Luận án nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐẶNG TRƯỜNG GIANG ận Lu án NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC tiế TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA n PHYTOSOME SILYBIN sĩ ới M ất nh LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐẶNG TRƯỜNG GIANG Lu ận NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA án PHYTOSOME SILYBIN tiế Ngành đào tạo: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc n Mã số: 972 02 02 sĩ M ới LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC ất nh NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hữu Mỹ PGS.TS Nguyễn Văn Long HÀ NỘI – 2023 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục hình Lu Chương TỔNG QUAN ận ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN VỀ SILYBIN án 1.1.2 Cơng thức hóa học 1.1.3 Tính chất lý hóa 1.1.4 Dược động học sĩ 1.1.5 Tác dụng dược lý n tiế 1.1.1 Nguồn gốc M 1.1.6 Công dụng, liều dùng, tác dụng không mong muốn ới 1.1.7 Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống 1.2 PHYTOSOME ất 1.2.1 Khái niệm nh silybin 12 12 1.2.2 Thành phần phytosome 13 1.2.3 Ưu, nhược điểm phytosome 15 1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome 16 1.2.5 Các tiêu đánh giá phytosome 21 1.2.6 Một số nghiên cứu bào chế phytosome silybin 26 1.3 MỘT SỐ NỘI DUNG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME 26 1.3.1 Nội dung đánh giá sinh khả dụng phytosome 26 1.3.2 Nội dung đánh giá tác dụng bảo vệ gan phytosome 28 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.1.1 Nguyên vật liệu 30 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31 2.1.3 Động vật thí nghiệm 32 Lu 2.1.4 Địa điểm thực nghiên cứu 33 ận 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin 34 án 2.2.2 Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin tiế 48 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 55 n Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 sĩ 3.1 KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 57 M 3.1.1 Kết nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid 57 67 nh thí nghiệm ới 3.1.2 Kết nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng 3.1.3 Kết bào chế, đánh giá số đặc tính tiêu chất lượng ất phytosome silybin quy mô 150g/mẻ 3.1.4 Theo dõi độ ổn định phytosome silybin 88 102 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 3.2.1 Kết đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin 105 105 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng độc tính cấp độc tính bán trường diễn phytosome silybin thực nghiệm 111 3.2.3 Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin chuột cống trắng thực nghiệm 115 Chương BÀN LUẬN 119 4.1 VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 4.1.1 Về nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid 119 119 4.1.2 Về nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng thí nghiệm 120 4.1.3 Về đánh giá số đặc tính phytosome silybin 129 4.1.4 Về theo dõi độ ổn định phytosome silybin 136 Lu 4.2 VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG ận BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 4.2.1 Về đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin án 4.2.2 Về đánh giá độc tính phytosome silybin 137 137 143 tiế 4.2.