TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ HƯƠNG THẢO
1.1.1 Tên gọi và phân loại thực vật
- Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L
- Tên thường gọi: Hương thảo, dương chổi…
- Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L
- Tên thường gọi: Hương thảo, dương chổi…
Theo phân loại thực vật, Hương thảo được xếp theo trình tự sau:
- Thân: thẳng đứng có nhiều nhánh dài, dạng cây bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, lá và hoa có mùi thơm.
Lá cây có đặc điểm là lá đơn, mọc đối và dày, với mép lá gập xuống Chúng không có cuống và có màu xanh đậm, bóng ở mặt trên, trong khi mặt dưới lá có màu trắng và phủ lông tơ.
Hoa mọc ra từ nách lá, có hình dáng như môi với màu xanh dương, dài dưới 1 cm Đài hoa hình chuông, phủ lông mịn, trong khi tràng hoa có cấu trúc 2 môi, với môi dưới chẻ sâu giống như một số loại hoa lan Mùa hoa nở từ tháng 3 đến tháng 5.
- Quả: giống như hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm gồm 4 quả khô hợp lại, màu nâu
- Toàn cây có mùi rất thơm Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có hoa và lá [2].
Hương thảo, một loài cỏ thơm đặc trưng của vùng Địa Trung Hải, được trồng phổ biến ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi Loài cây này mọc hoang dại dọc theo bờ biển Địa Trung Hải và trong khu vực tiểu vùng Himalaya Từ xa xưa, hương thảo đã được trồng ở nhiều nơi như Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ và Venezuela.
Cây được nhập trồng tại Việt Nam chủ yếu ở các tỉnh miền núi trung du phía Bắc, miền Trung và miền Nam Phương pháp trồng phổ biến là giâm cành hoặc gieo hạt Cây phát triển tốt trong khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá nóng, và yêu cầu đất trồng phải có khả năng thoát nước tốt.
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài Hương thảo
Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) cho thấy rằng hợp chất này được cấu tạo từ một hoặc nhiều đơn vị isopren (C5H8) và có chung một gốc sinh tổng hợp Acid carnosic có thể được chia thành hai loại chính là terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch thẳng Ngoài ra, dựa vào số đơn vị isopren, các terpen còn được phân loại thành monoterpen (C10), sesquiterpen (C15), diterpen (C20), triterpen (C30) và tetraterpen (C40).
Cấu trúc của một số loại terpen như diterpen, triterpen, phenolic diterpen,… trong Hương thảo đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol
Betulin, oleanolic acid, and ursolic acid are key compounds that exhibit various health benefits Additionally, carnosic acid and its derivatives, including carnosol and 12-O-methylcarnosic acid, contribute to their therapeutic properties The compounds 12-methoxy-trans-carnosic acid and 12-methoxy-cis-carnosic acid, along with seco-hinokiol, further enhance the bioactive profile Moreover, 7β-methoxy-abieta-8,13-dien-11,12-dion-(20,6β)-olid and 7α-methoxy-abieta-8,13-dien-11,12-dion-(20,6β)-olid, along with royleanolic acid, are noteworthy for their potential health applications.
(13), rosmanol (14), acid betulinic (15), acid 23-hydroxybetulinic (16), rofficeron (17), epirosmanol (18), methyl carnosat (19) [6]; rosmariquinon
(20), rosmadial (21) [7]; isorosmanol (22); 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [8] Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.2.
Nghiên cứu chiết xuất phần lá và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Acid carnosic, một hợp chất có hoạt tính sinh học cao, không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe mà còn có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Việc chiết xuất và tinh chế hợp chất này từ hương thảo không chỉ góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên mà còn mở ra cơ hội cho các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và mỹ phẩm tự nhiên Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của hương thảo trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Hình 1.2 Cấu trúc của một số terpen phân lập trong Hương thảo
Flavonoid là hợp chất phenol quan trọng có mặt trong hầu hết các bộ phận của thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, nơi chúng tạo ra màu sắc rực rỡ thu hút côn trùng, hỗ trợ quá trình thụ phấn Cấu trúc cơ bản của flavonoid có dạng C6-C3-C6, thể hiện tính chất đa dạng và vai trò sinh học của chúng trong tự nhiên.
