Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide phe pro 5thp leu(oh) có nguồn gốc từ loài ếch litoria rubella bằng thực nghiệm bắt gốc tự do hydroxyl, abts và frap

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH NGUN BẢO HƯNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHĨNG OXI HĨA CỦA PEPTIDE PHE — PRO - 5HTP - LEU(OH) CÓ NGUỎN GÓC TU LOÀI ÉCH LITORIA RUBELLA BẰNG THỰC NGHIEM BAT GOC TU DO HYDROXYL, ABTS VA FRAP Nganh: HOA PHAN TICH Mã ngành: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHĨ HỖ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành phịng D14 phân tích thí nghiệm trường Đại Học Cơng Nghiệp thành phế Hề Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Thanh Nhã Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 07 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1; GS.1S: Lễ Năm, LẦN seenaersnnitirtiittisttitrena - Chủ tịch Hội đồng PGS.TS Trần Quang Hiếu - Phản biện PGS.TS Trần Văn Mẫn - Phan biện TS Nguyễn Quốc Thắng - - Ủy viên TS Bùi Thị Thu Thủy - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc Si) CHU TICH HOI DONG TRUONG KHOA CONG NGHE HOA HOC GS.TS Lé Van Tan PGS.TS Nguyễn Văn Cường BỘ CƠNG THƯƠNG TRUONG DAI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH CONG HOA XA HOI CHU NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Báo Hưng MSHV: 20000381 Ngày, tháng, năm sinh: 01/03/1989 Noi sinh: Déng Nai Neganh: Hoa phan tich cc ceceeceeeceereeeeceereereneeeenreaes Ma nganh: 8440118 I TEN DE TAI: Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa peptide Phe — Pro — 5hfp — Leu — OH có nguồn gốc từ loài éch litoria rubella thực nghiệm bắt gốc tự đo Hydroxyl, ABTS FRAP NHIEM VU VA NOI DUNG: (1) Khao sat quy trình bắt g6c ty Hydroxyl, ABTS va khtr sit (FRAP) peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH phương pháp quang phổ UV-Vis, đáp ứng đầy đủ thông số thâm định theo TCVN ISO 17025:2017 (2) Nghiên cứu quy trình đánh giá khả chống oxy hóa thực nghiệm cho thấy khả bắt gốc tự đo Hydroxyl, khả tương tác gốc tự ABTS khử sắt huyết tương Frap peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH Những khảo sát bước đầu cho việc nghiên cứu peptide có khả chống oxy hố để bảo quản thực phẩm phát triển y hoe II NGAY GIAO NHIEM VỤ: Il NGAY HOAN THANH NHIEM VỤ: IV NGUOI HUONG DAN KHOA HOC: TS Tran Thi Thanh Nha Tp H6 Chi Minh, thang ndm 20 23 NGUOI HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO (Ho tén va chit ky) (Ho tén va chit ky) TRUONG KHOA CONG NGHE HOA HOC (Ho tén va chit ky) LỜI CÁM ƠN Luận văn Thạc sĩ ngành Hóa phân tích với đề tài “Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa peptide Phe — Pro — Shtp — Leu — OH bang thie nghiém bat géc ty Hydroxyl, ABTS khứ sắt FRAP” trình cố gắng, nễ lực không ngừng ban than cộng với giúp đỡ, khích lệ quý Thầy Cơ, bạn bè người thân gia đình suốt trình nghiên cứu học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Thanh Nhã trực tiếp hướng dẫn thực đề tài hướng dẫn tơi tận tình suốt q trình Tơi chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường tồn thể q thầy khoa Cơng Nghệ Hóa trường Đại Học Cơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực nghiệm trường Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy cô viện đào tạo quốc tế Sau Đại Học hỗ trợ, hướng dẫn nhiều học trường LOI CAM DOAN Tôi tên là: Nguyễn Báo Hưng, học viên cao học chun ngành Hóa Phân tích, lớp CHHOPTI10A, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Tôi cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận văn cơng trình tơi