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin 143 4.3 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 148 sĩ KIẾN NGHỊ n KẾT LUẬN 146 150 M DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ PHỤ LỤC ất nh TÀI LIỆU THAM KHẢO ới CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt ̅ X/TB Giá trị trung bình Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 13C 13 Phần viết đầy đủ C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 1H H-NMR (Hydro-1 Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 31P Lu P-NMR (Phospho-31 Nuclear Magnetic Resonance) ận 31 Aerosil ALT Alanine Aminotransferase AST ATP AUC0-24/∞ án AE Aspartate aminotransferase tiế Adenosine triphosphat n Diện tích đường cong nồng độ - thời gian từ sĩ thời điểm đến 24 giờ/vô CR Chất rắn 11 Cmax Nồng độ đỉnh máu 12 COX Cyclooxygenase 13 CTPT Công thức phân tử 14 cs Cộng 15 DCM Dichloromethan 16 DĐVN Dược điển Việt Nam 17 DLS Tán xạ ánh sáng động học (Dynamic light ới M 10 ất nh scattering) 18 DMSO Dimethyl sulfoxide 19 DNA Phân tử mang thông tin di truyền (Acid Deoxyribonucleic) TT 20 Phần viết tắt DSC Phần viết đầy đủ Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential scanning calorimetry) 21 ĐT Độ tan 22 EE Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (Entrapment efficiency) 23 Kỹ thuật ion hóa phun điện (Electrospray ESI inonization) EtOH Ethanol 25 h Giờ (Hours) HC Hoạt chất HLB Hằng số cân dầu nước 26 HPLC (Hydrophilic Lipophilic Balance) Sắc ký lỏng hiệu cao tiế 28 án 27 ận Lu 24 n (High-performance liquid chromatography) Hps Hiệu suất phun sấy 30 HQC Nồng độ định lượng cao sĩ 29 M (High Quantitative Concentration) HSPC ới 31 Phosphatidyl cholin đậu nành hydrogen hóa nh (Hydrogenated soy phosphatidyl cholin) Hth Hiệu suất thu hồi hoạt chất 33 IR/ FT-IR Phổ hồng ngoại phổ hồng ngoại biến đổi ất 32 Fourier (Infrared spectroscopy Fourier transform Infrared spectroscopy) 34 KLPT Khối lượng phân tử 35 KTTP Kích thước tiểu phân 36 LD50 Liều gây chết 50% số động vật thí nghiệm (Lethal Dose) TT 37 Phần viết tắt LOD Phần viết đầy đủ Giới hạn phát (Limit of Detector) 38 Log P/Log D Hệ số phân bố dầu - nước (Partition coefficient/Distribution coefficient) 39 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) 40 LQC Nồng độ định lượng thấp (Low Quantitative Concentration) m/z Khối lượng/điện tích ion 42 MD Maltodextrin 43 MQC Nồng độ định lượng trung bình MRT (Medium Quantitative Concentration) án 44 ận Lu 41 Thời gian lưu trú trung bình (mean retention/residence time) tiế Phổ khối lượng (Mass spectrometry) 45 MS 46 NSX 47 NXB Nhà xuất 48 NN-LN Nhỏ - Lớn 49 PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate n Nhà sản xuất sĩ ới M Buffered Saline) PC Phosphatidyl cholin 51 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 52 PL Phospholipid 53 PSC Phổ tương quan photon (photon correlation ất nh 50 spectroscopy) 54 PVP Polyvinylpyrrolidone 55 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) 56 SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) TT 