Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống

Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.Nghiên cứu thu nhận polyphenol, chlorophyll từ rau má thìa (Centella asiatica (L.) Urb) và ứng dụng trong đồ uống.

RAUMÁTHÌA

Rau máthìa(Centella asiatica(L), Urban) làloàith ực vật có đặc điểmthânbò lan trên đất,màuxanh l ục hay lục ánh đỏ, có r ễ ởcácm ấu, láhìnhth ậnmàuxanh v ới cuốngdàivàphần đỉnhlátròn,k ết cấu lá trơn nhẵn vớicác gând ạng lướihìnhchânv ịt,cáclá m ọc ra từ cuốngdàikho ảng 5-20 cmvàc ócácc ụm hoa đơn mọc ở kẻ lá g ồm1 đến 5 hoa nhỏ. Hoa raumácómàut ừánhh ồng tới đỏ, mọcthànhcác tánnh ỏtrònn ằm gầnmặtđất.Mỗihoađượcbaophủmộtphầntronghailábắcmàuxanh.Cáchoalưỡngtínhnàykhán hỏ khoảng 3mm cóthùy trànghoa, hoa c ó 5 nh ị và 2vòinhụy.

Hình 1 1 Hình thái cây rau má[28]

(A) Câyraumáthìa,(B) C ụm hoa, (C) Hoa, (D) Quả, (E) Quả cắt ngang, (F) Hoa đồ

Quảcóhìnhmắ t lướidàyđặc,đâylàđiểmphânbiệtraumáthìavớ i cácloàitrong chiHydrocotyle, có qu ả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn cơm Bộ rễ bao gồmcácthânr ễ, mọc thẳng đứng,chúngcómàutr ắng kem và được che phủ bằngcáclôngtơ ở rễ [6,13,27].

Urb.),chúngthu ộc giớiPlantae,NgànhM a g n o l i o p h y t a, lớpMagnoliopsida, bộApiales, họApiaceae,phânh ọMackinlayoideae, chiCentella,loàiCentella asiatica[187]. Ở các địa phương, rau má cũng có nhiều tên khác nhau như: ở Việt Nam có têntích huy ết thảohoặcliên ti ền thảo,ở Lào làphanok, ở Campuchia làtrachiek kranh, ở Myanma làTrachiek-kranh, ở Srilanka và Ấn Độ làGotu-kola[5].

Căn cứ theo đặc điểm thực vật học, ở Việt Nam rau má đượctìmth ấycácloàinhư sau [5,6,13]:

- Câyraumáláraumu ống (Emilia sonchifolia(Linn));

Rau má có nguồn gốc từ Australia, các đảo Thái Bình Dương, New Guinea, Melanesia, Malesia và Châu Á Hiện này rau má cũng phân bố nhiều ở các quốc gia Nam Á như Malaysia, Trung Quốc, Srilanka, Ấn độ, Việt nam, Lào, Campuchia, Indonesia [110,128]. Ở Việt Nam, rau má m ọc tựnhiênkh ắp nơi từvùngh ải đảo, ven biển đếnvùngnúiởđộcaodưới1800m,thíchhợpmọcởnhữngnơiẩmướtnhưthunglũng,bờmương, ruộng… Vào mùa mưa ẩm, rau má sinh trưởng rất mạnh, nhanh và kh ỏe, ra hoa quả nhiềuvàocuốimùahèvàđầumùathu,táisinhtựnhiênchủyếutừhạt.Docókhảnăng đẻnhánhkh ỏe, cây thường tạothànht ừng mọc đám dàyđặc.

Rau má thường được trồng trong khoảng thời gian từ 30-35 ngày là có th ể thu hoạch lứa đầu tiên nhưng năng suất chưa cao vì cây chưa bò dày, năng suất cao thường từ lần thu hoạch thứ 2, thứ 3 [6].

Trong đời sống, rau má có th ể được sử dụng hằng ngày như một loại rau ăn ở dạngnấucanh,luộc,ănsống,xaylàmnướcgiảikhát,sảnxuấtthànhcácthứcuốngcôngnghiệp [6].

Trongtâyy,rau málàloài th ảo dượccótácd ụngsáttrùng,gi ải độc, thanh nhiệt, cótínhb ổ dưỡng cao Rau má có nhi ềukhoángch ất, nhiều chất chống oxyhóanêncó thểsửdụngđểcảithiệntrínhớ,tăngtuổithọ,làmmáulưuthôngtốtởtĩnhmạchvàmao mạch, bảo vệ mặt trong củathànhm ạch và làm tăng tính đàn hồi của mạchmáu.D ịch chiết rau má cótácd ụngsáttrùng,làmch ậmlãohóavà gi ảm huyếtáp.Lugkana Mato và c ộng sự đã nghiên cứu và cho r ằng sử dụng lượng nhất định dịch chiết rau má m ỗi ngàytrong2tháng,ngườigiàcảithiệnrõrệtkhảnăngnhớvàtrạngtháitinhthần[90].

Trongđôngy,raumáđượcmôtảcóvịhơiđắng,tínhngọtmát,cótácdụngthanh nhiệtgiảiđộc,sáttrùng,chữathổhuyết,tảlỵ,mụnnhọt,rômsẩy…Toànbộcâyraumá có th ể sử dụnglàmthu ốc ở dạng tươi hay phơi khô Trong trường hợp sử dụng ở dạng khô, người ta thu hoạch cảcây,r ửa sạch và phơi khô, khi sử dụng đemtháinh ỏ sắc lấy nước uống [2,5,6,13].

Cácnghiênc ứu cũng cho thấy, trong raumácónhi ều hợp chấtcóho ạttínhsinh họcmạnhnhưhoạttínhbảovệtếbàoda,niêmmạcdạdày,tếbàothầnkinh,khángnấm,khángvi khu ẩnvàvirus,có ho ạttínhch ống oxyhóa,ho ạttínhkh ử sắtvàhoạttínhb ắt gốc tự do DPPH.Ngoàira, rau m ácòncótácd ụnglàmgi ảmpháttri ển khối u, giảm nguy cơ bệnh tiểu đường, giảm ung thư gan và ung thư vú [27,40]

Cácho ạt chất trong rau mácótác d ụnglênm ột số biểubì,kíchthíchs ự sừnghóavàtácd ụng đến sựphânchia t ế bào, qua đó làm nhanh lành vết thươngngoàida.

D ịch chiết raumácótácd ụng chống lại sựlãohóadanêncó th ể thúc đẩyquátrìnhtáit ạo tế bào da làm cho căngđầysức sống, bề mặt da đầy đặn, săn chắc và đàn hồi tốt,khôngxảy ra hiện tượng gấp nếpvàchảynhão[27,40,99] Asiaticosid vàmadecassosid trong dịch chiết raumákíchthíchs ựhìnhthànhCollagen I, madecassosidgiúpti ết ra collagen IIIcótácd ụng duytrìlànda m ạnh khỏe, ngăn chặncóhiệu quả hiện tượnglãohóa[32,99,161]vàcóho ạttínhb ảo vệ tếbàogan r ất tốt [188].

Mặtkhác,cácnghiênc ứu vềtácd ụng của rau má đã ghi nhận tinh dầu raumácótácd ụng ức chế được sựpháttri ển tếbàogâyb ệnh ung thư [46] Khả năng chống oxy hóa và kháng ung thư của rau má cũng đượcFrederico Pittellavà c ộng sựnghiênc ứu cho thấy phenolic, flavonoid từ dịch chiết rau má có kh ả năng chống lại khối uáctínhở chuột (B16F1)vàtế bào ung thư vú ở người (MDA MB-231)[53].

Nhiềunghiêncứukháccũngchothấybộtraumávàdịchchiếtcủachúngcóhoạttínhch ống oxyhóa,ho ạttínhkh ử sắt và ho ạttínhb ắt gốc tự do DPPH cao Hoạttínhchống oxyhóac ủa nó được sosánhtương đồng vớicácch ất chống oxyhóat ổng hợp nhưBHT,BHA[183],tươngđồngvớiα- tocopherol[78].Trongđóthànhphầntổng phenoliccóđộtươngquanmạnhvớihoạttínhch ốngoxyhóacủadịchchiết,vậynêncó thểnóir ằngthànhph ần tổng phenolic làtácnhânchínhcho ho ạttínhch ống oxyhóatrong rau má [38,78].Cácnghiênc ứu cũng cho thấy, có s ự tương quan mạnh giữacáchoạttínhkh ử sắt, hoạttínhb ắt gốc tự do DPPH vớithànhph ần phenolic trong rau má [23].

