiếp xúc với nước trong 3-4 tuần Để bảo vệ cây, che sáng bằng giấy mỏng nhằm giảm ánh sáng và hạn chế bốc hơi nước trong khoảng thời gian này.

Các chỉ tiêu theo dõi:

5 Hệ số nhân = mẫu thu đ ợc mÉu cÊy ban ®Çu

8 Độ dài rễ trung bình chiều dài rễ sè rÔ

7 Sè rÔ trung b×nh/c©y sè rÔ sè c©y

6 Tỷ lệ ra rễ (%) c©y ra rÔ c©y ban ®Çu x 100 ảnh 1: Quả địa lan hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides)

Phần 4: Kết quả và thảo luận 33 1 Tạo nguồn vật liệu vô trùng

Nghiên cứu nhân nhanh bằng phơng pháp cát lát mỏng-3536 4.3 Nghiên cứu ảnh hởng nhóm Cytokinin đến quả trình nhân

Cắt lát mỏng tế bào là phương pháp hiệu quả trong nhân giống vô tính in-vitro Chúng tôi áp dụng kỹ thuật này cho giống Hồng Hoàng nhằm nhân nhanh giống quý với chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.

Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước lát mỏng đến quá trình phát sinh hình thái lát cắt, đặc biệt là trên cây phong lan và địa lan thương mại tại Viện Sinh học Nông nghiệp - ĐHNNI Tất cả đều cho thấy kích thước lát mỏng tối ưu cho quá trình này là từ 0,3 – 0,5 mm Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng kích thước lát cắt 0,3 – 0,5 mm để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin.

Nghiên cứu này tập trung vào khả năng phát sinh hình thái lát cắt từ protocorm sạch bệnh, được cắt ngang và cấy vào môi trường MS bổ sung 2% đường và 0,65% agar Các chất điều tiết sinh trưởng như BA và kinetin được thêm vào với các nồng độ khác nhau, với kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 2.

Bảng 2 ảnh hởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ mẫu thành thểhình protocorm(

Tỷ lệ mẫu tạo chồi(%)

Hệ số nhân protocorm/lát(số máng)

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 công thức

Hệ số nhân Đồ thị 1: ảnh h ởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt

4.4 Nghiên cứu ảnh hởng nhóm Cytokinin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm trên giống hồng hoàng

Bảng 3 ảnh hởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy)

Chỉ tiêu theo dõi Công thức

Tỷ lệ protocorm thành(%)hình

Tỷ lệ chồi thành (%)hình

Hệ số protocorm/nh©n lát mỏng

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 ảnh 3: ảnh h ởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt

(sau 8 tuần nuôi cấy) ảnh 2: ảnh h ởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7

Kết quả từ bảng 2 và 3 chỉ ra rằng việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng, với tỷ lệ mẫu tạo protocorm cao hơn so với nhóm đối chứng.

Khi bổ sung BA với nồng độ từ 0,3 đến 3,0 ppm trong môi trường MS chứa 2% đường và 0,65% agar, tỷ lệ protocorm cao nhất đạt được khi bổ sung 1,0 ppm BA Từ nồng độ này trở đi, tỷ lệ protocorm giảm dần, cho thấy BA không chỉ ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ hình thành protocorm mà còn quy định khả năng tạo protocorm của mỗi lát cắt Số lượng lát cắt hình thành protocorm tỷ lệ thuận với số protocorm được tạo ra, tuy nhiên, nếu vượt quá giới hạn nồng độ, hiệu quả sẽ giảm.

K9 – Khoa Công nghệ sinh học độ nhất định thì BA lại là tác nhân kìm hãm khả năng hình thành thể protocorm

Khi bổ sung 0,3 – 1,0 kinetin, tỷ lệ lát cắt hình thành thể protocorm tăng từ 2,62 đến 6,26 lần, với đường biểu tác động của kinetin có dạng đường cong một đỉnh Ở nồng độ 1,0 kinetin, số protocorm trên lát cắt đạt giá trị cực đại, trong khi các nồng độ cao hơn sẽ giảm dần nhưng vẫn cao hơn so với đối chứng Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái của mẫu ban đầu là.