57 Phần viết tắt SEM Phần viết đầy đủ Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) Si-A/Si-B Silybin A/ Silybin B 59 Si-PC Silybin-phosphatidyl cholin 60 Siphy/ Sitp Silybin dạng phytosome/Silybin toàn phần 61 SKD Sinh khả dụng 62 SKĐ Sắc kí đồ 63 SMEDDS Hệ phân phối thuốc tự vi nhũ hóa Lu 58 ận 64 (self-microemulsifying drug delivery system) Phosphatidyl cholin đậu nành SPC án TBA 67 TD/CR 68 TEM Tert-butylalchol Tá dược/chất rắn Kính hiển vi điện tử truyền qua sĩ 66 Thời gian bán thải n t1/2 tiế 65 (Soy phosphatidyl cholin) (Transmission electron microscopy) M THF Tetrahydrofuran 70 Tmax Thời gian đạt tới nồng độ đỉnh máu 71 TT Thứ tự 72 tt/kl Thể tích/khối lượng 73 USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) 74 tt/tt Thể tích/thể tích 75 WHO Tổ chức y tế giới (World Health Organzation) 76 XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) 77 TMTTTT Tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy 78 HE x 200/400 Nhuộm ới 69 ất nh Hematoxylin-Eosin, 200/400 lần độ phóng đại Bảng Tên bảng Trang 3.28 Thành phần công thức bào chế phytosome silybin 150g/mẻ 91 3.29 KTTP, PDI, Zeta phytosome silybin 92 3.30 Hệ số phân bố dầu nước silybin phytosome silybin 93 3.31 Độ hòa tan bột phytosome silybin từ mẻ bào chế dung dịch pH 1,2 93 3.32 Độ hòa tan bột phytosome silybin từ mẻ bào chế dung Lu dịch pH 6,8 94 ận 3.33 Độ tan silybin dạng phytosome dung môi nước 94 3.34 Một số tiêu chất lượng mẻ phytosome silybin bào chế quy án mô 150g/mẻ 95 3.35 Dự kiến tiêu chuẩn sở phytosome silybin 101 tiế 3.36 KTTP, PDI, Zeta bột phytosome silybin sau thời gian bảo quản tháng điều kiện khác n 102 103 M điều kiện khác sĩ 3.37 Độ ẩm bột phytosome silybin sau thời gian bảo quản tháng ban đầu sau tháng bảo quản ới 3.38 Phần trăm hàm lượng silybin bột phun sấy so với thời điểm 104 nh 3.39 Độ hòa tan dung dịch pH 6,8 bột phytosome silybin sau ất tháng bảo quản điều kiện thực lão hóa cấp tốc 104 3.40 Các thông số dược động học silybin nguyên liệu phytosome silybin 111 3.41 Ảnh hưởng silybin phytosome silybin lên hoạt độ AST ALT huyết chuột bị nhiễm độc PAR 116 3.42 Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột sau ngày uống thuốc 117 PHỤ LỤC 10 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN Phụ lục 10.1 Khối lượng chuột trước sau thí nghiệm (n=10) Khối lượng chuột (gam/con) Trước thí nghiệm (ngày 1) Sau ngày uống mẫu Sau ngày uống mẫu Lô (chứng sinh lý) Lô (chứng bệnh lý) Lô (silymarin) Lô (silybin nguyên liệu) Lô (phytosome liều 1) Lô (phytosome liều 2) 141,3 ± 22,0 153,1 ± 19,7 147,8 ± 24,9 162,2 ± 23,5 151,5 ± 18,4 151,2 ± 27,3 143,0 ± 15,6 158,1 ± 20,8 149,3 ± 23,9 162,5 ± 33,0 157,9 ± 15,9 158,1 ± 23,6 142,7 ± 15,3 158,0 ± 19,4 150,3 ± 24,1 171,5 ± 30,9 162,9 ± 16,3 154,8 ± 18,9 ận Lu Lô P(ngày 1)1-2-3-4-5-6:0,418; P(ngày 7)1-2-3-4-5-6:0,234 ; P (ngày 9)1-2-3-4-5-6:0,10 *P(lô1)1-7-9:0,272; **P(lô2)1-7-9:0,429; *P(lô3)1-7-9:0,142; **P(lô4)1-7-9:0,161; **P(lô5)1-7-9:0,005; **P(lô6)1-79:0,166 án P (trong ngày) P (giữa ngày) tiế (*P:Kiểm định Friedman – P: Kiểm định Kruskal-Wallis – **P: Kiểm định RM one-way ANOVA) n sĩ Phụ lục 10.2 Nhiệt độ chuột