Hai vòng benzen A và B được nối với nhau qua một mạch 3 carbon, tạo thành nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến trong dược liệu nguồn gốc thực vật Những hợp chất này thường có màu vàng, nhưng cũng xuất hiện với các màu sắc khác như xanh, tím, đỏ hoặc không màu Trong Hương thảo, đã phân lập được nhiều flavonoid như genkwanin, isocutellarein 7-O-glucosid, 6''-O-(E)-feruloylhomoplantaginin, 6''-O-(E)-feruloylnepitrin, 6''-O-(E)-p-coumaroylnepitrin, 6-methoxyluteolin-7-glucopyranosid, luteolin 3'-O-β-D-glucuronid, luteolin 3'-O-(3''-O-acetyl)-β-D-glucuronid, kaempferol, luteolin, ladanein, hispidulin và diosmethin.
(36), diosmin (37), sinensetin (38), homoplantaginin (39), eriocitrin (40), gallocatechin (41), hesperidin (42), acacetin (43), cirsimaritin (44) [9, 10] Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.3.
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra khả năng tạo ra chất đổi mới Acid carnosic, một hợp chất có giá trị, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm thực phẩm và dược phẩm Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và tinh chế là cần thiết để nâng cao hiệu quả thu nhận và bảo tồn các đặc tính sinh học của hương thảo.
Hình 1.3 Cấu trúc của một số flavonoid phân lập trong Hương thảo
Bên cạnh các hợp chất terpen và flavonoid đã được phân lập, các phenolic cũng được tìm thấy trong loài Hương thảo như: acid rosmanic
(45), acid rosmarinic (46), acid caffeic (47), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-β- D - glucopyranos (48), 1-O-feruloyl-β- D - glucopyranos (49) [9].
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra khả năng ứng dụng của chất này trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm Acid carnosic không chỉ có đặc tính chống oxy hóa mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả hơn Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic từ hương thảo mở ra cơ hội mới trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Hình 1.4 Cấu trúc của một số phenolic phân lập trong Hương thảo
Tổng hợp các nghiên cứu đã công bố cho thấy rằng thành phần hóa học của cây Hương thảo rất đa dạng và phong phú, điều này cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc sử dụng cây Hương thảo trong chữa bệnh trong đời sống hàng ngày.
1.1.6 Tác dụng sinh học và công dụng
Hương thảo là thảo dược hữu ích cho cơ thể suy nhược, choáng do huyết áp thấp, và người mệt yếu do tuần hoàn kém Nó cũng hỗ trợ trong việc cải thiện tình trạng mau quên, tiêu hóa kém, đau nhức cơ, thấp khớp, viêm họng, nhức đầu, căng thẳng thần kinh, và giúp chống rụng tóc Hương thảo có thể được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau.
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã cho thấy các hợp chất trong Hương thảo có nhiều hoạt tính sinh học như:
Năm 2008, Naciye Erkan và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các hợp chất từ Hương thảo, bao gồm acid carnosic, acid rosmarinic và sesamol, cùng với các chiết xuất từ tinh dầu hạt đen Kết quả cho thấy hàm lượng phenolic trong tinh dầu Hương thảo cao hơn (162 mg GAE/g) so với tinh dầu hạt đen (28,2 mg GAE/g), điều này giải thích cho hoạt tính chống oxy hóa vượt trội của Hương thảo Các hợp chất phenolic diterpen như carnosol và acid carnosic, cùng với acid rosmarinic và acid caffeic, được phân lập từ Hương thảo, trong đó acid carnosic và carnosol được công nhận có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, giúp chống lại các gốc tự do.