Raumácòncótácdụnglàmgiảmtácđộngoxyhóacủalipidperoxidation(LPO), protein carbonyl (PCO) [100] vàhydrogen peroxide [95] trong tếbàonãochu ột, qua đó có kh ả năng chống oxyhóat ếbàoth ần kinh, tứclàthamgia b ảo vệ tốtcáct ếbàothần kinh trướccác tácnhânoxyhóa.Ngoàira, nh ờ đặctínhd ịch chiết rau má có kh ả nănglàmgi ảm hoạt động của enzyme α-glucosidasevàcóhoạttínhb ắt gốc tự do cao,nêncó thểmởratiềmnăngứngdụngđểlàmthuốcđiềutrịbệnhtiểuđườngvàthuốcchốngoxy hóa trong tương lai[144].

Nhữngthànhphầnchohoạttínhsinhhọccaonhấtđãđượctìmth ấytrongraumáthìalàcácpolyphenol, terpenoid và flavonoid Nh ững hoạttínhquan tr ọngnàyở rau máthìađãđượcsửdụngnhiềutrongyhọccổtruyềnvàđượcnghiêncứuứngdụngtrong nhiều lĩnh vực ở đời sống hiệnđại.

1.1.2 Thành phần hóa học của rau máthìa

Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của rau má khá đa dạng, phong phú và có hàm lượng thay đổi tùy theo vị trí địa lý, mùa vụ, điều kiện thổ nhưỡng [59].

Proteintrongraumáthườngchiếmhàmlượngrấtthấp,chỉkhoảng2%khốilượng khô [59] Các amino acid chủ yếu được tìm thấy là alanine và serine, bên cạnh đó cũng cóítaminobutyrate, aspartate, glutamate, histidine, lysine, threonine, arginine, leucine, iso-leucine, valine, methionine, tyrosine, phenylalanine, proline, cystine, glycine

[27,40].Trongraumáthìathìcarbohydratecóhàmlượngtươngđốicao,cóthểđạtđến55% khối lượng khô của nó, trong đó chủ yếu chứa các thành phần như: glucose, mesoinositol, centellose, pectin, arabinogalactan[40].

Các polyphenol trong rau má được tìm thấy chủ yếu là hai nhóm flavonoid và acidphenolic[157].Cáchợpchấtthuộcnhómflavonoidđãđượcxácđịnhnhư:apigenin và rutin [30],kaempferol, kaempferol-3-o-β-d-glucuronide và Kaempferol 3-p- coumarate [184],quercetin, quercetin-3-o-β-d-glucuronide, castillicetin, naringin và luteolin [40] Các hợp chất thuộc nhóm acid phenolic như: acid rosmarinic,acid chlorogenic, acid 3,4-di-o-caffeoyl quinic, acid 1,5-di-o-caffeoyl quinic, acid 3,5-di-o- caffeoyl quinic, acid 4,5-di-o-caffeoyl quinic, acid isochlorogenic [24,40,163].

GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOLVÀCHLOROPHYLL

1.2.1 Polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa củapolyphenol

Polyphenol(haycòngọilàpolyhydroxylphenol)làcáchợpchấtcónguồngốctựnhiênvà t ồn tại nhiều trong thực vật, mỗi đơn vị cơ bản (monomer) củachúnglà m ột hoặc nhiều vòng phenol, trong đó các vòng benzen gắn với một hoặc nhiềunhómhydroxyl (-OH) trực tiếp vớinguyênt ử cacbon trên vòng benzen, các đơn vịnàyliênkết với nhau tạothànhpolyphenol.

Tính chất lý hóa học và hoạt tính sinh học của phenol thay đổi tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm hydroxyl trên vòng benzen Các nhóm hydroxyl ảnh hưởng đến tính chất vật lý của phenol và từ đó quyết định đến tính chất vật lý của polyphenol Liên kết hydro hình thành giữa các nhóm hydroxyl trong phenol và với nước làm tăng nhiệt độ sôi và cải thiện độ tan trong nước so với các hydrocarbon có khối lượng phân tử tương đương.

Theo Singh A vàc ộng sự (2011), polyphenol trong thực vật có ch ủ yếu 5 nhóm hợp chất sau: stilbenes, lignans, flavonoids, acid fllagic vàacid phe nolic [157].

Có nhi ềunghiênc ứu vềthànhph ầnhóah ọc trên đối tượng rau má, cho đếnnaycó th ể thấycácpolyphenol c ủachúngch ủ yếu tồn tại ở hainhómflavonoid và acid phenolic.

* Flavonoid:là m ộtnhómph ổ biến củacách ợp chất polyphenol tựnhiên,lànhómh ợp chất phổ biến nhất trongtrái cây,rau qu ả và đồ uống có ngu ồn gốc từ thực vật Đến nay có hơn 8.000 hợp chất thuộc nhóm flavonoid được xác định, nhiều hợp chất flavonoid đem lạimàus ắc hấp dẫn cho hoa,tráicâyvàlá.Ở thực vật,cách ợp chấtnàycó kh ả năng bảo vệ chống lại tia cựctím,m ầm bệnh và các loài động vật ăn lá [26,50,112].

Hình 1 2 Cấu trúc cơ bản nhóm flavonoid

Các flavonoid được quantâmvìchúngcó nhi ều lợi ích dinh dưỡng và còn được xem lànhómho ạt chấtdùngtrong tr ị liệu Cụ thể,chúngcó kh ả năng tăng cường sức khỏe,sứcđềkháng,ngănngừabệnhtật,ungthư,cótínhkhángviêm,bảovệtĩnhmạch,làmgi ảm xơ vữa động mạch [26,121].

Flavonoid là d ẫn xuất benzo--pyrone của phenolic vàvòngpyrane, có c ấutrúcphổ biến là khung flavonoid cơ bảnliênk ết vớicácnhómhydroxyl ( -OH)vàmethoxyl(-O-CH3-).Cácnhómchínhc ủa flavonoid có 3 vòng: vòng thơm A đượcliênk ết hợp nhất với dị vòng C, vòng thơm B cũng đượcliênk ết với dịvòngC nh ờliênk ết C-C.

Flavonoidkhácnhau nh ờ sự sắp xếp củacácnhómbênhydroxyl, methoxyl, glycosidvànhờ sựliênk ết giữacácvòngA và B D ựatrêns ựkhácbi ệt về cấutrúcc ụ thể, flavonoid đượcphânlo ạithành6phânnhóm:flavonol, flavones, flavanone, flavanol, anthocyanidin vàisoflavone.

Các nhóm hydroxyl đượctìmth ấytrênc ả 3vòngA, B và C t ạo điều kiện đểchúngcó th ểliênk ết với carbohydrate.Cácflavonoidliênk ết với một hoặc nhiềuphântử glucose gọilàglycosideflavonoid,cácflavonoidkhôngliênk ết vớiphânt ử glucose gọi làaglycones.

Trong rau má thìa có m ột số hợp chất phổ biến thuộc nhóm flavonoid đã được xác định là: kaempferol, kaempferol-3-o-β-d-glucuronide, kaempferol 3-p-coumarate, quercetin, quercetin-3-o-β-d-glucuronide, castillicetin, apigenin, rutin, luteolin, naringin… [27,139,184].

Hình 1 3 Một số hợp chất phổ biến nhóm flavonoid

* Acid phenolic:Gồm những hợp chất là d ẫn xuất của acid benzoic và acid cinnamic.Cácd ẫn xuất của acid benzoic phổ biến nhất là p -hydroxybenzoic, vanillic, syringic, acid gallicvàcácd ẫn xuất acid cinnamic phổ biến bao gồm p-coumaric, caffeic, ferulicvàacidsinapic.Cácd ẫn xuấtnàykhácnhau v ề mức độ hydroxylhóavà methoxyl hóa vòng thơm [174].