trước sau thí nghiệm (n=10) Nhiệt độ chuột (°C) Sau ngày uống mẫu 36,7 ± 0,4 36,7 ± 0,7 36,8 ± 0,5 37,2 ± 0,5 36,9 ± 0,5 36,9 ± 0,4 37,0 ± 0,4 36,4 ± 0,4 36,8 ± 0,4 37,2 ± 0,6 37,0 ± 0,5 36,8 ± 0,4 37,1 ± 0,8 36,6 ± 0,4 37,1 ± 0,5 36,7 ± 0,5 36,9 ± 0,6 37,2 ± 0,7 ất P (giữa ngày) Sau ngày uống mẫu nh P (trong ngày) Trước thí nghiệm (ngày 1) ới Lơ (chứng sinh lý) Lô (chứng bệnh lý) Lô (silymarin) Lô (silybin nguyên liệu) Lô (phytosome liều 1) Lô (phytosome liều 2) M Lô P(ngày 1)1-2-3-4-5-6:0,392; P (ngày 7)1-2-3-4-5-6:0,002 ; **P (ngày 9)1-2-3-4-5-6:0,123 *P(lô1)1-7-9:0,405; *P(lô2)1-7-9:0,121; *P(lô3)1-7-9:0,601; ***P(lô4)1-7-9:0,154; ***P(lô5)1-7-9:0,873; ***P(lô6)1-79:0,120 (*P:Kiểm định Friedman – P: Kiểm định Kruskal-Wallis - **P: kiểm định one-way ANOVA ***P: kiểm định RM one-way ANOVA) Phụ lục 10.3 Hình ảnh Đại thể Lô Lô Lô Lô Lô Lơ Phụ lục 10.4 Hình ảnh vi thể ận Lu án PL10.4.2: Hình ảnh vi thể gan chuột lô chứng sinh học (chuột số 01) (HE x 200) Sung huyết nhu mơ gan n tiế PL10.4.1: Hình ảnh vi thể gan chuột lô chứng sinh học (chuột số 04) (HE x 200) Nhu mơ gan bình thường sĩ ới M PL10.4.4: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ chứng bệnh lý (chuột số 17) (HE x 200) Hoại tử nhu mơ gan PL10.4.5: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống silymarin (chuột số 27) (HE x 200) Viêm nhẹ khoảng cửa nhu mơ gan PL10.4.6: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống silymarin (chuột số 22) (HE x 200) Thối hóa tồn tế bào gan ất nh PL10.4.3: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ chứng bệnh lý (chuột số 15) (HE x 200) Thoái hóa, hoại tử tế bào gan quanh TMTTTT PL10.4.8: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống silybin nguyên liệu (chuột số 37) (HE x 200) Thối hóa tồn tế bào gan + viêm nhẹ khoảng cửa ận Lu PL10.4.7: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống silybin ngun liệu (chuột số 40) (HE x 200) Thối hóa mỡ cục tế bào gan án n tiế PL10.4.10: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống phytosome silybin liều (chuột số 44) (HE x 200) Thối hóa tồn tế bào gan, số thối hóa mỡ sĩ PL10.4.9: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống phytosome silybin liều (chuột số 47) (HE x 200) Thối hóa tế bào gan quanh TMTTTT ới M ất nh PL10.4.11 Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống phytosome silybin liều (chuột số 57) (HE x 200) Nhu mơ gan bình thường PL10.4.12: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống phytosome silybin liều (chuột số 53) (HE x 200) Thối hóa mỡ giọt nhỏ tế bào gan PHỤ LỤC 11 QUY TRÌNH BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN QUY MÔ 150 g/mẻ HỌC VIỆN QUÂN Y PHYTOSOME Quy trình: ………… SILYBIN Có hiệu lực từ ngày ký MỤC ĐÍCH: Hướng dẫn chi tiết cách thức tiến hành bào chế phytosome silybin, nhằm bào chế sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng cách ổn định, Lu an toàn hiệu PHẠM VI ÁP DỤNG: Phịng thí nghiệm ận TRÁCH NHIỆM: Tất nhân viên tham gia vào quy trình án NỘI DUNG QUY TRÌNH: tiế 4.1 Thơng tin tổng qt: - Tên nguyên liệu: Phytosome silybin n - Dạng bào chế: dạng bột phun sấy sĩ - Quy cách đóng gói: Bột phun sấy chứa phytosome silybin đóng túi ới M zipper - Cỡ mẻ: 150g TT nh 4.2 Công thức bào chế: Tiêu chuẩn Silybin 95% gam 25,0 NSX Phosphatidyl cholin 90% gam 75,0 NSX Maltodextrin gam 40,0 NSX Aerosil gam 10,0 NSX EtOHtđ ml 3880,0 NSX THF ml 120,0 NSX Nước cất ml 850,0 DĐVN V Tên nguyên liệu Đơn vị Số lượng ất 4.3 Thiết bị: TT Tên thiết bị - dụng cụ Bếp từ gia nhiệt Đơn vị Số lượng 01 Model C-MAG HS10 Bình cầu thủy tinh (6 lít) 01 SJ: 60/46 Hệ thống cô quay máy 01 N1200B Máy siêu âm đầu dò máy 01 01D882 Máy phun sấy ly tâm máy 01 LPG-5 4.4 Sơ đồ quy trình: ận Lu án n tiế sĩ ới M ất nh 4.5 Quy trình bào chế: 4.5.1 Kiểm tra trước bào chế: - Bình cầu, sinh hàn dụng cụ thủy tinh phải rửa nước tinh khiết, tráng nước cất, sấy tủ sấy khô - Bếp khuấy từ gia nhiệt, hệ thống cô quay chân không, thiết bị siêu âm đầu dò thiết bị phun sấy phải vệ sinh lắp đặt sẵn 4.5.2 Kiểm nhận nguyên liệu: Các nguyên liệu kiểm tra chất lượng trước đưa vào bào chế theo tiêu chuẩn ghi mục 4.2 4.5.3 Cân chia xử lý nguyên liệu: Tiến hành cân chia nguyên liệu theo bảng sau: ận Lu TT Tên nguyên liệu Silybin 95% Phosphatidyl cholin 90% Maltodextrin Aerosil EtOHtđ THF Nước cất 4.5.4 Tiến hành bào chế: Đơn vị gam gam gam gam ml ml ml Số lượng 25,0 75,0 40,0 10,0 3880,0 120,0 850,0 Thiết bị sử dụng Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân lò xo 10kg Cân điện tử 3.000g Cân điện tử 3.000g án * Bước Tạo phức hợp tiế - Nguyên liệu: silybin 95%, Phosphatidyl cholin 90%, EtOHtđ n - Thiết bị: Bếp từ gia nhiệt C-MAG HS10, bình cầu (SJ: 60/46), sinh hàn sĩ thủy tinh hệ thống quay N1200B M - Tiến hành: Hịa tan silybin 95%, PC90% vào 4,0 lít hỗn hợp dung mơi ới EtOHtd:THF (97:3) Sau đưa vào bình cầu dung tích lít, tiến hành phản ứng (hồi lưu) bếp từ gia nhiệt điều kiện nhiệt độ 50°C, tốc độ khuấy nh 100 vòng/phút thời gian 4,5 Kết thúc phản ứng, chuyển bình cầu tạo màng film mỏng ất sang máy cô quay chân không, tiến hành cô bốc dung môi 50°C đến - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm kiểm tra cảm quan u cầu: có hình thành màng film mỏng bình quay chân khơng * Bước Hydrat hóa giảm KTTP - Nguyên liệu: màng film phức hợp, nước cất - Thiết bị: Máy siêu âm đầu dò 01D882 - Tiến hành: Nhấc bình cầu khỏi hệ thống cất quay, sau cho từ từ 850,0 ml nước cất vào bình cầu, vừa cho vừa kết hợp khuấy trộn để tạo hỗn dịch phytosome Sau hydrat hóa hết thể tích nước chuyển bình cầu vào đầu dò siêu âm, tiến hành siêu âm 720W 12 phút - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm kiểm tra cảm quan Yêu cầu: Hỗn dịch màu trắng, khơng có tượng kết tụ tiểu phân đáy bình * Bước Phun sấy Lu - Nguyên liệu: Hỗn dịch nano phytosome silybin, maltodextrin, aerosil ận - Thiết bị: Máy phun sấy ly tâm LPG-5 - Tiến hành: Sau siêu âm, tiến hành phối trộn hỗn hợp tá dược án MD/AE (80/20) vào hỗn dịch Hỗn dịch phun sấy sử dụng bột bình thu mẫu n tiế máy LPG-5 điều kiện khí đầu vào 140°C, tốc độ cấp dịch 10ml/phút Thu - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm sĩ kiểm tra cảm quan Yêu cầu: Bột khô tơi, màu trắng đến vàng, khơng mùi, ới * Bước Đóng túi, dán nhãn M vị đắng nh - Bột phun sấy thu hồi phận thu hồi sản phẩm