Chiết xuất etanolic từ cây Hương thảo và acid rosmarinic đã được chứng minh có tác dụng chống viêm hiệu quả qua các nghiên cứu in vivo trên chuột, giảm rõ rệt các dấu hiệu viêm như COX2, PGE-2, IL-1β, MMP2 và NO Nghiên cứu năm 2017 cho thấy khả năng điều trị đau thần kinh và rối loạn thần kinh liên quan đến viêm, trong khi nghiên cứu năm 2013 của Salvan da Rosa chỉ ra rằng carnosol và acid rosmarinic có hoạt tính kháng viêm mạnh, ức chế bạch cầu và giảm tiết dịch, từ đó ngăn ngừa các bệnh lý viêm và tự miễn dịch.
TỔNG QUAN VỀ ACID CARNOSIC
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid carnosic
- IUPAC: (4aR, 10aS)- 5, 6- dihydroxy-1, 1- dimethyl- 7- propan- 2- yl- 2,3,4,9,10,10a-hexahydrophenanthrene-4a-carboxylic acid.
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng của hợp chất này trong các lĩnh vực khác nhau Acid carnosic có đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic từ hương thảo không chỉ cung cấp nguồn nguyên liệu quý giá cho ngành công nghiệp thực phẩm mà còn mở ra cơ hội nghiên cứu sâu hơn về lợi ích sức khỏe của nó.
Độ hòa tan của acid carnosic tăng khi áp suất và lượng etanol tăng Trong các điều kiện áp suất đã nghiên cứu, acid carnosic có độ hòa tan cao hơn ở nhiệt độ thấp Bên cạnh đó, acid carnosic cũng tan trong methanol.
- Hằng số phân lý (pKa): 4,14 ± 0,4 [21].
1.2.3 Tác dụng sinh học của acid carnosic
1.2.3.1.Tác dụng chống oxy hóa
Sự oxy hóa góp phần gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, bệnh tim mạch, rối loạn thần kinh, bệnh Alzheimer, suy giảm nhận thức và lão hóa Acid carnosic, một hợp chất tự nhiên, đã thu hút sự chú ý trong nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa Nghiên cứu của Juan và cộng sự (2006) chỉ ra rằng acid carnosic trong dịch chiết MeOH từ cây Hương thảo có khả năng thu dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC 50 là 9,2%.
Năm 2001, nghiên cứu của Masuda và cộng sự đã chỉ ra rằng cơ chế chống oxy hóa của AC liên quan đến hai nhóm phenol phản ứng trong phần thơm, trong đó nhóm phenolic ở vị trí 11 đóng vai trò quan trọng hơn Nhóm 11-phenolic sẽ cung cấp H+ để tạo ra gốc carnosat, dẫn đến một loạt các phản ứng ghép nối gốc-gốc phức tạp, cuối cùng tạo ra epoxyquinon Epoxyquinon có cấu trúc tương tự như các sản phẩm chống oxy hóa của vitamin E và cũng sở hữu khả năng chống oxy hóa.
Năm 2019, Valentina cùng cộng sự của ông đã làm một nghiên cứu trên
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng acid carnosic có khả năng kháng khuẩn đối với 15 chủng vi khuẩn, bao gồm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus Kết quả cho thấy acid carnosic (AC) hoạt động hiệu quả hơn đối với vi khuẩn gram dương so với vi khuẩn gram âm Sự khác biệt này chủ yếu xuất phát từ tính nhạy cảm của màng tế bào vi khuẩn; lớp bọc lipopolysaccharid ở vi khuẩn gram âm hạn chế sự khuếch tán của AC, làm giảm hiệu quả kháng khuẩn của nó.
Trong một nghiên cứu khác của Ali và cộng sự (2020) cũng chỉ ra rằng
AC có khả năng hoạt động hiệu quả hơn trong việc tiêu diệt vi khuẩn Gram dương so với Gram âm Vi khuẩn Gram âm có cấu trúc thành tế bào và màng tế bào chứa một lượng nhỏ lipid và một lượng lớn peptidoglycan AC tác động như một chất làm biến tính protein, thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn và dẫn đến sự diệt vong của chúng.
