Realtime PCR làm việc với COVID - 19
Mẫu được lấy từ các bộ phận như mũi hoặc cổ họng, nơi virus COVID-19 tập trung Sau đó, mẫu này được xử lý bằng dung dịch hóa học để loại bỏ protein và chất béo, chỉ giữ lại RNA RNA chiết xuất này bao gồm vật liệu di truyền của người và, nếu có, RNA của virus.
RNA được chuyển đổi thành DNA thông qua enzyme trong phương pháp Reverse Transcription PCR Các nhà khoa học bổ sung các đoạn DNA ngắn vào các phần cụ thể của DNA virus, và nếu virus có mặt trong mẫu, các đoạn này sẽ tự động gắn vào Một số đoạn DNA được sử dụng để khuếch đại, trong khi những đoạn khác được dùng để đánh dấu và phát hiện virus, đây cũng là phương pháp được áp dụng để định tính virus COVID-19.
Hỗn hợp mẫu được đưa vào máy real time RT-PCR, nơi trải qua chu trình nhiệt độ để kích hoạt các phản ứng hóa học, tạo ra các bản sao giống hệt nhau của DNA virus Quá trình này được lặp lại nhiều lần, với mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lượng bản sao: từ hai thành bốn, từ bốn thành tám, và tiếp tục như vậy Một thiết lập real time RT-PCR tiêu chuẩn thường thực hiện khoảng 35 chu kỳ, dẫn đến việc tạo ra khoảng 35 tỷ bản sao mới của các phần DNA virus từ mỗi sợi virus trong mẫu.
Khi các bản sao mới của DNA virus được tạo ra, nhãn đánh dấu gắn vào DNA và giải phóng thuốc nhuộm huỳnh quang, được đo và hiển thị trên màn hình theo thời gian thực Máy tính theo dõi lượng huỳnh quang trong mẫu sau mỗi chu kỳ, và khi mức huỳnh quang nhất định được vượt qua, điều này xác nhận sự hiện diện của virus Các nhà khoa học cũng theo dõi số chu kỳ cần thiết để đạt mức này nhằm ước tính mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng: chu kỳ càng ít, mức độ nhiễm virus càng nghiêm trọng.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng và định tính COVID-19 Kỹ thuật này cho phép phát hiện và nhân bản DNA của virus SARS-CoV-2, giúp xác định sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm Việc áp dụng phương pháp PCR trong xét nghiệm COVID-19 không chỉ nâng cao độ chính xác mà còn rút ngắn thời gian chẩn đoán, từ đó hỗ trợ hiệu quả trong công tác phòng chống dịch bệnh Sự phát triển và cải tiến của phương pháp này tiếp tục góp phần quan trọng trong nghiên cứu gen và ứng dụng trong y tế.
Thành phần Real time PCR
Phát hiện sản phẩm PCR theo thời gian thực được thực hiện thông qua việc sử dụng phân tử huỳnh quang để báo cáo sự gia tăng DNA, với tín hiệu huỳnh quang tăng lên tỷ lệ thuận với lượng DNA Các hóa chất huỳnh quang như thuốc nhuộm liên kết DNA và đầu dò đánh dấu cụ thể trình tự được sử dụng để theo dõi quá trình này Để theo dõi huỳnh quang trong quá trình khuếch đại, các bộ tuần hoàn nhiệt chuyên dụng với mô-đun phát hiện huỳnh quang được áp dụng, cho phép đo lường lượng sản phẩm khuếch đại trong từng chu kỳ.
Material
Chìa khóa kỹ thuật chính trong kỹ thuật realtime PCR là hai loại hóa chất thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các sản phẩm PCR trên thiết bị Real time PCR.
Hóa chất nhuộm SYBR ® Green I
Màu huỳnh quang có khả năng gắn kết mạnh mẽ với sợi đôi DNA, tạo ra ánh sáng huỳnh quang khi được kích thích bởi nguồn sáng Sự tăng cường cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ phản ứng cho phép máy đo lường hiệu quả của quá trình này.
Công thức hóa chất nhuộm SYBR® Green I là phương pháp phát hiện đầu tiên, sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ để kết hợp vào DNA sợi kép Trong số các thuốc nhuộm huỳnh quang, SYBR® Green I nổi bật với khả năng phát hiện DNA hiệu quả.