chuyển vào túi Zipper Đóng kín túi dán nhãn mặt túi ất - Nhân viên kiểm nghiệm lấy mẫu kiểm tra tiêu theo tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm 4.5.5 Lưu ý: Toàn thơng số q trình bào chế phải ghi chép cụ thể theo biểu mẫu quy trịnh TÀI LIỆU KÈM THEO: Không LƯU TRỮ HỒ SƠ: Không - HẾT TÀI LIỆU - PHỤ LỤC 12 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG PHYTOSOME SILYBIN (DỰ THẢO) HỌC VIỆN QUÂN Y TT NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THUỐC PHYTOSOME SILYBIN Số TC: Si-PC.01/K69 Có hiệu lực kể từ ngày ký Phytosome silybin bào chế phản ứng tạo phức silybin phosphatidylcholin (PC), sau hydrat hóa làm khơ phương pháp phun sấy Lu YÊU CẦU KỸ THUẬT ận 1.1 Tính chất: Dạng bột khô tơi, màu trắng đến vàng, không mùi, vị án đắng 1.2 Mất khối lượng làm khơ: Khơng q 5% tiế 1.3 Kích thước tiểu phân số PDI: sĩ - Chỉ số PDI: ≤ 0,5 n - KTTP: Kích thước tiểu phân trung bình không 300nm 1.4 Chỉ số nén CI (%) KLRbk: nh 1.5 Định tính: ới - KLRbk: khơng nhỏ 0,35 M - Chỉ số CI (%): từ 16 - 20% ất Chế phẩm phải thể phép thử định tính silybin A Silybin B: Trong phần định lượng, sắc ký đồ mẫu thử phải xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic silybin A silybin B sắc ký đồ mẫu chuẩn 1.6 Định lượng: - Hàm lượng silybin dạng phytosome chế phẩm không nhỏ 10,0% (KL/KL) - Hàm lượng silybin toàn phần chế phẩm không nhỏ 11% (KL/KL) 1.7 Độ hòa tan: Phần trăm silybin hòa tan sau 60 phút dung dịch pH 6,8 không nhỏ 85% PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Kiểm tra cảm quan 2.2 Mất khối lượng làm khô: Thử theo phụ lục 9.6, DĐVN V (1 g, 1050C giờ) 2.3 Kích thước tiểu phân số PDI: Lu - Kích thước tiểu phân phytosome silybin phân bố môi trường ận nước dạng hỗn dịch (huyền phù) xác định phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) án - Tiến hành: Cân khoảng 0,01g bột phytosome silybin, phân tán tiế 50ml nước cất lần Tiếp tục pha loãng nước cất lần khoảng 50 - 100 lần đến quan sát mẫu dung dịch đục nhờ nhờ gần suốt n tiến hành đo kích thước tiểu phân máy đo kích thước tiểu phân ZT- sĩ 100-Z M 2.4 Chỉ số nén CI (%) KLRbk: ới Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 6.13 Một lượng bột có khối lượng nh xác định (m) cho vào ống đong hình trụ Thế tích khối bột ban đầu V0 Sau đó, ống đong gõ đến thể tích khơng thay đổi đọc thể tích ất cuối Vf Chỉ số nén bột tính theo cơng thức: CI (%) = 𝑉0 − 𝑉𝑓 × 100 𝑉𝑓 Khối lượng riêng biểu kiến tính theo cơng thức: Dbk = m/Vf Trong đó: +> Dbk: Khối lượng riêng biểu kiến bột (g/ml) +> m: Khối lượng bột/cốm đem đo (g) +> Vf: Thể tích biểu kiến bột sau gõ (ml) 2.5 Định tính: Định tính Silybin A B: phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3) Điều kiện sắc ký, mẫu chuẩn, mẫu thử, cách tiến hành phần Định lượng (mục 2.6) 2.6 Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3) * Điều kiện sắc ký: cột Luna C18 (250 x 4,6 mm, µm, Phenomenex, Mỹ); detector UV, bước sóng phát 288 nm; dung môi pha động MeOH: H3PO4: nước= 20: 0,5: 80 (A) MeOH: H3PO4: nước= 80: 0,5: 20 Lu (B); tốc độ dịng 1,0 mL/phút; theo chương trình gradient (0-5 phút: 15 % ận B, 5-20 phút: 15-45 % B, 20-30 phút: 45 % B, 30-31 