(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus kty prrs 01 và kty prrs 02

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTYPRRS-01 VÀ KTY-PRRS-02 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc i tháng LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp q báu mà luận văn tơi hồn thành Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình quan cơng tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii tháng MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục… iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng .vi Danh mục hình .vii Trích yếu luận văn .viii Thesis Abstract x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .1 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .3 1.2.1 Mục tiêu chung .3 1.2.2 Mục tiêu cụ thể .3 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU .3 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI .4 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI .4 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 2.1 TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .5 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS Việt Nam .7 2.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS 12 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS .12 2.2.2 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS 14 2.2.3 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS 19 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 23 3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .24 3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS01, KTY-PRRS-02 24 3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS01, KTY-PRRS-02 24 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 iii 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 3.5.7 3.5.8 3.5.9 3.5.10 PHẦN 4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 24 Phương pháp gây nhiễm virus PRRS tế bào 25 Phương pháp xác định TCID50 26 Phương pháp xác định nhân lên virus 27 Phương pháp RT – PCR 28 Phương pháp giải trình tự gene 29 4.1.1 Kết nghiên cứu xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus định lượng protein 30 Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang thỏ 31 Phương pháp IPMA 32 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phần mềm 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM .34 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 34 4.1.2 Kết nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 .37 4.1.3 Kết nghiên cứu xác định nhân lên 02 chủng virus KTY- PRRS-01 KTY-PRRS-02 37 4.1.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm với chủng virus KTY – PRRS-01 KTY-PRRS-02 40 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 43 Kết phản ứng RT-PCR 43 Kết giải trình tự gene chủng virus PRRS nghiên cứu 44 Kết truy cập ngân hàng gene 45 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu .57 So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu .59 4.2.6 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 5.1 KẾT LUẬN .65 5.2 KIẾN NGHỊ .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 73 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men tế bào lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ số lượng virus số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV .14 Bảng 3.1 Thông tin nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTYPRRS-02 .23 Bảng 4.1 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 34 Bảng 4.2 Kết xác định hiệu giá 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTYPRRS-02 chủng virus vắc-xin 37 Bảng 4.3 Kết tinh chế kháng nguyên virus PRRS 40 Bảng 4.4 Kết phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV thời điểm 14 ngày sau tiêm kháng nguyên PRRS lần 41 Bảng 4.5 Kết phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV chuột thỏ thí nghiệm 42 Bảng 4.6 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 chủngvirus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 47 Bảng 4.7 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 50 Bảng 4.8 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu 55 Bảng 4.9 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu 56 Bảng 4.10 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) 57 Bảng 4.11 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) 58 Bảng 4.12 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%) 59 Bảng 4.13 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%) .60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái virus PRRS 12 Hình 2.2 Hình ảnh cấu trúc hệ gene virus PRRS 13 Hình 4.1 Tế bào Marc 145 khơng gây nhiễm virus 36 Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 36 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 36 Hình 4.6 Bệnh tích tế bào sau 84 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Hình 4.7 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus KTY-PRRS-01 38 Hình 4.8 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus KTY-PRRS-02 38 Hình 4.9 Đối chứng tế bào 42 Hình 4.10 Phản ứng IPMA dương tính .42 Hình 4.11 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) ORF5 (hình B) 44 Hình 4.12 Kết so sánh trình tự gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu 46 Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 50 Hình 4.14 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng tham chiếu .53 Hình 4.15 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng tham chiếu .54 Hình 4.16 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 62 Hình 4.17 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu 64 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Tên Luận văn: “Nghiên cứu số đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích luận văn nhằm chọn chủng virus PRRS tiềm có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ nghiên cứu chuyên sâu như:sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng phịng, trị PRRS; cơng cường độc để đánh giá hiệu vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu virus phân lập biến chủng dùng dịch tễ học phân tử Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene Môi trường nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, kít tách chiết RNA, kít RT-PCR, kít giải trình tự gene, kit BCA Để kiểm tra đặc tính sinh học virus cần sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào, gây nhiễm virus lên môi trường tế bào, xác định hiệu giá virus, xác định đường cong sinh trưởng virus mơi trường tế bào, nghiên cứu tính kháng ngun virus chuột thỏ, kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA Phương pháp RT-PCR để xác định có mặt virus Giải trình tự gene để xác định đặc điểm sinh học phân tử virus Kết kết luận: - Kết nghiên cứu đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS- 02: Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 36 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01và chủng KTY-PRRS-02 Bệnh tích tế bào biểu tế bào co cụm lại với chồi lên đáy bình Chủng virus KTY-PRRS-01, CPE đạt 100% 84 Chủng virus KTY-PRRS-02, CPE đạt 100% 72 Quy luật nhân lên chủng virus nghiên cứu môi trường tế bào giống Virus giải phóng ngồi tế bào có hiệu giá cao virus tế bào Hiệu giá virus tương đối viii cao chủng KTY-PRRS-01 (1,74x10 TCID50/25µl) KTY-PRRS-02 (3,16 x10 TCID50/25µl), thời điểm hiệu giá virus đạt cao khoảng 60 đến 84 sau gây nhiễm Chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS02 có khả gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm - Kết nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02: Đoạn gene ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 amino acid Glycoprotein (GP5) Đoạn gene ORF7 có kích thước 372 bp mã hóa cho 123 amino acid protein N Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ 98,58% 98,03% Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 92,93%-99,65% 85,12%-99,42% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ 96,32% 95,04% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 82,88%-98,80% 84,36%-98,80% Hai chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 có nhánh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) ix