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng và xác định virus COVID-19 Kỹ thuật này cho phép phát hiện và khuếch đại các đoạn DNA của virus, giúp xác định sự hiện diện của nó trong mẫu bệnh phẩm Sử dụng PCR trong nghiên cứu genomic cung cấp thông tin chính xác về sự biến đổi của virus, từ đó hỗ trợ trong việc theo dõi và kiểm soát dịch bệnh Việc áp dụng phương pháp này không chỉ nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn góp phần vào việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
SYBR® Green I là một trong những phương pháp phát hiện phổ biến nhất, đặc biệt hiệu quả khi nghiên cứu một amplicon duy nhất Thuốc nhuộm này có khả năng xen kẽ vào bất kỳ DNA sợi kép nào được tạo ra, giúp nâng cao độ chính xác trong phân tích.
Bất kể phương pháp liên kết, có ít nhất hai yêu cầu đối với DNA thuốc nhuộm liên kết để phát hiện thời gian thực các sản phẩm PCR:
Tăng huỳnh quang khi bị ràng buộc với DNA sợi kép
Việc sử dụng SYBR ® Green I trong PCR không chỉ không gây ức chế mà còn nâng cao độ nhạy phát hiện so với Ethidium bromide Đồng thời, đầu dò phát huỳnh quang Taqman ® cũng góp phần cải thiện hiệu quả của quá trình này.
Đầu dò oligonucleotide sợi đơn có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA đích và được gắn các phân tử phát huỳnh quang Sự phát quang này xảy ra khi đầu dò kết hợp với DNA đích, dẫn đến sự thay đổi cường độ phát quang sau mỗi chu kỳ phản ứng PCR Máy Realtime sử dụng thông tin này để định lượng số bản sao DNA được nhân lên tại từng thời điểm Ngoài ra, còn nhiều cơ chế phát quang khác được phát triển, nhưng đều dựa vào sự thay đổi cường độ huỳnh quang liên quan đến sự gia tăng của phân tử DNA đích.
Phương pháp phát hiện thứ hai sử dụng các oligonucleotide mục tiêu đặc hiệu như TaqMan® probes, Molecular Beacons hoặc Scorpion primers Những oligonucleotide này được gán nhãn bằng thuốc nhuộm huỳnh quang và Quencher Mặc dù bản thân oligonucleotide không phát huỳnh quang đáng kể, nhưng chúng sẽ phát huỳnh quang khi tương tác với mẫu (như trong trường hợp của Molecular Beacons) hoặc khi thuốc nhuộm bị cắt ra trong quá trình mở rộng (như trong đầu dò TaqMan).
Đầu dò TaqMan sử dụng huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR cụ thể trong suốt quá trình chu kỳ PCR Thiết kế của đầu dò này bao gồm sự kết hợp giữa thuốc nhuộm Reporter ở đầu 5′ và một thuốc nhuộm quenching, cho phép theo dõi sự tích lũy của sản phẩm một cách chính xác.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành công cụ quan trọng trong việc định lượng và định tính COVID-19, nhờ vào việc sử dụng đầu dò 5’ nuclease phát huỳnh quang Việc nhuộm Quencher ở đầu 3′ đã đơn giản hóa đáng kể thiết kế và cải thiện hiệu quả tổng hợp các đầu dò này Điều này không chỉ tăng cường độ chính xác của kết quả xét nghiệm mà còn nâng cao khả năng phát hiện virus SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm.
Công nghệ phân tích Real-time PCR
Từ ngày 21 tháng 1 đến ngày 12 tháng 2 năm 2020, 56 bệnh nhân nhiễm SARS-CoV-2 đã được nhập viện tại Bệnh viện Đồng Tế, Vũ Hán, Trung Quốc Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán COVID-19 theo hướng dẫn của Ủy ban Y tế Quốc gia Trung Quốc Mẫu ngoáy họng hoặc ngoáy mũi sâu được thu thập vào các ngày khác nhau sau khi xuất hiện triệu chứng Virus SARS-CoV-2 được phát hiện qua xét nghiệm RT-Real time PCR với bộ phát hiện acid nucleic COVID-19 Hai gen mục tiêu, ORF1ab và protein nucleocapsid (N), đã được kiểm tra trong quá trình xét nghiệm Thời gian chuyển đổi acid nucleic của virus được xác định khi có hai kết quả âm tính liên tiếp Tất cả dữ liệu xét nghiệm được thu thập đến ngày 3 tháng 3 năm 2020.