phút: 45-15 % B, 31-40 phút: 15% B); thể tích tiêm mẫu 10 µl; nhiệt độ cột 40ᵒC án * Chuẩn bị dung dịch thử dung dịch chuẩn: tiế Mẫu chuẩn: Cân xác khoảng 25,0 mg chuẩn silybin (gồm hỗn hợp Si-A Si-B) vào bình định mức 25 mL, hòa tan MeOH vừa đủ đến n vạch để dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/mL Từ dung sĩ dịch này, chuẩn bị chuẩn làm việc có nồng độ 20 µg/mL M Mẫu thử (định lượng silybin dạng phytosome): Cân xác khoảng ới lượng phytosome tương ứng với khoảng 0,1g silybin vào bình nón (có nh nắp), thêm 25mL chloroform, lắc máy lắc 10 phút Lọc dịch qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành dịch đến cắn Sau hịa tan 10mL ất MeOH (siêu âm 30 phút), chuyển vào bình định mức 25mL bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Hút 1mL chuyển vào bình định mức 25mL, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, trước định lượng HPLC Mẫu thử (định lượng silybin tồn phần): Cân xác khoảng lượng phytosome tương ứng với khoảng 0,1g silybin vào bình định mức 25mL, thêm khoảng 10mL MeOH siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Hút 1mL chuyển vào bình định mức 25mL, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, trước định lượng HPLC * Tiến hành: Tiêm riêng biệt lần dung dịch chuẩn làm việc, lần 10µl vào máy sắc ký lỏng Tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu diện tích pic silybin Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích píc silybin khơng lớn 2,0% Tiêm 10 µl dung dịch thử dung dịch chuẩn làm việc vào hệ thống Lu sắc ký lỏng Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu, ghi thời gian lưu diện ận tích pic silybin sắc ký đồ dung dịch Hàm lượng % (KL/KL) silybin dạng phytosome/silybin tồn phần án chế phẩm tính theo cơng thức: 𝑅𝑇 100 𝑥 25 𝑥 25 × 𝐶𝐶 × 𝑅𝐶 106 × 𝑚 tiế 𝑋(%) = n Trong đó: - RT, Rc diện tích pic silybin sắc ký đồ dung dịch thử sĩ dung dịch chuẩn tương ứng M - m khối lượng chế phẩm lấy định lượng (g) ới - CC nồng độ silybin dung dịch chuẩn (µg/ml) nh 2.7 Độ hòa tan: Tiến hành khảo sát độ hòa tan silybin sau: ất - Cân lượng mẫu (tương đương với 100mg silybin) cho vào cốc chứa mơi trường thử độ hịa tan Các bình chứa nhúng bể cách thủy (37 ± 0,5)℃ - Mơi trường thử độ hịa tan: mơi trường pH 6,8: 900ml dung dịch đệm phosphat (bổ sung 0,5% Tween 80 để đảm bảo điều kiện sink) - Thiết bị thử kiểu cánh khuấy với tốc độ khuấy 100 vòng/phút Sau khoảng thời gian 10, 30, 60, 120, 180, 240 phút, lấy khoảng 10ml dung dịch thử, ly tâm phút với tốc độ 10.000 vòng/phút Phần dịch lọc qua màng lọc 0,2µm định lượng hàm lượng silybin HPLC với điều kiện sắc ký tương tự mục 2.6 Tiếp theo bù khoảng 10ml dung dịch môi trường phối trộn với phần cắn sau ly tâm, sau rót vào cốc thử độ hịa tan để trì thể tích khơng đổi thời điểm khác ận Lu án n tiế sĩ ới M ất nh PHỤ LỤC 13 MỘT SỐ HÌNH ẢNH KTTP CỦA PHYTOSOME SILYBIN ận Lu án n tiế sĩ ới M ất nh Phụ lục 13.1 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 1) ận Lu án n tiế sĩ ới M ất nh Phụ lục 13.2 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 2) ận Lu án n tiế sĩ ới M ất nh Phụ lục 13.3 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 3)