(Luận văn thạc sĩ) hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây tỏi trắng hải dương sạch virus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TỎI TRẮNG HẢI DƯƠNG SẠCH VIRUS Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh TS Nguyễn Thị Lâm Hải NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Quỳnh Mai i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Viện sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, bên cạnh nỗ lực phấn đấu thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, cán kỹ thuật, bạn bè người thân Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh TS Nguyễn Thị Lâm Hải – Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy giáo, Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô, cán nhân viên môn Công nghệ sinh học thực vật – Viện sinh học Nông nghiệp – Học viện nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện tốt cho hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người thân, bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Quỳnh Mai ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ vii Danh mục hình viii Tóm tắt Error! Bookmark not defined Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung tỏi .4 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm thực vật học tỏi 2.2 Yêu cầu sinh thái tỏi 2.2.1 Các yếu tố tự nhiên .6 2.2.2 Các yếu tố dinh dưỡng .7 2.3 Giá trị tỏi 2.3.1 Thành phần dinh dưỡng tỏi .7 2.3.2 Tác dụng tỏi 2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ tỏi giới Việt Nam 2.4.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ tỏi giới .9 2.4.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ tỏi Việt Nam 10 2.5 Sâu bệnh hại tỏi biện pháp phòng trừ 11 2.6 Một số cơng trình nghiên cứu tỏi 13 2.6.1 Nghiên cứu giới 13 2.6.2 Nghiên cứu nước 14 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Địa điểm nghiên cứu 16 iii 3.2 Thời gian nghiên cứu 16 3.3 Đối tượng/Vật liệu nghiên cứu .16 3.4 Nội dung nghiên cứu 17 3.4.1 Tạo mẫu tỏi in vitro virus: .17 3.4.2 Giai đoạn nhân nhanh: Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi 17 3.4.3 Giai đoạn tạo củ in vitro: 18 3.4.4 Giai đoạn vườn ươm 19 3.4.5 Phương pháp nghiên cứu 19 Phần Kết thảo luận .23 4.1 Kết 23 4.1.1 Tạo mẫu tỏi in vitro virus: .23 4.1.2 Giai đoạn nhân nhanh: Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi 25 4.1.3 Giai đoạn tạo củ 32 4.1.4 Giai đoạn vườn ươm 37 4.1.5 Ảnh hưởng thời vụ trồng tỏi khác đến khả sống sinh trưởng củ in vitro vườn ươm 39 4.2 Thảo luận .41 4.2.1 Tạo virus nuôi cấy meristem 41 4.2.2 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến nhân nhanh in vitro .41 4.2.3 Tạo củ in vitro 42 4.2.4 Giai đoạn ex vitro (trồng củ in vitro vườn ươm) 42 Phần Kết luận kiến nghị 44 5.1 Kết luận .44 5.2 Kiến nghị .46 Tài liệu tham khảo .47 Phụ lục 49 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA : Benzyl adenine BVTV : Bảo vệ thực vật cs : Cộng CT : Công thức CTTD : Chỉ tiêu theo dõi CTTN : Công thức thí nghiệm C.V% : Sai số thí nghiệm IBA : Indol butyric acid 5%LSD : Độ lệch chuẩn mức ý nghĩa 5% LYSV : Leek yellow stripe virus MS : Môi trường Murashige and Skoog (1962) NXB : Nhà xuất OYDV : Onion yellow dwarf virus SYSV : Shallot yellow stripe virus α-NAA : α-naphtyl axetic acid v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng kích thước meristem đến khả tái sinh chồi tỏi (sau tuần nuôi cấy) 23 Bảng 4.2 Kết kiểm tra độ bệnh tái sinh từ kích thước meristem khác 23 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi tỏi (sau tuần nuôi cấy) 25 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tổ hợp BA IBA đến khả nhân nhanh chồi tỏi (sau tuần nuôi cấy) 28 Bảng 4.5 Ảnh hưởng tổ hợp BA α-NAA đến khả nhân nhanh chồi tỏi (sau tuần nuôi cấy) 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo củ từ chồi tỏi 31 Bảng 4.7 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến khả tạo củ (sau tuần nuôi cấy) 34 Bảng 4.8 Xác định kích thước củ in vitro đến khả sống sinh trưởng vườn ươm (sau tuần nuôi cấy) 36 Bảng 4.9 Ảnh hưởng thời vụ đưa củ in vitro vườn ươm đến khả sống sinh trưởng vi 37 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo củ từ chồi tỏi 33 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến khả tạo củ 36 Biểu đồ 4.3 So sánh hệ số nhân chồi cao thí nghiệm bổ sung BA, tổ hợp BA với IBA tổ hợp BA với α-NAA đến khả nhân nhanh chồi tỏi 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Kết kiểm tra họ Potyvirus mẫu tái sinh từ meristem 24 Hình 4.2 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi tỏi .26 Hình 4.3 Ảnh hưởng tổ hợp BA IBA đến khả nhân nhanh chồi tỏi .28 Hình 4.4 Ảnh hưởng tổ hợp BA α-NAA đến khả nhân nhanh chồi tỏi 30 Hình 4.5 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo củ từ chồi tỏi .32 Hình 4.6 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến khả tạo củ 35 Hình 4.7 Xác định kích cỡ củ tỏi in vitro đến khả sống sinh trưởng ngồi vườn ươm 36 Hình 4.8 Xác định thời vụ đưa củ in vitro vườn ươm đến khả sống sinh trưởng 38 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Tên Luận văn: Hồn thiện quy trình nhân giống in vitro tỏi trắng Hải Dương virus Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo tỏi trắng Hải dương virus Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống kỹ thật nuôi cấy mô tỏi trắng Hải Dương làm sở cho sản xuất giống chất lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất Phương pháp nghiên cứu Đề tài thực nội dung nghiên cứu đối tượng tép tỏi chồi tỏi tuần tuổi giống tỏi trắng thu thập tỉnh Hải Dương giai đoạn tạo mẫu virus; giai đoạn nhân nhanh nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số nhân nhanh chồi tỏi; giai đoạn tạo củ tỏi in vitro tốt ươm trồng củ tỏi in vitro vườn ươm để hồn thiện quy trình nhân giống virus đánh giá khả sinh trưởng phát triển giống phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật tách meristem (đỉnh sinh trưởng), Phương pháp đánh giá mức độ virus chồi tái sinh kỹ thuật RT-PCR, Phương pháp trồng củ in vitro vườn ươm số liệu tính tốn chương trình IRRISTAT5.0 (Phương pháp xử lý số liệu) Kết kết luận Kết đạt sau: (1) Kích thước meristem thích hợp để làm virus cho tỏi < 0,5mm; (2) Môi trường tốt để nhân nhanh chồi tỏi MS + 30g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 1,0 mg/l BA + 0,25 mg/l α-NAA, với hệ số nhân chồi 3,24 chồi/mẫu, chiều cao 10,84 cm sau tuần;(3) Tuổi tốt cho vào tạo củ in vitro tuần tuổi; (4) Mơi trường thích hợp cho việc tạo củ in vitro: MS + 120 g/l saccarose; (5) Kích cỡ củ in vitro đủ tiêu chuẩn để đưa ươm trồng có đường kính 0,9- 1,5cm khối lượng trung bình 0,89- 1,42g Và kích cỡ thích hợp đưa vườn ươm củ in vitro có đường kính 1,5cm trọng lượng trung bình 1,42g; (6) Thời vụ thích hợp để đưa củ in vitro vườn ươm khoảng tháng 10 với tỷ lệ sống đạt 92,7% ix