MS + 15% ND + 2% đờng + 1,0 ppm BA (1,0 ppm kinetin) + 0,65% agar

4.3 Nghiên cứu ảnh hởng nhóm Cytokinin đến quả tr×nh nh©n nhanh thÓ protocorm

Giai đoạn này của thí nghiệm tập trung vào việc xác định môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh thể protocorm, quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ vi nhân giống Các protocorm cần phải đồng nhất, và các chồi tạo cây hoàn chỉnh phải có tỉ lệ sống cao, phát triển mạnh mẽ và ít biến dị.

Kinetin và BA, thuộc nhóm Cytokinin, có khả năng kích thích mạnh mẽ sự hình thành protocorm, làm cho chúng trở thành những hợp chất không thể thiếu trong quá trình nuôi cấy in-vitro Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc bổ sung các hợp chất này để đánh giá ảnh hưởng đến hệ số nhân giống của địa lan bản địa trong môi trường ống nghiệm.

5 0 kinetin, BA vào môi trờng nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Kết quả đợc trình bày ở bảng 4 và 5, đồ thị 3 và 4.

Bảng 4: ảnh hởng của BA đến quá trình nhân nhanh thÓ protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ protocorm thành(%)hình

Hệ số nh©n(lÇn) ĐC: MS + 2% đờng

CT4: §C+ 1,0ppm BA 35,40 64,60 1,72K9 – Khoa Công nghệ sinh học

Bảng 5: ảnh hởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thÓ protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ protocorm hình thành (%)

CT1: §C + 0,3ppm kinetin 21,90 78,10 1,28 Đồ thị 3: ả nh hởng của BA đến quá trình nhân

0 0.5 1 1.5 2 2.5 § /C CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7

CV (%) 3,10 Đồ thị 4: ảnh hởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh protocorm

0 0.5 1 1.5 2 2.5 § /C CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7

Hệ số nhân ảnh 5 cho thấy ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm sau 8 tuần nuôi cấy Hình ảnh minh họa cho thấy sự khác biệt giữa các công thức CT 1 đến CT 7 Tương tự, ảnh hưởng của BA cũng được đánh giá qua quá trình nhân nhanh thể protocorm sau 8 tuần, với các công thức CT 1 đến CT 7 thể hiện rõ sự biến đổi.

Kết quả từ bảng 4 và 5 chỉ ra rằng việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự hình thành protocorm và chồi.

Kết quả bảng 4 cho thấy việc bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng hệ số nhân so với đối chứng, với mức tăng từ 1,12 đến 2,35 lần và tỷ lệ thuận với nồng độ của BA.

Nồng độ BA từ 0,3 – 1,5 ppm làm giảm tỷ lệ mẫu hình thành chồi và chất lượng chồi Khi nồng độ BA tăng lên 2 ppm trở lên, xuất hiện các chồi nhỏ li ti biến dạng.

Chồi 5 4 không có khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh, do đó không được xem là chồi hữu hiệu và có chất lượng kém Việc tăng nồng độ là không cần thiết, vì BA chỉ làm tăng hệ số nhân thể protocorm nhưng lại kích thích sự phát triển của chồi nách.

Việc bổ sung kinetin cho thấy hiệu quả tương tự như BA, với nồng độ 1,5ppm đạt hệ số nhân cao nhất là 2,16 lần Sau đó, chỉ tiêu này giảm dần và thấp nhất ở công thức đối chứng với 1,20 lần Điều này cho phép xác định môi trường nhân nhanh protocorm.

MS + 2% đờng + 1,5ppm BA (1,5ppm kinetin) +0,65% agar

Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa lên hệ số nhân và chất l- ợng của chồi

và chất lợng của chồi

Nước dừa là một hợp chất tự nhiên được sử dụng trong nuôi cấy in-vitro từ năm 1949, với ứng dụng rộng rãi trong nhân nhanh các loại cây như phong lan và dứa Trong nước dừa chứa nhiều axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN và ADN, cùng với các hợp chất auxin và glucoxit cytokinin có hoạt tính Các thí nghiệm trong giai đoạn này tập trung vào việc tạo ra môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh, quyết định hiệu quả và tốc độ nhân giống Mục tiêu là đạt hệ số nhân nhanh cao, đảm bảo chất lượng chồi và tiết kiệm thời gian, chi phí Chúng tôi tách các cụm 2-3 chồi vào môi trường MS với 2% đường và 6,5g agar để tối ưu hóa quá trình này.

