Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng

Từ đó bệnh của cây có thể đợc định nghĩalà : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinhvật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trờng mà ta có thể nhìn thấy đợc

Lời cảm ơn Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cán công nhân viên phòng đà tạo điều kiện giúp đỡ em suèt thêi gian thùc tËp võa qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật Lời mở đầu Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân Viện Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984) Hiện nay, Viện nằm địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội Chức Viện : -Nghiên cứu, ứng dúng phơng pháp di truyền học đại công nghệ sinh học để chọn tạo giống trồng có suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh điều kiện bất lợi môt trờng -Tạo chủng vi sinh vật phục vụ bảo quản chế biến lơng thựcthực phẩm, sản xuất loại chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp bền vững bảo vệ môi trờng -Tăng cờng hợp tác quốc tế tham gia đào tạo cán lĩnh vự Di truyền Công nghệ sinh học Để thực đợc chức trên, Viện đà tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu chuyển giao công nghệ với tổng số cán 116 ngêi ®ã cã tiÕn sÜ , phã giáo s, 16 phó tiến sĩ thạc sĩ Trong năm qua, Viện đà đạt đợc nhiều thành tựu, đà thực chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, dự án sản xuất thử, tạo đợc nhiều giống lúa chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo quy trình tiến kỹ thuật đợc công nhận Ngoài ra, Viện thực dự ¸n hỵp t¸c qc tÕ víi c¸c tỉ chøc UNDP, FAO Nhờ thành tự mà Viện đà nhận đợc nhiều giải thởng có giá trị nớc: Giải thởng quốc tế đóng góp phát triển nông nghiêph Châu Thái Bình Dơng, huân chơng lao động hạng giới thiệu chung bƯnh häc thùc vËt I Quan niƯm vỊ bƯnh h¹i thực vật Việc đợc xác lúc bị bệnh vấn đề khó khăn đợc nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ngời ta cho đợc coi khoẻ mạnh phát triển bình thờng biểu chức sinh lý mức tối đa tiềm di truyền Các tế bào mô phân sinh khoẻ mạnh thực chức phân chia chuyên hoá thể đòi hỏi cần thiết Các kiểu tế bào chuyên hoá khác hấp thụ nớc dinh dỡng từ đất, đa nớc dinh dỡng đến tất phận cây, tiến hành trình quang tổng hợp, trình chuyển hoá trao đổi chất, lu giữ sản phẩm trình quang tổng hợp tạo hạt quan tái tạo khắc cho khả sinh tồn phát triển Bất tế bào hay phận có khả thực hay nhiều chức đặc biệt bị can thiệp vi sinh vật yếu tố môt trờng bất lợi hoạt động tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế bị chết trồng trở nên bị bệnh Đầu tiên bệnh xảy mét vµi tÕ bµo vµ vÉn cha biĨu hiƯn nhng chØ mét thêi gian ng¾n, bƯnh lan réng phận bị bệnh bắt đầu thay đổi biểu triệu chứng bệnh mà mắt thờng thấy đợc Dựa vào thay đổi mà thể phản ứng lại xâm nhiễm vi sinh vật hay ảnh hởng yếu tố môi trờng bất lợi mà biết đợc mức độ bệnh Từ bệnh đợc định nghĩa : chuỗi phản ứng tế bào mô thực vật với vi sinh vật gây bệnh với yếu tố môi trờng mà ta nhìn thấy đợc không nhìn thấy đợc, dẫn đến thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, tình trạng nguyên vẹn trồng dẫn đến suy yếu gây chết toàn phần phần Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh cách can thiệp vào trình trao đổi chất tế bào thông qua enzyme, chất độc tố, chất điều hoà sinh trởng loại chất khác mà chúng tiết tiếp xúc với chủ, hấp thụ dinh dỡng tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng chúng Một số sinh vật khác lại gây bệnh cách sống ký sinh phát triển, sinh sản hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe hậu tất yếu làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống nớc đờng Ngoài ra, yếu tố môi trờng gây bệnh thực vật tác động với mức ngỡng chống chịu Có nhiều loại bệnh hại trồng, chúng đợc phân nhóm theo nhiỊu tiªu chn: theo triƯu chøng bƯnh, theo bé phËn bị bệnh, theo loại bị bệnh Hiện nay, phổ biến ngời ta phân loại bệnh dựa vào loại tác nhân gây bệnh Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm loại: bệnh gây yếu tố sinh học bệnh gây yếu tố không sinh học Theo tiêu chuẩn này, ta đợc nguyên nhân gây bệnh, trình tiến triển cách lan truyền bệnh từ suy đợc biện pháp phòng trừ bệnh Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật I Khái niệm chung: Nuôi cấy mô tế bào phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trờng dinh dỡng nhân tạo điều kiện vô trùng Bao gồm: - Nuôi cấy thể thực vật hoàn chỉnh - Nuôi cấy quan, bé phËn t¸ch rêi cđa thùc vËt nh mÈu l¸, mẩu rễ, đoạn thân, phận hoa, - Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành - Nuôi cấy mô sẹo (callus) - Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa tính toàn tế bào Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào thể đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh điều kiện phù hợp Cơ sở vật chất tính toàn tế bào thể đa bào chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền Khi tạo đợc môi trờng nuôi cấy phù hợp, sử dụng chất ®iỊu khiĨn sinh trëng thùc vËt, ta cã thĨ ho¹t hoá gen cần thiết để bắt tế bào thể thực vật phát triển đợc thành hoàn chỉnh Phân hoá phản phân hoá tế bào sở lý thuyết công nghệ Trong đó, phân hoá việc chuyển tế bào phôi sinh trở thành tế bào chuyên hoá để thực chức khác sinh lý, sinh hoá; phản phân hoá chuyển tế bào đà chuyên hoá trở lại trạng thái phôi sinh, có khả phân chia tế bào Điều kiện để tế bào thể tính toàn qua đờng phân hoá phản phân hoá môi trờng nuôi cấy II.Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trờng nuôi cấy yếu tố quan trọng, định cho thành công việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời Thành phần bao gồm: Nguyên tố khoáng đa lợng: Là nguyªn tè nh N, P, K, Mg, S, Ca ,chiÕm nhiều môi trờng nuôi cấy với hàm lợng nguyên tố thờng lớn 30mg/l Chúng nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc Các nguyên tố khoáng vi lợng: Là nguyên tố nh Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn, Co với hàm lợng nguyên tố nhỏ 30mg/l Chúng thành phần coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn tế bào sống Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, mô tế bào chuyển sang phơng thức sống dị dỡng nên cần phải cung cấp cho chúng nguồn cacbon hữu cơ, thờng đờng mía saccaroza (trong số trờng hợp sư dơng glucoza, maltoza, lactoza ) Ngoµi ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rÃi nuôi cấy huyền phù tế bào trần với chức ổn định áp suất thẩm thấu Vitamin: Tế bào mô thực vật điều kiện in vitro có khả tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung vitamin ngoại sinh vào môi trờng cÊy Vitamin thêng dïng lµ nhãm B dƠ hoµ tan vµo níc nh B1, B2, B3, B5, B6 víi hàm lợng từ đến vài mg/l Chúng thành phần coenzim hàng loạt enzim xúc tác cho phản ứng hoá sinh, thiếu môi trờng nuôi cấy *Myo-Inositol hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào vitamin), tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có tác động kích thích mạnh mẽ phân chia tế bào, đợc sử dụng với lợng lớn ~ 100 mg/l Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng môi trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc trình phân hoá phản phân hoá tế bào, thể đợc tính toàn tế bào nuôi cấy tế bào mô thực vật tách rời Ngời ta thờng sử dơng chđ u hai nhãm chÊt ®iỊu khiĨn sinh trëng thực vật sau: - Auxin: kích thích