1.2.3.3 Tác dụng giảm đau, chống viêm
Acid carnosic là một hoạt chất có tác dụng giảm đau và chống viêm hiệu quả, đã được xác nhận qua nhiều nghiên cứu Nghiên cứu của Guangtao Xia và cộng sự (2017) chỉ ra rằng acid carnosic có khả năng giảm đau và chống viêm khớp ở chuột bằng cách ức chế viêm thông qua việc điều chỉnh con đường p38 phụ thuộc vào ROS Kết quả theo dõi cho thấy các cytokine gây viêm như COX2, TNF–a, IL–1β và IL–18 đều giảm khi chuột được điều trị bằng acid carnosic.
Nghiên cứu của Mei Liu và cộng sự (2018) cho thấy rằng AC không chỉ ức chế sự biểu hiện của các cytokine gây viêm như TNFɑ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, MMP-3 mà còn điều hòa sản xuất RANKL AC có hiệu quả trong cả viêm khớp cấp tính và mạn tính, cho thấy chiết xuất từ cây Hương thảo là một hoạt chất tiềm năng cho việc phát triển thuốc chữa viêm khớp dạng thấp từ thiên nhiên.
Nghiên cứu gần đây cho thấy acid carnosic có khả năng ngăn ngừa một số loại ung thư, bao gồm ung thư ruột kết, ung thư vú và các khối u da Điều này được thực hiện thông qua cơ chế ức chế sự tăng sinh, xâm lấn và di căn của tế bào, đồng thời kích thích quá trình tự chết của tế bào ung thư.
Nghiên cứu chiết xuất phần lạp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra rằng chất này có khả năng chống ung thư Acid carnosic gây ra quá trình apoptosis và làm giảm hoạt động của các enzyme phân giải protein thông qua việc điều chỉnh biểu hiện của mRNA COX-2.
Nghiên cứu của Sicong Jiang và cộng sự (2021) chỉ ra rằng AC làm giảm biểu hiện của các protein trong pha G2/M như MDM2, cyclin B1 và CDC2 Hoạt động chống ung thư của AC được cho là do khả năng kích hoạt con đường tín hiệu qua p21 và thúc đẩy quá trình chết tế bào Liều lượng ức chế của AC phụ thuộc vào kiểu hình của dòng tế bào ác tính, với IC 50 trong ung thư vú từ 25,6 – 96 àM và thấp hơn trong ung thư tuyến tiền liệt, khoảng 19,6 àM đến 22,9 àM.
Acid carnosic đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxy hóa và chống viêm, giúp nâng cao hiệu quả bảo vệ sức khỏe Nhờ vào những đặc tính này, acid carnosic được xem là một yếu tố đầy hứa hẹn trong việc phòng ngừa ung thư, cần được nghiên cứu và phát triển thêm.
1.2.3.5 Bảo vệ thần kinh và chống Alzheimer
Acid carnosic (AC) có khả năng bảo vệ thần kinh, giảm và ngăn ngừa tổn thương tế bào thông qua tác dụng chống oxy hóa và chống viêm AC kích hoạt các đường truyền tín hiệu liên quan đến sự tồn tại của tế bào trong điều kiện căng thẳng, cho thấy vai trò quan trọng trong việc bảo vệ ty thể của tế bào thần kinh Rối loạn chức năng ty thể là nguyên nhân chính gây ra các rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer, Parkinson và Huntington Do đó, nghiên cứu các chiến lược nhằm hạn chế suy giảm ty thể trong các tình trạng thoái hóa thần kinh đang thu hút sự quan tâm trong lĩnh vực dược học.
Acid carnosic (AC) đã cho thấy 17 tác động tích cực lên ty thể não trong các mô hình thực nghiệm về tổn thương thần kinh Dựa trên dữ liệu được thảo luận, AC nổi bật như một ứng cử viên tiềm năng cho vai trò chất bảo vệ thần kinh thông qua cơ chế tác động lên ty thể của tế bào thần kinh.