Hình 1 4 Hợp chất cơ bản nhóm acid phenolic

Các acid phenolic có ho ạt tính ch ống oxy hóa cao và có m ặt trong hầu hết các loại ngũ cốc, rau vàqu ả Trong đó acid caffeic có nhiều nhất trong một số loại trái cây dạng quả mọng [104], trong khi acid coumaric thường có t ỷ lệ thấp hơn [142] và acid ferulic chiếm 90% tổng lượng acid phenolic trong ngũ cốc [97].

Những acid phenolic có th ể ở dạng tự do hoặc liên k ết trong cấu trúc Acid phenolic dạng tự do thường tồn tại ở lớp vỏ quả, ở phần áo h ạt vàacid phenolic ở dạng liên k ết thìliên k ết với thành t ế bào [138].

Trong rau máthìa, một số acid phenolic đã đượctìmth ấy như acid rosmarinic, acidchlorogenic,acid3,4-di-o-caffeoylquinic,acid1,5-di-o-caffeoylquinic,acid3,5-di- o- caffeoylquinic, acid 4,5-di-o-caffeoylquinic, acid isochlorogenic… [24,40,163].

Acid 3,4-di-o-caffeoylquinic Acid 1,5-di-o-caffeoylquinic

Acid 3,5-di-o-caffeoylquinic Acid 4,5-di-o-caffeoylquinic

Hình 1 5 Một số hợp chất phổ biến nhóm acid phenolic

Các polyphenol được biết đếnlàcách ợp chất có ho ạttínhch ống oxyhóam ạnh, có kh ả năng chuyểnhóacácg ốc tự do, chất oxyhóathànhcácch ất trunghòa.Hàngngàycơthểchúngtatiếpthurấtnhiềucácgốctựdovàchấtoxyhóa,chúngđượctạora từcácquátrìnhchuy ểnhóat ếbàoho ặc tiếp nhận từcácngu ồn bên ngoài như: ô nhiễm,khóithu ốclá,b ức xạ, thuốc Cácg ốc tự dovàch ất oxy hóa trong cơ thể đóng vai tròkép,có th ể cóíchho ặc có h ại.Xétv ề mặt có h ại, khi tiếp nhận nhiềucácg ốc tự do và chấtoxyhóathìcơthểsẽkhôngthểchuyểnhóahếtdẫnđếnsựtíchtụchúng.Quátrình nàylànguyênnhânquan tr ọng có th ể dẫn đến sựpháttri ểncácb ệnh tật như: ung thư, rối loạn tự miễn dịch, lão hóa, đục thủy tinh thể,viêmkh ớp dạng thấp, bệnh tim mạch,thoáihóath ần kinh [86].

Cơthểconngườicómộtsốcơchếđểchốnglạisựhiệndiệncácgốctựdovàcácchất oxyhóab ằngcáchtrunghòa,chuy ểnhóachúngnh ờcácch ất chống oxyhóa.Cácchất chống oxy hóa được cơ thể tổng hợpnênho ặc được cung cấp từbênngoàithôngqua thực phẩm hoặccácch ất bổsung.

Trongcácch ống oxyhóa,cách ợp chất nhóm polyphenol cũng có đặctínhn ổi bật đó là có hoạttínhch ống oxyhóam ạnh Tiếp cận vấn đề cơ chế chống oxyhóac ủacácpolyphenoldựatrêncơsởlýthuyếtvàthựcnghiệmchothấychúngcóthểthựchiệncácho ạt động này đối vớicácg ốc tự do, cụ thể gồm các cơ chế sau: Chuyểnnguyênt ử hydro (HAT: hydrogen atom transfer), chuyển proton kết hợp electron (PCET: proton coupled electron transfer), chuyển một electron sau khi chuyển proton (SET-PT: single electron transfer followed by proton transfer), chuyển proton mất electron (SPLET: sequential proton loss electron transfer), sựhìnhthànhph ức hợp cơ bản (RAF: radical adductformation)vàchuyểnnguyêntửhydro mấttuầntựproton(SPLHAT:sequential proton loss hydrogen atom transfer) [55,106].

CáccơchếtrêncóthểđượctómlượtbằngcáchkýhiệuPhOHlàcôngthứcchung chocácch ất chống oxyhóathu ộcnhómpolyphenol và X  làcông th ức chung chocácchấtcóbảnchấtoxyhóa.Ởmộtđiềukiệnnhấtđịnhcácchấtchốngoxyhóathuộcnhómpolyph enol (PhOH) sẽ chuyển hydronguyênt ử (H  ) sangliênk ết với gốc tự do (X  ) củacácch ấtoxyhóa để tạo hợp chất (HX) (1) hoặc có th ể kết hợp với gốc tự do (X  ) củacácch ất oxy hóa để tạothànhph ức hợp giữa chất chốngoxyhóavàgốc tự do [Ph- OH-X]  ( 2 )

Trong quá trình chống oxy hóa, gốc tự do (X∙) của các chất oxy hóa sau khi nhận nguyên tử hydro (H∙) từ các chất chống oxy hóa thuộc nhóm polyphenol sẽ tạo thành gốc trung hòa XH Các gốc phenoxyl (PhO∙) sinh ra có thể tiếp tục nhường H∙ để tạo thành quinone hoặc kết hợp với các gốc tự do khác, với các gốc phenoxyl khác để tạo các chất trung hòa Các phức hợp tạo thành [Ph -OH-X]∙ cũng sẽ kết hợp với nhau hoặc các gốc khác để tạo các chất trung hòa.

Cáchợpchấtpolyphenollànhữngnhómchấtthứcấpchủyếucủathựcvật,chúngđa dạng về cấutrúcvà ch ức năng Hầu hếtcácpolyphenol có ngu ồn gốc từ quátrìnhtraođổichấtvàchủyếutừL-phenylalaninthôngquaconđườngphenylpropanoidtrong thựcvật[41].Polyphenoltrongthựcvậtcóvaitròtạomàusắcchothựcvật,bảovệthực vậttrướctiacựctím,chốnglạisựoxyhóa,bảovệthựcvậttrướcsựtấncôngcủavisinh vậtgâyhại[75,149]vàquyếtđịnhnhiềuđếnđặctínhchốngoxyhóa,hoạttínhsinhhọc trong thực vật[41].

Cáchợpchấtphenollànhữngchất hoạtđộnggiữ vaitròchủđạoquyếtđịnhđến hươngvị,màusắccủanhiềusảnphẩmthựcphẩm.Ởmộtmứcđộnhấtđịnh,chúngtham giavào cácquátrìnht ạo racácc ấu tử thơm mới, tạo nên mùi thơm đặc biệt cho thực phẩm[71,103].Polyphenolthườngcótrongthựcphẩmvàđồuốngcónguồngốcthực vật, đặc biệtlàtáo,qu ả mọng,tráicâyh ọ camquýt,m ận,bôngc ải xanh, ca cao,trà,càphêvànhiềuloạikhác[ 41].Tuycónhiềuđặctínhtốt,nhưngcũngcócảnhbáovềnhững tác hại của việc tiêu thụ quá nhiều polyphenol, đặc biệt là các hợp chất được phân lập chứ không được tiêu thụ có trong thựcphẩm.

KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN POLYPHENOL,CHLOROPYLL

Táchchi ết là quátrìnhthu nhậncácch ất có trong m ột loạinguyênli ệu dựavàotínhtan của chất tan trong dungmôivàquátrìnhkhu ếchtánc ủa chất tan từnguyênli ệu ra môi trường dungmôi Để chiết rút được chất tan với hiệu suất cao, người ta cần lựa chọnđượcdungmôichiếttheonguyêntắcđảmbảochấttanhòatanvớihàmlượngcao nhưng phải có ho ạttínhcần thiết Do vậy,tùythu ộcvàoloại chất tan, người ta có th ể lựa chọn dungmôicó b ản chấtkhácnhau: dung d ịch đệm, nước cất hay dungmôih ữu cơ, … cho quátrìnhchiết.