K9 – Khoa Công nghệ sinh học sau đó bổ sung nớc dừa ở các nồng độ khác nhau Sau 8 tuần theo dõi, kết quả thu đợc ở bảng 6, đồ thị 5

Bảng 6 ảnh hởng của nớc dừa đến hệ số nhân, chất lợng của chồi địa lan Hồng hoàng (sau 8 tuần theo dâi)

Nước dừa có ảnh hưởng đáng kể đến hệ số nhân và chất lượng của chồi Cụ thể, việc sử dụng nước dừa trong quá trình chăm sóc cây trồng giúp cải thiện hệ số nhân và nâng cao chất lượng chồi Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nước dừa không chỉ cung cấp dinh dưỡng mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chồi.

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7

+ : Trung bình (Chồi bé, lá xanh nhạt) ++: Khá (Chồi mảnh, lá xanh đậm) +++: Tốt (Chồi mập, lá xanh đậm)

Nước dừa có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của chồi, với tất cả các công thức bổ sung nước dừa đều cho hệ số nhân lớn hơn so với công thức đối chứng Đặc biệt, công thức CT4 với 15% nước dừa thể hiện kết quả nổi bật.

ND cho kết quả cao nhất với hệ số nhân (1,94) chiều cao (4,62 cm), số lá (3,58 lá).

Việc bổ sung nước dừa vào các công thức có thể nâng cao chất lượng chồi Tuy nhiên, nếu nồng độ nước dừa quá cao, hệ số nhân và chất lượng chồi sẽ bị giảm Do đó, mức bổ sung nước dừa tối ưu là khoảng 15% trong các môi trường để tăng cường hiệu quả nhân nhanh.

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Trong giai đoạn này, chúng tôi tiến hành tách các chồi riêng rẽ có kích thước từ 6,5 – 7,5 cm, mập và khỏe mạnh để nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung NAA và than hoạt tính với nồng độ khác nhau Mục tiêu là xác định môi trường thích hợp cho việc ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 7 và 8, cùng với đồ thị 6 và 7.

Bảng 7 ảnh hởng của than hoạt tính đến sự ra rễ cây địa lan Hoàng

CTTD Tỷ lệ ra rễ (%)

Sè rÔ Chiều dài rễ Đồ thị 6 ảnh h ởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

CT1 CT2 CT3 CT4 công thức sè rÔ chiều dài rễ

Bảng 8: ảnh hởng của α- NAA đến hình thành rễ cây địa lan

6 0 ảnh 7: ảnh h ởng của than hoạt tính đến sự hình thành rễ

CT 1 CT 2 CT3 CT4 ảnh 8: ảnh h ởng của - NAA đến sự hình thành rễ

MS +2% đờng + 0,3 ppm NAA (hoặc 1g THT) + 0,65% agar.

Các nghiên cứu ở giai đoạn sau nuôi cấy mô

Giai đoạn chuyển cây từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên là rất quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của quá trình vi nhân giống vào sản xuất thực tiễn Để đảm bảo tỷ lệ sống cao cho cây khi ra vườn, chúng tôi thực hiện xử lý giá thể và che sáng cho cây.

4.6.1 Nghiên cứu ảnh hởng của biện pháp xử lý giá thể đến sự sinh trởng phát triển của cây địa lan Hồng hoàng giai đoạn bồn mạ

Biện pháp xử lý giá thể được thực hiện bằng cách phối trộn xơ dừa và dớn theo tỷ lệ 1:1, ngâm trong 2-3 ngày và sau đó rửa sạch Tiếp theo, giá thể này được phối trộn với thuốc nấm khuẩn, thuốc trừ sâu, và dinh dưỡng chuyên dùng cho lan của Trung Quốc, ngâm trong 1 ngày 1 đêm Sau khi vớt ra, để giá thể ráo đến độ ẩm khoảng 8% trước khi tiến hành trồng Kết quả được trình bày trong bảng 9.

Kết quả từ bảng 9 cho thấy, giai đoạn vờm ơm cây địa lan in-vitro rất phù hợp với giá thể xơ dừa và dớn theo tỷ lệ 1:1 Giá thể K9 – Khoa Công nghệ sinh học được bổ sung thuốc nấm, trừ sâu và dinh dưỡng, đã cho tỷ lệ sống sót lên đến 93,75% sau 8 tuần theo dõi Ngoài ra, độ tăng chiều cao và số lá của cây cũng cao hơn so với giá thể không được xử lý.