3.2 Phân tích định tính bằng RT-qPCR
3.2.1 Kiểm tra RT-qPCR là gì?
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao, cho phép khuếch đại và phát hiện DNA một cách hiệu quả Với khả năng phát hiện chỉ từ một đoạn DNA đơn lẻ, PCR đã trở thành phương pháp phổ biến nhất trong lĩnh vực này nhờ vào sự đơn giản và hiệu quả của nó.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều loại mầm bệnh như vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng Tuy nhiên, bộ gen của coronavirus là RNA, không phải DNA Do RNA có sự khác biệt với DNA, enzyme Taq polymerase không hiệu quả trong việc sao chép RNA Vì vậy, để phát hiện RNA, một biến thể của PCR gọi là phiên mã ngược (RT-PCR) được áp dụng Phương pháp này bao gồm hai bước: bước đầu tiên sử dụng enzyme sao chép ngược để chuyển đổi RNA thành DNA (cDNA), sau đó bước thứ hai sử dụng Taq polymerase để khuếch đại cDNA giống như trong xét nghiệm PCR thông thường.
Bước phiên mã ngược diễn ra ở 50°C trong 15 phút, sau đó là vô hiệu hóa RT trong 3 phút và kích hoạt Taq polymerase Giai đoạn PCR bao gồm bước biến tính 5 giây để tách các sợi DNA thành sợi đơn, tiếp theo là ủ nhiệt và polyme hóa trong 45 giây ở 60°C, trong đó mồi khuếch đại và đầu dò phát hiện lai với sợi đơn cDNA Polymerase sao chép khuôn mẫu DNA, tạo ra DNA sợi kép Trong quá trình polyme hóa, đầu dò dịch chuyển và thủy phân, tách fluorophore và giải phóng huỳnh quang Quá trình này thường được lặp lại khoảng 40 lần Một lần chạy RT-qPCR điển hình hoàn thành trong khoảng 1 giờ 27 phút, với định lượng đạt được bằng cách đo cường độ tín hiệu huỳnh quang ở cuối mỗi chu kỳ để suy ra lượng sản phẩm PCR.
Trong quá trình kiểm tra RT-qPCR, tín hiệu được tạo ra nhờ vào các thuốc thử bao gồm chất đệm, enzyme, đoạn mồi DNA mục tiêu và đầu dò DNA cụ thể Hình 3.2.11 minh họa cấu hình nhiệt của thử nghiệm RT-qPCR điển hình được thực hiện trên thiết bị BioRad CFX qPCR.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng và xác định COVID-19 thông qua việc sử dụng các đoạn mồi có nhãn huỳnh quang Trong quá trình này, mẫu RNA mục tiêu được đánh dấu ở một đầu bằng nhãn huỳnh quang và đầu kia bằng chất dập tắt Các mẫu bên trái và bên phải đều chứa cùng một đoạn mồi và mẫu dò, nhưng mẫu bên trái có RNA mục tiêu, trong khi mẫu bên phải không có Việc áp dụng kỹ thuật này giúp nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện và định lượng virus SARS-CoV-2.
Các mẫu được ủ ở nhiệt độ khoảng 50°C để thực hiện phiên mã cDNA đích cụ thể từ một trong các mồi đặc hiệu sợi bên trái, trong khi không có phiên mã ngược ở bên phải.
B Biến tính: Mẫu được đun nóng đến 95°C, làm biến tính RNA nhưng vẫn giữ nguyên cDNA.
Nhiệt độ ủ được điều chỉnh xuống khoảng 60°C, tùy thuộc vào khảo nghiệm cụ thể Việc này cho phép mồi và đầu dò mục tiêu liên kết với mục tiêu tương ứng bên trái, trong khi vẫn giữ cho mồi và đầu dò không bị ràng buộc ở bên phải.