1.3.1 Kỹthuậttáchchiết, thu nhậnpolyphenol Để tách chiết polyphenol, hiện nay người ta có th ể sử dụng một số kỹ thuật khác nhau:

Ngâmchi ếtlàkỹ thuật thường dùng đểtáchchiếtcácho ạt chất sinh học từ thực vật, đặc biệtlàcách ợp chất phenolic [70].Nguyênli ệu thực vật sau khi xử lý s ẽngâmtrongcácdungmôikhácnhau : nước, n-hexan, chloroform, benzen, ethanol, methanol,

[11].Tuynhiên,hiệuquảchiếtbằngdung môiđượcquyết địnhbởiloạidungmôisử dụng, bản chất của polyphenol và tương tác, liên kết của polyphenol vớicácthànhphần thựcvật[116].Vìvậy,khichọndungmôichiếtphảixemxétvịtrícủapolyphenoltrongcây,n ếucácpolyphenol ch ủ yếu tồn tại trong gianbàothìch ỉcóth ể chiết bằngethanol hoặccácdungmôih ữu cơ có độphânc ực cao[145].

Việctáchchiếtcách ợp chất có ho ạttínhch ống oxyhóab ằngcácdungmôitừ rau má b ằngkỹthuậtngâmchi ết cho thấy dịch chiết từ các dung môi có độphânc ực caosẽchodịchchiếtcóhàmlượngpolyphenolcóhoạttínhchốngoxyhóacao,cònđối với dịch chiết bằng dung môi có độ phân cực thấpthìdịch chiết sẽ có hàm lượng polyphenol có ho ạttínhch ống oxy hóa không đáng kể [25] Chẳng hạn, dịch chiết polyphenolcóhoạttínhch ống oxyhóatừládâubằng dung môi có độphânc ực cao như methanol 75% sẽ cho dịch chiết có hàm lượng polyphenol có ho ạttínhch ống oxyhóacao nhất so vớicácdungmôikhác[15] hoặc thu nhận polyphenol từlángôs ẽ cho hiệu quả cao khi chiết bằng kỹ thuậtngâmd ầm với dung môi nước [3] Hoặcquátrìnhchi ết polyphenolcóhoạttínhchốngoxyhóatừđậunànhbằngacetone70%(v/v),tỷlệnguyên liệuvàdungmôilà 1: 60 (w/v) với ba chukỳvới 3 giờ cho mỗi chu kỳtríchly ở nhiệt độ40°Csẽ cho hiệu suất chiết cao nhất [7] Kết quảnghiênc ứutáchchi ết polyphenol từvỏthâncâyquaonước(Dolichandronespathacea)bằngkỹthuậtngâmchiếtchothấy ethanol 90% là dungmôichi ếttáchpolyphenol tốt nhất khi chiết với tỷ lệ DM/NL là 15/1,nhiệtđộlà60 o Cvàthờigianlà9giờ[14].

Sử dụng sóng siêu âm thường có t ần số từ 20 kHz đến 10 MHz trong quátrìnhtáchchiếtcáchoạt chất cũng làm tăng hiệu quả chiết Kỹ thuật chiếtnàygiúplàmgi ảm lượng dungmôih ữu cơ, ít ảnh hưởng đến môi trường và an toàn đối với sức khỏe con người [176].Tácd ụng của sóng siêu âm là làm căng phồng tếbào,phávỡthànht ếbàovà s ự hydrathóatừ đólàmtăng khả năng tiếpxúcc ủa dungmôichi ết vớicácphânt ử hoạt chất dẫn tới cải thiện khả năng khuếchtán,chuy ển khốivàhi ệu quả chiếttách[177].Việcsửdụngsóngsiêuâmtrongchiế t rútcácchấtđượcchorằngsẽcảithiệnhiệu suất chiếtlênt ới 35% trongquátrìnhchi ếttáchcách ợp chất phenolic từ nguồn thực vật [175] Chẳng hạn, quátrìnhchi ết anthocyanin (một hợp chất thuộcnhómpholyphenol từ nho) bằng kỹ thuật chiết có h ỗ trợsóngsiêuâm,chi ết thủy tĩnh cao áp và chiết trong điện trường cho thấy cả 3 mẫu chiết đều cho hàm lượng anthocyanin cao gần gấp 2 lần sovới mẫuđốichứng chiếttheokỹthuậtngâmdầmở70 o Ctrong1giờ.Trongđó,mẫu chiết có h ỗ trợ sóng siêu âm cho hàm lượng anthocyanin cao nhất Kết quảnghiêncứu cũng cho thấy, cả 3 mẫu chiết trên đều cho dịch chiết có ho ạttínhch ống oxyhóacao hơn mẫu đối chứng [42].

Kỹ thuậttáchchiếtcóh ỗ trợ vi sóng đượccácnhànghiênc ứu thực hiệnvàonhững năm 1980 Quátrìnhchi ết này làm tăng nhiệt dungmôinh ờ đóphân táchcácphânt ử hoạt chất từ thực vậtvàodungmôichi ết [140] So vớicáck ỹ thuật chiếtkhác,kỹ thuật chiết có h ỗ trợ visóngcó nh ững ưu điểm như thời gian chiết ngắn, kiểmsoáttốtđượcnhiệtđộ,sửdụngítdungmôi,tố c độchiếtcao,tiếtkiệmnănglượng,chấtlượng sản phẩm tốt và chiphíthấp [60] Trong kỹ thuật chiết có h ỗ trợ visóng,nhi ệt sinh ra có độ đồng đều khắp trongnguyênli ệu chiết Mặt khác, khi tăng tác dụng của visóngvàthờigianchiếtthìlàmtănghiệusuấtthuhồilượngpolyphenoltựdovàtănghoạttínhchống oxyhóatrongquátrìnhchi ết polyphenol [61,62].

Kỹ thuậttáchchiết có h ỗ trợ visóngcó chiphívậnhànhth ấp, nhanhchóngvà cóthểđượcsửdụngtrongquymôsảnxuấtcôngnghiệpnhưngquantrọnglàphảichọn đượcnhiệtđộvàthờigianchiếtphùhợpchotừngloạinguyênliệu.

Táchc hiết trong dungmôicóápl ựclàquátrìnhchi ết trong dungmôiở nhiệt độ cao từ 50 đến 200 o Cvàápsu ất từ 3,5 đến 20 MPa Trongkỹthuậtnày,m ẫu rắn được đóng gói trong túi chiếtvàsử dụng dungmôih ữu cơ hoặc nước ởápsu ất, nhiệt độ cao hơn điểmsôic ủa dungmôi[123] Hiệu suất chiết bằng dungmôicóápl ực được cải thiện nhờ làm tăng độhòatan c ủacácch ấtvàodungmôi[122] Ngoài ra, tăng áp suất ở nhiệt độ cao, độ khuếchtánc ủacácchấtvàodungmôicó th ể tăng lên nhờ sựphávỡ lực Van der Waals,liênk ết hydrovàlực lưỡng cực giữacácphânt ử chất tan[162].

Nghiênc ứu sự ổn định củacácpolyphenol khi chi ết trong điều kiện dungmôiquánhiệt, kếtquảnghiêncứuchothấycácchấtphenolicđượcthử nghiệm,hầuhết đều ổn định và có t ỷ lệ thu hồitrên85% khi chi ết bằng methanol ở 150 o C [125]. Mặtkháckhi chiếtcácpolyphenol là catechin và epicatechin t ừ látrà,hạt nho có t ỷ lệ thu hồi khoảng 95% ở 130 o C Tuynhiên,ho ạttínhc ủa catechin và epicatechin t ừ hạt nho tốt nhất khi chiết trong dungmôicóápl ực bằng methanol so vớikỹthuậtngâmchi ết và chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmở cùng điều kiện[131].

Kỹ thuật thủy tĩnh cao áp thường sử dụng chất lỏng để tạo cộtápsu ất100÷1.000MPa trong quátrìnhchi ết.Áplựcnày được truyền đi tức thời, đồng đều vàkhôngph ụ thuộc vào kích thước,hìnhdángc ủa vật liệu chiết Nước là ch ất lỏng thường dùng để truyềnápl ực, trongquátrìnhx ửlýcóhoặckhôngc ấp nhiệt Trước đây, ứng dụngchínhcủa kỹ thuật thủy tĩnh cao áp là thanh trùng thực phẩm nhằm tăng thời hạn lưu trữ và tạocáctínhch ất đặc trưng cho thực phẩm.Ngàynay, nhi ềunghiênc ứu tập trungvào cácứngdụngtiêntiếncủakỹthuậtthủytĩnhcaoápđốivớiviệccảithiệnhiệuquảchiếtcácch ất Jun và c ộng sự đã so sánh việc chiếttáchpolyphenol t ừ lá trà xanh b ằng kỹ thuật chiết thủy tĩnh cao áp và ngâm chiết, kết quảnghiênc ứu cho thấy hiệu suất chiết polyphenolđượcquyếtđịnhrấtlớnbởi mứctăngápsuất,cụthểkhiápsuấttăngtừ100 đến 600MPa thìhi ệu suất chiết tăng từ 15 đến 30% [155] Cơ chếchínhc ủa chiếtbằng kỹ thuật thủy tĩnh cao áp là dướiápl ực thủy tĩnh cao, thành tếbàob ịphávỡ, dungmôi sẽ đi vào tếbàolàmcho t ếbàoch ất vàcách ợp chất polyphenol sẽ giảiphóngramôitrường dung môi Chính cơ chế tác động này làm tăng hiệu suất chiết của kỹ thuậtchiết thủy tĩnh cao áp, ít tác động xấu đến hoạttínhc ủacácch ất[155].

