(Luận văn thạc sĩ) hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty tnhh mtv avac việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM LÊ THỊ XIÊM HỒN THIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAMN QUY TRÌNH SẢN XUẤT QUY MƠN XUẤT QUY MÔT QUY MÔ CÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VẮC XIN VÔ HOẠT NHŨ DẦUC XIN VÔ HOẠT NHŨ DẦUT NHŨ DẦUU PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔI LOẠT NHŨ DẦUN SINH SẢN XUẤT QUY MÔN VÀ HÔ HẤT QUY MÔP Ở LỢN TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT LỢN TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆTN TẠT NHŨ DẦUI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM Chuyên Ngành: Thú Y Mã Số:: 8640101 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: PGS.TS Nguyễn Bá Hiênn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Xiêm i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán công nhân viên công ty TNHH thành viên Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Xiêm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thıết đề tàı .1 1.2 Mục tıêu nghıên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sınh sản hô hấp lợn .3 2.1.1 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp 2.1.2 Tình hình phân bố lưu hành hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp tại Việt Nam 2.2 Vırus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.1 Hình thái cấu trúc virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.2 Sức đề kháng virus đặc tính ni cấy .8 2.3 Bệnh học hộı chứng rốı loạn sınh sản hô hấp lợn 2.3.1 Triệu chứng lâm sàng bệnh lý .8 2.3.2 Bệnh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Type II thể độc lực cao 2.4 Miễn dịch virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn .10 2.5 Vắc xın phịng hộı chứng rốı loạn sınh sản hơ hấp .12 2.5.1 Hiểu biết chung vắc xin 12 iii 2.5.2 Những nguyên tắc để đảm bảo chất lượng sản xuất vắc xin, chế phẩm sinh học quy mô công nghiệp 13 2.5.3 Sản xuất vắc xin phương pháp vô hoạt virus 15 2.5.4 Sản xuất vắc xin phương pháp nhược độc virus môi trường tế bào 16 2.5.5 Phương pháp sản xuất vắc xin hệ .17 2.6 Chất bổ trợ .21 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.1 Thời gian nghiên cứu .23 3.2 Địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng nghiên cứu 23 3.3.1 Đối tượng, vật liệu 23 3.3.2 Hóa chất bất hoạt 23 3.3.3 Chất bổ trợ .23 3.3.4 Các loại dung dịch, môi trường .23 3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ .25 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.4.1 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn quy mô công nghiệp 26 3.4.2 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS quy mô công nghiệp .26 3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 27 3.5.3 Phương pháp gây nhiễm, thu hoạch chuẩn độ virus PRRS 29 3.5.4 Phương pháp cô đặc, vơ hoạt, nhũ hóa kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin 30 3.5.5 Kiểm tra thành phẩm vắc xin 32 3.5.6 Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme thảm tế bào lớp 35 3.5.7 3.5.8 Phương pháp Elisa phát kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 37 Phương pháp phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 38 iv 3.6 Xử lý số liệu 39 Phần Kết thảo luận 40 4.1 Tối Ưu trình sản xuất kháng nguyên VIRUS PRRS hệ thống chai roller 40 4.1.1 Tối ưu hóa quy trình ni tế bào Marc – 145 chai roller 40 4.1.2 Tối ưu hóa quy trình gây nhiễm, thu hoạch virus PRRS hệ thống chai roller 45 4.2 Tối ưu trình bất hoạt kháng nguyên sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu 48 4.2.1 Nghiên cứu q trình đặc kháng ngun 48 4.2.2 Nghiên cứu trình bất hoạt kháng nguyên 50 4.2.3 Xác nhận q trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin 52 4.2.4 Kiểm sốt q trình sản xuất vắc xin PRRS vô hoạt 54 4.3 Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin 58 4.3.1 Kiểm tra cảm quan 58 4.3.2 Kiểm tra vô trùng .59 4.3.3 Kiểm tra an toàn 60 4.3.4 Kiểm tra hiệu lực .62 Phần Kết luận kiến nghị .69 5.1 Kết luận 69 5.2 Kiến nghị 69 Tài liệu tham khảo 70 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BEI Binary Ethylenimine CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FTM Fruit Thioglycolate Agar GMP Good Manufacturing Practices IPC In Process control IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay NBCS Newborn Calf Serum NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome S/P Sample/Positive SD Sabouraud dextrose agar SP Structural protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TN Thí nghiệm TRS Technical Report Series TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth WHO World Health Organization XLD Xylose Lysine Deoxycholate vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số tên thường gặp tài liệu Bảng 2.2 Tổng hợp ổ dịch PRRS xảy Việt Nam từ 2007-2016 Bảng 2.3 Các vắc xin thử nghiệm sản xuất 18 Bảng 4.1 Kết kiểm tra khả phát triển tế bào Marc – 145 điều kiện có 5% CO2 khơng có CO2 40 Bảng 4.2 Kết xác định lượng tế bào Marc-145 chai thích hợp 41 Bảng 4.3 Kết xác định tốc độ lăn phù hợp 42 Bảng 4.4 Khả sinh trưởng tế bào Marc – 145 chai roller 2X 44 Bảng 4.5 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp virus PRRS chủng KTY-PRRS1 môi trường nuôi cấy tế bào 46 Bảng 4.6 Kết xác định thời gian thu hoạch thích hợp virus PRRS chủng KTY-PRRS-01 môi trường nuôi cấy tế bào Bảng 4.7 48 Hiệu giá virus sau cô đặc phương pháp lọc tiếp tuyến .49 Bảng 4.8 Kiểm tra sản phẩm sau bất hoạt (bằng formaldehyde BEI) 50 Bảng 4.9 Xác nhận quy trình bất hoạt BEI 52 Bảng 4.10 Kết nhũ hóa vắc xin dầu khống ISA 201VG .53 Bảng 4.11 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin trước bất hoạt 54 Bảng 4.12 Kết kiểm tra hiệu giá virus trước bất hoạt 55 Bảng 4.13 Kết kiểm tra q trình vơ hoạt virus vắc xin BEI 56 Bảng 4.14 Kết kiểm tra vô trùng virus vắc xin sau bất hoạt 56 Bảng 4.15 Kết kiểm tra vắc xin sau nhũ hóa 57 Bảng 4.16 Kết kiểm tra vơ trùng sau nhũ hóa 57 Bảng 4.17 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin PRRS 58 Bảng 4.18 Kết kiểm tra cảm quan vắc xin PRRS vô hoạt .59 Bảng 4.19 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin .59 Bảng 4.20 Kết kiểm tra an toàn vắc xin PRRS lợn thí nghiệm 60 Bảng 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA 63 Bảng 4.22 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA .64 Bảng 4.23 Kết đánh giá công cường độc .66 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố PRRS Việt Nam từ 2007-2013 Hình 2.2 Hình ảnh hình thái, cấu trúc virus PRRS Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc gen virus PRRS Hình 2.4 Gen từ chủng virus khác 19 Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp theo quy mô cơng nghiệp 27 Hình 4.1 Hình ảnh ni cấy tế bào chai roller 2X 43 Hình 4.2 Tế bào Marc-145 qua thời điểm 45 Hình 4.3 CPE virus PRRS đối chứng 47 Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể (bằng ELISA, số S/P, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 Hình 4.5 Hiệu giá kháng thể (bằng phương pháp IPMA, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 Hình 4.6 Hình ảnh kiểm tra hạt nhũ hóa kính hiển vi 53 Hình 4.7 Vắc xin PRRS vô hoạt sau chia liều 58 Hình 4.8 Một số hình ảnh kiểm tra vơ trùng sản phẩm 60 Hình 4.9 Thân nhiệt lợn kiểm tra an toàn 61 Hình 4.10 Kiểm tra an tồn vắc xin 61 Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS 62 Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA 65 Hình 4.13 Lợn trước sau công cường độc 67 Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt lợn sau công cường độc 68 viii