trình tăng trởng tế bào, kích thích hình thành mô sẹo rễ bất định Các loại thờng dùng IAA(axit indolaxetic), αNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lợng dùng nhỏ 10-5-10-7 mol/l - Xytokinin: kích thích phân chia tế bào tạo chồi bất định Các loại thờng dùng Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin), Zeatin, TDZ(Thidiazuron) với hàm lợng 10-5-10-7 mol/l Ngời ta sử dụng phối hợp auxin cytokinin với tỷ lệ hàm lợng phù hợp để đạt mục đích mong muốn Quy luật tơng đối: tỷ lệ auxin xytokinin lớn mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình mẫu cấy tạo mô sẹo, tỷ lệ thấp tạo chồi Ngoài hợp chất Gibberillin có vai trß quan träng sinh lý ngđ nghØ cđa hạt, chồi, phát triển hoa, tăng tởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều nuôi cấy mô phân sinh; hợp chất ức chế sinh trởng: axit absisic (ABA), CCC… sư dơng b¶o qu¶n ngn gen sư dụng bảo quản nguồn gen invitro Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: thành phần thờng dùng nhng không bắt buộc môi trờng nuôi cÊy Bao gåm níc dõa, dÞch nghiỊn mét sè rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt dịch chiết nấm men, hợp chất cazein, pepton để gia tăng chất dinh dỡng, chất có hoạt tính điều khiển sinh trởng phát triển mẫu cấy Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy Thờng dùng Agar agar Đây polysaccarit tảo biển, hoà tan với nớc nhiệt độ lớn 80 0C dạng lỏng nhiệt độ nhỏ 400C lại dạng rắn(gel) Agar có khả ngậm nớc cao, cần 6-12 g làm đông đặc 1l nớc trạng thái rắn tế bào mô thực vật dễ dàng hấp thu đợc chất dinh dỡng từ môi trờng III Nguyên tắc, kỹ thuật chung nuôi cấy mô tế bào: Ngày nay, hầu hết nhà nghiên cứu khoa học thống thành công nuôi cấy mô tế bào đạt đợc trải qua bớc sau: Bớc 0: Bớc chuẩn bị Chọn lọc mẹ đạt tiêu chuẩn sau: - Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần - Có khả sinh trởng phát triển tốt - Sạch bệnh, đặc biệt virus - Nếu tự nhiên đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng mẹ điều kiện cách ly với nguồn bệnh tối u điều kiện chăm sãc, dinh dìng, b¶o vƯ thùc vËt… sư dơng bảo quản nguồn gen để có mẹ đạt tiêu chuẩn Bớc 1: Nuôi cấy khởi động Mục đích giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy th ờng sử dụng phòng thí nghiệm chồi đỉnh, chồi nách mẹ Ngoài ra, tuỳ thuộc đối tợng nuôi cấy ngời ta sử dụng mẫu nuôi cấy nh mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc tiến hành để đảm bảo mẫu vi sinh vËt nhng tØ lƯ sèng cao HiƯn sư dơng chủ yếu phơng pháp sát trùng bề mặt chất hoá học, thờng HgCl2 0,1% sát trùng 5-10 phút phổ biến dung dịch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl)2 5% 20-30 Ngoµi dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhng hiệu kh«ng cao Sau khư trïng mÉu cÊy, ta tiÕn hành đa mẫu cấy vào môi trờng thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm phôi vô tính Việc lựa chọn môi trờng thích hợp khó khăn, cần phải đặc biệt ý đến tỷ lệ, hàm lợng chất điều khiển sinh trởng môi trờng để làm cho mẫu cấy phát sinh đợc hình thái Bớc 2: Nhân nhanh mẫu Toàn trình nuôi cấy mô tế bào xét cho nhằm mục đích tạo hệ số nhân chồi cao Chính giai đoạn đợc coi giai đoạn đánh giá tính u việt hay không u việt phơng pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn này, môi trờng dinh dỡng nhân tạo để nuôi cấy thờng đợc đa thêm vào chất điều khiĨn sinh trëng, c¸c chÊt bỉ sung kh¸c nh níc dừa, nớc chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt đợc hệ số nhân chồi cao mà ®¶m b¶o søc sèng, b¶n chÊt di trun, cã thĨ tạo thành hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn giống giai đoạn sau Tuy nhiên, tuỳ đối tợng nuôi cấy, ngời ta