Táchc hiết trong điện trường là k ỹ thuật chiếttách tiênti ến đã đượcnghiênc ứu rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩmvàhoạt chất sinh học, đây là quá trình chiếttáchcácchất được thực hiện trong môi trường điện trường, quátrình nàykhôngsinh nhi ệt.Nghiênc ứu sự tác động của điện trường đếnquátrìnhchi ếttáchanthocyanin trong quá trìnhlênmenrượunhochothấyhiệusuấtthuhồianthocyanintănghơn21,5%và28,6% khi vỏ quả nho được xử lý b ằng điện trường tương ứng là 5 và 10 kV/cm so v ới chiết thông thường [88].Ngoàir a , k h i s ử d ụ n g đ i ệ n t r ư ờ n g 5 k V / c m t h ì h à m l ư ợ n g a n t h o c y a n i n nóiriêngvà polyphenol t ổng cao hơn trong quá trình sản xuất rượu vang nhođỏ[132].Hơnnữa,xửlýbằngđiệntrườngthìsảnphẩmrượuvangnhosẽchochất lượng cảm quan tốt hơn, cụ thể, cải thiện cảm vịvàmàus ắc nhờ sự tăng hàm lượngcácpolyphenolvàcácanthocyanintrongrượu[45,89],hoạttínhchốngoxyhóacaokhoảng 4 lần so vớikhôngdùngk ỹ thuật xửlývàviệc tăng hoạttínhch ống oxyhóatương quan với sự tăng hàm lượng polyphenol trong mẫu dịch chiết [42] Như vậy, điện trường cótácd ụng tăng khuếchtánch ất tannóichung,cácpolyphenolnóiriêngvàodungmôitrongquátrìnhchiế t Dovậy,điệntrườngcó thểđượccoilàkỹthuậttriểnvọngđểlàmtăng hiệu quảquátrìnhchi ếttách[155].

Trong kỹ thuậttáchchiết siêu tới hạn, cần quan tâm đến chất lưu siêu tới hạn, đây là một dạng vật chất tồn tại trong điều kiện áp suất và nhiệt độ cao hơnđiểm tớihạn.Trongđiềukiệnnày,vậtchấtcótrạngtháiđặcbiệtvừalỏngvừakhí,cụthểvừacó thể khuếch tán nhưchất khí, có thể thấm qua vật chất nhưchất lỏng Ngoài ra ở điều kiệnnhiệtđộvàápsuấtgầnvớiđiểmtớihạn,thayđổinhỏcủacácthôngsốnàydẫnđến thay đổi lớn vềmật độcủa vật chất[63].

Chất lưu siêu tới hạn được dùng trong một số trường hợp để thay thế cácdungmôihữucơlànước và CO2 NếusosánhvớinướcthìCO2cónhiềuưuđiểmhơn,thườngđược sử dụng vì hoạt động tương đối tốt, có điểm tới hạn vừa phải, cụ thể có nhiệt độtớihạncủaCO 2l à 31,2oCsovớinướclà101,1oCvàápsuấttớihạn72,9atmsovới nước là 217,6 atm Ngoài ra, CO2được xem là an toàn và không cần phải loại trừ dưlượngsaukhichiết,chỉđơngiảnlàloạibỏkhihạápsuấttạinhiệtđộphòng.Tuynhiên,CO 2 không thích hợp để chiết xuất các hợp chất phân cực cao như flavonoid vì độ phân cực của

CO2thấp Do vậy, các dung môi khác như metanol, ethanol có nồng độ thấpcó thể được sử dụng tạo đồng dung môi để làm tăng hiệu suất chiết trong chiết siêu tới hạn.

Sử dụngkỹthuật chiết CO2siêut ới hạn, metanol làm đồng dung môi để chiếtpolyphenol từ lá ô liu cho th ấy hàm lượng polyphenol tăng theo nhiệt độ,ápsu ất và nồng độ nhưng đạt cao nhất trong thời gian 140phút.K ỹ thuật chiếtsiêut ới hạn với đồng dung môi methanol 10% thu được hàm lượng phenolic cao hơn so vớikỹthuật chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmv ới dungmôiphânc ực thấp (n-hexane, diethylether, ethylacetate), nhưng thấp hơn đáng kể so với dung môi có độphânc ực cao (metanol, ethanol)[82].Chẳnghạn,nghiêncứuchiếttáchisoflavonetừbộtđậunànhbằngkỹthuậtchiếtsiêut ới hạn bằng CO2với đồng dungmôimetanol 10%, chi ết soxhlet với dungmôiethanol 80% và chi ết có h ỗ trợsóngsiêuâmv ới dungmôimetanol 70% K ết quảnghiênc ứu cho thấy chiết bằngkỹthuậtsiêut ới hạn cho hàm lượng isoflavones thấp nhất là 86,28 gam/gam khô so v ới chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmlà 311,55 gam/gam khô và so v ới chiết soxhlet là 212,86 gam/gam khô [148] Mặc dù hi ệu suất thu hồi isoflavonethấphơnkhisửdụngkỹthuậtchiếtsiêutớihạn,nhưngkỹthuậtchiếtnàycótínhch ọn lọc hoạt chất caovìrấtítcáct ạp chất khuếchtán vàod ịch chiết và s ố bước thực hiện cũng íthơn.

Táchc hiết chất lỏngsiêut ới hạn là k ỹ thuật chiết đượcnghiênc ứu để thay thếcáck ỹ thuật chiết sử dụng dungmôih ữu cơ, được sử dụng rộng rãi để chiếtcácho ạt chất từnguyênli ệu rắn trong tự nhiên đặc biệt là chi ếtcácthànhph ần thực phẩm Ưu điểmnổibậtcủa kỹthuậtlàsử dụngrấtíthoặckhôngcầndungmôihữucơ,chấtlượng sản phẩm chiết cao, thời gian chiết ngắnvàcótínhch ọn lọc cao khi chiết, tuynhiênk ỹ thuật này có chi phí đầu tư cao [63,129].

KỸ THUẬTSẤYPHUN

Sấy phun là kỹ thuậtlàmkhôcácgi ọt chất lỏng đã đượclàmphântánv ớikíchthước rất nhỏ trong dòng không khí nóng và thu được bột ở dạng hạt mịn, khô [181].Quátrìnhs ấy phun gồm ba giai đoạnchính là tạo giọt nhỏ (atomization), chuyển từ giọt nhỏthànhh ạt (droplet-to-particle) và thu h ồi hạt Quátrìnhs ấy khô gi ọt lỏng trongkhôngkhínóngx ảy ra qua hai giai đoạn gồm giai đoạn ban đầu là nhiệt độ của lớp hơi nướcbãohoàtrênb ề mặt giọt lỏng xấp xỉ nhiệt độ bầu ướt củakhôngkhívàtốc độsấykhông đổi Giai đoạn hai sự khuếchtán bêntrong h ạt rangoàib ề mặt giảm dần và t ốc độ sấy giảm dần. Để thực hiệnkỹthuật này, người ta dịchhóanguyênli ệu, phun dịchnguyênli ệuthànhcácgi ọtcókíchthước rất nhỏ (atomization) trong môi trường nhiệt độ cao đểtáchẩmvàlàmkhôchất tan, chuyểnchúngv ề dạng bột trong thiết bị sấy phun.Kỹthuật sấy phun tạonêndi ệntíchb ề mặt lớn dưới dạngcácgi ọt chất lỏng rất nhỏ, mịnthôngquaquátrìnht ạo giọt nhỏ từ dịch sấy trong buồng sấy tạo ra sản phẩm dạng hạt bộtvàhìnhcầu [51,169].

