Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh bà rịa vũng tàu và nghiên cứu ứng dụng trong dược mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM Chủ nhiệm đề tài: Sinh viên: Tống Thị Ngọc Bé, lớp DH15HC GVHD: TS Tống Thị Minh Thu đồng hướng dẫn TS Nguyễn Thị Tuyết BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019 Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol chè xanh trồng tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu nghiên cứu ứng dụng Dược Mỹ Phẩm Mã số: 1459/HD-BVU Chủ nhiệm đề tài: Tống Thị Ngọc Bé, sinh viên lớp DH15HC, Viện: Kỹ thuật – Kinh Tế biển, Trường: Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu Nội dung chính: - Chiết tách polyphenol chè xanh dung môi, Enzym kỹ thuật khác - Định tính thành phần hóa học polyphenol Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS - Định lượng phương pháp Folin-Denis Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Hoạt tính chống oxi hóa xác định dựa theo mơ hình phospho molybdenum - Xác định hoạt tính kháng khuẩn polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vịng vơ khuẩn - Kết đạt được: Đã tìm điều kiện tối ưu cho trình chiết polyphenol từ chè xanh là: Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi 1/25, nhiệt độ O chiết 65 C, thời gian: 35 phút - Hàm lượng polyphenol tổng cao chè (Loại thứ 2, 3, 4) 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w hàm lượng polyphenol tổng 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% hàm lượng polyphenol tổng 20,79% hiệu suất tăng 1,04 lần Hàm lượng polyphenol cao nụ 21,94% thấp chè già 17% o Khi sấy cao chiết chè nhiệt độ 120 C hàm lượng polyphenol cịn thấp 1,41% - Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế ảnh hưởng nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng đồng thời giữ mà mùi vị ban đầu chè - Hoạt tính oxy hóa dịch chiết polyphenol chè cao nhiều so với loại khác (Lá neem, lơ hội, xồi) tăng dần theo nồng độ - Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết chè kháng chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi dù nồng độ thấp (100 – 800 mg/ml) - Sau mẫu chiết đo HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, nên tách Polyphenol chế phẩm dạng tinh khiết để ứng dụng số lĩnh vực nhằm đạt giá trị cao mặt kinh tế - Xây dựng quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phịng thí nghiệm) Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019 Chữ ký CNĐT:…………………… MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH .iii DANH MỤC SƠ ĐỒ iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Giới thiệu chung chè 1.1.1 Nguồn gốc phân bố chè .5 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tình hình sản xuất chè Việt Nam 1.1.4 Thành phần hóa học chè 1.1.5 Dược tính chè 1.2 Polyphenol chè 1.2.1 Nguồn gốc chuyển hóa phân loại hợp chất phenolic thực vật .9 1.2.2 Các hợp chất Polyphenol có chè 10 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin chè .16 1.2.4 Phương pháp định tính, định lượng polyphenol chè 17 1.2.5 Hoạt tính sinh học polyphenol chè 22 1.3 Một số khái niệm trích ly phương pháp trích ly polyphenol chè 24 1.3.1 Bản chất trình trích ly 24 1.3.2 Các phương pháp trích ly 24 1.4 Ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly chất lượng sản phẩm 28 1.4.1 Ảnh hưởng dung môi nồng độ dung môi 28 1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly 30 1.4.3 Ảnh hưởng thời gian trích ly 30 1.4.4 Ảnh hưởng pH 31 1.4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 31 1.4.6 Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh 32 1.5 Giới thiệu số loài vi khuẩn phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 33 1.5.1.Giới thiệu số loài vi khuẩn 33 1.5.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 42 1.5 Phương pháp Sấy thăng hoa 44 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 46 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 46 2.1.1 Nguyên liệu chè 46 2.1.2 Chủng vi sinh vật 46 2.1.3 Hóa chất, thiết bị 46 2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis 47 2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 47 2.2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic 48 2.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ chè 49 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thông số công nghệ 49 2.3.2 Một số quy trình khảo sát khác 52 2.3.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol chè dung mơi có hỗ trợ enzym 52 2.3.4 Ảnh hưởng độ ẩm độ già 53 2.3.5 Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết chè 53 2.4 Định tính, định lượng polyphenol cao chiết chè 54 2.4.1 Định tính số hợp chất hữu có dịch chiết chè thuốc thử 54 2.4.2 Định tính polyphenol phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 56 2.4.3 Định tính UV-VIS 56 2.4.4 Định tính định lượng polyphenol HPLC 57 2.5 Xác định hoạt tính sinh học dịch chiết chè 57 2.5.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa dịch chiết chè 57 2.5.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 58 2.6 Khảo sát quy trình quy trình sấy 61 2.6.1 Sấy nhiệt độ cao 61 2.6.2 Sấy thăng hoa 61 2.7 Nghiên cứu ứng dụng cao chè sản phẩm kem dưỡng da 62 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Kết tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol chè .64 3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát yếu tố công nghệ 64 3.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng enzym 65 3.1.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa 65 3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol 66 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng .66 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .69 3.2.5 Ảnh hưởng PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70 3.3 Ảnh hưởng độ ẩm độ non già tới hàm lượng polyphenol tổng cao chiết chè 71 3.4 Ảnh hưởng số quy trình chiết khác 72 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng enzym hiệu chiết tách polyphenol 73 3.5.1 Ảnh hưởng enzym cenlulozo trình chiết tách polyphenol 73 3.5.2 Ảnh hưởng enzym pectinase trình chiết tách polyphenol .74 3.6 Ảnh hưởng trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng 75 3.7 Kết định tính, định lượng polyphenol chè 76 3.7.1 Định tính hợp chất chè thuốc thử 76 3.7.2 Định tính TLC 77 3.7.3 Định tính UV – VIS 78 3.7.4 Định lượng polyphenol chè HPLC 79 3.8 Kết khảo sát hoạt tính sinh học chè 80 3.8.1 Kết hoạt tính oxy hóa 80 3.8.2 Hoạt tính kháng khuẩn 82 3.9 Kết khảo sát quy trình lưu mẫu sấy cao chiết chè 85 3.9.2 Ảnh hưởng sấy nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng cao chiết chè 86 3.9.3 Sấy thăng hoa cao chiết chè 87 3.10 Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da 89 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 4.1 Kết luận 92 4.2 Kiến nghị 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C Catechin CG Catechingallate CK Chất Khô DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl EC Epicatechin ECG Epicatechingallate EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechingallate GC Gallocatechin GCG Gallocatechingallate HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao MIC Minimum inhibitory concentration TLC Sắc ký lớp mỏng UV Vùng tử ngoại VIS Khả kiến i DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sự hấp thụ dung dịch theo màu 21 Bảng 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic 64 Bảng 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65 Bảng 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65 Bảng 4: Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 66 Bảng 5: Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67 Bảng 6: Ảnh hưởng tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68 Bảng 7: Ảnh hưởng tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 69 Bảng 8: Ảnh hưởng PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70 Bảng 9: Khảo sát Ảnh hưởng độ ẩm độ non già 71 Bảng 10: Khảo sát số quy trình chiết khác 72 Bảng 11: Khảo sát Ảnh hưởng enzym cenlulozo trình chiết tách polyphenol 73 Bảng 12: Khảo sát Ảnh hưởng enzym pectinase trình chiết tách polyphenol 74 Bảng 13: Khảo sát Ảnh hưởng trình tinh chế polyphenol 76 Bảng 14: Kết khảo sát định tính nhóm chất 77 Bảng 15: Biểu đồ ảnh hưởng trình tinh chế polyphenol 78 Bảng 16: Kết đo bước sóng dịch chè sau tinh chế 78 Bảng 17: Hàm lượng chất polyphenol 79 Bảng 18: Kết sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 80 Bảng 19: Độ hấp thụ quang cao loại nồng độ 81 Bảng 20: Kết lực kháng oxy hoá theo nồng độ 81 Bảng 21: Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết chè 83 Bảng 22: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 86 Bảng 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da 90 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Lá chè Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT Hình 2: Cơng thức cấu tạo catechin 11 Hình 3: Công thức cấu tạo (-)-EGCG 11 Hình 4: Cơng thức cấu tạo ECG 13 Hình 5: Cơng thức cấu tạo C(A) EC(B) 13 Hình 6: Cơng thức cấu tạo Anthoxanthin 14 Hình 7: Cơng thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin 16 Hình 9: Vi khuẩn Escherichia coli kính hiển vi 34 Hình 10: Vi khuẩn Bacillus cereus kính hiển vi 35 Hình 11: Vi khuẩn Salmonella kính hiển vi 37 Hình 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus kính hiển vi 38 Hình 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kính hiển vi 41 Hình 1: Lá chè sau xử lý 50 Hình 2: Thiết bị chiết tách 51 Hình 3: Mẫu đo UV - VIS 51 Hình 4: Hệ thống cô quay chân không 51 Hình 5: Mẫu chè ủ với enzyme 53 Hình 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu cao 57 Hình 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hố 58 Hình 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn 59 Hình 9: Tủ sấy nhiệt độ cao 61 Hình 10: Thiết bị sấy thăng hoa 62 Hình 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 64 Hình 2: Đường chuẩn axit gallic 64 Hình 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 65 Hình 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 66 Hình 5: Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng .66 iii