1.2.4 Ứng dụng của acid carnosic
1.2.4.1 Ứng dụng là phụ gia thực phẩm ở châu Âu
Chất chiết xuất từ cây Hương thảo đã được sử dụng làm chất chống oxy hóa trong ngành công nghiệp thực phẩm hơn 20 năm, chủ yếu từ nhựa dầu Hương thảo hòa tan trong dầu Được công nhận bởi Ủy ban Châu Âu vào năm 2010 với số E392, chất này được sử dụng chủ yếu để bảo quản thực phẩm mặc dù cũng mang lại hương vị Các quy trình chiết xuất phải tuân theo các tiêu chí nghiêm ngặt về độ tinh khiết, bao gồm chiết xuất bằng dung môi hoặc carbon dioxide siêu tới hạn Chỉ các chiết xuất Hương thảo đã khử mùi chứa acid carnosic và carnosol mới được công nhận là phụ gia thực phẩm, với các hợp chất này là các chất chống oxy hóa chính trong chiết xuất.
PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU
1.3.1 Các khái niệm về chất đối chiếu hóa học
Chất đối chiếu (CĐC) là chất đồng nhất được xác định chính xác để sử dụng trong các phép thử hóa học, vật lý và sinh học Trong quá trình thử nghiệm, các tính chất của CĐC sẽ được so sánh với những đặc điểm của chất cần thử Để đảm bảo độ tin cậy, chất đối chiếu cần có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.
- CĐC hóa học được phân loại theo các mức độ như sau [39]:
+ Chất đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS): là chất được công nhận rộng
Vào ngày 19 tháng 7, các chỉ tiêu chất lượng đã được xác định phù hợp với tài liệu công bố, với hàm lượng được chấp nhận làm chuẩn định lượng mà không cần so sánh với bất kỳ chất hóa học nào khác.
Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS) là một loại chất đối chiếu mà các tính chất và chỉ tiêu chất lượng của nó được xác định thông qua việc so sánh với chất đối chiếu sơ cấp Trong quá trình thiết lập SCRS, việc sử dụng chất đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS) để thực hiện so sánh là cần thiết.
1.3.2 Thiết lập chất đối chiếu sơ cấp
Quy trình thiết lập PCRS bao gồm các bước quan trọng như đánh giá nhu cầu, xác định mục đích sử dụng, lựa chọn nguyên liệu, áp dụng phương pháp kiểm nghiệm, xác định hàm lượng, đóng gói và phân phối Tất cả các bước này cần tuân thủ theo hướng dẫn của tài liệu do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ban hành.
Hàm lượng chất đối chiếu và số lượng phòng thí nghiệm tham gia đánh giá phụ thuộc vào mục đích sử dụng Đối với phép thử định tính và thử tinh khiết, chỉ cần 1 phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO/IEC 17025 với hàm lượng khoảng 90% Trong khi đó, phép thử định lượng và hiệu chỉnh thiết bị yêu cầu ít nhất 3 phòng thí nghiệm và hàm lượng không nhỏ hơn 95%.
Các chất đối chiếu là yếu tố quan trọng trong sản xuất và đảm bảo chất lượng ngành Dược Tuy nhiên, giá thành của các PCRS từ Anh, Mỹ, Quốc tế và Châu Âu thường quá cao cho nhu cầu phân tích và nghiên cứu thông thường Do đó, các Hội đồng Dược điển khu vực và quốc gia, cùng với các phòng thí nghiệm đạt chuẩn, đã thiết lập PCRS dựa trên quy trình tạo ra chất đối chiếu thứ cấp.
1.3.3 Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp
Các Hội đồng Dược điển quốc gia hoặc khu vực và các phòng thí nghiệm được ủy quyền xây dựng quy trình thiết lập SCRS dựa trên quy trình PCRS Việc thiết lập SCRS thường diễn ra khi nguồn PCRS không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và đảm bảo chất lượng thuốc Tại Việt Nam, quy trình này được thực hiện theo hướng dẫn cụ thể.
Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng của hợp chất này trong nhiều lĩnh vực Acid carnosic, một hợp chất có hoạt tính sinh học cao, được chiết xuất từ lá hương thảo, có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm, mang lại lợi ích cho sức khỏe Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và tinh chế sẽ giúp nâng cao hiệu quả thu nhận acid carnosic, mở ra cơ hội phát triển sản phẩm tự nhiên có giá trị trong ngành dược phẩm và thực phẩm.
Tiêu chuẩn chất lượng (TCCL) của CĐC bao gồm các chỉ tiêu chất lượng (CTCL) và phương pháp phân tích (PPPT), được xây dựng dựa trên TCCL của các hợp chất trong Dược điển hoặc của nhà sản xuất Các yếu tố này liên quan đến đặc điểm vật lý, hóa học của chất nghiên cứu và mục đích sử dụng của CĐC PPPT dùng để đánh giá CTCL của CĐC phải là các phương pháp trong Dược điển và được dự kiến sử dụng để kiểm tra mẫu theo tiêu chuẩn đó.
Các chỉ tiêu chất lượng cơ bản thường được công bố trên chứng chỉ phân tích của CĐC bao gồm: mô tả và định tính sản phẩm, pH, hàm lượng kim loại nặng, độ ẩm, năng suất quay cực, cắn sau khi nung, điểm chảy, độ trong và màu sắc dung dịch, giảm khối lượng do sấy khô, tro sulfat, tạp hữu cơ bay hơi, tạp chất liên quan và định lượng.
- Một số PPPT trong Dược điển hay dùng để xác định các CTCL của hoạt chất hoặc thành phẩm thuốc [42]:
+ Định tính: IR, HPLC, TLC, UV-Vis, điểm chảy.
Để xác định độ tinh khiết của các hợp chất, các kỹ thuật sắc ký như HPLC và TLC được sử dụng để phát hiện tạp chất liên quan, trong khi GC giúp xác định dung môi hữu cơ bay hơi hoặc tồn dư dung môi Ngoài ra, việc xác định góc quay cực riêng, đo pH, quét nhiệt vi sai, và kiểm tra kim loại nặng cũng rất quan trọng Các phương pháp khác bao gồm xác định tro sulfat, độ ẩm, giảm khối lượng do sấy (sấy thường hoặc sấy chân không) và hàm lượng nước.
+ Định lượng: HPLC, UV-Vis, chuẩn độ thể tích, định lượng bằng vi sinh.
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Lá Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) được thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2021, với chất lượng đồng đều và tươi ngon, không bị sâu bệnh Để đảm bảo tính đồng nhất trong các mẫu khảo sát, nguyên liệu cần được thu hái trong điều kiện khô ráo.
Hình 2.1.Lá Hương thảo sấy khô
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng của hợp chất này trong các lĩnh vực khác nhau Acid carnosic, một thành phần chính trong hương thảo, có nhiều lợi ích cho sức khỏe và được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic từ hương thảo không chỉ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả.
Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu
Tên Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Acetonitril (ACN) Merck, Đức Tiêu chuẩn phân tích
Acid phosphoric Merck, Đức Tiêu chuẩn phân tích
Quốc Tiêu chuẩn phân tích
Tiêu chuẩn tinh khiết, phân tích
- Các hóa chất, dung môi, thuốc thử cần thiết khác dùng trong phòng thí nghiệm.
Bảng 2.2 Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu
Tên thiết bị Xuất xứ
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Waters – 2695D, bộ phận tiêm mẫu tự động, đầu dò PDA 2998; phần mềm Empower.
Cân phân tích điện tử Mettler Todedo – MS 205DU độ chính xác 0,0001g
Cân kỹ thuật Mettler Todedo – MS 205DU độ chính xác 0,01 g
Máy đo hàm ẩm tự động Sartorius Đức
Bảng 2.2 Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu
Máy siêu âm Elmasonic Mỹ
Bộ dụng cụ chiết hồi lưu Việt
Máy cô quay chân không Buchi Thụy
Quốc Bản mỏng Silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn Đức Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) Bruker Mỹ
Một số dụng cụ, thiết bị nghiên cứu khác dùng trong phòng thí nghiệm (tủ sấy, máy xay, cốc thủy tinh, …)
Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng của hợp chất này trong việc ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Acid carnosic nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương do gốc tự do Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic không chỉ nâng cao giá trị dinh dưỡng của hương thảo mà còn mở ra hướng đi mới cho các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả Nghiên cứu này có thể đóng góp vào việc phát triển các phương pháp bảo quản thực phẩm tự nhiên và tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ thiên nhiên.