4.6.2 Nghiên cứu ảnh hởng của biện pháp che tối khi cây địa lan đa ra vờn ơm

Việc xử lý được thực hiện theo thí nghiệm 4.6.1 Sau khi trồng, cần phủ một lớp giấy mỏng lên lới che chung trong vườn ươm để giảm ánh sáng và hạn chế bốc hơi nước trong khoảng thời gian 3-4 tuần.

Lu ý trong khoảng thời gian này không tới bất kỳ loại nớc hay dinh dỡng nào Kết qủa thu đợc trình bày ở bảng 10, đồ thị

Bảng 10 ảnh hởng của biện pháp che tối khi cây địa lan Hồng hoàng đa ra vờn ơm

Số lá trung bìnhtrên cây(lá)

Số lá trungmíi bìnhtrên cây(lá) CT1: Xơ dừa + Dớn

(1:1) có xử lý, có che.

(1:1) có xử lý, không che.

Biện pháp che tối cho cây dưa trong vườn ươm có ảnh hưởng đáng kể đến chiều cao cây Đồ thị 8 cho thấy sự phát triển của cây dưa khi áp dụng các biện pháp che tối phù hợp Hình ảnh 9 minh họa cách thức che tối hiệu quả khi cây dưa được đưa ra ngoài vườn ươm, góp phần bảo vệ và thúc đẩy sự sinh trưởng của cây.

(1:1) không xử lý, không che.

Qua bảng 10 cho thấy: giá thể đợc xử lý và có che Sau

Trong nghiên cứu về tỷ lệ sống của địa lan, công thức có che và có xử lý đạt tỷ lệ sống cao nhất là 96,77%, trong khi công thức không xử lý nhưng có che có tỷ lệ sống thấp nhất Việc đa cây từ in-vitro ra vườn ươm với ánh sáng che sáng là rất tốt, nhưng cần sử dụng giá thể đã qua xử lý thuốc trừ sâu và dinh dưỡng để cây phát triển thuận lợi Để tối ưu hóa sự sinh trưởng, vườn nuôi trồng địa lan nên giảm 40% ánh sáng trực xạ Kết quả này nhất quán với nghiên cứu của một số tác giả trước đây (Nguyễn Thịên Tịch , 1987).

4.6.3 ảnh hởng của dinh dỡng khác nhau đến sự sinh trởng

Phát triển của cây địa lan phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó giá thể trồng và việc bổ sung dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng Nghiên cứu tỉ lệ đạm, lân, kali, vitamin và vi lượng phù hợp cho việc bổ sung thường xuyên là cần thiết Chúng tôi đã bố trí các loại dinh dưỡng khác nhau để đánh giá hiệu quả, và kết quả được trình bày trong bảng 11 và đồ thị 9.

Bảng 11: ảnh hởng của dinh dỡng đến khả năng sinh tr- ởng và phát triển của cây địa lan Hồng hoàng (sau 8 tuÇn theo dâi)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

CT1: Phân chuyên dụng cho lan của

K9 – Khoa Công nghệ sinh học ảnh 10: ảnh h ởng của dinh d ỡng tới sự sinh tr ởng và phát triển của cây địa lan ngoài v ờn ơm

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5

Bảng 11 cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các công thức phân bón, trong đó công thức 30:10:10 kết hợp với vitamin và vi lượng của môi trường MS mang lại hiệu quả tốt nhất Kết quả được thể hiện qua các chỉ tiêu như chiều cao cây, số lá, chiều dài lá và chiều rộng lá Ngược lại, công thức 20:20:20 cho kết quả kém nhất, cho thấy tầm quan trọng của việc lựa chọn công thức phân bón phù hợp trong giai đoạn đầu phát triển của cây.

Trong giai đoạn sinh trưởng phát triển nhanh, việc cung cấp phân bón có hàm lượng đạm cao cho cây địa lan là rất quan trọng Điều này nhấn mạnh sự cần thiết của nguồn dinh dưỡng giàu nitơ (N) cho sự phát triển của cây.

5 Phần 5 kết luận và kiến nghị

Từ kết quả thu đợc chúng tôi rút ra kết luận:

1 Môi trờng thích hợp để gieo hạt địa lan Hồng hoàng là

Việc sử dụng môi trường gieo hạt với công thức VW bao gồm 100ml ND, 10g đường saccaroza, 1g peptôn, 65g agar và 50g khoai tây trên mỗi lít đã cho thấy tác động tích cực đến sự nảy mầm của hạt Lượng khoai tây bổ sung thích hợp trong môi trường này là 50g/lít.