Kỹ thuật sấy phun phù h ợp cho việc tạo bột sản phẩm từnguyênli ệu dạng lỏngcócáctínhch ấtlýhóat ốtvàbảo tồn được hoạttínhsinh h ọc của sản phẩm [111].

Trong sấy phun, thời gian tiếpxúcnhi ệt của giọt dịch sấy rất ngắn, khoảng 5-100giây,nênít bị biến đổi vật chất, đảm bảo được chất lượngcácch ất dễ bị biến đổi như các chất dinh dưỡng,màus ắc và hương vị [146] Bột sấy thu hồi bằng kỹ thuật sấy phuncóhàmẩmvàhoạtđộnướcthấpnênrấtổnđịnh,hàmẩ m vàhoạtđộnướcphổbiếncủabộtrauqu ả sấyphunthườnglà2-5%và0,2-0,6[77,154],cóhoạttínhkhángvisinhvàchốngoxyhóat ốt,ítb ịcácph ản ứng đổimàu,th ủyphân,oxyhóalipidvàcácbiến đổi do tác động củaenzyme[102],bộtcókíchthướchạtnhỏ,dẫnđếnsảnphẩmcómậtđộlớn[66].Do đó, kỹ thuật sấy phuncóth ểápd ụng rộng rãi để sản xuất bộttráicâyvà rau qu ả trongcôngnghi ệp thực phẩm, dược phẩm[136].

220 o Cnêncó th ể biến đổicách ợp chất nhạy cảm nhiệt như là lycopene, beta- carotene, anthocyanin, vitamin C,màus ắc và hương vị [80] Hơn nữa, dịch sấygiàuđường như nướcéptráicâyvà rau qu ả sẽ khó s ấy phun trực tiếpvìdễ tạo nên độ keo,gây bámdínhthànhbu ồng sấy và s ản phẩm keo dính không đạtyêuc ầu, trong trường hợp này thường phải bổ sungcácch ất mang, phụ liệu sấy[29].

Sấy phun có th ể kết hợp với các điều kiện hỗ trợ khác như sấy phun có h ỗ trợsiêuâm,s ấy phunchânkhông,s ấy phunchânkhôngcóhỗ trợsiêuâmvàsấy phun bằngkhôngkhíkhô s ẽcónhi ều ưu điểm hơn so với sấy phun thông thường [79,168]. Để thu nhận được bột rau quả có chất lượng, đặctínhlýhóat ốtthìthiết bị sấy phun phải đảm bảo các đặctínhk ỹ thuật, phải chọnkỹthuật và điều kiện sấy phun phù hợp.

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấyphun

Chất lượng bột sản phẩm thu nhận được bằng kỹ thuật sấy phun phụ thuộcvàođiều kiện quátrìnhs ấy bao gồm nồng độ dịch sấy, nhiệt độ không khí đầuvàovà đầu ra,lưulượngdòngcấpliệu,lưulượngvàápsuấtkhínén,lưulượngkhíkhô,loạ i cơcấu phunvàtốc độ phun [51,77],…

* Nhiệt độ không khí đầu vào và đầu ra

Cács ắc tố vàcách ợp chất nhạy cảm có th ể bị biến đổi khi sấy phun ở nhiệt độ đầuvàoquá cao, c ụ thể cónghiênc ứu cho thấy là khi nhi ệt độ sấy phun caolàmgi ảm chấtlượngbộtbetacyaninsấyphuntừdịchchiếtthanhlong[170],làmgiảmhàmlượng phenolicvàhoạttínhb ắt gốc tự do DPPH của bột sấy phun từ nướcépme r ừng [108], giảm hàm lượng anthocyanin và ho ạttínhch ống oxyhóac ủa bột củ cải đen [113] khi nhiệt độ đầuvàoc ủaquátrìnhs ấy phunquácao. Đặc tính hóa lý c ủa bột sấy cũng chịu ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ sấy Cụ thể khi tăng nhiệt độ sấy đầu vào s ẽ làm thúc đẩy quá trình bay hơi nước nên làm tăng tốc độ sấy, qua đó nâng cao năng suất bột [166], độ ẩm của bột sấy thấp [35] và ảnh hưởng đến mật độ khối của bột [33].

Nhiệtđộtạicyclon,nơicáchạtbộtđượctáchrakhỏikhôngkhíẩmvàlắngxuống đáy của cyclon được xác định là nhi ệt độkhôngk hí đầu ra Nhiệt độ không khí đầu ra cũng là thông số quan trọng trong sấy phun, quyết định đến tốc độ sấy [92] Khi tăng nhiệt độ không khí đầu ra sẽlàmgi ảm độ ẩm của bột và tăng năng suất quátrìnhs ấy [105].

Sấy phun trực tiếp dịch rau quả thường khó th ực hiện do sản phẩm sau sấy dễ bị keodính,l ắng đọngtrênthànhbu ồng sấy,nguyênnhândo cócách ợp chất cótínhkeo trong dịch sấy Chất mang là m ột trong những phụ liệu quan trọng nhất trong sấy phun nhờ khả năng làm giảm sự keo nhớt của dịch sấy, tạo gắn kết các cơ chất trong dịch sấylênch ất mang Do đó khó có thể sấy phuncácd ịch sấy từtráicây,rau qu ảmàkhôngcó chất mang [136].Ngoàira,cácch ất mang trong sấy phuncóthể làm tăng năng suất sấy, tăng hiệu suất thu hồi, giảm độ keodính,gi ảm độhútẩmvàbột sấy ổn định hơn.

Cácch ất mang phổ biến được sử dụng trong sấy phun là v ề cơ bảncácpolyme carbohydrate thuộccácnhóm:(1) tinh b ộtvàcácd ẫn xuất của nó(maltodextrin, dextrin và cyclodextrin ), (2) gum (gum arabic, gum karaya ), (3) cellulose vàcácd ẫn xuất củanó(carboxymethylcellulose,hydroxypropylmethylcellulose )[49].Việclựachọn chất mang phụ thuộc vào đặc điểmhóalý d ịch sấy, mụctiêuquátrìnhs ấy vàtínhantoànc ủa chất mang đối với thực phẩm, với môi trường Chất mang phải có độhòatan caotrongdịchsấy,cókhảnăngtạomàngvàtạodungdịchcóđộnhớtthấpngaycảnồng độ cao Để sấy phun, chất mang phải cóphânt ử lượng cao, nhiệt độ kết tinh caovàcókhảnăngbảovệcáchợpchấtnhạycảmdướitácđộngnhiệtđộ,oxy, ánhsángvàđộẩm [47].

Tinhbộtvàdẫnxuấtcủanócóđặctínhs ửdụnglàmchấtmangsấyphuntốtnhư trọng lượngphânt ử cao,hòatan t ốt trong nước, độ nhớt thấp, ít bám dính, đặc biệt là đặctínhítt ạomàngr ất quan trọng đối với hiệu quả sấy khô và b ảo quản các đặctínhcủacáchợpchất[107].Tráingượcvớitinhbột,gumcókhảnăngtạomàngmạnh,nhiệt độkếttinhthấp.Tươngtự,cellulosevàcácdẫnxuấtcủanócóđặcđiểmtạomàng,hoạt động bề mặt mạnh, nhưng không tiêu hóa được [49] Trong một sốnghiênc ứu, protein cũngđượcsửdụngcùngvớitinhbộthoặcdẫnxuấtcủanó,đặcbiệtlàwheyprotein,bởi vìnó có khả năng tạomàngvàgiữ chất dinh dưỡng rất tốt [65].

Cácch ất mang thường được sử dụng trong sấy phun nướcéptráicâyvàrauqu ả làmaltodextrinvàgumarabic do tr ọng lượngphânt ử cao, nhiệt độ kết tinh cao, độhòatan tốt và độ nhớt thấp [136] Polyphenolvàcácch ất có ho ạttínhch ống oxyhóatrong bột sấy phun cao hơn khi sử dụng gum arabiclàmch ất mang sấycácd ịch chiết từ rau quả so vớicácch ất mang khác như b-cyclodextrin và maltodextrin [150] Ngược lại, chất mang là maltodextrin cho b ột sản phẩm giữ được hoạttínhch ống oxy hóa và độ hòa tan cao hơn hơn gum arabic [113].

Quacácnghiênc ứu cho thấy, khi thay đổi nồng độ chất mang sẽ tác động đến hàmlượngcáchoạtchấtvàhoạttínhc ủachúngtrongbộtsấy.Cụthể,khităngnồngđộ chất mang maltodextrin 5-9% sẽlàmgi ảm hàm lượng phenolicvàho ạttínhb ắt gốc tự do[108],khităngnồngđộmaltodextrin10-17%sẽlàmtănghàmlượnglycopenetrong bột sấy phun từ nướcépổi nhưng có sự giảm nhẹ khi tăng nồng độ maltodextrin từ khoảng17- 20%.

Mặtkhác,khităngnồngđộmaltodextrinsẽlàmgiảmđộẩmbộtdolàmtăngtổng hàm lượng chất rắn trong dịch sấy Cụ thể, độ ẩm giảm từ 2,6% xuống 1,9% khi tăng hàm lượng maltodextrinvàod ịch sấy từ 8% đến 16% trongquátrìnhs ấy phun nướcépdâu[76] và s ự lưu giữmàus ắc bột betacyanin sấy phun từ rau dền tím tăng khi tăng nồng độ maltodextrin [33].

Từnhữngnghiêncứutrênchothấy,khócóđềnghịchungchonồngđộchấtmang cần bổ sung cho dịch sấy trong sấy phun Chất manglàthànhph ần gắn kết vớicácho ạt chất trong dịch chiết nên chúng cũng ảnh hưởng nhiều đến đặctínhvàhoạttínhc ủa bột sấy phun [154].

Do đó, nồng độ chất mang phù h ợp phụ thuộcvàom ụctiêuc ủasấyphun, loại dịch sấyvàloại chấtmang.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU

NGUYÊNVẬTLIỆU

2.1.1 Rau máthìa:Raumáthìa(Centella asiatica(L), Urban), thuộc giớiPlantae,bộ

Hình 2 1 Hình ảnh rau má s ấy khô

Rau má được trồng ở Nha Trang - Khánh Hòa và được thu mẫu sau khi trồng được75ngăytuổi.Saukhithuhoạch,raumâđượcxửlýsơbộgồmloạibỏtạpcâcchất,lâvăng,lấavăt hunhậnlá,cuốnglá.Sau khi thu nh ậnvàxử lý, rau má được rửa sạch, ly tâm tách nước và được sấy khô b ằng tủ sấy trong điều kiện không khí cưỡng bứccóbứcxạhồngngoạicôngsuất1.250w/m 3 ởnhiệtđộ65 o Ctrongthờigian8giờvàđạtđộ ẩm 8% [1] Rau má sau s ấy được nghiền nhỏthànhb ột với kích thước 1-2 (mm) bằngmáynghi ền mẫuphòngthíngi ệm (IKAA11 Basic, Đức), bột được trộn đều cho đồng nhấtvàbaogóichânkhôngb ằng bao bìPAcótráng nhôm, khối lượng 200gam/túivàđược lưu trữ ở nhiệt độ -18 o C để sử dụng trongquátrìnhthínghi ệm[57].

2.1.2 Chất mang:Cácch ất mang (chất trợ sấy): maltodextrin, dextrin và gum arabic sử dụng trongnghiênc ứulàcácph ụ gia được Bộ Y tế chophéps ử dụng trong thựcphẩm,đạttiêuchuẩntinhkhiếtdoPhápsảnxuất,đượcCôngtyTNHHNamGiang TP HồChíMinh nh ập khẩuvàphânphối.

- Xác định: chất mang, tốc độ đĩa phun, nồng độ chất mang,ápsu ấtkhínén,nhi ệt độ sấy

- Tối ưu hóa công đọan sấy phun theo môhìnhBox-Behnken

Dịch chiết Nghiên c ứu chiết rút

Xác định tuổi thu hoạch Định danh loài b ằng kỹ thuật gen DNA

PHƯƠNG PHÁP BỐTRÍTHÍNGHIỆ M

Cách ti ếp cận các n ội dung nghiên c ứu được trình bày ở hình 2.2.

Hình 2 2 Sơ đồ cách ti ếp cận các n ội dung nghiên c ứu

Thời gian bảo quản: nhiệt độ phòng và điều kiện lạnh Đánh giá đặc tính b ột: độ tan, kích thước bột, chỉ số đa phân tán, đặc tính nhi ệt Xác định công th ức bột đồ uống rau má

- Xác định:cáchth ức chiết, dungmôi,n ồng độ dungmôi,nhi ệt độ, thời gian và t ỷ lệ DM/NL

- Tối ưu công đoạn chiết theo môhìnhBox - Behnken

Xác định hàm lượng polyphenol, chlorophyllvàhoạttínhchốngoxyhóatheo thời gian thuhoạch

Xác định một số chất có ho ạttínhsinh h ọc Xác địnhthànhphần sinh hóa cơ bản

MẫunguyênliệuraumáđượcsửdụngđểgiảitrìnhtựgenDNAnhằmđịnhdanh, xácđịnhđúngloàiraumácầnsửdụngchoquátrìnhnghiêncứu.Saukhiđịnhdanh,tiếnhànhl ấy mẫu raumá,phântíchm ột sốthànhph ần sinh hóa cơ bản vàcách ợp chất có hoạttínhsinh h ọc cơ bản: hàm lượng polyphenol, chlorophyll và ho ạttínhch ống oxyhóaqua các giai đoạn sinh trưởng Kết quả phân tích là cơ sở để đánh giá chất lượng, xác định thời gian thu hoạch nhằm thu được rau máthìacó hàm lượng polyphenol, chlorophyllvàhoạttínhch ống oxyhóacaodùnglàmnguyênli ệu choquátrìnhnghiêncứu. Để thu nhậncácpolyphenol và chlorophyllcóhoạttínhch ốngoxyhóa,quátrìnhnghiênc ứu sẽ xác địnhcácy ếu tố ảnh hưởng đến quátrìnhchi ếttách:cáchth ức chiết, dungmôi,nhi ệt độ, thời gian,tỷlệ DM/NL, Kết quả xác định là cơ sở để xác địnhthôngs ốbiênchoquátrìnhchi ếttáchvà là cơ sở để tiếnhànhtối ưu hóa công đoạn chiết để thu được dịch chiết rau má có hàm lượng polyphenol và chlorophyll v ới hoạttínhchống oxyhóacao nh ất.

Dịch chiết raumáthìathu nh ận theo các điều kiện tối ưu được cô đặcchânkhôngvà dịch chiết sau cô đặc được sử dụng đểnghiênc ứu sấy phun Trong quátrìnhnghiêncứu sấy phun sẽ tiến hành xác địnhcácthôngs ố ảnh hưởng đếnquátrìnhs ấy phun: loại chất mang, tốc độ đĩa phun, hàm lượng chất mang, nhiệt độ sấy,ápsu ất khí nén,… Kết quả thu được là cơ sở đểnghiênc ứu tối ưu hóa công đoạn sấy phun với mụctiêuthu nhận được bột rau máthìachứa polyphenol vàchlorophyll v ới hoạttínhch ống oxyhóavà hàm lượng cao nhất.

Bộtraumáthunhậnsauquátrìnhsấ y phunsẽđượcnghiêncứuphốitrộnvớimột sốthànhphầnkhácnhư:đườngsaccharose,…Kếtquảnghiêncứulàcơsởđểlựachọn được tỷ lệcácchất phối trộn phù h ợp cho sản phẩm bột rau má định hướngdùngtrong đồuống.

Ngoàira,còntiếnhànhnghiênc ứu đánh giá sự biến đổi hàm lượng polyphenol, chlorophyllvàhoạttínhch ốngoxyhóacủabộtraumáthìatheothờigianlưugiữởnhiệt độ thường và nhi ệt độ lạnh Kết quả đánh giá là cơ sở để sơ bộ đề xuất chế độ lưu giữ bột raumáphùh ợp cho sử dụng làm đồuống.