2.2.1.1 Phương pháp định lượng acid carnosic trong dược liệu Hương thảo bằng phương pháp HPLC a Xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo:
Theo phụ lục 9.6 (DĐVN V), phương pháp xác định hàm lượng ẩm được thực hiện bằng cách sấy khô mẫu với khối lượng khoảng 3g ở nhiệt độ 105°C trong 4 giờ bằng máy đo hàm ẩm tự động.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU
Các số liệu được xử lý bằng thuật toán thống kê và phần mềm MicrosoftExcel 2016.
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền – Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân Y.
Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Viện nghiên cứu y dược học quân sự – Học viện Quân Y.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU HƯƠNG THẢO
3.1.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
3.1.1.1 Kết quả xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả xác định hàm ẩm dược liệu Hương thảo
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng của hợp chất này trong ngành thực phẩm và dược phẩm Acid carnosic, với đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ, có thể bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do và cải thiện sức khỏe tổng thể Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic từ hương thảo không chỉ góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn mở ra cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm thiên nhiên.
3.1.1.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
Chuẩn AC có độ tinh khiết 98%, trong quá trình cân, khối lượng mẫu chuẩn đã cân là 0,0051g Kết quả thu được như sau:
- Tính tương thích hệ thống Kết quả xác định tính tương thích hệ thống được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả xác định tính tương thích của hệ thống HPLC
Hệ số bất đối xứng
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy các thông số như diện tích pic, thời gian lưu và số đĩa lý thuyết đều đạt tiêu chuẩn yêu cầu Điều này chứng tỏ rằng hệ thống sắc ký phù hợp với mẫu phân tích.
Bảng 3.3 Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
T Nồng độ chuẩn AC (àg/ml) Diện tớch pic
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng của chất này trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm Acid carnosic có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm nhờ vào đặc tính chống oxy hóa và kháng viêm Việc chiết xuất và tinh chế acid carnosic không chỉ nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe con người.
- Kết quả bảng trên được minh họa rõ hơn dưới dạng đồ thị ở hình 3.1
Di ện tớ ch p ic (à V* s)
Hình 3.1: Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 39,98 đến 249,9 àg/ml, có sự phụ thuộc tuyến tính rõ rệt giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích Phương trình hồi quy được xác định là y = 13897x – 382209 với hệ số tương quan R² = 0,9995 Điều này cho thấy đường chuẩn đã được xây dựng đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC.
3.1.2 Kết quả xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ Hương thảo
3.1.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết xuất
Khảo sát các loại dung môi như EtOH 50%, 75% và 96% được thực hiện với phương pháp chiết siêu âm Tỷ lệ dung môi/dược liệu được chọn là 15/1, thực hiện chiết 2 lần với thời gian chiết là 40 phút mỗi lần Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong bảng 3.4.
Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã được thực hiện nhằm xác định các hợp chất có lợi cho sức khỏe Acid carnosic nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tiềm năng ứng dụng của hương thảo trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng, đồng thời khẳng định giá trị dinh dưỡng của loại thảo mộc này.
