Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei) Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm thực hiện

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi Sinh I301, Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng trường Đại học Lạc Hồng

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng lợi khuẩn Bacillus và

- Khảo sát một số đặc tính sinh học có lợi của các chủng Bacillus và

- Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng lợi khuẩn đã phân lập.

Vật liệu nghiên cứu

Nguồn 1: Mẫu nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) tại một số trại tôm thuộc ấp Nhất Trí, xã Vĩnh Thanh, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai

Nguồn 2: Nội tạng của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) loại 40 - 50 con/kg, tại một số trại tôm thuộc ấp Nhất Trí, xã Vĩnh Thanh, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai

Chủng vi sinh vật kiểm định:

Vibrio parahaemolyticus được phân lập từ ao tôm bệnh chết (được cung cấp bởi

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh)

Chủng Escherichia coli ATTC25922 từ Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật - Viện Vi Sinh Vật Học và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội

Chủng vi sinh vật đối chứng: Bacillus subtilis chế phẩm Bio-One từ công ty TNHH Sinh Phẩm Số 1 Khánh Hòa Địa chỉ QL1 - KCN Suối Dầu - Cam Lâm -

 CaCO3 (Merch, Đức)  Glucose (Merch, Đức)

 Cao Thịt (Merch, Đức)  Lactose (Merch, Đức)

 H2O2 (Vĩnh Phú, Việt Nam )  Maltose (Merch Đức)

 HCl (Merch, Đức)  NaOH (Merch, Đức)

 KNO3 (Merch, Đức)  Peptone (Merch, Đức)

 Nystatin (Pharmedic, Việt Nam)  FeCl3 (Merch, Đức)

 NaCl (Minh Thanh, Việt Nam) 

2.3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

 Tủ cấy vi sinh (Huy Hoàng)  Ống nghiệm (Iwaki, Đức)

 Tủ ủ vi sinh (Ketong, Nhật)  Pipet man (Boeco, Đức)

 Cân điện tử (Scout Pro, Đức)  Kính hiển vi (Olympus,Ý)

 Đèn cồn (Văn Minh, Việt Nam)  Lò vi sóng (Sharp, Nhật)

 Đĩa petri (Merch, Đức)  Máy đo pH (Hanna, Hàn Quốc)

 Erlen (Duran, Đức)  Tủ sấy (Ketong, Nhật)

 Nồi hấp (Sanyo, Nhật)  Máy đo OD (Beckeman Coulter,

 MRS - agar (Man, Rogosa, Sharpe): Hãng Biokar Diagnostics, sản xuất năm

 MRS - Broth (Man, Rogosa, Sharpe): Hãng Biokar Diagnostics, sản xuất năm

 TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose Agar): Hãng Biokar Diagnostics, sản xuất năm 2016, Pháp

 NA (Nutrient Agar): Hãng Biokar Diagnostics, sản xuất năm 2016, Pháp

 NB (Nutrient Broth): Hãng Biokar Diagnostics, sản xuất năm 2016, Pháp.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.3 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu thập 7 đợt mẫu, bao gồm 24 mẫu nước và 24 mẫu nội tạng tôm, được ký hiệu lần lượt là a, b, c, d, e, f Trong đó, a chỉ các chủng dự định phân lập là B (Bacillus) và L (Lactobacillus); b là số đợt lấy mẫu được đánh dấu từ I đến V; c phân loại mẫu thành N (nước) và T (tôm); d xác định ao thu mẫu với các ký hiệu A1, A2, A3; e là số thứ tự mẫu phân lập; và f là số thứ tự chủng phân lập.

Mẫu nước ao nuôi tôm

Sử dụng chai thủy tinh vô trùng để thu mẫu nước từ các vị trí khác nhau trong ao nuôi tôm Mỗi mẫu nước, có dung tích 500 ml, cần mang tính chất đại diện cho tổng số 6 ao Các mẫu này sẽ được mã hóa và bảo quản ở nhiệt độ 4°C trước khi chuyển về phòng thí nghiệm Phân tích mẫu phải được thực hiện trong vòng 6 giờ để đảm bảo độ chính xác của kết quả (Trần Linh Thước, 2007).

Trong nghiên cứu này, 500g tôm đại diện đã được thu nhận từ một trong sáu ao nuôi tôm Các mẫu tôm sẽ được mã hóa và bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C trước khi được chuyển đến phòng thí nghiệm Quá trình phân tích mẫu sẽ được thực hiện trong vòng 6 giờ (Nguyen, 2014).

 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu nước ao nuôi tôm

Lắc đều để mẫu nước được đồng nhất Tiến hành hút 50 ml mẫu nước cho vào erlen vô trùng

Sau khi thu hoạch, tôm được rửa bằng cồn 70 độ để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn trong quá trình phân tích Tiếp theo, sử dụng dao mổ đã được khử trùng để tiến hành mổ và thu thập nội tạng của tôm (Nguyen, 2014; Kongnum, Hongpattarakere, 2012).

2.4.2 Phương pháp pha loãng mẫu

Chuẩn bị 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml NaCl 0,9% đã được hấp khử trùng và đánh số thứ tự từ 1 đến 7 Mẫu ban đầu sẽ được pha loãng theo cấp độ thập phân từ 10^-1 đến 10^-7 (Trần Linh Thước, 2007; Nguyễn Lân Dũng và cs, 1976).

2.4.3 Phương pháp phân lập một số chủng lợi khuẩn Bacillus và Lactobacillus

2.4.3.1 Xác định hình thái vi khuẩn

Quan sát hình thái khuẩn lạc

Mẫu pha loãng được nuôi cấy trên môi trường thạch NA cho Bacillus và MRS agar cho Lactobacillus, sau 24 - 36 giờ ủ ở 37 độ C, sẽ được quan sát để đánh giá hình thái khuẩn lạc (Trần Linh Thước, 2007).