với hướng dẫn giảng viên hướng dẫn TS Trần Thị Thanh Nhã, Trường Đại học Công nghiệp Thành phế Hề Chí Minh Những kết nghiên cứu tác giả khác sử dụng luận văn có trích dẫn đầy đủ Học viên (Chữ ký) Nguyễn Bảo Hưng il TĨM TẮT Éch Litoria rubella từ Úc nghiên cứu vài thập kỷ cho thấy tuyến da lưng chúng tiết số peptide nhỏ chứa trình tự Pro-Trp, gọi peptide /pfophvillin L Peptide Phe — Pro — Trp — Leu(NH›) nghiên cứu cho thấy khả phần chất chống oxy hóa đa giúp ếch đối phó với thay đổi mạnh mẽ mức độ tiếp xúc với oxy độ âm, chúng sống khu vực rộng lớn Úc với thay đổi khí hậu rộng rãi Mặc dù peptide từ nhiều ếch Úc báo cáo có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, hoạt tính sinh học họ peptide chưa khám phá Trong nghiên cứu này, peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH peptide khác có nguồn gốc từ lồi ếch có đặc điểm đặc biệt thay tryptophan 5-hydroxytryptophan (5HTP) 5-hydroxytryptophan amino acid chuyển hóa tryptophan nghiên cứu cho thấy khả chống oxi hóa cao đứng riêng rẽ Vì vậy, để xác định khả chống oxy hóa tồn diện peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, peptide tổng hợp đánh giá bắt gốc tự OH, ABTS” khử sắt (FRAP) Các thử nghiệm rang peptide Phe-Pro-SHTP-Leu-OH cé kha nang bat gốc tự Hydroxyl khả chống oxi hóa qua hai thử nghiệm bắt gốc ABTS” khứ sắt FRAP Điều góp phần cho việc khám phá peptide ứng đụng cho phát triển y học bảo quản thực phẩm 1H ABSTRACT The red tree frog Litoria rubella from Australia has been studied for several decades showing that their dorsal skin glands secrete a number of small peptides containing a Pro-Trp sequence, known as fryptophyllin L peptides, Phe - Pro - Trp - Leu(NH2) peptide was studied and shown to be part of a skin antioxidant that helps frogs cope with drastic changes in oxygen and moisture exposure, as they live over a large area of Australia with extensive Australian climate variability Although frog genera have been peptides from reported to have a wide several range of biological activities, the bioactivities of this peptide family have yet to be uncovered Phe-ProS5HTP-Leu-OH species, peptide, another peptide produced is distinguished hydroxytryptophan from the aforementioned in this study by the substitution (SHTP) 5-hydroxytryptophan is of tryptophan a tryptophan amino frog by 5acid metabolite that has been examined and demonstrated to have a strong antioxidant capability on its own To establish the overall antioxidant capability of the Phe-Pro5HTP-Leu-OH peptide, it was produced and tested for OH, ABTS® scavenging, and iron reduction (FRAP) reduction tests reveal that the free radical ABTS* radical scavenging and FRAP iron Phe-Pro-SHTP-Leu-OH peptide can scavenge Hydroxyl free radicals and exhibits antioxidant activity This aids in the discovery of novel peptides for medical applications 1V MỤC LỤC ABSTRACT iv MUC LUC V DANELMUC BINECANET ueeessseendsetnstedpibiilttilbisDUDIDSAG1E900G01S000100G3H80 i DANH MUC BANG BIEU 9I28)00/900A32030á000 xi "607100055 lạ Đi HH sannnnưnhototBEIHIGSBHE300G300DIĐIGEEDNSUEHUNGEGDIGNSEBIR-GTIREDIGEEHIIGHHUNRIDIDIGBEHE VY 0ï nàn iu Đối tượng vả nhiệm vụ nghiÊn CỨU Ý nghĩa đề tài CHUONG lì ác: tt ST HH Hi rre 55 2s 222221121112111221221112122122222222222222 2a TỎNG QUAN VẺ LĨNH VỰC NGHIÊN CƯU INH§u 0n (na 1:1;z2 Danh phấp DeDH[GticiicsesnnibsdiieHeHEEEESISEEIESESSIREGEIREIGEIHHSSAMHSeBASetonB 1.1.3 Ứng đụng peptide có hoạt tính chống oxi hóa ©22-222222222cc2zeerxcee a 1.2 Gốc tự đo chất chống oxy hóa -22-222 22222212111221121112211211221 212C 1221 (Se ters yeas ssczse cence aoa vem annem nunc mece aoa ee moneee none sncasnnecenae 1.2.2 Ảnh hưởng gốc tự co thể sinh vật -ccccccccscee 1.2.3 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa -552 22 2212212221222 .ee 10 1.2.4 Peptide chống oxy hóa nội sinh (GSH) khả chống oxy hóa tương đương Trolox (AC siitno tia tHg tay LH EEX TH GIĐI HAY HH HYHHEĐĐYLHRGEXHHUEEHEHUUSEDSiEtidoawt 11 13 Téng quan vé peptide Phe — Pro — 5HTP - Leu - OH . .-2 13 1.3.1 Giới thiệu éch Litoria rubella cccceseeeeeeeseessssssssssssnnieeeeeesseeeesssnsesens 13 1.3.2 Téng quan vé peptide tryptophyllin L téng hop tir da ếch Litoria rubella 16 1.3.3 Téng quan vé peptide Phe — Pro — 5HTP — Leu — OH . -+.-2 18 14 Cac phwong phap danh gia hoat tinh chéng oxy h6a o.oo ee cece eee eee 19 1.4.1 Phương pháp khử sắt FRAP -2 2222 S222221222122122212222222222222 xe 20 1.4.2 Phương pháp bắt gốc ABTST 22222 2212221222122122212212222222222 xe 1.4.3 Phương pháp bắt gốc Hydroxyl In 000/5 21 1.5.1 Nguyên tắc sở định lượng -2222222122212221222122222212222 xe 21 1.5.2 Trang bị so dé khéi ca m6t may UV-VIS ooo ec cee cece teceeteeees 22 CHƯƠNG? Dll N61 dungen THUCNGHIỂNH:ss.eczszreeoindnsannuoonatngosnseostdyen 23 gh Ste ewesecncosecsersennnzovsennaenveunwenveusneesenerisnnaer umwmeuenmwenveumaeest 23 2.1.1 Phương pháp khử sắt huyết tương FRAP peptide 23 2.1.2 Phương pháp bắt gốc tự đo ABTS peptide . 222222 22 zzcxrev 25 2.1.3 Phương pháp bắt gốc tự đo Hydroxyl peptiđe 222222 27 2.1.4 Đánh giá phương pháp phân tích St t2 nhe 29 2.2 Khảo sát thông số tối ưu phương pháp FRAP .-.©22-222S2zsze2 30 2.2.1 Khảo sát phê hấp thu tối ưu phương pháp FRAP 22-222 S2 sec 30 2.2.2 Khảo sát thể tích hỗn hợp thuốc thứ FRAP phương pháp FRAP 31 2.2.3 Xây dựng đường chuẩn phương pháp FRAP 22222222 222221222222e2 31 2.3 Nghiên cứu khả khử sắt peptide theo phương pháp FRAP 32 2.3.1 Khảo sát khả khử sắt peptide theo nồng độ phương pháp FRAP 32 2.3.2 Khảo sát điểm kết thúc phản ứng phương pháp FRAP 33 2.3.3 Phân tích mẫu phương pháp FRAP .-255S 22t 2x22eEtrzrerke 33 2.4 Khảo sát thông số tối ưu phương pháp ABTS . -222:S2zscc¿ 34 2.4.1 Khảo sát phê hấp thu tối ưu phương pháp ABTS 34 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích hỗn hợp thuốc thử ABTS 35 2.4.3 Xây dựng đường chuẩn trolox phương pháp ABTS . 36 2.5 Nghiên cứu bắt gốc tự ABTS Peptide theo phương pháp ABTS SENH408759912470P10ESRETS04i0N1t191800105105120170141910101200070012070901202DE019124001014/4E1900-1201/1800070050 36 2.5.1 Khảo sát khả bắt gốc tự đo peptide theo nồng độ phương pháp 11 36 2.5.2 Khảo sát điểm kết thúc phản ứng phương pháp ABTS 37 2.5.3 Phân tích mẫu phương pháp ABTS . -72: 2222221 2112221221212E re 38 2.6 Khảo sát thông số bắt gốc tự đo HYDROXYL ò2-.22cS2c sec 39 Mi 2.6.1 Khảo sát phê hấp thu tối ưu phương pháp HYDROXYL 39 262Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Deoxyrebose phương pháp HYDROXYL, 4Aäädd5 39 2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng pH phương pháp HYDROXYL 40 2.6.4 Khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh gốc tự HYDROXYL phương 0") 0sb40) (9a ee eee cece eeeesececcecceresieneneeeeeerseeesetisesevesesseeaeeeaeees 41 2.6.5 Khảo sát thời gian ủ hỗn hợp phản ứng sinh gốc tự HYDROXYL H80) 10s040)405ea0115 41 2.6.6Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trình phân ứng sinh gốc tự HYDROXYL phương pháp HYDROXXYL ì c c Scnhere 42 2.6.7 Khảo sát thời gian bền màu phương pháp HYDROXYL 43 2.6.8 Nghiên cứu khả bắt gốc tự Peptide theo phương pháp HYDROXYL, " 44 CHUONG3 3.1 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN .-tt trai 45 Kết khảo sát thông số tối ưu phương pháp FRAP 45 3.1.1 Kết khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp FRAP 45 3.1.2 Kết khảo sát tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử FRAP phương pháp FRAP 45 3.1.3 Kết xây đựng đường chuẩn phương pháp FRAP - 46 3.2 Kết nghiên cứu khả khử sắt peptide tối ưu phương 010011 47 3.2.1 Kết khảo sát khả khử sắt peptide theo nồng độ phương pháp + ,2.AHL.Ỏ 47 3.2.2 Kết khảo sát điểm kết thúc phân ứng phương pháp FRAP 48 3.2.3 Kết phân tích mẫu phương pháp FRAP 22222222222 222221222.ee 49 3.3 Kết khảo sát thông số tối ưu phương pháp ABTS 30 3.3.1 Kết khảo sát phô hấp thu tối ưu phương pháp ABTS 30 3.3.2 UBS Kháo sát ánh hưởng tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử ABTS phương pháp suuyngrnttieeoioitidrnrlgtidztrtoiL0Đ11191400110500/4D190Đ10 08 001001159909150005491180900758500097100000918) 51 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn trolox cia phuong phap ABTS eee 3.4 32 Nghiên cứu bắt gốc tự đo ABTS Peptide theo phương pháp ABTS Vii Do sai số ngẫn nhiên trình phân tích nên phép thử nghiệm thường khơng cho kết giếng nhan Để kiểm soát sai số này, người ta dùng khái niệm độ lặp lại Độ lặp lại phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên không liên quan đến giá trị thực Độ lặp đánh giá cách đối chiếu giá trị tính với giá trị RSD% lặp lại tương ứng theo quy định Tiền hành cách thực thí nghiệm lặp lại mẫn, tính độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) hay hệ số biến thiên (CV%) theo công thức sau: 2.2 Khảo sát thông số tối ưu phương pháp ERAP 2.2.1 Khảo sắt phỗ hấp thu tối ứu phương pháp FRAP Phương pháp trắc quang dùng tia đơn sắc để chiếu vào dung dich thu nhận độ hấp thu quang A Nếu A thu nhận lớn nhất, gọi phổ hấp thu cực đại, sử dụng kết phân tích có độ nhạy cao Tuy nhiên khơng phải bước sóng cực đại bước sóng tối ưu Giá trị bước sóng tối ưu cố định cho tất khảo sát Phổ hấp thu phức tiến hành với nồng độ sau pha loãng FRAP 10 HM, 25 WM, 50 HM Mẫu trắng thực song song không chứa dung địch chuẩn EeSOa Quy trình thực bảng 2.3 30 Bảng 2.3 Quy trình khảo sát phê hấp thu phức phương pháp FRAP Bình Nơng độ dung địch chuẩn Fe?' (mM) 0.06 0.15 03 Thể tích dung dịch chuẩn (mL) Thể tích hỗn hợp thuốc thứ (mL) Lắc để yên 30 phút bể điều nhiệt nhiệt độ 37°C Đo mật độ quang bước sóng 4=400-800 nm 2.2.2 Khảo sát thể tích hỗn hợp thuấc thử FRAP phương pháp FRAP Thể tích hỗn hợp thuốc thử ảnh hưởng khả bắt gốc phức Thể tích hỗn hợp thuốc thử nhỏ khơng đủ khử phức màu vàng sang phức màu xanh tím, với lượng thuốc thử dư gây ảnh hướng đến khả bắt gốc gây lãng phí hố chất Phương pháp FRAP thực karamac đồng nghiệp tỉ lệ thê tích thuốc thử chọn 1:5 (v v) (2016) Vậy nên cần khảo sát thê tích hỗn hợp thuốc thứ FRAP tối ưu Khảo sát lượng thê tích hễn hợp thuốc thứ nềng độ GSH sau pha loãng FRAP 0.1 mM với thê tích thuốc thử thay đổi từ I đến 10 mL Mẫu trắng thực song song không chứa dung dịch chuẩn GSH Quy trình thực bảng 2.4 Bảng 2.4 Quy trình khảo sát ảnh hưởng hỗn hợp thuốc tht Frap phương pháp FRAP Bình Nong d6 GSH mM Thể tích GSH (mL) Thể tích hỗn hợp thuốc thử (mL) 10 0.2 | 0.3 | 04 | 05 | 06 | 0.7 | 08 | 09 1.0 11 ] 2 J4 |3 ]4 |5 ]|56|]7 |5] |0 Lắc đêu đề yên 30 phút bê điều nhiệt nhiệt độ 37°C Đo quang À =593 nm 2.23 Xây dựng đường chuẩn phương pháp FRAP Nềng độ chất phân tích có mẫu phải nằm giới hạn cao thấp đường chuẩn Giới hạn chấp nhận đường chuẩn hệ số hồi quy tuyến tính phải đạt yêu cầu sau: 0.99 < R2