đạt đợc hệ số nhân cao việc kích thích hình thành c¸c cơm chåi hay kÝch thÝch sù ph¸t triĨn cđa chồi nách thông qua việc tạo từ phôi vô tính Bớc 3: Tạo hoàn chỉnh Khi đạt đợc kích thớc định, chồi đợc chuyển từ môi trờng bớc vào môi trờng tạo rễ Thờng sau 2-3 tuần, từ chồi riêng lẻ xuất rễ giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng auxin auxin nhóm hormon thực vật quan trọng có chức tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Tuy nhiên, số loài nh chuối ngái hình thành rễ tốt đạt đợc môi trờng chất điều hoà sinh trởng Bớc 4: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Giai đoạn đa hoàn chỉnh từ ống nghiệm đất bớc cuối quy trình nuôi cấy mô tế bào Cây lấy ống nghiệm phải đợc rửa agar bám bề mặt rễ để tránh xâm nhập côn trùng nấm mốc.Theo Bhojwani Razdan(1983), quy trình thành công trớc đa đất ta ơm cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày Trong khoảng thời gian này, rễ đợcc sinh bắt đầu hình thành Sau chuyển đất với chế độ chăm sóc bình thờng Tuy nhiên số vấn đề tồn việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là: - Sự bất định di truyền + Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy tợng biến dị soma: sai khác hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền tái sinh nhận đợc giai đoạn invitro giai đoạn exvitro + Khắc phục: Chọn mẫu cấy mô non chuyên hoá để dễ điều khiển phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng sử dụng, từ giảm đợc ảnh hởng chúng Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển nhân nhanh (5-6 lần), để giảm tích luỹ, gia tăng ảnh hởng chát điều khiển sinh trởng - Sự nhiÔm mÉu cÊy + Cã mét sè vi sinh vËt có khả xâm nhập tồn sâu hƯ thèng m« dÉn cđa thùc vËt Khi tÕ bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3 tuần nuôi cấy + Khắc phục: Chọn nuôi trồng mẹ tiêu chuẩn, mẹ bị bệnh dùng kháng sinh để khử trùng mẫu - Sự tiết ®éc tè tõ mÉu cÊy + Sau 1-2 ngµy đa vào môi trờng, mẫu cấy tiết chất màu đen, nâu làm hỏng môi trờng, chết mẫu Các chất tanin, polyphenol bị oxy hoá + Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lợng tanin, polyphenol ; gây vết thơng giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy cách ngâm dung dịch axit hữu có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit xitric; bổ sung vào môi trờng than hoạt tính để hấp phụ chất nói - Hiện tợng thuỷ tinh hoá mẫu cấy + Khi nuôi cấy môi trờng lỏng bình nuôi bị hạn chế khả trao đổi khí tế bào mô thực vật bị mọng nớc, trở nên suốt, có hình dạng không bình thờng + Khắc phục: Bổ sung vào môi trờng chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cờng độ chiếu sáng giảm nhiệt độ phòng nuôi IV ứng dụng nuôi cấy mô tế bào công tác giống trồng: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật phục vụ nhiều lĩnh vực khác Trong công tác giống trồng, nuôi cấy in vitro đợc ứng dụng để: - Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống - Duy trì, bảo quản, nhân nhanh giống cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao - Làm virus, phục tráng giống bị thoái hoá bệnh Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính trồng phơng pháp nuôi cấy in vitro đợc quan tâm Ngời ta ớc tính có khoảng 300 loại đợc nhân giống phơng pháp Lợi ích chỗ: tạo quần thể với số lợng lớn mà giữ nguyên đặc tính mẹ, giống khoẻ mạnh, virus, sinh trởng tốt cho suất cao; phục tráng quần thể thực vật có nguy diệt vong; trao đổi quốc tế nguồn gen lu giữ, bỏ quản dạng in vitro Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, ngời ta tạo đợc hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đợc hiệu kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc dễ dàng khắc phục đợc điều kiện bất lợi Phơng pháp tỏ đặc biệt hiệu với loại khó nhân giống đờng hữu tính, giống quý có số lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh 1.3 Các dung dịch đệm dung DAS-ELISA - Dung dÞch Coating pH=9,6 NaCO3 1,59g NaHCO3 2,93g NaN3 Níc cÊt lần 0,20g 1000ml - Dung dịch PBS pH7,4 NaCl 8,00g KH2PO4 0,20g Na2PO4 42,9g KCl NaN3 Níc cÊt lần 0,20g 0,20g 1000ml - Dung dịch PBS Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T: PBS + 0,5ml Tween 20 - Dung dÞch PBS – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) PVP PBS – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone) - Dung dÞch hiƯn mµu (Substrate) pH9,8 Diethanolamine 97,00ml NaN3 0,20g Níc cÊt lần 900ml Phơng pháp nghiên cứu 2.1 Phơng pháp chuẩn bị mẫu - 0,5 gam mẫu đợc lấy vị trí khác (Virus để chẩn đoán bƯnh ta lÊy mÉu ë l¸, mét sè mÉu lÊy ) đợc nghiền dung dịch chiết - Mẫu đợc nghiền dung dịch dịch chiết với tỷ lệ 1/10 (1mg/ 10ml dung dịch đệm) Sau dịch nghiền đợc lọc qua thuỷ tinh để giữ lại phần thực vật không bị nghiền nát để thu đợc dịch đồng Dịch đợc pha loÃng với tỷ lệ khác để: o Xác định ngỡng giới hạn phép thử (Giới hạn độ hoà loÃng kháng nguyên) o Tìm nồng độ hoà lo·ng tèt nhÊt, nã cã nång ®é ®đ ®Ĩ chÈn đoán lợng tác hân gây bệnh đông thời phép thử không bị che khuất sắc tố diệp lục (Để loại trừ diệp lục dịch chiết mẫu nồng độ hoà loÃng thấp ta tiến hành ly t©m ë 7000 rpm phót) 2.2 Phơng pháp DAS-ELISA, bớc tiến hành *Nguyên lý phơng pháp DAS-ELISA Dùng kháng thể đa dòng bao phủ bề mặt giếng để bắt giữ kháng nguyên thích hợp Cho kháng nguyên vào Kháng thể gắn enzyme đợc sử dụng để phát Cuối nhân biết mẫu phản ứng tơng tác với chất màu Hình Nguyên lý phơng pháp ELISA Sandwich kẹp kháng thể lần Cucumber Mosaic Viruses (CMV) Phơng pháp trực tiếp Kháng thể Đặt kháng thể đặc hiệu Bề mặt cứng Đặt kháng nguyên Kháng nguyênngnguyên nguyên Enzyme Đặt kháng thể có gắn ENZYME gọi thể cộng hợp (conjugate) Kháng thể Thể cộng hợp (Conjugate) Chất cho phản ứng nhuộm màu Biểu phản ứng Các bớc tiến hành Đặt kháng thể đặc hiệu đà đợc hoà loÃng dung dịch đệm coating vào giếng đĩa plaque (100l/giếng) o đ 2h ë 370C o Rưa ®Üa plaque lần dung dịch PBS Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T Cho dịch nghiên cứu đà đợc hoà loÃng dung dịch đệm PNS Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T + PVP vào giếng đĩa plaque (100l/giếng) o ủ 370C 2h đêm 40C o Rửa đĩa plaque lần dung dịch PBS – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T Đặt kháng thể gắn enzyme Phosphataza kiềm đà đợc hoà loÃng dung dịch đệm PBS Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T + PVP vào giếng đĩa plaque (100l/giếng) o ủ 370C 2h đêm 40C o Rửa đĩa plaque lần dung dịch PBS – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) T ChÊt nÒn cđa enzyme lµ para Nitro Phenyl Phosphat (pNPP) pha vµo dung dịch đệm màu substrate nồng độ 2mg/ml sau ®ã cho vµo giÕng cđa ®Üa plaque (100l/giÕng) o đ ë 370C 30 ®Õn 2h Khi mn dõng phản ứng dùng 50l dung dịch NaOH 3M để dừng phản ứng Đọc kết máy so mµu quang häc ë bíc sãng 405nm ChØ sè quang häc D.O thĨ hiƯn kÕt qu¶ cđa ph¶n øng O.D lớn gấp lần O.D đối chứng bệnh đà bị nhiễm virus (Theo Sanofi-Pasteur) Iii: Kết thảo luận Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Mẫu đối chứng 10 giếng TEV: kiểm tra mẫu cà chua Mẫu đối chứng 10 giÕng tiÕp theo lµ TSV: kiĨm tra mÉu cµ chua A B C D E F G H 10 TP TP + + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 TP TP + + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 11 12 Bảng tổng hợp kết đo O.D Tên virus Mẫu TEV (Tobacco Etch Virus) 1.6985 TSV (Tobacco Spot Virus) 0.3165