VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Khoa Thú y Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý Thú y
THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Thông tin sơ bộ về nguồn gốc của 02 chủng virus KTY-PRRS-
2 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 được Khoa Thú y –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ 02 trang trại thuộc 2 tỉnh Thái Bình và Nghệ An vào năm 2013
Bảng 3.1 Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01,
STT Tên chủng Cơ quan Đối tượng Địa phương Năm thu phân lập lấy mẫu lấy mẫu mẫu
1 KTY-PRRS-01 Phổi Lợn nái
2 KTY-PRRS-02 Hạch phổi Lợn nái
Các chủng virus PRRS trên đều được phân lập từ các mẫu cơ quan của lợn có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh PRRS
Máy móc, trang thiết bị, hóa chất và dụng cụ
Các máy móc, trang thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm: Máy PCR, máy giải trình tự gene, thiết bị điện di, máy chụp ảnh gel, tủ nuôi cấy tế bào, kính hiển vi soi ngược,
Hóa chất và dụng cụ: bộ kít tách chiết RNA, kít RT-PCR, kít giải trình tự gene, kít Elisa, DMEM, tế bào Marc 145, FCS, Kit BCA, ống eppendorf, đầu tuyp, Fancol 15 ml, Fancol 50ml, xilanh, kim lấy máu, khay mẫu và khay đệm cho giải trình tự gene,
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-
- Xác định hiệu giá của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02.
- Xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY- PRRS-01, KTY-PRRS-02
- Xác định đường biểu diễn sự nhân lên của virus
- Nghiên cứu khả năng gây miễn dịch của 02 chủng virus KTY- PRRS-01, KTY-PRRS-02 cho động vật thí nghiệm
+ Tinh chế kháng nguyên và tiêm cho động vật thí nghiệm
+ Thu huyết thanh và xác định hàm lượng kháng thể bằng phương pháp
3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-
- Giải trình tự gene của chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
- Xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của 2 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với các chủng virus khác trong ngân hàng gene.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào Chuẩn bị môi trường đầy đủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37 o C trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải đông tế bào Marc 145 ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ. Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào
Giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO 2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
- Cấy chuyển tế bào Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca 2+ hoặc Mg 2+ )
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA Ủ trong 5 đến
10 phút Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại căn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10àl tế bào trong 990àl mụi trường khụng đầy đủ) dựng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi tính số tế bào trong 1ml
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x10 5 tế bào/ ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/ bình T75)
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở
37 0 C, 5%CO 2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x10 6 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20 o C trong 2-
3 giờ, chuyển sang -80 o C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
3.5.2 Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
Phương pháp gây nhiễm virus trên tế bào là phương pháp khoa học tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong Y học để nghiên cứu các virus như: phân lập,nuôi cấy, giám định, chuẩn độ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức để nuôi cấy các vắc-xin virus Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trưng Những biến đổi có tính chất đặc trưng đó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ(Cytophathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử Mỗi ổ tế bào bị hoại tử đó được gọi là một đơn vị plague, có thể đánh giá được khối lượng virus gây nhiễm bằng số đơn vị plague xuất hiện Có những tế bào bị nhiễm virus chưa đến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này đã bị thay đổi.
Căn cứ vào CPE khi phân lập virus quan sát được dưới kính hiển vi soi ngược có thể đánh giá được hiệu quả phân lập, nuôi cấy virus
Phương pháp gây nhiễm virus cho tế bào Marc 145 (chai T25) Vật liệu gõy nhiễm cho mỗi chai tế bào T25 là 200àl huyễn dịch virus PRRS Mỗi chủng virus nghiên cứu được gây nhiễm lên tế bào Marc 145 ở MOI=0,1 hàng ngày theo dõi bệnh tích tế bào và ghi chép kết quả, tiến hành theo dõi cho đến khi virus phá hủy hoàn toàn tế bào Những giếng tế bào có bệnh tích được thu và bảo quản ở -80 o C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3 Phương pháp xác định TCID 50
Chuẩn bị tế bào Marc 145 trên đĩa 96 giếng
Tế bào Marc 145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x
10 3 tế bào/ml Cho 100 àl huyễn dịch tế bào trờn vào tất cả cỏc giếng Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 0 C trong môi trường 5 % CO 2 , theo dõi hàng ngày.
