Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei) Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG  BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI) VÕ THỊ LAN CHI HUỲNH MINH HIẾU ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG  BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI) GVHD: ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ ĐỖ MINH ANH SVTH: VÕ THỊ LAN CHI HUỲNH MINH HIẾU ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Lạc Hồng, Lãnh đạo Khoa Kỹ Thuật Hóa Học Mơi Trường trường Đại học Lạc Hồng, Liên Hiệp Hội Khoa Học Kỹ Thuật Đồng Nai tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành nghiên cứu thời gian qua Chúng tơi xin trân trọng bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hướng dẫn Đồn Thị Tuyết Lê cô Đỗ Minh Anh thời gian qua tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu, bồi kiến thức hoàn thành đề tài nghiên cứu Chúng chân thành cảm ơn đến Ông Nguyễn Văn Linh Anh Nguyễn Thanh Tùng ngụ ấp Nhất Trí, xã Vĩnh Thanh, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai hỗ trợ nguồn mẫu trình nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân chia sẻ, động viên giúp chúng tơi có thêm nghị lực hoàn thành tốt nghiên cứu MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iv ĐỒ THỊ v LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Cơ chế tác dụng probiotic 1.1.3 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản suất probiotic cho tôm 1.2 Tổng quan tôm thẻ chân trắng 1.2.1 Đặc điểm hình thái tơm thẻ chân trắng 1.2.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm nuôi 1.2.3 Tình hình dịch bệnh tơm thẻ chân trắng .7 1.3 Tổng quan số cơng trình nghiên cứu ngồi nước sử dụng probiotic cho tôm 1.3.1 Trong nước 1.3.2 Ngoài nước CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Thời gian địa điểm thực .11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Vật liệu nghiên cứu 11 2.3.1 Nguồn mẫu 11 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.3 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 13 2.4.2 Phương pháp pha loãng mẫu .14 2.4.3 Phương pháp phân lập số chủng lợi khuẩn Bacillus Lactobacillus 14 2.4.4 Phương pháp tuyển chọn định danh số chủng Bacillus Lactobacillus 15 2.4.5 Khảo sát số đặc tính sinh học có lợi chủng phân lập 18 2.4.6 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng phân lập 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .20 3.1 Kết phân lập số chủng Bacillus Lactobacillus 20 3.1.1 Kết phân lập số chủng Bacillus 20 3.1.2 Kết phân lập số chủng Lactobacillus 21 3.2 Kết tuyển chọn định danh số chủng Bacillus Lactobacillus 23 3.2.1 Kết tuyển chọn số chủng Bacillus Lactobacillus .23 3.2.2 Kết định danh số chủng Bacillus Lactobacillus .27 3.4 Kết khảo sát số đặt tính sinh học có lợi chủng Bacillus Lactobacillus .32 3.4.1 Khả sinh enzyme ngoại bào .32 3.4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn theo thời gian 35 3.4.3 Khảo sát khả chịu mặn .41 3.4.4 Khảo sát khả thích nghi pH 42 3.5 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng số chủng Bacillus Lactobacillus .44 3.5.1 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng chủng B subtilis BVIITA3.2.3 .44 3.5.2 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng số chủng Lactobacillus 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT  B subtilis : Bacillus subtilis  L plantarum : Lactobacillus plantarum  L salivarius : Lactobacillus salivarius  L reuteri : Lactobacillus reuteri  E coli : Escherichia coli  OD : Optical Density  V parahaemolyticus : Vibrio parahaemolyticus  V alginolyticus : Vibrio alginolyticus  MRS agar : Man, Rogosa, Sharpe  MRS Broth : Man, Rogosa, Sharpe Broth  TCBS : Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose  APW : Ankalin Peptone Water  NA : Nutrient Agar ii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1.Các dạng khuẩn lạc môi trường NA 20 Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng môi trường NA 20 Hình 3.3.Các khuẩn lạc mơi trường chọn lọc MRS có bổ sung 0.5% CaCO3 21 Hình 3.4.Thử nghiệm khả chuyển màu Uffelman 23 Hình 3.5 Khả phân giải chất số chủng vi khuẩn 24 Hình 3.6 Đường kính vịng kháng khuẩn chủng vi khuẩn 26 Hình 3.7 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIITA1.4.1 27 Hình 3.8 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIITA1.4.2 28 Hình 3.9 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIINA2.2.2 28 Hình 3.10 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIVNA2.3.1 28 Hình 3.11 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIINA1.1.2 29 Hình 3.12 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIITA1.5.3 29 Hình 3.13 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BVIITA3.2.3 .29 Hình 3.14 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Bacillus subtilis BIIITA1.5.2 29 Hình 3.15 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Lactobacillus salivarius LIITA1.2.2 31 Hình 3.16 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Lactobacillus salivarius LIITA2.1.2 31 Hình 3.17 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.3 31 Hình 3.18 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.3 31 Hình 3.19 Trình tự gen mã hóa 16s rRNA chủng Lactobacillus plantarum LVIITA3.3.9 32 iii Hình 3.20 Vịng phân giải chất chủng Bacillus subtilis BVIITA3.2.3 Bacillus subtilis (ĐC) 33 Hình 3.21 Vịng phân giải chất chủng Lactobacillus phân lập 34 Hình 3.22 Đường kính vịng kháng V parahaemolyticus chủng Bacillus theo thời gian 35 Hình 3.23 Đường kính vịng kháng E coli chủng Bacillus theo thời gian 37 Hình 3.24 Đường kính vịng kháng V parahaemolyticus chủng Lactobacillus theo thời gian 38 Hình 3.25 Đường kính vịng kháng E coli chủng Lactobacillus theo thời gian 39 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái nhuộm Gram chủng nghi ngờ Bacillus 21 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái nhuộm Gram chủng nghi ngờ Lactobacillus 22 Bảng 3.3 Kết sinh hóa chủng nghi ngờ Bacillus 27 Bảng 3.4 Kết sinh hóa chủng nghi ngờ Lactobacillus 30 Bảng 3.5 Đường kính vịng phân giải chất chủng Bacillus 33 Bảng 3.6 Khả đối kháng V parahaemolyticus chủng Bacillus 36 Bảng 3.7 Khả đối kháng E coli chủng Bacillus 36 Bảng 3.8 Khả đối kháng V parahaemolyticus chủng Lactobacillus 38 Bảng 3.9 Khả đối kháng E coli chủng Lactobacillus 40 v ĐỒ THỊ Đồ thị 1: Đường kính vòng phân giải chất chủng nghi ngờ Bacillus 24 Đồ thị 2: Khả kháng V parahaemolyticus chủng nghi ngờ Lactobacillus 25 Đồ thị 3: Giá trị OD600nm chủng Bacillus subtilis BVIITA3.2.3 độ mặn khác 41 Đồ thị 4: Giá trị OD600nm chủng Lactobacillus độ mặn khác 41 Đồ thị 5: Giá trị OD600nm chủng Bacillus subtilis BVIITA3.2.3 khoảng pH khác 42 Đồ thị 6: Giá trị OD600nm chủng Lactobacillus khoảng pH khác 43 Đồ thị 7: Đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BVIITA3.2.3 môi trường NB 44 Đồ thị 8: Đường cong sinh trưởng chủng Lactobacillus môi trường MRS Broth 45