Trang 1 Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU VŨ PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆN
TỔNG QUAN
Đau thắt ngực không ổn định
ĐTNKÔĐ, một loại trong HCĐMVC, được xác định bởi sự xuất hiện triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim, bao gồm cơn đau thắt ngực mới hoặc biến đổi các dạng đau ngực, gia tăng cơn đau thắt ngực khi nghỉ ngơi, hoặc các biến đổi đau thắt ngực tương đương Tuy nhiên, không có dấu ấn sinh học của tổn thương cơ tim (như troponin) và điện tâm đồ có thể có những thay đổi.
1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ
Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của mảng xơ vữa Khi tế bào nội mô bị tổn thương, monocyte gắn với các phân tử dính nội mô, thâm nhập vào lớp dưới nội mô và biến đổi thành đại thực bào Những đại thực bào này tiêu hóa LDL, chuyển thành tế bào bọt và hình thành dải chất béo Để duy trì viêm, đại thực bào được kích hoạt thu hút thêm đại thực bào khác thông qua việc tiết ra các chất trung gian Hơn nữa, đại thực bào cũng kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn trong lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra các cytokine, góp phần vào hình thành mô xơ trong lưới ngoại bào.
Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa chủ yếu phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa, không chỉ kích thước Lõi vữa giàu lipid và thiếu collagen nâng đỡ, và nghiên cứu chỉ ra rằng kích thước lõi vữa tỉ lệ thuận với khả năng vỡ Viêm cũng là yếu tố quan trọng, làm tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng xơ vữa, dẫn đến sự gia tăng kích thước lõi xơ vữa và làm mỏng vỏ bao xơ.
Các phân tích bệnh học chỉ ra rằng, mảng xơ vữa dễ tổn thương có sự thiếu hụt tế bào cơ trơn Các chất trung gian viêm có thể gây chết tế bào cơ trơn theo chương trình hoặc ức chế tổng hợp collagen Mảng xơ vữa có nguy cơ cao nếu có các đặc điểm như lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, sự tập trung dày đặc của đại thực bào và lympho T, số lượng tế bào cơ trơn ít, cùng với sự tăng cường biểu hiện metalloproteinase, dẫn đến thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết.
Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ (Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)
Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa các thụ thể trên bề mặt tiểu cầu và hình thành huyết khối Nếu mảng vỡ nhỏ
1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định
Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:
- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:
+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần
+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)
Cơn đau thắt ngực kéo dài hơn 15-20 phút khi nghỉ ngơi và có đáp ứng với các dẫn xuất nitrat có thể là dấu hiệu quan trọng Nếu không có phản ứng với nitrat, tình trạng này có thể liên quan đến nhồi máu cơ tim không có sóng Q.
- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi
- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.
Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu
Tiểu cầu, thành phần nhỏ nhất của máu, có hình đĩa với đường kính 3-4 µm, không nhân và được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tủy xương Dưới kính hiển vi, tiểu cầu thể hiện cấu trúc phức tạp với hệ thống màng, vi quản, ống đặc, nhiều hạt và các kênh mở Màng tiểu cầu gồm hai lớp lipid kép, chứa glycoprotein (GP) đóng vai trò là thụ thể bề mặt và tham gia vào quá trình đông máu Ngoài ra, màng tiểu cầu còn có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]
Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh suy yếu, làm lộ lớp dưới nội mô chứa các protein dính như collagen và yếu tố von Willebrand (vWF) Trong điều kiện dòng máu cao, vWF đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Ngược lại, khi dòng máu chậm hoặc tĩnh, bám dính tiểu cầu chủ yếu diễn ra qua collagen và phức hợp GP Ia/IIa Những tương tác này làm giảm tốc độ lưu thông của tiểu cầu, tạo điều kiện cho các cặp thụ thể - phối tử tương tác chặt chẽ hơn, dẫn đến bám dính tĩnh Đặc biệt, sự tương tác giữa collagen và GP VI kích hoạt các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, trong khi vWF và collagen tạo liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa.
Trong giai đoạn ngưng tập tiểu cầu, các tiểu cầu kết dính với nhau để hình thành các đám gọi là nút tiểu cầu Thụ thể GP IIb/IIIa đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Khi tiểu cầu được kích hoạt, phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt tiểu cầu sẽ hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin và vitronectin, trong đó fibrinogen là chủ yếu do nồng độ cao trong huyết tương và ái lực mạnh với GP IIb/IIIa Sự liên kết này tạo cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến ngưng tập và tiếp tục hoạt hóa, diễn ra liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu Các chất gây ngưng tập tiểu cầu (NTTC) như ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen và ristocetin, trong đó ADP là chất quan trọng nhất vì không phụ thuộc vào tác nhân khác và tăng cường phản ứng ngưng tập ADP, được bài tiết từ hồng cầu ở các thành mạch bị tổn thương, làm tăng nhanh nồng độ ADP, giúp tạo nút cầm máu ban đầu ADP phát huy hiệu quả tối đa khi gắn kết với các thụ thể P2Y1, P2Y12 và P2X1 trên tiểu cầu, trong đó P2Y1 và P2Y12 là thiết yếu cho hiện tượng NTTC Đây là một trong những trọng tâm của nghiên cứu về thuốc ức chế NTTC trong dự phòng và điều trị huyết khối.
➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu
Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, tiểu cầu trải qua nhiều biến đổi phức tạp, bao gồm sự thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố sinh học Quá trình này ảnh hưởng đến cả hình thái và sinh hóa của tiểu cầu.
Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu (Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20
1.2.3 Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt hóa tiểu cầu là phương pháp điều trị chính trong ĐTNKÔĐ, giúp giảm biến cố tim mạch và tỉ lệ tử vong cho bệnh nhân Các thuốc chống NTTC được phân loại dựa trên cơ chế tác dụng của chúng.
- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)
- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient], ticlopidine [Ticlid])
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat])
- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])
- CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor])
1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel
Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)
Aspirin là thuốc chống tiểu cầu được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi, giúp giảm tử vong do mạch máu khoảng 15% và biến cố tim mạch không gây tử vong khoảng 30% ở bệnh nhân có nguy cơ cao Thuốc này ức chế enzyme cyclooxygenase (COX) bằng cách gắn vào gốc Ser tại vị trí 529 của COX-1 và 516 của COX-2, ngăn chặn quá trình chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2) PGH2 là tiền chất của các prostanoid, chủ yếu là thromboxan A2 (TXA2) và prostacyclin (PGI2) TXA2, khi được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu, gây co mạch mạnh và tạo ra hiện tượng ngưng tụ tiểu cầu không hồi phục Việc aspirin ức chế COX-1 làm giảm sản xuất TXA2, từ đó ngăn chặn hiện tượng ngưng tụ tiểu cầu Mặc dù aspirin cũng ức chế men prostacyclin synthetase, dẫn đến giảm sản xuất PGI2 từ tế bào nội mạc, nhưng tác động này yếu hơn và không kéo dài do tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp lại enzyme mới.
Clopidogrel không có hoạt tính chống NTTC và sau khi hấp thu tại ruột, khoảng 85% lượng thuốc được chuyển hóa thành chất không có hoạt tính bởi các enzyme esterase như carboxylesterase và butyrylcholinesterase Chỉ 15% lượng clopidogrel được chuyển hóa qua hai bước tại gan nhờ hệ thống enzyme P-450, chủ yếu là CYP2C19, tạo thành chất có hoạt tính Chất này ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP vào các thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến tình trạng các tiểu cầu không kết dính với nhau do các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa.
Clopidogrel undergoes a complex metabolic process that converts it into its active metabolite, which is crucial for its therapeutic effects This transformation involves several enzymatic steps, each resulting in different chemical compounds that contribute to the drug's efficacy Understanding the metabolic pathway of clopidogrel is essential for optimizing its use in clinical settings.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC
(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )
Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19
Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là
SNP (biến thể đơn nucleotide) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người, với mỗi gen chứa nhiều nucleotide (A, T, G, C) mã hóa thông tin cho sản phẩm nhất định Mỗi SNP thể hiện sự khác biệt một nucleotide trong gen, ví dụ, có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng thymine (T) Những SNP này tạo nên sự khác biệt di truyền giữa các cá nhân.
Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)
SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen đạt ít nhất 1% Mặc dù có thể có 4 loại nucleotide, nhưng SNP thường chỉ xuất hiện với 2 alen do nguồn gốc từ đột biến điểm trong hệ gen, chuyển đổi một nucleotide thành một nucleotide khác Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản, các thế hệ sau sẽ mang đột biến này, dẫn đến hình thành SNP trong quần thể Thông thường chỉ có 2 alen: một alen gốc và một alen đột biến Để xuất hiện alen thứ 3, cần có một đột biến mới tại vị trí trước đó, và cá thể mang đột biến phải truyền lại cho thế hệ sau, nhưng khả năng này rất hiếm, vì vậy phần lớn SNP chỉ tồn tại với 2 alen.
SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa mà không làm thay đổi trình tự axit amin, hoặc có thể gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin Ngoài ra, SNP cũng có thể xuất hiện trong vùng điều khiển, dẫn đến sự thay đổi trong biểu hiện gen, hoặc trong các vùng giữa các gen.
SNP xuất hiện khoảng 1 lần trong mỗi 300 nucleotide, tương đương với khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen con người, và chúng có thể đóng vai trò như các marker sinh học để xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh tật Khi SNP xảy ra trong gen hoặc vùng điều khiển gần gen, chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng gen và liên quan đến bệnh tật Dù hầu hết các SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, một số SNP lại có vai trò quan trọng trong nghiên cứu sức khỏe, giúp dự đoán phản ứng của cá nhân với thuốc, nhạy cảm với yếu tố môi trường và nguy cơ phát triển bệnh lý SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi di truyền gen bệnh trong gia đình, và các nghiên cứu tương lai sẽ tìm hiểu các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư.
1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc
Enzym cytochrome P450, đặc biệt là CYP2C19, là các protein hem nằm trong lưới nội chất của tế bào gan, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc Các enzyme CYP khác bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, với CYP2C19 được coi là một enzyme chủ chốt trong siêu họ cytochrome P450.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260
Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 (Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )
Gen CYP2C19 bao gồm 9 exon và mã hóa cho protein dài 490 axit amin Gen này có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định Trong số đó, alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường, trong khi các alen như *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 quy định enzyme CYP2C19 với hoạt tính giảm, mất hoặc tăng Đặc biệt, alen *2 và *3 là hai đa hình alen quan trọng nhất, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á.
The CYP2C19 gene is illustrated with the positions of its exons (highlighted in black boxes) and several alleles, which play a significant role in drug metabolism and response Understanding the genetic variations within CYP2C19 is crucial for personalized medicine, as these alleles can influence the efficacy and safety of various medications.
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường
Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính
Alen rs4244285 (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, gây ra đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5, dẫn đến sự xuất hiện của vị trí cắt nối intron-exon bất thường Đa hình này tạo ra ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Đột biến này làm cho khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn bình thường, tạo ra enzyme không có hoạt tính CYP2C19*2 là dạng alen mã hóa enzyme CYP2C19 mất hoạt tính phổ biến nhất, với tần số xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á.
CYP2C19*3 là alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính, có kí hiệu rs4986893 tại vị trí (c.636G>A), với đột biến thay G bằng A ở exon 4 dẫn đến mã kết thúc sớm tại axit amin 212 Đa hình này tạo ra ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Tần số alen CYP2C19*3 trong phần lớn quần thể dưới 1%, nhưng tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á, dao động từ 2-9%.
Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và
*8 (rs41291556) Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]
Một số alen khác đã được xác định trong các quần thể khác nhau, tuy nhiên, dữ liệu mô tả về chúng còn rất hạn chế Ngoài ra, các thuật toán phân tích cũng được áp dụng để dự đoán ảnh hưởng của những alen này lên chức năng protein.
1.3.2.2 Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc
Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa nhiều loại thuốc, bao gồm clopidogrel (Plavix), mephenytoin, omeprazole và diazepam Trong số đó, enzyme CYP2C19 là enzyme chủ yếu chịu trách nhiệm chuyển hóa thuốc clopidogrel.
Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:
- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin
- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ
- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ
Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, và từ đó sinh ra chất B, cũng có thể có hoặc không có hoạt tính Trong khi đó, chất C và D luôn không có hoạt tính Đặc biệt, chất A có khả năng tạo ra nhiều loại chất B hoặc C.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]
Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]
Trong pha I của quá trình chuyển hóa, phản ứng chủ yếu là phản ứng oxy hóa, nổi bật với sự tham gia của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450 Quy trình này diễn ra qua các bước chính, tạo điều kiện cho sự chuyển đổi các chất trong cơ thể.
Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen
và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành
Nghiên cứu của Sibbing và cộng sự (2009) trên 2,485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da cho thấy rằng tỉ lệ biến cố huyết khối sau khi đặt stent ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 cao gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại, với giá trị p = 0,007.
Nghiên cứu ELEVATE-TIMI (2011) là một thử nghiệm đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi được thực hiện trên 333 bệnh nhân mắc bệnh tim tại 32 địa điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011 Kết quả cho thấy, bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 khi sử dụng liều clopidogrel 225 mg có tác dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg, trong khi bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 không đạt được hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu ngay cả khi dùng liều 300 mg.
Nghiên cứu của Yang J và cộng sự (2013) chỉ ra rằng những người mang 1 alen đột biến (*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, *2/*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1), với giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,0039.
Nghiên cứu của Yu Chen và các cộng sự (2015) trên 336 bệnh nhân HCĐMVC can thiệp mạch vành qua da cho thấy nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 có tỷ lệ NTTC cao hơn đáng kể so với nhóm mang kiểu gen dại ở cả thời điểm nhập viện và sau 1 tháng, với p lần lượt là 0,005 và 0,003 Ngoài ra, nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm mang alen kiểu dại CYP2C19*1, với p=0,003.
Nghiên cứu cho thấy alen CYP2C19*2 có tỉ lệ cao trong quần thể, và bệnh nhân mang alen này gặp biến cố tim mạch nghiêm trọng hơn so với những người không mang gen Điều này khẳng định vai trò quan trọng của CYP2C19*2 trong việc kháng thuốc clopidogrel.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Đến nay, chưa có nghiên cứu nào xác định mối liên hệ giữa độ NTTC và kiểu gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Hiện tại, chỉ có các nghiên cứu tập trung vào mối liên quan giữa độ NTTC và một số yếu tố trong các bệnh lý khác nhau.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) về chỉ số NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường cho thấy rằng chất kích thích tiểu cầu collagen nồng độ 1mg/ml đạt 65,5±6,7%, trong khi chất kích thích ADP nồng độ 10µM đạt 67±6,5% Kết quả nghiên cứu không phát hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ.
Trương Thị Minh Nguyệt (2003) đã nghiên cứu độ NTTC ở bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim, với kết quả cho thấy mức độ NTTC trung bình là 71,6±8,83% khi sử dụng chất kích thích ADP nồng độ 5μM Đặc biệt, nhóm bệnh nhân NMCT cấp có độ NTTC cao hơn, đạt 74,46±9,95%, và sự khác biệt này có ý nghĩa so với nhóm chứng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng độ NTTC tăng có liên quan đồng biến với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng yếu tố nguy cơ như tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, hút thuốc lá và tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch.
Nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cho thấy độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn so với mức 67±6,5% ở người bình thường Những bệnh nhân NMCT cấp có nhiều yếu tố nguy cơ sẽ có độ NTTC cao hơn so với những người có ít yếu tố nguy cơ Đặc biệt, độ NTTC giảm rõ rệt sau khi điều trị tấn công bằng thuốc chống NTTC (Plavix, Aspirin và Lovenox) so với trước can thiệp.
Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) đã tiến hành nghiên cứu mối liên hệ giữa các kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2 và CYP2C19*3 với tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent động mạch vành và điều trị bằng clopidogrel Hiện tại, nghiên cứu vẫn đang trong quá trình thực hiện và chưa có kết quả cuối cùng được công bố.
Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam về mối liên hệ giữa độ nhạy thuốc và đa hình di truyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân đái tháo đường không phụ thuộc insulin Do đó, việc nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực này là rất cần thiết, nhằm cải thiện hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) Sau khi nhập viện, họ được điều trị bằng liệu pháp kháng tiểu cầu kép, bắt đầu từ ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin 100mg/ngày kết hợp với clopidogrel 75mg/ngày.
- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel
- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng
- Tai biến mạch não dưới 3 tháng
- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần
- Nguy cơ cao chảy máu
- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018
➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam
- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Tim mạch Việt Nam
- Viện nghiên cứu hệ gen
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện để xác định cỡ mẫu nghiên cứu Đối tượng tham gia được lựa chọn dựa trên các tiêu chuẩn nhất định và phải đồng ý tham gia nghiên cứu Quá trình lựa chọn diễn ra liên tục cho đến khi đạt đủ cỡ mẫu 54 bệnh nhân tại Viện Tim mạch Việt Nam.
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas
- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific
- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek
- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific
- Chất kớch tập là ADP 5 àM của hóng Nippon Corporation (Nhật Bản)
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.
Các bước nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:
2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Để lấy mẫu, cần 4ml máu từ tĩnh mạch của bệnh nhân, chuyển vào ống chuyên dụng chứa chất chống đông EDTA nhằm ngăn ngừa nhiễm bẩn Cần ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu Lượng máu trong mỗi ống đủ để thực hiện nhiều lần tách DNA tổng số, đồng thời đảm bảo có mẫu lưu để lặp lại quá trình tách DNA cho đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân.
Mẫu cần được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày Sau đó, mẫu sẽ được vận chuyển theo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia.
Hà Nội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng
Ống mẫu cần ghi rõ các thông tin thiết yếu như mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mỗi mẫu phải được lưu trữ trong sổ, bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, cùng với tình trạng của mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng.
2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số
Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:
- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA
- DNA liên kết với màng silica-gel
- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer
- Thu nhận DNA tổng số
2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số
Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:
➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Thực nghiệm được thực hiện tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus Các bước trong quy trình thao tác chung được tiến hành một cách cẩn thận để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của thí nghiệm.
- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di
- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút
- Thể tớch mẫu điện di: 5 àl mẫu + 1àl DNA 6X loading dye, 5àl Ruler 100
2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm
2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR
Nguyên lý của kỹ thuật PCR là khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn thông qua sự tổng hợp DNA mới từ một DNA khuôn ban đầu bằng enzym polymerase Các thành phần chính của phản ứng PCR bao gồm DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trình PCR được chia thành ba giai đoạn chính.
- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép
Giai đoạn gắn mồi là quá trình hạ nhiệt độ xuống mức thích hợp để mồi có thể tự bắt cặp với sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào loại mồi được sử dụng, cụ thể là trình tự và số lượng nucleotide của mồi.
- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]
Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:
Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm
*2 CYP2C19*2-F TGGAATTTGAAGTATCTTTGAGCCC 719 bp CYP2C19*2-R CAATGAATCACAAATACGCAAGCAG
Chúng tôi đã tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2 và *3 Quy trình PCR cho hai alen này được trình bày chi tiết trong bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3
Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 68˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Phương pháp điện di là công cụ quan trọng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR, với quy trình thực hiện tương tự như điện di trong kiểm tra chất lượng tách chiết DNA.
2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1 Mix đều
2 Nếu DNA 0,05)
3.1.4 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
3.1.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
Khâu tách chiết DNA tổng số là bước thiết yếu trong việc xác định kiểu gen Để đánh giá chất lượng DNA tổng số, chúng tôi đã áp dụng phương pháp điện di để thực hiện đánh giá định tính và đo OD để đánh giá định lượng Kết quả của các phép đo OD và điện di sẽ được trình bày chi tiết.
Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA
Nồng độ DNA tách từ các mẫu máu toàn phần dao động từ 13,10 ng/µl đến 170,05 ng/µl, với độ tinh sạch cao, thể hiện qua tỷ lệ OD260/OD280 từ 1,806 đến 2,146.
➢ Kết quả điện di DNA tổng số
Sản phẩm tách DNA tổng số cũng được đánh giá bằng cách điện di trên gel agarose 0,7% với hiệu điện thế 90V, chạy trong một giờ
Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7%
Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker Làn 16-38 : DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy chất lượng DNA tổng số đạt yêu cầu tốt, với tất cả mẫu đều có một băng điện di rõ ràng, ít bị đứt gãy Sản phẩm DNA tách được đáp ứng đủ điều kiện cho thí nghiệm PCR nhằm nhân dòng các phân đoạn gen tiếp theo.
3.4.1.2 Kết quả khuếch đại vùng gen chứa alen CYP2C19*2, CYP2C19*3
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các vùng gen chứa alen *2 và *3, giúp thu được vùng gen đặc hiệu cho từng alen.
Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1%
Làn M: Ruler 100bp Plus DNA Ladder Lần 2(-), 3(-): Đối chứng âm
Làn 2-41 đến 2-45, 2-49: sản phẩm PCR vùng chứa *2 của các bệnh nhân với mã tương ứng Làn 3-41 đến 3-45 : sản phẩm PCR vùng chứa *3 của các bệnh nhân với mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy các cặp mồi sử dụng có tính đặc hiệu cao, với các thành phần và điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa Mỗi alen tạo ra một băng duy nhất, rõ nét trong các mẫu DNA, không có băng phụ hay hiện tượng smear Kích thước băng được xác định chính xác.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.4.3 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 bằng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự
Trước khi thực hiện RFLP và giải trình tự, sản phẩm PCR cần được tinh sạch và đo nồng độ DNA Chúng tôi đã sử dụng kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omega-biotek) để tinh sạch 25 µl sản phẩm PCR theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hình 3.3 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2
A Kiểu dại GG, B Dị hợp đa hình GA, C Đồng hợp đa hình AA
Hình 3.4 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3
A Kiểu dại GG, B Dị hợp đa hình GA
CYP2C19*2 có kiểu gen dại là GG, với kiểu gen dị hợp và đồng hợp đa hình lần lượt là GA và AA Trong khi đó, CYP2C19*3 cũng có kiểu gen dại là GG, và kiểu gen dị hợp đa hình của nó chưa được xác định rõ.
GA Sản phẩm GTT cho hình ảnh rõ nét Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu
Bàn luận
ĐTNKÔĐ là một dạng của hội chứng động mạch vành cấp, chủ yếu do nứt hoặc vỡ các mảng xơ vữa không ổn định, dẫn đến hình thành cục máu đông mà chưa gây
Bệnh động mạch vành, đặc biệt là đau thắt ngực không ổn định (ĐTNKÔĐ), là nguyên nhân hàng đầu gây nguy hiểm cho sức khỏe, dẫn đến tỷ lệ tử vong và thương tật cao trên toàn cầu Tình trạng này đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt ở các quốc gia đang phát triển như Việt Nam.
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt động tiểu cầu là phương pháp điều trị chính trong ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Phương pháp này dựa trên các hướng dẫn quốc tế cập nhật, như hướng dẫn của Hội Tim mạch Hoa Kỳ, nhằm nâng cao sức khỏe và cải thiện tiên lượng sống cho bệnh nhân.
Liệu pháp kháng tiểu cầu kép bao gồm aspirin và clopidogrel vẫn là lựa chọn hàng đầu trong điều trị chống tắc nghẽn tiểu cầu (NTTC) nhằm ngăn ngừa các biến cố tim mạch Tuy nhiên, một số lượng lớn bệnh nhân vẫn xảy ra các biến cố thiếu máu cơ tim cục bộ mặc dù tuân thủ đúng phác đồ điều trị Sự khác nhau giữa các bệnh nhân điều trị clopidogrel có thể giải thích cho tình trạng này, vì clopidogrel là một tiền chất không có tác dụng sinh học và cần được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính thông qua cytochrome P450 ở gan, chủ yếu là CYP2C19 Quá trình này giúp ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu, giảm độ NTTC và ngăn chặn sự kết dính của tiểu cầu.
Enzym CYP2C19 là một enzym đa hình với 25 alen, và hoạt tính của enzym này thay đổi tùy thuộc vào sự hiện diện của các alen trong kiểu gen.
Alen *1 biểu hiện hoạt tính enzyme bình thường, trong khi các alen *2 và *3 gây mất hoạt tính enzym Cơ chế đáp ứng kém với clopidogrel chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do các yếu tố phi di truyền như không tuân thủ điều trị, tương tác thuốc, béo phì, tuổi cao, rối loạn chuyển hóa lipid, hút thuốc, tăng huyết áp, tiểu đường và tiền sử nhồi máu cơ tim.
Nghiên cứu này không chỉ xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 mà còn đánh giá mối tương quan giữa độ NTTC và đa hình CYP2C19 cùng với các yếu tố ảnh hưởng khác ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Kết quả cho thấy có sự liên quan đáng kể về độ NTTC giữa bệnh nhân mang alen quy định enzym hoạt động bình thường và bệnh nhân mang alen quy định enzym mất hoạt tính chuyển hóa (p