Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm chi cục BVTV Tỉnh Yên Bái.
Phòng nghiên cứu Trung tâm ứng dụng khoa học công nghệ -
Sở khoa học công nghệ tỉnh Yên Bái.
Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 9 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017.
Vật liệu nghiên cứu
- Giống ngô: DK6919, HN68, LVN885.
- Nguồn nấm lây bệnh: Các bệnh nấm hại chủ yếu trên lá ngô tại Văn Yên, Yên Bái.
- Các loại thuốc Anvil 5SC (Hexaconazole), Daconil 75WP
(Chlorothalonil), Tepro Super 300EC (Tebuconazole + Propiconazole).
- Môi trường nuôi cấy WA, PGA
- Các hóa chất trong phòng thí nghiệm: cồn, axit acetic
- Các dụng cụ cần trong phòng thí nghiệm: tủ định ôn, tủ sấy,buồng cấy vô trùng, kính hiển vi, lam kính, lamen, đĩa petri, đũa thủy tinh,ống đong, que cấy, dao,
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra các bệnh hại do nấm gây ra trên lá ngô tại huyện Văn Yên, Tỉnh Yên Bái.
- Xác định, chuẩn đoán tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu được trong quá trình điều tra bằng trực tiếp và phân lập trên môi trường nhân tạo.
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô.
- Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học trên môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô.
- Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp phun bào tử và lây nhiễm trực tiếp sợi nấm gây bệnh đốm lá lớn, đốm lá nhỏ và gỉ sắt trên các giống: DK6919, HN68, LVN885.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây ngô QCVN 01- 167:2014/BNNPTNT ban hành năm 2014
3.5.1.1 Bệnh trên lá (đốm lá lớn, đốm lá nhỏ, gỉ sắt)
Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 10 lá ngẫu nhiên/điểm.
Mỗi điểm chọn 10 lá ngẫu nhiên (lá non, lá bánh tẻ, lá già), đếm số lá bị bệnh và phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp:
Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh;
Cấp 3: từ 1 – 5% diện tích lá bị bệnh;
Cấp 5: > 5 – 25% diện tích lá bị bệnh;
Cấp 7: > 25 – 50% diện tích lá bị bệnh;
Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh.
3.5.1.2 Bệnh trên thân (Bệnh khô vằn ngô):
Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 30 cây/ điểm, phân cấp bệnh theo thang 9 cấp:
Cấp 1: < 1/4 diện tích bẹ lá bị hại.
Cấp 3: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại.
Cấp 5: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại, cộng lá thứ 3, thứ 4 bị bệnh nhẹ
Cấp 7: > 1/2 đến 3/4 diện tích bẹ lá bị hại và lá phía trên bị hại. Cấp 9: Vết bệnh leo tới đỉnh cây, các lá nhiễm nặng, một số cây chết. Các chỉ tiêu cần theo dõi
- Tỷ lệ, chỉ số bệnh (%)
Tỷ lệ bệnh (%) = Tổng số lá bị bệnh x 100 Tổng số lá điều tra
Trong đó: N1 là số cây bị bệnh ở cấp 1;
N3 là số cây bị bệnh ở cấp 3;
Nn là số cây bị bệnh ở cấp n;
N: là tổng số cây điều tra; n: là cấp bệnh cao nhất trong thang phân cấp (cấp 9).
3.5.2 Phương pháp điều chế môi trường phân lập nấm
1 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh (đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lọ nắp nhựa chuyên dụng ): có thể khử trùng bằng hoá chất hoặc sấy ở nhiệt độ cao Sấy ở nhiệt độ cao thông dụng hơn.
Dụng cụ thuỷ tinh rửa sạch bằng xà phòng, rửa lại bằng nước vòi Phơi khô trên giá, đóng gói bằng giấy bạc bọc thực phẩm
Cho vào tủ sấy, sấy ở 150 0 C trong 3 giờ
2 Rót môi trường ra đĩa petri: Thao tác cần được thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo vô trùng.
Môi trường cần được để nguội khoảng 55-60 0 C
Rót môi trường dầy khoảng 5 mm (20ml môi trường/đĩa petri 9cm) Để bề mặt môi trường khô (khoảng 20 phút) trước khi đậy nắp đĩa
3 Các loại môi trường dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm
Môi trường WA (Water agar): đun 15g agar trong 800 ml nước cho tan thạch Bổ sung nước cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 C/20 phút, để nguội khoảng 55-60 0 C trước khi rót ra đĩa.
Rót môi trường WA đã khử trùng vào đĩa petri
Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Khoai tây: 200gGlucose: 20 gAgar: 20 gNước: 1000 ml
Khoai tây rửa sạch, cắt lát, đun trong nước 1 giờ Lọc qua vải lọc, bổ sung agar vào dịch lọc, đun cho tan agar Bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 121 0 C/20 phút Để nguội 55-60 0 C trước khi rót ra đĩa petri.