Trong quá trình polyme hóa, polymerase mở rộng tổng hợp DNA bắt đầu từ một mồi, và sau chu kỳ đầu tiên, nó thực hiện việc thay thế và thủy phân các mẫu dò liên kết Quá trình này tách fluorophore khỏi chất dập tắt, dẫn đến phát ra ánh sáng khi fluorophore được kích thích ở bước sóng thích hợp Ngược lại, ở phía bên phải, không có ánh sáng nào được phát ra Chu kỳ đầu tiên này tiếp tục với một số chu kỳ bổ sung do người dùng xác định, được biểu thị bằng các mũi tên trở lại bước B.
Biểu đồ khuếch đại cho thấy sự phát xạ ánh sáng tăng dần từ mẫu bên trái (ô màu xanh lá cây) với kết quả dương tính, trong khi mẫu bên phải không có mục tiêu khuếch đại ghi nhận không có phát xạ ánh sáng và kết quả âm tính.
RT-qPCR có ưu điểm nổi bật trong việc định lượng RNA và tải lượng virus một cách dễ dàng, khi các thông số xét nghiệm được thiết lập đầy đủ và có các đối chứng thích hợp Chu kỳ định lượng (Cq) đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Hình 3 Tạo tín hiệu trong suốt quá trình kiểm tra RT-qPCR
Phương pháp RT-qPCR đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng chính xác và có thể tái tạo nồng độ virus COVID-19 Các giá trị huỳnh quang được ghi lại trong mỗi chu kỳ phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại tại thời điểm đó Số lượng mẫu ban đầu ảnh hưởng đến số chu kỳ cần thiết để đạt được điểm Cq, nơi tín hiệu huỳnh quang lần đầu tiên có ý nghĩa thống kê Điểm Cq luôn xảy ra trong giai đoạn khuếch đại theo hàm mũ, do đó, việc định lượng trở nên hạn chế bởi các thành phần trong phản ứng.
Nhược điểm của qRT-PCR bao gồm sự phụ thuộc vào đường chuẩn, độ nhạy kém với chất ức chế trong mẫu lâm sàng và hiệu suất không ổn định ở nồng độ thấp Thêm vào đó, các xét nghiệm COVID-19 qRT-PCR hiện tại cần nhiều bước xử lý ngược dòng như thu thập mẫu, ly giải virus và tinh chế RNA Quy trình này thường bị hạn chế bởi sự thiếu hụt nguồn cung trong phòng thí nghiệm và bộ dụng cụ chiết xuất RNA, dẫn đến tình trạng tắc nghẽn trong thử nghiệm COVID-19.
3.3 Phân tích định lượng bằng ddPCR 3.3.1 Định nghĩa ddPCR
PCR kỹ thuật số giọt (ddPCR) là một phương pháp tiên tiến trong kỹ thuật PCR, sử dụng công nghệ giọt nhũ tương dầu nước để phân đoạn mẫu thành 20.000 giọt Quá trình khuếch đại PCR diễn ra độc lập trong từng giọt, giúp định lượng DNA với độ chính xác cao.
Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm mồi đích và dấu huỳnh quang, thường là đầu dò Taqman hoặc thuốc nhuộm gắn kết DNA huỳnh quang Kỹ thuật Taqman thường được sử dụng để phát hiện SARS-CoV-2, với gen nucleocapsid và gen orf1ab được chọn làm mục tiêu.
Phân tích định lượng bằng RT-qPCR
Phản ứng
Trong quá trình kiểm tra RT-qPCR, việc tạo tín hiệu là rất quan trọng Thuốc thử kiểm tra bao gồm một chất đệm, các enzyme cần thiết, đoạn mồi DNA cụ thể cho mục tiêu và một đầu dò DNA Hình 3.2.11 minh họa cấu hình nhiệt của thử nghiệm RT-qPCR điển hình được thực hiện trên thiết bị BioRad CFX qPCR.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là một kỹ thuật quan trọng trong việc định lượng và xác định COVID-19 Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi được đánh dấu bằng nhãn huỳnh quang ở một đầu và chất dập tắt ở đầu kia Trong quá trình thực hiện, mẫu bên trái chứa RNA mục tiêu, trong khi mẫu bên phải không có RNA mục tiêu, cho phép phân tích chính xác sự hiện diện của virus Điều này giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong việc chẩn đoán COVID-19, hỗ trợ hiệu quả trong việc kiểm soát dịch bệnh.
A RT: Các mẫu được ủ ở nhiệt độ khoảng 50°C, dẫn đến RT phiên mã cDNA đích cụ thể từ một trong các mồi đặc hiệu sợi ở bên trái, không có phiên mã ngược ở bên phải.
B Biến tính: Mẫu được đun nóng đến 95°C, làm biến tính RNA nhưng vẫn giữ nguyên cDNA.
C Ủ: nhiệt độ được hạ xuống khoảng 60°C, với nhiệt độ thực tế phụ thuộc vào khảo nghiệm Điều này cho phép cả mồi và đầu dò mục tiêu cụ thể liên kết với mục tiêu tương ứng của chúng ở bên trái, trong khi mồi và đầu dò vẫn không bị ràng buộc ở bên phải.
D Polyme hóa: bước này có thể kết hợp với bước ủ. Ở bên trái, polymerase mở rộng quá trình tổng hợp DNA, ban đầu chỉ từ một mồi, nhưng sau chu kỳ đầu tiên từ cả hai, và thay thế và thủy phân bất kỳ mẫu dò liên kết nào Điều này tách fluorophore và chất dập tắt và dẫn đến phát ra ánh sáng nếu fluorophore được kích thích ở bước sóng thích hợp. Ở bên phải, không có điều này xảy ra và không có ánh sáng nào được phát ra Chu kỳ đầu tiên này được theo sau bởi một số chu kỳ xa hơn, do người dùng xác định, được biểu thị bằng mũi tên cố định dẫn trở lại bước B.
E Biểu đồ khuếch đại thu được đối với mỗi mẫu theo dõi sự phát xạ ánh sáng ngày càng tăng đặc tính của kết quả dương tính từ mẫu bên trái (ô màu xanh lá cây),trong khi mẫu không có mục tiêu khuếch đại ở bên phải ghi lại không có phát xạ ánh sáng và kết quả âm tính.
Ưu điểm
RT-qPCR mang lại ưu điểm quan trọng trong việc định lượng RNA và tải lượng virus một cách dễ dàng, khi các thông số xét nghiệm được thiết lập đầy đủ và có các đối chứng thích hợp Chu kỳ định lượng (Cq) đóng vai trò trung tâm trong quá trình này.
Hình 3 Tạo tín hiệu trong suốt quá trình kiểm tra RT-qPCR
Phương pháp RT-qPCR đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng chính xác và có thể tái tạo nồng độ virus COVID-19 Các giá trị huỳnh quang được ghi lại trong mỗi chu kỳ phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại tại thời điểm đó Số lượng mẫu ban đầu ảnh hưởng đến số chu kỳ cần thiết để đạt được điểm Cq, nơi tín hiệu huỳnh quang trở nên có ý nghĩa thống kê Điểm Cq xảy ra trong giai đoạn khuếch đại theo hàm mũ, cho thấy rằng việc định lượng không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong phản ứng, do đó đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Nhược điểm
qRT-PCR gặp nhiều hạn chế, bao gồm sự phụ thuộc vào đường chuẩn, độ nhạy với chất ức chế trong mẫu lâm sàng và hiệu suất không đồng nhất ở nồng độ thấp Bên cạnh đó, các xét nghiệm COVID-19 qRT-PCR hiện tại yêu cầu nhiều bước xử lý ngược dòng, như thu thập mẫu, ly giải virus và tinh chế RNA Quy trình này thường bị cản trở bởi tình trạng thiếu hụt nguồn cung trong phòng thí nghiệm và bộ dụng cụ chiết xuất RNA, dẫn đến tình trạng tắc nghẽn trong quá trình thử nghiệm COVID-19.
Phân tích định lượng bằng ddPCR
Định nghĩa ddPCR
PCR kỹ thuật số giọt (ddPCR) là phương pháp PCR kỹ thuật số sử dụng công nghệ giọt nhũ tương dầu nước, trong đó mẫu được chia thành 20.000 giọt và quá trình khuếch đại PCR diễn ra trong từng giọt riêng lẻ Phương pháp này cho phép định lượng DNA với độ chính xác cao.
Phản ứng
Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm mồi đích và dấu huỳnh quang, thường sử dụng đầu dò Taqman hoặc thuốc nhuộm gắn kết DNA huỳnh quang Kỹ thuật Taqman thường được áp dụng để phát hiện SARS-CoV-2, với gen nucleocapsid và gen orf1ab là các mục tiêu chính.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành công cụ quan trọng trong việc định lượng và xác định virus COVID-19 Qua việc phân tích genomic, phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm Đặc biệt, PCR không chỉ giúp trong việc chẩn đoán mà còn hỗ trợ theo dõi sự lây lan và biến thể của virus Sự phát triển và ứng dụng của phương pháp này đã góp phần đáng kể vào công tác phòng chống dịch bệnh toàn cầu.
Các giọt nhũ tương dầu trong nước được tạo ra bằng chip vi lỏng với các kênh cắt ngang, tạo ra các giọt có đường kính từ 90 đến 120 μm Những giọt này có khả năng chứa không, một hoặc nhiều phân tử mục tiêu, và sự phân bố của các mục tiêu trong các phân vùng tuân theo phân phối Poisson.
Các giọt được làm nóng bằng hệ thống tuần hoàn nhiệt để khuếch đại Sau quá trình này, số lượng phân tử mục tiêu trong các giọt tăng lên hàng chục tỷ, giúp tín hiệu huỳnh quang trong các giọt trở nên dễ dàng phát hiện hơn.
Các giọt được kiểm tra bằng hệ thống phát hiện quang điện, bao gồm tia laser và ống nhân quang, để phát hiện sự phát huỳnh quang của các phân tử mục tiêu Sự phát huỳnh quang này đủ mạnh để phân biệt với huỳnh quang nền Dựa trên biên độ tín hiệu, mỗi giọt được phân loại là tích cực hoặc tiêu cực Sử dụng phân bố Poisson, phần trăm các giọt dương được tính toán nhằm xác định số lượng bản sao tuyệt đối của các phân tử mục tiêu trong hỗn hợp phản ứng ban đầu.
Hình F minh họa kết quả phân tích của phản ứng dPCR đích kép, cho thấy các cụm trong chế độ xem 2D với các kết hợp mục tiêu khác nhau.
Ưu điểm
Phương pháp định lượng tuyệt đối dPCR có ưu điểm là ít nhạy cảm với các chất ức chế hơn so với qPCR, đồng thời việc tính toán số bản sao không phụ thuộc vào tài liệu tham khảo.
Hình 3 Quy trình phản ứng ddPCR
Phương pháp PCR, đặc biệt là dPCR, đã chứng tỏ được độ nhạy cao trong việc định lượng chính xác COVID-19 bằng cách phân chia hỗn hợp phản ứng thành hàng chục nghìn giao dịch con, giảm đáng kể số lượng DNA không mục tiêu trong mỗi phản ứng Điều này giúp giảm nhiễu không đặc hiệu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc khuếch đại mục tiêu Ngoài ra, dPCR cũng có độ ổn định tốt nhờ khả năng tách biệt các chất ức chế khuếch đại, giảm thiểu ảnh hưởng của chúng và cải thiện khả năng phát hiện Cuối cùng, dPCR cho phép phát hiện sự khác biệt về số lượng bản sao với độ chính xác cao hơn so với qPCR, nhờ vào việc tối ưu hóa hỗn hợp phản ứng và tăng số lượng phân vùng trong quá trình xét nghiệm.
Nhược điểm
Đắt hơn so với qPCR
Phạm vi phát hiện động hạn chế
Sự cố với amplicon rất lớn
Luồng công việc phức tạp hơn so với qPCR
Kết quả
Cả qPCR và dPCR đều có khả năng phát hiện nhạy và định lượng chính xác, nhưng mỗi phương pháp lại có những ưu điểm riêng, mang lại lợi ích khác nhau cho các ứng dụng cụ thể.
Phương pháp PCR, bao gồm qPCR và dPCR, đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng và định tính virus COVID-19 qPCR cung cấp thông lượng cao và khả năng sàng lọc hiệu quả cho số lượng lớn mẫu, trong khi dPCR mang lại độ nhạy cao để phân biệt tỷ lệ kiểu đột biến và kiểu thuần, cùng với độ chính xác đáng tin cậy Việc ứng dụng các kỹ thuật này giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và theo dõi sự lây lan của virus.
Cả hai công nghệ đều bổ sung cho nhau, và sự kết hợp của chúng mang lại cho các nhà nghiên cứu nhiều giải pháp đa dạng cho các ứng dụng bộ gen khác nhau.
qPCR
Sự gia tăng DNA qua mỗi chu kỳ được xác định bằng sự thay đổi cường độ tín hiệu huỳnh quang, cho phép so sánh với mẫu tham chiếu để xác định số lượng bản sao gốc của DNA trong phản ứng.
ddPCR
Hình 4 Các giai đoạn khuyết đại qPCR
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành công cụ quan trọng trong việc định lượng và xác định virus COVID-19 Qua việc phân tích gen, phương pháp này cho phép phát hiện sự hiện diện của virus một cách nhanh chóng và chính xác Đặc biệt, PCR đóng vai trò then chốt trong việc theo dõi sự lây lan của COVID-19, cung cấp dữ liệu thiết yếu cho các biện pháp kiểm soát dịch bệnh Sự phát triển của công nghệ PCR đã cải thiện đáng kể khả năng chẩn đoán và giám sát dịch bệnh, góp phần vào công tác phòng chống đại dịch hiệu quả hơn.
Sau chu trình PCR điểm cuối, mỗi phân vùng được phân tích để xác định sự hiện diện của tín hiệu huỳnh quang và tính toán số lượng phân tử tuyệt đối trong mẫu Phương pháp dPCR không cần đường cong chuẩn để thực hiện định lượng.
Hạt dương tính màu xanh dương Hạt âm tính màu đen và nằm dưới ngưỡng.
Compararision
Phát hiện đột biến, SNP, allen bổ trợ
Do độ đặc hiệu cao, ddPCR được khuyến nghị cho việc phát hiện đột biến và SNP, đồng thời phân biệt các alen Công nghệ ddPCR cung cấp độ nhạy cần thiết để nhận diện các biến thể gen một cách chính xác.
Hình 5 Kết quả của PCR vi giọt kỹ thuật số cho 6 phản ứng khác nhau
Hình 6 So sánh ddPCR và qPCR
Phương pháp PCR đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng và xác định các đột biến hiếm gặp của COVID-19, đặc biệt là trong các mẫu không thuần, đơn bội và những mục tiêu có mức độ phong phú thấp trong sinh thiết lỏng như tế bào khối u lưu hành và DNA không có tế bào Đối với các mẫu có mục tiêu hiếm, ddPCR cung cấp độ chính xác và định lượng tuyệt đối, trong khi qPCR thích hợp cho các tần số đột biến trên 1% và phân tích tan chảy có độ phân giải cao (HRM).
Phát hiện tỷ lệ đột biến 1%
Phù hợp kinh tế cho các nghiên cứu sàng lọc lớn
Phạm vi tác động rộng
Biểu hiện gene
qPCR là phương pháp lý tưởng để nghiên cứu biểu hiện gen nhờ vào khả năng định lượng chính xác các mức độ biểu hiện khác nhau và phân biệt các biến thể mối nối Phương pháp này cũng hỗ trợ các ứng dụng thông lượng cao và tự động hóa, đồng thời tiết kiệm chi phí khi xử lý nhiều mẫu Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần phát hiện các thay đổi nhỏ hơn 2 lần, độ chính xác của dPCR có thể được ưu tiên sử dụng.
Dải tác động rộng - đo tốc độ thấp và cao trong cùng một giếng
Tương thích tự động hóa
Nghiên cứu tế bào đơn lẻ, biểu hiện đồng thời protein, định lượng, v.v
Có sẵn các thử nghiệm: 12 sinh vật trong máy thăm dò hoặc SYBR Green Supermix / SsoFast ™ EvaGreen Supermix ddPCR
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là một công cụ quan trọng trong việc định lượng và phân tích gen trong nghiên cứu COVID-19 Kỹ thuật này cho phép phát hiện và xác định nhanh chóng sự hiện diện của virus SARS-CoV-2, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và theo dõi sự lây lan của dịch bệnh Việc áp dụng phương pháp PCR trong nghiên cứu gen giúp cung cấp thông tin chính xác về sự biến đổi gen của virus, góp phần vào việc phát triển vắc xin và các biện pháp điều trị hiệu quả Hơn nữa, phương pháp này còn đóng vai trò quan trọng trong việc giám sát và kiểm soát dịch bệnh, đảm bảo an toàn sức khỏe cộng đồng.
Phát hiện các thay đổi nhỏ - 10%
Định lượng trực tiếp biểu hiện gen
Phân biệt allen bổ trợ
Các thử nghiệm có sẵn: người, chuột, chuột trong cặp đầu dò hoặc cặp mồi choQX200 ™ ddPCR ™ EvaGreen Supermix
Chỉnh sửa gen
dPCR (phân tích PCR số lượng phân tử) được khuyến nghị cho việc phân tích chỉnh sửa gen nhờ khả năng phát hiện tần suất chỉnh sửa thấp, bao gồm cả gen mục tiêu và ngoài mục tiêu Phương pháp này cũng cho phép phân tích các mức gDNA rất thấp Trong khi đó, qPCR (PCR định lượng thực thời gian) thường được sử dụng để sàng lọc quần thể tế bào lớn và nhanh chóng xác định kiểu gen thông qua kỹ thuật HRM (phân tích nhiệt độ nóng chảy cao).
Phát hiện các chỉnh sửa CRISPR / Cas1, ZFN2 và TALEN3
Định lượng NHEJ4 và HDR5 chính xác và nhạy
Phát hiện các sự kiện ngoài mục tiêu qPCR
Phát hiện đáng tin cậy> 1%
Phù hợp kinh tế cho các nghiên cứu sàng lọc lớn
Số lượng bản sao chép
ddPCR được khuyến nghị để phân tích sự thay đổi số lượng bản sao vì khả năng phát hiện chính xác các biến đổi này ngay cả với số lượng bản sao thấp hơn so với qPCR Trong khi đó, qPCR yêu cầu số lượng bản sao cao hơn khi sự khác biệt giữa các mẫu giảm dPCR có thể phát hiện những thay đổi nhỏ trong nếp gấp, cụ thể là sự thay đổi từ 5 đến 6 bản sao Mặc dù vậy, qPCR vẫn hữu ích cho các ứng dụng có thông lượng cao và trong các trường hợp có sự khác biệt lớn về số lượng bản sao.
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành công cụ quan trọng trong việc định lượng và xác định virus COVID-19 Đặc biệt, kỹ thuật ddPCR (Digital Droplet PCR) cho phép phát hiện chính xác nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ trong việc theo dõi sự lây lan của dịch bệnh Việc áp dụng các phương pháp genômik trong nghiên cứu COVID-19 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về virus mà còn cung cấp thông tin cần thiết để phát triển vaccine và liệu pháp điều trị hiệu quả Sự phát triển của công nghệ PCR đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y tế, đặc biệt trong bối cảnh đại dịch toàn cầu.
Phát hiện sự thay đổi trong số lượng bản sao nhỏ với độ chính xác 10% là yếu tố quan trọng trong việc phân tích dữ liệu Thay đổi này có thể được quan sát rõ ràng trên màn hình đầu tiên trong phạm vi thử nghiệm.
Phân biệt số bản sao chính xác và nhạy cảm
Cần ít bản sao qPCR
Phù hợp để phát hiện các biến thể lớn
Chọn phương pháp PCR phù hợp với từng ứng dụng
R T Hayden, Z Gu, J Ingersoll, D Abdul-Ali, L Shi, S Pounds, A M Caliendo.
2012 “Comparison of Droplet Digital PCR to Real-Time PCR for Quantitative
Yan Danga , Ning Liua , Chianru Tanb , Yingmei Fenga , Xingxing Yuana , Dongdong Fanb , Yanke Pengb , Ronghua Jina , Yong Guob, Jinli Lou 2020.
“Comparison of qualitative and quantitative analyses of COVID-19 clinical sample”
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc định lượng và xác định virus COVID-19 Công nghệ này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vật liệu di truyền của virus, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và theo dõi sự lây lan của dịch bệnh Việc áp dụng phương pháp PCR trong nghiên cứu genomic không chỉ giúp nâng cao hiệu quả xét nghiệm mà còn cung cấp thông tin quý giá về biến thể của virus, góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn.