LUẬN văn THẠC sĩ đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen cyp2c192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại viện tim mạch việt nam

TỔNG QUAN

Đau thắt ngực không ổn định

ĐTNKÔĐ là một dạng trong HCĐMVC, được định nghĩa bởi sự xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim (cơn đau thắt ngực mới xuất hiện hoặc biến đổi các dạng đau ngực, hoặc sự gia tăng cơn đau thắt ngực lúc nghỉ ngơi, hoặc những biến đổi đau thắt ngực tương đương), không có sự xuất hiện các dấu ấn sinh học do tổn thương cơ tim (troponin), điện tâm đồ có thể thay đổi [29]

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ

Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình tiến triển bởi sự hình thành các mảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch vừa và lớn, diễn ra liên tục và dẫn đến thiếu máu cấp tính Các yếu tố nguy cơ như: cholesterol máu cao, THA, ĐTĐ, hút thuốc lá, đóng vai trò thiết yếu trong khởi phát XVĐM [43] Chúng làm tổn thương đến tế bào nội mô của mạch máu và gây rối loạn chức năng nội mô bằng cách làm giảm hoạt tính sinh học của nitric oxyde, tăng sản xuất endothelin, làm tổn thương mạch máu, tăng biểu lộ phân tử kết dính (selectin, phân tử kết dính tế bào mạch, phân tử kết dính giữa các tế bào) và tăng cường quá trình đông máu [39]

Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa Khi các tế bào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm đặc biệt là monocyte sẽ gắn với các phân tử dính nội mô, đi vào lớp dưới nội mô và biệt hóa thành đại thực bào Các đại thực bào ăn các phân tử LDL, chuyển thành tế bào bọt và hình thành lên dải chất béo Để duy trì quá trình viêm, đại thực bào được hoạt hóa sẽ thu hút thêm các đại thực bào khác bằng cách tiết ra các chất trung gian Thêm vào đó, đại thực bào cũng kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn ở lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra các cytokin, góp phần hình thành các mô xơ bởi lưới ngoại bào [43]

Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước

Lõi vữa của mảng xơ vữa giàu lipid và không có collagen nâng đỡ Nghiên cứu cho thấy kích thước của lõi vữa tỉ lệ thuận với khả năng vỡ mảng xơ vữa [40] Thêm vào đó, viêm là một nhân tố quan trọng làm mảng xơ vữa dễ bị tổn thương, liên quan đến tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng Sự tăng hoạt động này làm kích thước của lõi xơ vữa lớn lên và làm mỏng vỏ bao xơ của mảng do đại thực

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đó, các phân tích bệnh học còn cho thấy, có sự thiếu các tế bào cơ trơn tại các mảng xơ vữa dễ tổn thương Các chất trung gian trong quá trình viêm có thể làm cho các tế bào cơ trơn chết theo chương trình hoặc ức chế sự tổng hợp các chất collagen từ tế bào cơ trơn [56] Tóm lại, các mảng xơ vữa có nguy cơ cao hay dễ bị tổn thương nếu chúng có các đặc điểm sau: lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, tập trung dày đặc đại thực bào và lympho T, lượng nhỏ tế bào cơ trơn, tăng biểu hiện tại chỗ của metalloproteinase sẽ làm thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng xơ vữa [40]

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ (Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)

Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô lộ ra (giàu các yếu tố mô và tiền yếu tố đông máu) tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa các thụ thể trên bề mặt tiểu cầu, hoạt hóa quá trình ngưng kết tiểu cầu và kết quả là hình thành huyết khối Nếu mảng vỡ nhỏ và cục huyết khối không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ làm giảm dòng máu tới vùng cơ tim do động mạch đó nuôi dưỡng, thì biểu hiện lâm sàng là cơn đau thắt ngực không ổn định Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành [27,56]

1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định

Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:

- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:

+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần

+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)

+ Cơn đau thắt ngực kéo dài lúc nghỉ ngơi (>15-20 phút) nhưng đáp ứng với các dẫn xuất nitrat (nếu không có thể đó là nhồi máu cơ tim không có sóng Q)

- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi

- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.

Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu

Tiểu cầu là thành phần hữu hỡnh nhỏ nhất của mỏu, hỡnh đĩa, đường kớnh 3-4àm, không nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tủy xương Quan sát dưới kính hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc siêu phức tạp, gồm hệ thống màng, hệ thống vi quản, hệ thống ống đặc, nhiều hạt và hệ thống các kênh mở Màng tiểu cầu gồm 2 lớp lipid kép bao quanh tiểu cầu, có các glycoprotein (GP) tác dụng như các thụ thể (receptor) bề mặt và là nơi diễn ra các hoạt động đông máu của tiểu cầu [10] Ngoài ra, màng tiểu cầu cũng có thể nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [63]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]

Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suy yếu, để lộ lớp dưới nội mô có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), fibronectin, lamilin…[50,63] Khi tốc độ dòng máu cao, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính tiểu cầu ban đầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Tuy nhiên, khi tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh thì bám dính tiểu cầu ban đầu chủ yếu thông qua liên kết của collagen với phức hợp GP Ia//IIa Những tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, từ đó giúp các cặp thụ thể - phối tử tương tác, ràng buộc hơn nữa dẫn đến sự bám dính tĩnh [50,52] Đặc biệt, sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP VI làm hoạt hóa các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa vWF và collagen hình thành liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa [50]

Trong giai đoạn NTTC, tiểu cầu dính với nhau tạo thành từng đám (nút tiểu cầu) GP IIb/IIIa là một thụ thể có vai trò quan trọng trong giai đoạn này, có khoảng

4000 - 5000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của màng tiểu cầu bất hoạt Khi tiểu cầu hoạt hóa, các GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, chúng hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Tuy nhiên chúng gắn với fibrinogen là chủ yếu vì fibrinogen có nồng độ cao trong huyết tương và GP IIb/IIIa có ái lực với fibrinogen là mạnh nhất Khi liên kết này xảy ra trên các tiểu cầu sẽ tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau, diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [10,50] Một số chất có khả năng gây NTTC như: ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen, ristocetin…, trong đó ADP là chất gây NTTC quan trọng nhất vì chúng không phụ thuộc vào tác nhân khác và còn giúp cho phản ứng ngưng tập của các tác nhân khác diễn ra đầy đủ hơn Hơn nữa, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu Do đó, ở những thành mạch bị tổn thương, hồng cầu sẽ bài tiết ADP, làm tăng nhanh nồng độ ADP, giúp tăng NTTC, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu ADP phát huy hiệu quả tối đa khi gắn kết với cả 3 thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2Y12, P2X1, trong đó P2Y1, P2Y12 là 2 thụ thể cần thiết cho hiện tượng NTTC xảy ra tối đa Chúng là một trong những trọng tâm của nghiên cứu về thuốc ức chế NTTC trong dự phòng và điều trị huyết khối [10]

➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu

Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, các tiểu cầu sẽ xảy ra một loạt các biến đổi như quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố của tiểu cầu Quá trình này rất phức tạp, tiểu cầu biến đổi cả về hình thái và sinh hóa [69]

Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu (Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20

1.2.3 Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ

Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt hóa tiểu cầu là điều trị cốt lõi trong ĐTNKÔĐ, giúp làm giảm các biến cố tim mạch và giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh [53] Theo cơ chế tác dụng, các thuốc chống NTTC được phân loại như sau [63]:

- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)

- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient], ticlopidine [Ticlid])

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat])

- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])

- CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor])

1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)

Aspirin là thuốc chống tiểu cầu được nghiên cứu rộng rãi nhất và được sử dụng phổ biến trên lâm sàng Hơn 100 thử nghiệm ngẫu nhiên ở những bệnh nhân có nguy cơ cao đều cho thấy aspirin làm giảm tử vong do mạch máu xuống khoảng 15% và các biến cố tim mạch không gây tử vong xuống khoảng 30% Aspirin ức chế chọn lọc exzyme cyclooxygenase (COX) do gắn vào gốc Ser ở vị trí 529 của COX-1 và gắn vào gốc Ser ở vị trí 516 của COX-2, làm bất hoạt enzyme này, dẫn đến ngăn chặn quá trình biến đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2) PGH2 là cơ chất của nhiều isomerase tạo ra các prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu là thromboxan A2 (TXA2) và PGI2 TXA2 khi gặp các tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP) sẽ được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu, chúng có tác dụng gây co mạch mạnh và gây NTTC không hồi phục thông qua thụ thể TXA2 Aspirin ức chế COX-1 gây ức chế tạo TXA2, dẫn đến ức chế NTTC Vì tiểu cầu không có nhân, không thể tổng hợp thêm COX-1 mới nên sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốt đời sống của tiểu cầu Tuy nhiên, aspirin còn ức chế men prostacyclin synthetase dẫn đến ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 (có tác dụng ức chế NTTC và giãn mạch) của tế bào nội mạc, kết quả là kích thích NTTC Nhưng do các tế bào nội mạc có nhân có thể tổng hợp ra men mới nên tác dụng này không mạnh bằng tác dụng ức chế men COX và không kéo dài [54,68]

Clopidogrel không có hoạt tính chống NTTC Sau khi được hấp thu tại ruột, có tới 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase: carboxylesterase (CES), butyrylcholinesterase (BchE) thành chất không có hoạt tính

Chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa qua hai bước ở gan bởi hệ thống enzyme P-450 (chủ yếu là CYP2C19) tạo thành chất có hoạt tính Chất này có tác dụng ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP (adenosin diphosphate) vào các thụ thể (P2Y12) của nó lên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa và dẫn đến các tiểu cầu không kết dính được với nhau [54,68]

Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa (Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/Clopidogrel-metabolism-and-its- conversion-to-an-active-metabolite-Clopidogrel-AM-via_fig1_313838290)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC

(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )

Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19

Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là

“snip”) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người Gen là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa cho một sản phẩm nhất định Một gen chứa rất nhiều nucleotide (gồm 4 loại A, T, G và C) Mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt một nucleotide trong gen đó, tạo nên sự khác biệt về một gen giữa các cá thể Ví dụ, một SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T) Các SNP là sự khác biệt duy nhất, là cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [44]

Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)

SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1% Mặc dù, theo lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, nhưng thông thường SNP chỉ xuất hiện 2 loại alen Có thể giải thích điều này là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide khác Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì các thế hệ sau sẽ mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể Tuy nhiên, chỉ có 2 alen – một alen gốc và một alen đột biến Để có alen thứ 3, cần phải có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen, và cá thể mang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau Khả năng xảy ra là rất hiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [78]

SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa nhưng không gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin, có thể xảy ra ở một vùng mã hóa với sự thay đổi trình tự axit amin, có thể xảy ra trong vùng điều khiển gây ra sự thay đổi biểu hiện gen, hoặc có thể xảy ra trong một vùng giữa các gen [75]

SNP xuất hiện một lần trong mỗi 300 nucleotide, nghĩa là có khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người Chúng có thể hoạt động như các marker sinh học, giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan đến bệnh tật Khi SNP xảy ra trong một gen hoặc ở vùng điều khiển gần gen, chúng có thể liên quan trực tiếp đến bệnh tật bằng cách ảnh hưởng đến chức năng gen Hầu hết các SNPs không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Tuy nhiên, một số SNP đã chứng tỏ được vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu sức khoẻ con người Các SNP có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân đối với một số loại thuốc nhất định, sự nhạy cảm với các yếu tố môi trường như chất độc và nguy cơ phát triển thành bệnh lý cụ thể SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của gen bệnh trong gia đình Các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai sẽ được tiến hành để xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư [44]

1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc

Enzym cytochrome P450 là các protein màng có chứa hem (hem protein) nằm ở lưới nội chất của tế bào gan Enzyme CYP bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 là một enzyme quan trọng trong siêu họ cytochrome P450 [80]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260

Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 (Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )

Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin

Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định Bên cạnh alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường thì các alen như alen *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 quy định enzyme CYP2C19 giảm, mất hoặc tăng hoạt tính [73] Trong đó alen *2, *3 là 2 đa hình alen quan trọng nhất, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [68]

(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration- of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of)