Quan sát hình thái tế bào

Vi khuẩn được phân loại thành Gram dương và Gram âm dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chết và màng tế bào với dung dịch tím kết tinh và dung dịch Iod Cụ thể, vi khuẩn Gram dương giữ màu tím khi nhuộm và không bị mất màu khi tẩy bằng cồn, trong khi vi khuẩn Gram âm sẽ bị rửa trôi màu khi tẩy qua cồn (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1976).

2.4.3.2 Phương pháp phân lập một số chủng Bacillus

Sốc nhiệt 50ml mẫu nước và 50ml mẫu nội tạng tôm trong bể nước nóng ở

80 o C trong 20 phút và sốc lạnh với nước máy (Watcharya Purivirojkul và cs, 2007) Hút 100 𝜇l mẫu ở các độ pha loãng 10 -5 và 10 -6 trải trên môi trường thạch NA và ủ ở

Sau 24 giờ ủ ở 37 độ C, tiến hành quan sát hình thái và màu sắc của các khuẩn lạc cũng như tế bào của các chủng vi khuẩn Lựa chọn những khuẩn lạc nghi ngờ, sau đó cấy thuần và bảo quản giống trong ống thạch nghiêng (Vaseeharan và Ramasamy, 2003).

2.4.3.3 Phương pháp phân lập một số chủng Lactobacillus

Cân 5 g mẫu nội tạng tôm và hút 5ml mẫu nước cho lần lượt vào các túi PE chứa

Trong nghiên cứu, 45 ml môi trường MRS Broth được bổ sung 50 mg/l Nystatin và ủ kỵ khí ở 37 oC (Nguyen, 2014; Ishola, Adebayo-Tayo, 2012) Sau 24 giờ, mẫu được pha loãng với độ pha loãng 10^-7 100 𝜇l dịch pha loãng được trải vào môi trường MRS agar có 0,5% CaCO3 (Khuất Hữu Thanh, 2010) và ủ kỵ khí ở 37 oC trong 48 giờ Các khuẩn lạc đặc trưng có vòng phân giải CaCO3 được chọn lựa và quan sát dưới kính hiển vi Khuẩn lạc được chọn được tăng sinh trong MRS Broth, sau đó định tính acid lactic bằng thuốc thử Uffelman và bảo quản trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng MRS agar (Kongnum, Hongpattarakere, 2012; Nguyen, 2014; Nguyễn Lân Dũng và cs, 1976).

2.4.4 Phương pháp tuyển chọn và định danh một số chủng Bacillus và

2.4.4.1 Tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzyme ngoại bào

Theo hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, các chủng Bacillus nổi bật với khả năng sản xuất enzyme ngoại bào như amylase, protease và cellulose (Paul De Vos và cs, 2011) Việc tuyển chọn các chủng Bacillus nhằm xác định những chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào Khả năng này được đánh giá thông qua phương pháp chấm điểm và kiểm tra bằng vòng phân giải cơ chất ∆D.

∆D = D - d (mm) với D: đường kính vòng phân giải cơ chất (mm); d: đường kính khuẩn lạc (mm)

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường NB ở 37 o C trong 24 giờ Sau đó, các chủng này được cấy vào môi trường khảo sát NA có bổ sung 0.5% CMC, 0.5% casein và 0.5% tinh bột để đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase, protease và amylase Mẫu được ủ ở 37 o C trong 24 giờ, sau đó tiến hành quan sát và đo đường kính vòng phân giải cơ chất (Lê Thanh Mai và cs, 2005).

2.4.4.2 Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có khả năng kháng khuẩn

Theo phân loại vi khuẩn của Bergey, các chủng Lactobacillus không chỉ có khả năng tiết acid mà còn có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh (Paul De Vos và cs, 2011) Việc lựa chọn các chủng Lactobacillus có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus là rất quan trọng Hoạt tính kháng khuẩn được xác định thông qua phương pháp đục lỗ (Schillinger, Lücke, 1989), với đường kính vòng kháng khuẩn được tính bằng công thức ∆D = D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn và d là đường kính lỗ thạch.

Từ môi trường giữ giống, nuôi hoạt hóa qua đêm ở 37 o C các chủng

Chủng vi sinh vật Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS Broth, trong khi Vibrio parahaemolyticus đạt khoảng 10^5 cfu/ml và các chủng nghi ngờ Lactobacillus đạt khoảng 10^7 cfu/ml Các chủng vi khuẩn được trải đều trên bề mặt đĩa thạch NA có bổ sung 1,5% NaCl, tạo các lỗ thạch đường kính 10 mm 100 𝜇l chủng vi khuẩn mục tiêu được đưa vào các lỗ thạch và ủ ở 37 độ C trong 24 giờ Kết quả được quan sát và đo đường kính vòng kháng khuẩn.

2.4.4.3 Định danh bằng sinh hóa

Dựa vào khóa phân loại vi khuẩn của Bergey (Paul De Vos và cs, 2011) và phương pháp phân tích vi sinh vật của Trần Linh Thước (Trần Linh Thước, 2007), chúng tôi tiến hành thực hiện các phản ứng hóa sinh cho các chủng vi khuẩn được lựa chọn.

 Khả năng lên men đường: glucose, maltose, lactose, sucrose, fructose

Xác định khả năng lên men của vi sinh vật đối với các nguồn carbohydrate như glucose, maltose, lactose, sucrose và fructose là một phương pháp quan trọng Thử nghiệm này thường được áp dụng để nhận diện các vi sinh vật đường ruột, giúp phân tích và hiểu rõ hơn về sự phát triển của chúng trong môi trường tiêu hóa.