Khi quan sát thấy tế bào bám đáy trên 80 % thì tiến hành chuẩn độ vi rút.
– Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10 -1 đến 10 -6 hoặc thấp hơn tùy theo cách bố trí thí nghiệm.
– Lấy đĩa tế bào Marc 145 đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ
– Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 àl/giếng, sau đú loại bỏ dung dịch PBS (-)
– Hỳt 100 àl huyễn dịch vắc xin đó pha loóng lần lượt vào cỏc giếng tương ứng trên đĩa tế bào (từ B1 đến G5), dãy đối chứng tế bào (từ B6 đến G6), cho 100 àl mụi trường duy trỡ vào mỗi giếng
– Ủ tế bào ở 37 0 C trong môi trường có 5 % CO 2 trong 30 phút
– Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 àl/giếng, loại bỏ dung dịch PBS (-)
– Cho 200 àl mụi trường duy trỡ vào mỗi giếng
– Nuôi tế bào ở 37 0 C trong môi trường có 5 % CO 2 , theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày
– Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính
Tính kết quả Theo công thức Spearman-Karber: λ.TCID 50 (0,1 ml) = X + 1/2 – (N x /n) Trong đó:
X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế bào;
N x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm; n là số giếng của mỗi độ pha loãng; λ là độ pha loãng vi rút
3.5.4 Phương pháp xác định sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x10 4 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vắc-xin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,01 Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào mụi trường nuụi cấy 100àl/giếng
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các thời điểm 12, 24, 36, 48,
60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là lgcủa TCID 50 tại mỗi thời điểm thu virus
- Phương pháp tách chiết RNA
Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được của lợn mắc PRRS, các mẫu virus sau nuôi cấy được bảo quản trong điều kiện -80 0 C, tiến hành tách chiết RNA của virus để chẩn đoán lợn mắc bệnh
- Quy trình tách chiết RNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT của hãng Qiagen
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)l)
Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại hai đoạn gene ORF7 và ORF5:
Gen Mồi Trình tự (5 ’ -3 ’ ) Kích thước gen khuếch đại Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
Mồi xuôi GAT TGC GGC AAA TGA TAA CC
Mồi ngược TGC CAT TCA CCA CAC ATT CT
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40 o C bổ sung thêm
10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8 l sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6 l maker 100bp và 10 l sản phẩm PCR mỗi giếng
- Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
- Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh
3.5.6 Phương pháp giải trình tự gene
Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu Trong nghiên cứu này sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman
Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger Khi sợi DNA được tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng, trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh,
Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR
Thành phần Thể tớch cho 1 phản ứng (àl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 96 0 C 20 giây
Gắn mồi 50 0 C 20 giây 30 chu kỳ
Kéo dài chuỗi DNA 60 0 C 4 phút
Giữ sản phẩm ở 4 0 C Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ)
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự
3.5.7 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
Các chủng virus được lựa chọn để làm nguyên liệu cho các bước nghiên cứu tiếp theo được chúng tôi nhân lên với số lượng lớn để tiến hành tinh chế kháng nguyên Virus sau khi được gây nhiễm vào tế bào Marc
145, khi bệnh tích tế bào đạt yêu cầu thì tiến hành thu virus bảo quản trong điều kiện âm sâu và tiến hành đông tan tế bào nhiều lần để thu được hàm lượng virus nhiều nhất (tiến hành tối thiểu 3 lần đông tan).
Huyễn dịch virus được ly tâm ở 3000 vòng/4 o C/30 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy dịch trong phía trên, cho vào fancol
Siêu ly tâm dịch thu được ở trên: Trước khi tiến hành siêu ly tâm, phải khởi động máy siêu ly tâm trước khoảng 30 phút tạo môi trường ly tâm lạnh cho mẫu nghiên cứu, đồng thời cài đặt chế độ siêu ly tâm phù hợp.