(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu chọn chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv) tại việt nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM CAO THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNGU CHỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNGNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNGI CHỨU CHỌN CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNGNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠII LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠIN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠIN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠIP Ở LỢN (PRRSV) TẠI LỢN (PRRSV) TẠIN (PRRSV) TẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠII VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM ĐỂ LÀM NGUỒN SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢC LÀM NGUỒN SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢCN SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠIN XUẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠIT VACXIN NHƯỢN (PRRSV) TẠIC ĐỘI CHỨNGC Chuyên ngành: Thú y Mã số:: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: PGS.TS Nguyễn Bá Hiênn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các kết nghiên cứu luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Cao Thị Bích Phƣợng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập hoàn thành luận văn, ngồi sựnỗ lực thân, tơi nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, cho phép tỏ lòng biết ơn cảm ơn chân thành tới: Ban Giám đốc Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm Khoa Thú Y, thầy cô giáo khoa Thú y, môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi học tập, thực hồn thành luận văn Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn lời cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Cao Thị Bích Phƣợng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abtract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) 2.1.1 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.1.3 Đặc điểm dịch tễ học 2.1.4 Triệu chứng bệnh 10 2.1.5 Bệnh tích 11 2.1.6 Chẩn đốn lâm sàng 12 2.1.7 Chẩn đốn phi lâm sàng 12 2.1.8 Phịng bệnh 13 2.1.9 Điều trị 14 2.2 Tác nhân gây bệnh 14 2.2.1 Phân loại 14 2.2.2 Hình thái học 15 2.2.3 Cấu trúc 16 2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy 18 2.2.5 Sức đề kháng 18 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.1 19 Thời gian địa điểm iii 3.2 Đối tượng nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Vật liệu nghiên cứu 19 3.4.1 Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA 19 3.4.2 Cặp mồi kit PCR 19 3.4.3 Hoá chất thực phản ứng huyết học 20 3.4.4 Tế bào, hóa chất dùng cho ni cấy tế bào phân lập virus 20 3.4.5 Lợn thí nghiệm 20 3.5 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 20 3.5.1 Dụng cụ 20 3.5.2 Trang thiết bị 21 3.6 Phương pháp nghiên cứu 21 3.6.1 Phương pháp tách chiết RNA 21 3.6.2 Phản ứng RT-PCR 22 3.6.3 Chạy điện di kiểm tra có mặt virus PRRS 23 3.6.4 Phương pháp phân lập virus PRRS tế bào 23 3.6.5 Nghiên cứu tính thích ứng PRRSV tế bào Marc-145 24 3.6.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào 24 3.6.7 Phương pháp phát kháng thể kháng PRRS 26 3.6.8 Phương pháp gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm 27 3.6.9 Phương pháp giải trình tự gen 28 3.6.10 Phương pháp xử lý số liệu 29 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Kết thu thập mẫu triệu chứng bệnh tích 30 4.2 Khả gây bệnh tích môi trường tế bào MARC-145 chủng VIRUS KTY-PRRS-06 4.3 33 Kết so sánh khả gây bệnh tích tế bào chủng VIRUS KTYPRRS-06 cường độc sau cấy truyền qua 90 đời 4.4 Kết xác định hiệu giá Virus (TCID50) chủng VIRUS KTYPRRS-06 qua 90 đời cấy truyền 4.5 35 36 Kết xác định quy luật nhân lên chủng VIRUS KTY-PRRS-06 qua 90 đời cấy truyền 37 iv 4.6 Kiểm tra ổn định di truyền đời VIRUS KTY-PRRS-06 4.6.1 Kết so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 đời cấy truyền khác 4.6.2 4.7.2 47 Kết xác định khả nhược độc hoá VIRUS KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền 4.7.1 41 Kết so sánh tương đồng axit amin gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền khác 4.7 40 51 Kết đo thân nhiệt lợn sau gây nhiễm virus KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền 51 Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch lợn phản ứng ELISA 51 Phần Kết luận đề nghị 53 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 Tài liệu tham khảo 55 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ µl Microlit cDNA Complement Deoxynucleotide Acid CPE Cytophathogenic Effect CRFK Crandall Rees Feline Kidney ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FA Flourescent Antibody Staining FBS Fetal Bovine Serum IFA Indirect Flourescent Assay IHC Immunohistochemistry staining IPMA Immuno Peroxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA Ribonucleotide Acid RT-nPCR Reverse Transcription-nested PCR SN Serum Neutralizing TBE Tris Borate EDTA α MEM α Minimum Essential Medium Eagle α MEM α Minimum Essential Medium Eagle vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Chức ORF virus PRRS 17 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát PRRS 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR .28 Bảng 3.4 Chu trình PCR giải trình tự .29 Bảng 4.1 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY-PRRS-06 phân lập Bảng 4.2 Khả gây bệnh tích qua 90 đời cấy truyền chủngKTYPRRS-06 Bảng 4.3 35 Kết xác định hiệu giá virus KTY-PRRS-06 phân lập qua 90 đời cấy truyền Bảng 4.4 33 36 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy truyền khác tế bào Marc-145 44 Bảng 4.5 So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-06 Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy chu chuyển khác tế bào Marc-145 Bảng 4.7 46 49 So sánh tương đồng axit amin đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-06 vii 50 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Dịch PRRS Việt Nam – 2007 Hình 2.2 Hình ảnh xâm nhiễm phá huỷ đại thực bào PRRSV Hình 2.3 Hình thái virus PRRS 15 Hình 2.4 Cấu trúc hệ gen virus PRRS 16 Hình 4.1 Một số biểu lâm sàng lợn mắc PRRS 30 Hình 4.2 Biến đổi bệnh tích đại thể lợn nghi mắc PRRS 31 Hình 4.3 Biến đổi bệnh tích vi thể lợn mắc PRRS 32 Hình 4.4 Kết RT-PCR với cặp mồi N22-N24 (349 bp) 33 Hình 4.5 Khả gây bệnh tích tế bào chủng KTY-PRRS-06 mơi trường Marc-145 sau thời gian gây nhiễm 34 Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền 38 Hình 4.7 Kết phản ứng RT-PCR với mồi Go3F Go5R (720bp) 40 Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen chủng KTY-PRRS-06 44 Hình 4.9 Kết so sánh trinh tự amino acid chủng KTY-PRRS-06 nghiên cứu 48 Hình 4.10.Thân nhiệt lợn sau tiêm virus KTY-PRRS-06 P#90 51 Hình 4.11.Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau gây nhiễm với chủng KTY – PRRS-06 P#90 viii 52