2 Phơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có hiệu quả rất cao đối với việc nhân nhanh Bằng phơng pháp này có tác dụng thúc đẩy mạnh mẽ sự phát sinh thể protocorm có thể thu đợc

Sau 8 tuần nuôi cấy, protocorm đạt kích thước từ 27 đến 30 mm Môi trường nuôi cấy lớp mỏng thích hợp được xác định là MS kết hợp với 1ppm kinetin (hoặc 0,5ppm BA), 2% đường sacaroza và 0,65% agar.

3 Môi trờng thích hợp để nhân nhanh thể protocorm là:

MS + 2% đờng saccaroza +1,5ppm BA (hoặc 1,5ppm K) + 0,65% agar hệ số nhân đạt cao nhất 2,12( kinetin ) và 2,35(BA).

4 Nồng độ nớc dừa có hiệu quả cao trong việc nhân nhanh, bằng phơng pháp này ND có tác dụng làm tăng số lợng, chất lợng chồi nuôi cấy Môi trờng thích hợp cho nhân

K9 – Khoa Công nghệ sinh học nhanh: MS +15%ND + 2% đờng saccaroza + 0,65 % agar

5 Môi trờng thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh là: MS + 2% đờng saccaroza + 0,3ppm NAA (hoặc 1,0g than hoạt tính)+ 0,65% agar Trên môi trờng này sau 20 ngày nuôi cấy 100% số cây ra rễ, số rễ trên cây đạt 1,89 và 2,56.

Đề nghị

- Nghiên cứu, tìm hiểu khi tổ hợp một số loại phytohoomon trong giai đoạn nhân nhanh có khác so với dùng riêng hay không.

- Theo dõi sự sinh trởng, phát triển của cây trên nền giá thể khác nhau.

- Cho sử dụng các kỹ thuật đã đợc xác định trên vào việc xây dựng quy trình nhân nhanh địa lan Hồng hoàng.

- Tiếp tục nghiên cứu tối u hoá các khâu đã xác định ban ®Çu

1 Nguyễn Tiến Bân (1990), Các cây họ kín (Magnolioplyta) ở Việt Nam Tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái và tài nguyên, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 34-41.

2 Võ Văn Chi – Lê Khả Kế (1969), Cây cỏ thờng thấy ở Việt Nam, NXB Khoa Học, tr 57-80.

3 Võ Văn Chi – Dơng Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật – Thực vật bậc cao, NXB Đại học và THCN, tr 38.

4 Nguyễn Văn Chơng, Trịnh Văn Thịnh (1991), Từ điển Bách Khoa Nông Nghiệp, Trung tâm quốc gia biên soạn Từ điển Bách khoa Việt Nam, Hà Nội, tr 67-69

5 Dự án đầu t, phát triển hoa cây và cây kiểng tại TP HCM, 14-7-2005, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn TPHCM

6 Dự án xây dựng khu Nông-lâm nghiệp, công nghệ cao tại Trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng, 5-2003, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn TP Hải Phòng.

7 Vũ Hài, Trần Quý Hiển (2001), Nghề làm vờn, NXB Giáo Dôc.

8 Phạm Hoàng Hộ (1973), cỏ cây miền Nam, quyển 1,2, Bộ giáo duc – Trung tâm dợc liệu, tr 195

9 Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây Cỏ Việt Nam, quyển 3, NXB Trẻ, tr 918.

10 Trần Hợp (1990), Phong Lan Việt Nam, tập 1-2, NXB Khoa học và Kĩ Thuật, tr 68-72.

11 Nguyễn Hữu Huy - Phan Ngọc Cấp (1995), Mấy nét về cội nguồn phong lan, Đặc sản quý của các nớc nhiệt đới, Việt Nam hơng sắc, số 1, tr 15-16.

12 Phạm Thúc Huân (1989), Hoa lan cây cảnh và vấn đề

13 GS-TS Trần Văn Mão (2001), TS Nguyễn Thế Nhã, Phòng trừ sâu bệnh loại cây cảnh, NXB Nông nghiệp.

14 Nguyễn Công Nghiệp (1995), Trồng hoa lan, NXB TPHCM.

15 Phạm Thị Liên (2001), Nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan ở miền Bắc Việt Nam, luận án tiến sĩ nông nghiệp.

16 Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Nguyễn Thị Kim Lý, Đoàn Duy Thanh (2001), Kỹ Thuật trồng hoa, NXB Hà Nội.

17 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phơng Thảo (2004), giáo trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, tr 49-50, tr 54-55.

18 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Báo cáo thống kê đề tài nhánh, Viện sinh học Nông ngiệp - Đại học Nông nghiệp I.

19 Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sỹ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân (1998), Kỹ thuật trồng hoa lan, tr 216.

20 Vũ Văn Yến, Trồng lan trong ống nghiệm (1987), NXB TPHCM.

21 Nguyễn Khánh Vân, Nguyễn Thị Hiền, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, Các biểu đồ Việt Nam.

23 Koopowitz,-H (1986), “Effect of Biostimin on growth of meristematic tissue and protocom formation of some orchids in in vitro culture” American – Orchid – Society – Bulltin 55: N 0 167, p.273-287.

24 Mau, - RFL (1983), “Development of the orchid weevil,

25 Nesbitt,-LT, nesbitt,-MK (1985), “Terrestrial orchids, their culture” Austrilian – Plants.13:105, p.219-223.

26 Pais,-MS; Barroso,-J; Fevereiro,- P; Oliveira,-M (1983),

“Intergeneric fusion of terrestrial orchid protoplast induced by different fussion promoting agents Protoplasts” Poster proceedings: p.74-75.

27 Tisserat,-B; Vandercook,-CE (1986), “Computerized long – term tissue culture for orchids” American- Orchid- Society- Bulletin 51:2, p.185-198.

28 Valmayor, -H.L (1989), Growing dendrobiums for cutflower production, Los Banos, Laguna (Phillipines) PCARRD.

1.2 Mục đích yêu cầu đề tài -2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài -2

2 Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Sơ lợc về cây hoa lan -3

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thực vật -3

2.1.2 Đặc tính thực vật học của địa lan -4

2.1.3 Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa -7

2.1.4 Yêu cầu về ngoại cảnh của cây lan -7

2.2 Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nớc -11

2.2.1 Tình hình sản xuất hoa trên thế giới -11

2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam -12

2.3 Các nghiên cứu về nhân giống địa lan bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào -13

2.3.1 Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào -13

2.3.2 Một số nghiên cứu tiêu biểu -14

2.4 Phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào (Thin cell layers - TCL)- -15 2.4.1 Khái niệm: -15

2.4.2 Một số nghiên cứu về phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào- 15 2.5 Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl) -16

2.5.1 Phơng pháp TCL kinh điển -16

2.5.2 Phơng pháp TCL cải tiến -16

2.6 Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào -17

2.7 Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro -18

2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)- 18 2.7.2 Sù nhiÔm mÉu (explantcontamination) -19

2.8 Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô -20

2.8.1 Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra -21

2.8.2 Giai đoạn ở trong chậu chung -21

2.8.3 Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ -22

2.8.4 Giai đoạn thay chậu nhỏ và trồng vào chậu lớn -23

2.9 Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản -23

2.9.1 Kĩ thuật trồng cây con vào chậu -23

2.9.5 Phòng trừ bệnh cho cây -26

3 Phần 3: vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 27 3.1 vật liệu -27

3.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến sự nảy mầm của hạt: -27

3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định môi trờng khởi động thích hợp cho sự phát sinh hình thái của lát cắt -27

3.2.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hởng của kinetin và BA tới quá trình nhân nhanh thể protocorm. -28

3.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa( ND) đến hệ số nhân, chất lợng của chồi: -29

3.2.5 Thí nghiệm 5: ảnh hởng của than hoạt tính và  -NAA đối với sự ra rễ của cây. -29

3.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vờn ơm -30

3.2.7 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hởng chế độ che đối với cây ra vờn ơm. -30

3.2.8 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hởng của dinh dỡng đến sự sinh trởng và phát triển của cây -30

Tiêu đề	Nghiên Cứu Nhân Nhanh Giống Địa Lan Hồng Hoàng Sapa (Cymbidium Iridioides) Bằng Phương Pháp Nuôi Cấy Mô Tế Bào
Tác giả	Nguyễn Văn Thịnh
Trường học	Khoa Công nghệ sinh học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp

Định dạng
Số trang	75
Dung lượng	14,13 MB