(Chú ý, môi trường PGA rất giàu carbonhydrate Do vậy, để giảm sự sinh trưởng của nấm và tăng sự sinh bào tử có thể giảm lượng khoai tây và đường từ 50%-75%).
3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu
Với những mẫu nấm gây bệnh trên lá: gỉ sắt Puccinia maydis, đốm lá lớn E.turcicum, đốm lá nhỏ Bipolaris maydis… cho mẫu lá bị bệnh vào hộp mẫu, lưu trữ trong tủ mát và phân lập trong vòng 48h. 3.5.4 Phương pháp kiểm tra nấm từ vết bệnh
3.5.4.1 Kiểm tra trực tiếp vết bệnh (thích hợp cho các mô mỏng như lá cây) Chuẩn bị một lam sạch
Cắt vết bệnh cần quan sát thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1-2 cm Mẫu bệnh có thể được quan sát ngay sau khi thu thập ngoài đồng hoặc để ẩm trong hộp petri từ hôm trước. Đặt tiêu bản lên lam sao cho phần vết bệnh hướng lên trên. Điều chỉnh kính để có ánh sáng tối đa và quan sát ở độ phóng đại thấp (vật kính: x4, x10, x40).
Chú ý: Không nên cắt quá nhỏ mẫu bệnh và cần quan sát nhanh vì dưới cường độ ánh sáng mạnh, mẫu sẽ nhanh bị khô.
3.5.4.2 Kiểm tra nấm bệnh bằng cố định lam
Chuẩn bị: lam, la men, que khêu nấm, dao mổ, nước cất vô trùng, mẫu bệnh Mẫu bệnh (mẫu lá) có thể được sử dụng ngay sau khi thu thập hoặc để ẩm. Nhỏ một giọt nước cất lên lam
Dùng que khêu nấm hoặc dao mổ lướt nhẹ đầu nhọn trên vết bệnh, nhúng vào trong giọt nước trên lam và khuấy nhẹ Nhẹ nhàng đậy la men lên trên giọt nước (cố gắng tránh để có bọt khí) Dùng giấy thấm hút nước thừa xung quanh la men.
Quan sát ở độ phóng đại từ thấp đến cao (vật kính: x10, x20, x40).
3.5.5 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.5.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh Theo cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, đĩa môi trường
Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl 1-2%
3 Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới
4 Rửa mẫu bệnh sạch đất cát bằng nước vòi (đặc biệt là các mẫu rễ)
5 Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp
6 Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl 1-2 % Thời gian khử trùng từ 1-3 phút tùy vật liệu cây
7 Rửa lại bằng nước cất vô trùng
8 Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng
9 Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WA.
10 Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây, bệnh
11 Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm.
12 Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PGA.
3.5.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
- Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗ đục 5mm) trên các môi trường PGA, WA.
- Đối với mỗi loài nấm bệnh tiến hành thí nghiệm với 2 công thức là trên môi trường PGA và WA, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri Theo dõi trong vòng 5 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm).
3.5.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến sự phát triển của nấm trong phòng thí nghiệm theo phương pháp của Uesugi Yasuhiko
- Môi trường thử thuốc: Cân thuốc theo lượng đã tính phù hợp với nồng độ cần pha, để thuốc vào trong bình tam giác hoặc cốc đong có định mức, đổ lượng nước cất vô trùng theo lượng cần để tạo ra dung dịch mẹ có nồng độ xác định Ví dụ: Đối với thuốc Daconil 75WP, cân 1g thuốc pha với 75ml nước cất vô trùng sẽ tạo ra dung dịch mẹ nồng độ 10 000 ppm Dùng xi lanh hoặc pipet hút
1ml dung dịch mẹ cho vào bình định mức có 100ml dung dịch môi trường PGA lỏng đã được hấp, khử trùng sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 100ppm,
2ml dung dịch mẹ cho 100ml dung dịch môi trường sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 200ppm…
- Thí nghiệm đc tiến hành trên 3 loại thuốc Anvil 5SC, Daconil
75WP, Tepro Super 300EC với 4 công thức
+ CT4: Đối chứng (Môi trường PGA không xử lý thuốc)
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần là một hộp lồng đĩa petri,
- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm trung bình sau cấy trong 5 ngày (Đơn vị đo mm)
* Công thức pha chế dung dịch mẹ để thử thuốc trừ nấm trên môi trường nhân tạo PGA
10 6 Trong đú: 1 àai/ml = 1ppm = 10 6 b ml: Nước cất vô trùng + Tính lượng ml dung dịch mẹ cần lấy cho vào môi trường ở nồng độ cần có
M àai/ml Trong đó: C giá trị ko đổi P(g) (WP)
M àai/ml tương đương với a àai/ml
3.5.5.4 Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Phương pháp thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo kiểu Khối ngẫu nhiên đấy đủ RCB, Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại với vết bệnh trên lá là 10 vết, lây nhiễm toàn cây là 10 cây.