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy rằng khi sử dụng EtOH 50% làm dung môi chiết xuất, hiệu suất chiết đạt được chỉ là 1,85% Tuy nhiên, khi thay đổi dung môi sang EtOH 75% và EtOH 96%, hiệu suất chiết tăng đáng kể, với hiệu suất cao nhất đạt 3,88% khi sử dụng EtOH 96% Do đó, EtOH 96% được lựa chọn làm dung môi chiết xuất cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất
Dựa trên khảo sát dung môi chiết xuất, EtOH 96% được xác định là dung môi chiết tốt nhất Với dung môi này, hai phương pháp chiết xuất được khảo sát là chiết siêu âm và chiết hồi lưu, và kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất
Hiệu suất chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
(%) Phương pháp siêu âm Phương pháp hồi lưu
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy hiệu suất chiết của hai phương pháp chiết siêu âm và chiết hồi lưu là khác nhau Cụ thể, phương pháp chiết hồi lưu đạt hiệu suất cao hơn với giá trị 4,83% Điều này cho thấy chiết hồi lưu hiện đang được ưa chuộng và sử dụng phổ biến hơn trong thực tiễn.
Nghiên cứu chiết xuất phần lặp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) đã chỉ ra tiềm năng của hợp chất này trong việc chống oxy hóa và bảo vệ sức khỏe Acid carnosic không chỉ có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do mà còn hỗ trợ cải thiện chức năng não bộ Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết quan trọng về ứng dụng của hương thảo trong y học và dinh dưỡng, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên.
100g, quy trình chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo được xác định như sau:
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
+ Chuẩn bị nguyên liệu: Hương thảo được sấy ở 70 đến khi ℃ có hàm ẩm
Nghiền nguyên liệu dược liệu bằng thiết bị chuyên dụng, sau đó sấy bột ở nhiệt độ 70°C trong 1 giờ Sau khi sấy, bột được kiểm tra hàm ẩm bằng máy đo và đóng gói trong túi PE kín, 2 lớp Nguyên liệu cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng.
Trước khi tiến hành chiết xuất và cô cao, cần kiểm tra và đánh giá tình trạng hoạt động của máy hồi lưu (Mỹ) và bộ cất quay Buchi (Thụy Sĩ) Đảm bảo rằng các thiết bị này sạch sẽ và không còn dư phẩm để đạt hiệu quả tối ưu trong quá trình chiết xuất.
Cân khoảng 100 g bột dược liệu Hương thảo, cho vào bình cầu dung tích 1 lít.
Đong 500 ml ethanol 96% vào ống đong.
Làm ẩm bột dược liệu bằng một lượng ethanol 96% vừa đủ.
Cho phần Ethanol 96% còn lại vào bột dược liệu.
Tiến hành chiết hồi lưu trong thời gian 40 phút, số lần chiết 3 lần.
Lọc dịch chiết: Gộp dịch chiết từ 3 lần chiết xuất, lọc qua phễu lọc hút chân không để thu phần dịch trong.
- Tiến hành cô thành cắn đến khối lượng không đổi để phục vụ cho quá trình chạy HPLC điều chế.
Nghiên cứu chiết xuất phần lắp và tinh chế acid carnosic từ hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) cho thấy rằng, bằng phương pháp chiết xuất với ethanol 96%, chúng ta thu được 2,8 g sản phẩm.
Hòa tan 1g cắn (tương đương 37,71g Hương thảo) trong MeOH tối thiểu, sau đó lọc qua giấy lọc để loại bỏ cặn Tiếp tục lấy dịch và lọc qua màng lọc 0,45μm trước khi cho vào vial để sử dụng trong quy trình HPLC điều chế.
Sử dụng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.2.1.3, phân đoạn được xác định là acid carnosic Sau khi cô thu hồi dung môi đến khô hoàn toàn, thu được 27,9 mg SPTC.
- Hiệu suất điều chế của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế theo quy trình xây dựng:
- Hiệu suất của quá trình tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo:
3.2 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU ACID CARNOSIC
Quan sát sản phẩm tinh chế: acid carnosic là chất rắn dạng bột màu vàng nhạt, phù hợp với nhận dạng của các tài liệu đã công bố.
3.2.2.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Khảo sát bằng hệ dung môi DCM / MeOH (10 / 1, v/v)
Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC SPTC với hệ DCM / MeOH (10/1, v/v)
Nhận xét: SPTC chỉ có một vết, có màu và giá trị R f = 0,58 trùng với mẫu chuẩn Vì vậy, trong SPTC có chứa acid carnosic
3.2.2.2 Định tính bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều