Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 40 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Nội dung
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN MÔN GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP PCR TRONG ĐỊNH LƯỢNG/ĐỊNH TÍNH COVID 19 Giáo viên hướng dẫn: TS PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: TRẦN ĐỖ BẢO NHI_619H0049 NGUYỄN THỊ VÂN ANH_619H0106 ĐÀO CẨM QUYỀN_619H0134 PHẠM QUỐC TUẤN_619H0075 Nhóm : 04 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 Tieu luan Contents Tổng quan RealTime PCR Real time RT-PCR ? .4 2.1 Realtime PCR làm việc với COVID - 19 2.2 Thành phần Real time PCR 2.3 Material .6 Phương pháp .8 3.1 Công nghệ phân tích Real-time PCR .8 3.2 Phân tích định lượng RT-qPCR 3.2.1 Định nghĩa qPCR 3.2.2 Phản ứng 3.2.3 Ưu điểm .10 3.2.4 Nhược điểm .10 3.3 3.3.1 Định nghĩa ddPCR .10 3.3.2 Phản ứng 11 3.3.3 Ưu điểm .12 3.3.4 Nhược điểm .12 3.4 Kết .13 3.5 qPCR 13 3.6 ddPCR 14 3.7 Compararision 14 3.7.1 Phát đột biến, SNP, allen bổ trợ 15 3.7.2 Biểu gene 15 3.7.3 Chỉnh sửa gen 16 3.7.4 Số lượng chép .16 3.8 Phân tích định lượng ddPCR 10 Chọn phương pháp PCR phù hợp với ứng dụng 17 Reference 17 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 MỤC LỤC HÌNH ẢN Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Hình Máy Real-time PCR Hình Cơng thức hóa chất nhuộm SYBR® Green I Hình Tạo tín hiệu suốt trình kiểm tra RT-qPCR .9 Hình Quy trình phản ứng ddPCR 11 Hình Các giai đoạn khuyết đại qPCR 13 Hình Kết PCR vi giọt kỹ thuật số cho phản ứng khác 14 Hình So sánh ddPCR qPCR 14 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA RNA RT - PCR dd PCR acid deoxyribonucleic acid ribonucleic Real Time Polymerase Chain Reaction Droplet Digital Polymerase Chain SARS-CoV-2 Reaction Severe acute qPCR dPCR RT corona virus qualitattive PCR digital PCR Reverse Transcriptase Tieu luan respiratory syndrome (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Tổng quan RealTime PCR Bùng phát vào cuối tháng 12/2019, bắt nguồn từ chợ hải sản Hồ Nam, Vũ Hán, miền Trung Trung Quốc, virus Corona ban đầu xác nhận loại bệnh “viêm phổi lạ” “viêm phổi không rõ nguyên nhân” Các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu phân lập chủng corona virus mới, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tạm thời gọi SARS-CoV-2 có trình tự gen giống với SARS-CoV trước đây, với mức tương đồng lên tới 79,5% Đây dạng virus nên người chưa có miễn dịch, kể miễn dịch chéo trước Khi virus xâm nhập vào thể, vào số tế bào chiếm lấy máy tế bào (gây tổn thương viêm đặc hiệu đường hô hấp), đồng thời virus chuyển hướng máy để phục vụ cho nó, tạo virus nhiễm tiếp người khác Xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR phương pháp xét nghiệm xác định diện virus thông qua phát vật liệu di truyền virus SARSCoV-2, phương pháp có độ xác cao Xét nghiệm realtime RT-PCR cho kết định lượng nồng độ virus thời điểm xét nghiệm Kết giúp bác sĩ tiên lượng tiến triển bệnh, đánh giá hiệu điều trị Hiện có nhiều xét nghiệm khác dựa kỹ thuật qPCR, cho việc phát virus, phịng thí nghiệm toàn giới điều chỉnh xét nghiệm PCRs cho SARS-CoV-2 họ qua việc sử dụng đoạn mồi khác nhắm vào phần khác trình tự gen virus Các xét nghiệm RT-PCR nhắm vào RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp)/helicase, protein gai (spike) nucleocapsid SARS-CoV-2 giúp cải thiện chẩn đốn COVID-19 phịng xét nghiệm PCR định lượng, real time PCR, (qPCR) PCR phiên mã ngược (RTPCR) sử dụng tuyến tính khuếch đại DNA để xác định số lượng tuyệt đối tương đối chuỗi biết mẫu Bằng cách sử dụng phóng viên huỳnh quang phản ứng, đo tạo DNA xét nghiệm qPCR Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Real time RT-PCR ? Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại (amplicon) phát phân tích điểm cuối (end-point), cách chạy DNA gel agarose sau phản ứng kết thúc Ngược lại, Real time RT-PCR cho phép phát đo lường tích tụ sản phẩm khuếch đại tiến triển phản ứng, nghĩa "thời gian thực" Kỹ thuật realtime PCR phương pháp sử dụng để khuếch đại phân tử DNA in vitro Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thông thường chỗ có khả phát định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau chu kỳ phản ứng Phương pháp đòi hỏi máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định biến đổi cường độ huỳnh quang phản ứng khuếch đại Hình Máy Real-time PCR Ưu điểm Real time PCR so với PCR truyền thống Real time PCR cho phép bạn xác định số mẫu với độ xác độ nhạy cao dải động rộng Kết Real time PCR định tính (sự diện vắng mặt trình tự) định lượng (số lượng DNA) Real time PCR định lượng cịn gọi qPCR Ngược lại, PCR thơng thường bán định lượng tốt Ngoài ra, liệu Real time PCR đánh không cần điện di gel, dẫn đến giảm thời gian thí nghiệm tăng thơng lượng Cuối cùng, phản ứng Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Sau đó, giọt nhũ tương dầu nước tạo cách sử dụng chip vi lỏng có kênh cắt ngang (Hình B) Các giọt tạo có đường kính từ 90 đến 120 μm chứa không, nhiều phân tử mục tiêu Sự phân bố mục tiêu phân vùng tuân theo phân phối Poisson Các giọt sau làm nóng tuần hồn nhiệt để khuếch đại (Hình D) Sau chu kỳ nhiệt, số lượng phân tử đích giọt chứa nhiều phân tử tăng lên hàng chục tỷ, đó, tín hiệu huỳnh quang giọt phát Tiếp theo, giọt kiểm tra hệ thống phát quang điện bao gồm tia laser ống nhân quang Sự phát huỳnh quang giọt chứa phân tử mục tiêu đủ mạnh để phân biệt với huỳnh quang (Hình E) Theo biên độ tín hiệu, giọt phân loại tích cực tiêu cực Sử dụng phân bố Poisson, Hình Quy trình phản ứng ddPCR phần giọt dương tính tốn để xác định số lượng tuyệt đối phân tử mục tiêu hỗn hợp phản ứng ban đầu Hình F minh họa kết phân tích phản ứng dPCR đích kép, cụm chế độ xem 2D có kết hợp mục tiêu khác 3.3.3 Ưu điểm Đây phương pháp định lượng tuyệt đối: dPCR nhạy cảm với chất ức chế qPCR việc tính tốn số khơng dựa vào tài liệu tham khảo 13 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Độ nhạy cao: dPCR phân chia hỗn hợp phản ứng thành hàng chục nghìn giao dịch Do đó, số lượng DNA khơng mục tiêu bị giảm vài bậc độ lớn phản ứng có chứa mục tiêu (ví dụ: PCR tùy biến thành 10.000 đơn vị phản ứng, DNA không mục tiêu đơn vị giảm bậc độ lớn) Kết là, nhiễu không đặc hiệu tác động lên mục tiêu giảm số bậc cường độ, điều có lợi cho việc khuếch đại hợp lệ mục tiêu Do đó, dPCR trang bị độ nhạy cao định lượng xác mục tiêu Độ ổn định tốt: Nó tự tách chất ức chế khuếch đại hỗn hợp phản ứng thành nhiều đơn vị phản ứng riêng lẻ, làm giảm tổng số chất ức chế đơn vị cải thiện khả chống lại chất ức chế Hơn nữa, chất ức chế ảnh hưởng đến khuếch đại PCR xét nghiệm dPCR, phản ứng phụ bị ảnh hưởng xác định xác cường độ huỳnh quang chúng cao đáng kể so với huỳnh quang Độ xác cao: qPCR thường xun giải khác biệt gấp đôi số lượng xét nghiệm tiêu tăng gấp đôi chu kỳ cường độ huỳnh quang cao hai lần sau chu kỳ Trong dPCR, mặt lý thuyết phát khác biệt phân tử mục tiêu thơng qua việc tùy ý hóa hỗn hợp phản ứng PCR việc tăng số lượng phân vùng cải thiện độ xác 3.3.4 Nhược điểm Đắt so với qPCR Phạm vi phát động hạn chế Sự cố với amplicon lớn Luồng công việc phức tạp so với qPCR 3.4 Kết Mặc dù qPCR dPCR cung cấp khả phát nhạy định lượng xác, điểm mạnh riêng biệt chúng mang lại lợi khác cho ứng dụng khác 14 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 qPCR cung cấp thông lượng cao dải tác động rộng, hữu ích để sàng lọc số lượng lớn mẫu dPCR cung cấp độ nhạy cho phân biệt phân số (tỷ lệ kiểu đột biến / kiểu ) độ xác tin cậy Cả hai cơng nghệ có khả bổ sung, kết hợp hai phương pháp cung cấp cho nhà nghiên cứu loạt giải pháp cho ứng dụng gen khác 3.5 qPCR Sự gia tăng số lượng DNA chu kỳ đo thay đổi cường độ tín hiệu huỳnh quang So sánh với mẫu tham chiếu xác định số lượng gốc DNA mẫu phản ứng Hình Các giai đoạn khuyết đại qPCR 3.6 ddPCR 15 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 Mỗi phân vùng phân tích sau chu trình PCR điểm cuối để tìm diện hay khơng có tín hiệu huỳnh quang số lượng phân tử tuyệt đối có mẫu tính tốn dPCR khơng u cầu đường cong chuẩn để định lượng Hình Kết PCR vi giọt kỹ thuật số cho phản ứng khác Hạt dương tính màu xanh dương Hạt âm tính màu đen nằm ngưỡng 3.7 Compararision Hình So sánh ddPCR qPCR 3.7.1 Phát đột biến, SNP, allen bổ trợ Do mức độ đặc hiệu cao, ddPCR khuyến nghị để phát đột biến SNP, phân biệt alen ddPCR cung cấp độ nhạy cần thiết để phát 16 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 đột biến gặp kiểu không thuần, dạng đơn bội mục tiêu có mức độ phong phú thấp sinh thiết lỏng (chẳng hạn tế bào khối u lưu hành DNA khơng có tế bào) Đối với mẫu có mục tiêu mà sai lệch khuếch đại xảy ra, ddPCR cung cấp định lượng xác tuyệt đối qPCR phù hợp tần số đột biến biết 1% để phân tích tan chảy có độ phân giải cao (HRM) ddPCR Phát tỷ lệ đột biến 1% Phù hợp kinh tế cho nghiên cứu sàng lọc lớn HRM Phạm vi tác động rộng 3.7.2 Biểu gene qPCR khuyến nghị để nghiên cứu biểu gen, phạm vi tác động rộng nó, với khả định lượng mức độ biểu khác phân biệt biến thể mối nối, khả cho ứng dụng thông lượng cao tự động hóa Ngồi ra, qPCR tiết kiệm xử lý số lượng lớn mẫu Trong số trường hợp, ví dụ, cần phát thay đổi mức thấp ( 1% Phù hợp kinh tế cho nghiên cứu sàng lọc lớn Khả ghép kênh HRM 3.7.4 Số lượng chép ddPCR khuyến nghị để phân tích thay đổi số lượng sao, phát xác thay đổi với qPCR Với qPCR, khác biệt số lượng giảm, số lượng cần thiết tăng lên nhanh chóng dPCR phát thay đổi nhỏ nếp gấp thay đổi số sao, thay đổi từ đến qPCR hữu ích cho ứng dụng thơng lượng cao nơi có khác biệt lớn số lượng 18 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 ddPCR Phát thay đổi số lượng nhỏ - biểu thị độ xác 10% thay đổi hình thay đổi phạm vi thử nghiệm Phân biệt số xác nhạy cảm Cần qPCR Phù hợp để phát biến thể lớn Phổ thông lượng cao Phạm vi động rộng 3.8 Chọn phương pháp PCR phù hợp với ứng dụng Reference R T Hayden, Z Gu, J Ingersoll, D Abdul-Ali, L Shi, S Pounds, A M Caliendo 2012 “Comparison of Droplet Digital PCR to Real-Time PCR for Quantitative Detection of Cytomegalovirus” Yan Danga , Ning Liua , Chianru Tanb , Yingmei Fenga , Xingxing Yuana , Dongdong Fanb , Yanke Pengb , Ronghua Jina , Yong Guob, Jinli Lou 2020 “Comparison of qualitative and quantitative analyses of COVID-19 clinical sample” 19 Tieu luan (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19 (TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19(TIEU.LUAN).TIEU.LUAN.mon.GENOMIC.PHAN.tu.PHUONG.PHAP.PCR.TRONG.DINH.LUONGDINH.TINH.COVID.19