Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan hồng hoàng sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh Phần 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Cùng với phát triển kinh tế Nghề trồng hoa cảnh đà đem lại hiệu kinh tế cao, góp phần chuyển dịch cấu kinh tế nông nghiệp Sản xuất hoa lan mang lại nhiều lợi nhuận giá trị kinh tế thẩm mỹ Nó đà thực trở thành sản phẩm chiếm u thị trờng, thúc đẩy sản xuất kinh doanh đặc biệt c¸c níc nh Th¸i Lan, Singapo, Malaixia ë Th¸i Lan, kim ngạch xuất hoa lan cắt cành năm 1991 đạt 30 triệu USD, Singapore năm thu lợi nhuận từ lan cắt cành 10 triệu USD Kim ngạch xuất hoa lan giới hàng năm đạt 1,8 tû USD [13] ViƯt Nam lµ mét qc gia cã hƯ thèng rõng víi ®é che phđ lín, khÝ hậu nhiệt đới ẩm gió mùa phù hợp nhu cầu sinh thái loài lan Mặt khác nớc ta nằm trung tâm khởi nguồn nhiều loài lan quý, có tiềm to lớn nguồn dại quỹ gen phong phú Các vùng nh Sapa, cao nguyên Mộc Châu, Ba Vì, Đà Lạt thích hợp cho phát triển nhiều loài lan phục vụ công tác chọn tạo giống trồng Tuy nhiên gặp khó khăn thiên tai diễn biến bất thờng, nạn khai thác rừng tràn lan, nhiều loài lan quý có nguy tuyệt chủng, hệ sinh thái tài nguyên ngày cạn kiệt Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) số lợng nhng với vẻ đẹp tự nhiên loài có hoa tự dài nhất, hoa to bền, màu sắc nâu tím, cánh môi vàng sẫm, số lợng hoa chùm lên tới 15,5 hoa, đà thực thu hút ngời tiêu dùng nớc Nhng khả đậu K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh tự nhiên lại thấp Việc nghiên cứu tìm nhân giống in - vitro cho loài địa lan cha đợc nghiên cứu đầy đủ Để khôi phục phát triển lan địa nhằm bảo tồn nguồn gen phục vụ cho lai tạo lan rừng tơng lai, tạo nhiều loài đặc hữu Việt Nam vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu giải Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, triển khai nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) phơng pháp nuôi cấy mô tế bào 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích Xác định đợc số khâu kỹ thuật quy trình nhân giống địa lan địa, sở xây dựng kỹ thuật trồng nhân giống công nghệ nhân nhanh giống địa lan địa Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides) 1.2.2 Yêu cầu đề tài Giai đoạn nhân nhanh in - vitro - Nghiên cứu việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến nảy mầm hạt - Nghiên cứu nhân nhanh phơng pháp cắt lát mỏng - Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng - Nghiên cứu ảnh hởng nớc dừa đến chất lợng chồi Giai đoạn tạo hoàn chỉnh - Nghiên cứu ảnh hởng than hoạt tính đến trình rễ - Nghiên cứu ảnh hởng - NAA đến trình rễ Giai đoạn sau nu«i cÊy in vitro K9 – Khoa C«ng nghƯ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh - Nghiên cứu ảnh hởng xử lý giá thể giai đoạn vờn ơm - Nghiên cứu ảnh hởng biện pháp che tối đa vờn ơm - Nghiên cứu ảnh hởng số dinh dỡng đến sinh trởng phát triển giai đoạn vờn ơm K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lợc hoa lan 2.1.1 Nguồn gốc, vị trí hệ thống phân loại thực vật Cây hoa lan orchidaceae thuéc hä phong lan orchidaceae, bé lan orchidales, líp mầm Monocotyledoneae Cây lan đợc biết đến phơng Đông, theo Bretchacider từ đời vua Thần Nông (2800) trớc công nguyên, lan rừng đợc dùng làm thuốc chữa bệnh Sau với vẻ đẹp tác dụng chữa bệnh Robut Bron (1773 1858) ngời đà phân biệt rõ ràng họ lan họ khác [1, 2, 3, 4, 9, 10, 23] Joanlind (1979 – 1985) lµ ngêi đặt tảng đại cho môn học lan Năm 1836, ông công bố xếp tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tªn họ lan ông đa đựơc dùng ngày (Trần Hợp 1990) [10] Họ lan có mặt hầu hết vùng trái đất, nhng có khoảng 4/5 tập trung vùng nhiệt ®íi [20], nã ®øng thø hai sau hä cóc, kho¶ng 15000-35000 loài, phân bố từ 68 độ vĩ bắc 56 vĩ độ nam Tuy nhiên, phân bố họ vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt châu Mỹ Đông Nam (Mau RFL 1983) [23] Cây lan biết đến Trung Hoa kiến lan, Cymbidium ensifonymum loài bán địa lan châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục kỷ nhờ thuỷ thủ thời mà phong lan đà khắp miền địa cầu, lúc đầu Vanny sau K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh ®Õn B¹ch cËp, H¹c ®Ýnh råi kiÕn lan, lan chÝnh thức gia nhập vào ngành hoa cảnh giới 400 năm Việt Nam, có lẽ ngời khảo sát lan Việt Nam Gioalas Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào nha, ông đà mô tả lan Việt Nam lần vào năm 1789 Flora cochin chinensis gọi tên lan hành trình đến Nam phần Việt Nam aerides, phaius sarcopodium mà đà đợc Ben tham Hooker ghi lại “Genera plante rum” (1862 – 1883) (Ngun H÷u Huy, Phan Ngäc CÊp – 1995) [11], chØ sau ngêi Ph¸p đến Việt Nam có công trình nghiên cứu đợc công bố đáng kể F Gagne Pain A Gui Ilaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho nớc Đông Dơng thực vật Đông Dơng chí (Flora Genera Indochine) H Leconte chủ biên xuất từ năm 1932 1934 2.1.2 Đặc tính thực vật học địa lan Lan giống nh loại thực vật khác, có phận: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt theo tác giả Trần Hợp (1990) [10] lan đợc mô tả nh sau: 2.1.2.1 RƠ lan Nh×n chung, hä lan bao gồm thân thảo, sống lâu năm, sống đất, vách đá vôi sống phụ, sống hoại Đối với ®Þa lan sèng ë ®Êt, chóng thêng cã cđ giả, rễ mập, xum xuê phụ (bì sinh) rễ bò dài hay ngắn Chúng phát triển thân rễ nạc dài, ngắn mập hay mảnh mai (tuỳ thuộc vào loài) đa thể bò xa hay chụm lại thành bụi dày Hệ rễ nhỏ, đan thành búi, ngợc lại loài phong lan có kích K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh thớc lớn hay trung bình, hệ rƠ khÝ sinh ph¸t triĨn rÊt phong phó, mäc rÊt dài mập, khoẻ, vừa giữ cho thể khỏi bị gió làm lung lay làm nhiệm vụ hấp thu dinh dỡng số loài lan có thân, phát triển hệ rễ phát triển dày đặc kiêm nhiệm vai trò quang hợp Rễ có dạng dẹt, bò dài, màu xanh nh Đặc biệt loài phong lan sống hoại rễ có hình dạng, cấu trúc độc đáo, dài đến vài chục mét, có khảo leo bò cao 2.1.2.2 Thân Thân ngắn hay kéo dài, phân nhánh, mang hay không mang Theo M.E.Pfizer (1882) [10] phong lan có loại thân, mà đa số thuộc loại sinh trởng hợp trụ (nhóm không thân) Thân gồm hệ thống nhiều nhánh lâu năm, với phận nằm ngang, bò dải giá thể hay ẩn sâu lòng đất Ngợc lại, gặp loài phong lan sinh trởng đơn trục (nhóm có thân), thể khó có khả trì đợc t thẳng đứng, phải nhờ đến rễ chống đỡ để vơn cao, loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả Đó phận dự trữ nớc chất dinh dỡng để nuôi hoàn cảnh khô hạn sống bán cao Đa số củ giả có màu xanh bóng, nên với làm nhiệm vụ quang hợp 2.1.2.3 Lá lan Có thể phân lan thành loại: đứng, nửa đứng, cong rũ Hầu hết loại địa lan tự dỡng, xơng chế tạo chất dinh dỡng quang hợp, phát triển đầy đủ hệ thống Lá mọc đơn độc, xếp K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh dày đặc gốc, hay xếp cách đề đặn thân, củ giả Hình dáng thay đổi từ loại mọng nớc, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn hay có rÃnh, đến loại hình phiến mỏng, dài, dới sát gốc thờng tiêu giảm bẹ phiến hay giảm hẳn thành vảy Các loài địa lan có số nhánh biến động lớn: nhánh phải kể đến Đông lan (2,6 lá/ nhánh) Bạc lan (Cerythrostylum) cã sè l¸/ nh¸nh rÊt lín (9,1 l¸/ nh¸nh) Độ dày độ rộng khác nhau, dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm Thanh ngọc (Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm Về màu sắc, phiến thờng có màu xanh bóng nh chi Lan kiếm (Cymbidium SW), chi lan Bầu rợu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh đậm nh Hạc Đính Vàng (P flavum) 2.1.2.4 Hoa lan CÊu t¹o cđa hoa lan phong phú đa dạng Ta gặp nhiều loài mà mùa có hoa nở có nhiều cụm hoa mà cụm đơm Mặc dù muôn hình muôn vẻ nhng ta quan sát hoa lan cịng cã mét tỉ chøc ®ång nhÊt cđa hoa mÉu kiểu hoa đặc trng lớp mầm, nhng đà biến đổi nhiều để hoa có đối xứng qua mặt phẳng Mầm hoa địa lan đợc hình thành từ đốt thứ 3, thứ gần đáy giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thờng dài mang nhiều hoa, chồi hoa thờng xuất bên dới giả hành, nách lá, tách bẹ già đâm bên K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh Thông thờng, giả hành chØ cho hoa mét lÇn Chåi hoa thêng xt hiƯn đồng thời với chồi thân, nhng chồi hoa no tròn hơn, chồi thân dẹp Các chồi thân mọc đâm hai phía hình đuôi cá, chồi hoa bao hoa ôm chặt quanh phát hoa Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Chiều dài phát hoa từ 10 cm đến 100cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đờng xoắn ốc Búp hoa đà đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa Thoạt nhìn hoa Cymbidium có cánh gần giống nhau, thực có cánh hoa bên trong, lại đài bên ngoài, có cấu trúc màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ chuyên hoá thành cánh môi, màu sắc sắc sỡ xẻ thành thuỳ tạo dạng nửa hình ống Hai thuỳ bên ôm lấy trụ, thuỳ thứ có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng đến đậu hút mật thụ phấn cho hoa Giữa cánh môi có gờ dọc song song màu vàng.Tận bên có đĩa mật có tuyến tiết mồ hôi Hoa Cymbidium lỡng tính nhị đực nhị gắn chung trụ nhị, nhuỵ hình bán trụ cong phía trớc Nhị mang khèi phÊn mµu vµng cã gãt dÝnh nh keo Khối phấn đợc đậy nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn trục hợp nhuỵ cách với muỗm nhuỵ gờ lên Cấu trúc tự nhiên hoa Cymbidium thụ phấn đợc nhờ côn trùng Sau hoa thụ phấn, hoa xoay dần vị trí cũ, bầu noÃn phình to lên tạo thành K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh 2.1.2.5 Quả lan Quả địa lan thuộc loại nang, nở theo 36 đờng nứt dọc, có dạng từ dài (Vanilla) đến dạng hình trụ ngắn phình Khi chín nở mảnh vỏ dính lại với phần đỉnh phía gốc số loài chín nở theo 1-2 khía dọc, chí không nứt mà hạt khỏi vỏ vỏ bị mục nát 2.1.2.6 Hạt lan Hạt lan nhiều nhỏ li ti kích thớc hạt vô nhỏ với khối lợng toàn hạt 1/10-1/1000 mg không khí chiếm 76-96% thể tích Do hạt lan hầu nh khối lợng Hạt cấu tạo từ khối cha phân hoá, mạng lới nhỏ xốp chứa đầy không khí Phải trải qua 2-18 tháng hạt chín Phần lớn hạt thờng chết khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần Do hạt nhiều theo gió bay xa, nhng hạt nảy mần thành lại Chỉ khu rừng già Èm ít, vïng nhiƯt ®íi míi ®đ ®iỊu kiƯn cho hạt lan nảy mầm 2.1.3 Đặc điểm thực vật địa lan Hồng hoàng Sapa Địa lan Hồng hoàng (Hoàng lan) tên khoa học Cymbidium iridioides, có giả hình tròn dài, song đính, phiến hình gơm, dài 30-90 cm , rộng 2-3cm, mầu xanh đậm Chùm dài lá, hoa to rộng đến 10 cm, màu lục vàng hay vàng, môi thuỳ cạnh chóp nhọn, thuỳ có đốm sậm hay vàng, bìa dúm có lông Nang dài từ 8-10cm [9] K9 Khoa Công nghệ sinh học Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh Lá dài gần 70 cm hoa nở vào tháng 4, tháng 6, số trung bình / nhánh 5,1 Loại địa lan đẻ lần/ năm, đẻ hai đợt mầm năm, tháng 3- tháng 9-10, mầm đẻ vào tháng 9-10 thờng mầm sinh trởng phát triển kém, còi cọc, mầm khó có khả cho hoa Tốc độ sinh trởng chiều cao địa lan chậm, nhanh tháng thứ đạt chiều cao tối đa [14] 2.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh lan Để sinh trởng phát triển tốt chúng cần có yếu tố ngoại cảnh nh nơi xuất xứ Muốn nuôi dỡng tốt hoa lan trớc tiên cần tìm hiểu đặc tính sinh trởng 2.1.4.1 Nhiệt độ Yêu cầu nhiệt độ loài lan nguồn gốc phát sinh phân bố tự nhiên trính sinh trởng, phát triển đà quy thành nhóm lan Vì vào điều kiện khí hậu vùng xuất xứ loài lan giới đợc chia thành nhóm nhóm lan ôn đới, nhóm lan cận nhiệt đới nhóm lan nhiệt đới Trong giống địa lan (Cymbidium) đợc xếp vào nhóm lan ôn đới, chúng đợc phân bố từ vĩ độ 280-400 [19] Nhìn chung, nhiệt độ ảnh hởng đến trình sinh trởng cây, nhng giai đoạn phát dục mầm hoa nhiệt độ ảnh hởng lớn Thời kỳ phát dục khác chịu ảnh hởng nhiệt độ khác nhau, tháng 7tháng nớc nhiệt đới có nhiệt độ cao mầm hoa đợc hình thành vào buổi tối, nhiệt độ dao động quanh 150C thuận lợi cho trình phát dục mầm hoa, nhng K9 – Khoa C«ng nghƯ sinh häc