Hình 1.9 Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19

➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường

Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường

➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính

Alen có kí hiệu rs4244285 ở vị trí (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, đây là dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất hiện một vị trí cắt nối intron - exon bất thường Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen gồm kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính CYP2C19 *2 là dạng alen mã cho enzyme CYP2C19 mất hoạt tính phổ biến nhất với tần số xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á [68]

- Alen đa hình CYP2C19*3 CYP2C19*3 cũng là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính có kí hiệu rs4986893 ở vị trí (c.636G>A), đây là dạng đột biến thay G bằng A ở exon 4 làm xuất hiện mã kết thúc sớm ở axit amin 212 Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen, trong đó, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA Tần số của alen CYP2C19*3 trong phần lớn các quần thể là dưới 1%, tuy nhiên tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á với 2-9% [68]

Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và

*8 (rs41291556) Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]

Một số alen khác cũng được xác định trong các quần thể khác nhau với rất ít dữ liệu được mô tả hoặc được dùng các thuật toán phân tích để dự đoán ảnh hưởng của chúng lên chức năng protein [68]

1.3.2.2 Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc

Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) tham gia vào quá trình chuyển hóa phần lớn các thuốc khác nhau như thuốc chống ngưng tập tiểu cầu clopidogrel (Plavix), thuốc chống động kinh mephenytoin, thuốc ức chế bơm proton omeprazole, thuốc an thần diazepam…, trong đó enzyme CYP2C19 là enzyme chính tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel [80]

Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:

- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin

- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ

- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ

Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, sinh ra chất B có thể có hoặc không có hoạt tính Chất C, D luôn là chất không có hoạt tính Chất A có thể sinh ra nhiều loại chất B hoặc C [6]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]

Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước

Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]

Như đã nói ở trên, ở pha I, phản ứng chính là phản ứng oxy hóa và là phản ứng phổ biến nhất có xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450 Chu trình phản ứng được thực hiện theo các bước chính sau [6]:

Bước 1 Thuốc (Drug) phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe 3+ ) tạo phức hợp Drug - P450 (Fe 3+ ) Cyt-P450 lúc này biến đổi đương lượng từ trạng thái spin thấp thành trạng thái spin cao Sự biến đổi thế năng oxy hóa gây ra bằng cách này giúp vận chuyển điện tử thứ nhất thuận lợi

Bước 2 Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym

Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe 2+ )

Bước 3 Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa

Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen

và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành

Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da cho thấy: tỉ lệ các biến cố huyết khối đặt stent ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 tăng gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại với p=0,007 [71]

Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011

Các bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 liều clopidogrel 225 mg có tác dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg, còn với bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 thì liều 300mg cũng không có tác dụng chống NTTC [49]

Yang J và cộng sự (2013) cho thấy rằng ở những người mang 1 alen đột biến (*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, 2 /*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1) với p lần lượt là 0,002 và 0,0039 [81]

Yu Chen và các cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu trên 336 bệnh nhân HCĐMVC có can thiệp mạch vành qua da, theo dõi sau 1 tháng và 6 tháng Với nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm mang kiểu gen dại ở cả thời điểm nhập viện và sau 1 tháng (p lần lượt là 0,005 và 0,003) Đồng thời, nguy cơ các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm bệnh nhân mang alen kiểu dại CYP2C19*1 với p=0,003 [37]

Các nghiên cứu trên đều cho thấy, alen CYP2C19*2 chiếm tỉ lệ khá cao trong quần thể nghiên cứu Những bệnh nhân mang alen này cũng cho thấy có biến cố tim mạch nặng hơn so với những người không mang gen Điều này phần nào khẳng định vai trò của CYP2C19*2 trong kháng thuốc clopidogrel

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tính tới thời điểm này, chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, mới chỉ có các nghiên cứu về mối liên quan độ NTTC với một số yếu tố trên bệnh lý khác nhau

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) nghiên cứu “Chỉ số NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường” với chất kích tập tiểu cầu collagen nồng độ 1mg/ml là 65,5±6,7%; với chất kớch tập ADP nồng độ 10àM là 67±6,5%

Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17]

Trương Thị Minh Nguyệt (2003) nghiên cứu độ NTTC trên bệnh nhân thiếu mỏu cục bộ cơ tim với chất kớch tập ADP nồng độ 5àM là 71,6±8,83%, trong đú độ NTTC ở nhóm NMCT cấp là 74,46±9,95%, tăng có ý nghĩa so với nhóm chứng ở tất cả các bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim có các yếu tố nguy cơ như THA, ĐTĐ, béo phì, hút thuốc lá, tiền sử gia đình bị tim mạch Mức tăng độ NTTC có mối liên quan đồng biến mức độ vừa với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng nhóm nguy cơ [15]

Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cũng nghiên cứu về độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp trước và ĐMV cho thấy: độ NTTC ở người bị NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn so với người bình thường là 67±6,5% Bệnh nhân NMCT cấp có nhiều yếu tố nguy cơ thì độ NTTC sẽ cao hơn người có ít yếu tố nguy cơ Độ NTTC giảm rõ rệt sau liều điều trị tấn công của thuốc chống NTTC (Plavix+ Aspirin+ Lovenox) so với trước can thiệp [18]

Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent động mạch vành có điều trị clopidogrel Hiện tại nghiên cứu vẫn đang thực hiện và chưa công bố kết quả cuối cùng

Như vậy, cho tới nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ NTTC với đa hình di truyền gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng này điều rất cần thiết, giúp công tác điều trị và phòng bệnh ĐTNKÔĐ được tốt hơn.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA (American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012)

Bệnh nhân sau khi nhập viện, điều trị với liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin (100mg/ngày) kết hợp clopidogrel (75mg/ngày)

- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel

- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng

- Tai biến mạch não dưới 3 tháng

- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần

- Nguy cơ cao chảy máu

- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018

➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam

- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Viện Tim mạch Việt Nam

- Viện nghiên cứu hệ gen

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

Cỡ mẫu nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn, đồng ý tham gia nghiên cứu, được lựa chọn liên tục cho đến khi đủ cỡ mẫu (54 bệnh nhân) tại Viện Tim mạch Việt Nam.

Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas

- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific

- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)

- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek

- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific

- Chất kớch tập là ADP 5 àM của hóng Nippon Corporation (Nhật Bản)

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)

- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)

- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ

- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.

Các bước nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:

2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu

➢ Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch người bệnh, được chuyển vào ống chuyên dụng có sẵn chất chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn Ghi đầy đủ thông tin của bệnh nhân và mã code để tránh nhầm các mẫu với nhau Lượng máu ở mỗi ống đủ cho hơn một lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu để có thể lặp lại việc tách DNA tổng số cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định

➢ Bảo quản mẫu: Mẫu được bảo quản trong điều kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia

Hà Nội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng

➢ Kí hiệu mẫu: Ống mẫu phải có đầy đủ các thông tin bao gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin của mỗi mẫu phải được lưu lại trong sổ gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng

2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số

2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số

Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:

- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA

- DNA liên kết với màng silica-gel

- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer

- Thu nhận DNA tổng số

2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:

➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang

Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus

Các bước của quy trình thao tác chung:

- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di

- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút

- Thể tớch mẫu điện di: 5 àl mẫu + 1àl DNA 6X loading dye, 5àl Ruler 100

2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm

2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR

Nguyên lý: Nguyên lý của kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn là: DNA mới được tổng hợp từ 1 DNA khuôn ban đầu bằng enzym polymerase Thành phần chính của phản ứng bao gồm: DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trình gồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống thích hợp để mồi tự bắt cặp vào sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào mồi sử dụng như trình tự và số lượng nucleotide của mồi

- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]

Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:

Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm

Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2, *3 Quy trình PCR của 2 alen này được thể hiện trong bảng 2.2 và bảng 2.3 như sau:

Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng

DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút

+ 98˚C trong 10 giây + 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây

- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM

Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3

Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng

DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút

+ 98˚C trong 10 giây + 68˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây

- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM

2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR

Phương pháp điện di được sử dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR Quy trình được tiến hành tương tự như điện di kiểm tra chất lượng tách chiết DNA

2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:

1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1 Mix đều

2 Nếu DNA