Thu mẫu ở các độ tuổi khác nhau

Nhiệt độ: 50oC Thời gian: 60 phút Tỷ lệ DM/NL: 40/1 Ethanol 95%

Chọn độ tuổi thu hoạch rau máthìa phù h ợp

2.2.2 Bốtrí thí nghiệm xác định thông số thích hợp các nội dung nghiêncứu

2.2.2.1 Nghiên cứu xác định thời gian thu hoạch rau máthìa

Bố tríthínghi ệm xác định thời gian thu hoạch rau má thìa được trình bày ở hình

Hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa

Hình 2 3 Bố tríthínghi ệm xác định độ tuổi thu hoạch rau má thìa

Rau má thìa được gieo trồngtrênru ộngchuyêncanhtácv ề rau má c ủaCôngty TNHHThươngmạiTrangNôngvàđượcthunhậnvàocácđộtuổithuhoạchkhácnhau: 30, 45, 60,

Quá trình nghiên cứu bột rau má được thực hiện trên bốn độ tuổi thu hoạch khác nhau là 75, 90, 105 và 120 ngày tuổi Sau khi thu hoạch, rau má được rửa sạch, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệt sử dụng bức xạ hồng ngoại ở nhiệt độ 65 độ C trong thời gian 8 giờ và nghiền nhỏ để sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu Bột rau má được chiết trong điều kiện có hỗ trợ sóng siêu âm bằng dung môi ethanol 95% với tỷ lệ DM/NL 40/1 trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ chiết 50 độ C Sau khi chiết rút, lọc thu dịch chiết và xác định hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa.

Chọn dung môi và phương pháp chi ết phù h ợp

2.3.1.1 Nghiên cứu tách chiết polyphenol và chlorophyll có hoạt tính chống oxy hóa từ rau máthìa

* Xácđịnhcácthôngsốcủaquátrìnhchiếtpolyphenolvàchlorophyllcóhoạt tính chống oxy hóa từ rau máthìa

+Xác định dung môi và phương pháp chiết

Tiến hành b ố tríthínghi ệm xác định dung môi và phương pháp chiết theo sơ đồ trình bày ở hình 2.4.

Rau máthìa ở độ tuổi thu hoạch đã chọn

Nhiệt độ: 30 o C Thời gian: 30 phút

Tỷ lệ DM/NL: 30/1 (ml/g)

Hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa

Hình2 4 Bố tríthínghi ệm xác định dung môi và phươngphápc h i ế t

Raumáthìaở độ tuổi thu hoạch đã chọn được sử dụng chonghiênc ứu xác định dung môi và phương pháp chiết Tiếnhànhchiếtrútpolyphenol, chlorophyllcóho ạttínhch ống oxyhóatừ rau máthìab ằngcácdungmôichi ết có độphânc ựckhácnhau: nước cất, methanol, aceton, ethanol, ethyl acetat, chloroform, diethyl ethervàn- hexan.Quátrìnhchiế t rútđượcthựchiệntheo3phươngthứcchiếtkhácnhau:ngâmchiết,chiết hồi lưu và chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmv ớitỷlệ DM/NL 30/1 ml/g trong thời gian 30phútở nhiệt độ chiết 30 o C Sau khi chiếtrút,lọc thu dịch chiết và xác định hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạttínhch ống oxyhóa Kết quả xác định cao là cơ sở để lựa chọn dung môi và phương thứcchiết.

Chiết bằng dung môi và phương pháp chi ết khác nhau

Chiết hỗ trợ sóng siêu âm

Chọn nồng độ dung môi chi ết phù h ợp

+Xác định nồng độ dung môi

Từ kết quả thínghi ệm ở trên, ti ến hành b ố tríthínghi ệm xác định nồng độ dung môi chi ết theo sơ đồ trình bày ở hình 2.5.

Rau máthìa ở độ tuổi thu hoạch đã chọn

Chiết bằng dung môi đã chọn ở nồng độkhácnhau

Phương pháp và dung môi chiết đã chọn

Nhiệt độ: 30 o C Thời gian: 30 phút

Tỷ lệ DM/NL: 30/1 (ml/g)

Hàm lượng polyphenol, chlorophyll và h oạt tính chống oxy hóa

Hình 2 5 Bố tríthínghi ệm xác định nồng độ dung môi

Từ sơ đồ bố tríthínghi ệm ởhình2.5, ti ếnhànhchi ếtrútcácch ất từ raumáthìatheo các điều kiện đã chọn ởtrênnhưng nồng độ dungmôichi ếtkhácnhau: 75, 80, 85, 90, 95 và 99,9% với tỷ lệ DM/NL là 30/1 trong thời gian chiết 30phútở nhiệt độ 30 o C. Saukhichiếtrút,lọcthudịchchiết,xácđịnhhàmlượngpolyphenol,chlorophyllvàhoạttínhch ống oxyhóa Kết quả xác định cao là cơ sở để chọn nồng độ dungmôichiết.

+ Xác định nhiệt độ chiết

Tiếnhànhb ốtríthínghiệm xác định nhiệt độ chiết theo sơ đồtrìnhbàyởhình

Từ sơ đồ bố tríthínghi ệm, tiến hành chi ết rút các ch ất từ rau má thìa theo các điềukiệnđãchọnởtrênnhưngnhiệtđộchiếtkhácnhau:30,40,50, 60,70và80 o Cvới tỷ lệ DM/NL 30/1 trong thời gian chiết là 30phút.Sau khi chi ếtrút,l ọc thu dịch chiết vàxácđịnhhàmlượngpolyphenol,chlorophyllvàhoạttínhchốngoxyhóa.Kếtquảxácđịnh cao là cơ sở để chọn nhiệt độ chiết phù h ợp choquátrìnhnghiêncứu.

Chọn nhiệt độ chiết phù h ợp

Chọn thời gian chiết phù h ợp

Rau máthìa ở độ tuổi thu hoạch đã chọn

Phương pháp chiết và dungmôichiết với nồng độ đã chọn trong thời gian: 30phút, tỷ lệ DM/NL:

Hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa

Hình 2 6 Bố tríthínghi ệm xác định nhiệt độ chiết

+Xác định thời gian chiết

Tiến hành b ố tríthínghi ệm xác định thời gian chiết theo sơ đồ trình bày ở hình

Rau máthìa độ tuổi thu hoạch đã chọn

Phương pháp chiết, dung môi chiết với nồng độ và nhi ệt độ đã chọn, tỷ lệ DM/NL: 30/1 (ml/g)

Các h oạt tính ch ống oxy hóa

Hình 2 7 Bố tríthínghi ệm xác định thời gian chiết

Chiết trong các th ời gian khác nhau

Phân tích Chiết ởcácnhi ệt độkhácnhau

Chọn tỷ lệ DM/NL phù h ợp

Rau máthìa độ tuổi thu hoạch đã chọn

Phương pháp chiết, dung môi chiết với nồng độ, nhiệt độ và thời gian chiết đã xác định Chiết với tỷ lệ DM/NL khác nhau

Theo sơ đồ bố tríthínghi ệm ởhình2.7, ti ếnhànhchi ếtrútcácch ất từ rau máthìatheocácthôngs ố đã chọn trongcácthínghi ệm trước nhưng thời gian chiết thay đổikhácnhau: 30, 60, 90, 120, 150, 180phútvới tỷ lệ DM/NL 30/1 Sau khi chiếtrút,lọc thu dịch chiết và xác định hàm lượng polyphenol, chlorophyllvàhoạttínhch ống oxyhóa.Kết quả xác định cao là cơ sở để chọn thời gian chiết phù hợp.

+Xác định tỷ lệ DM/NL

Từ kết quả thínghi ệm ở trên, ti ến hành b ố tríthínghi ệm xác định tỷ lệ DM/NL theo sơ đồ trình bày ở hình 2.8.

10/1 ml/g 20/1 ml/g 30/1 ml/g 40/1 ml/g 50/1 ml/g 60/1 ml/g 70/1 ml/g

Các h oạt tính ch ống oxy hóa

Hình 2 8 Bố tríthínghi ệm xác định tỷ lệ DM/NL

Theo sơ đồ bốtríthínghiệm ởhình2.8, ti ếnhànhchi ếtrútcácch ất từ rau máthìatheocácthôngs ố đã chọn trongcácthínghi ệm trước nhưngtỷlệ DM/NL thay đổikhácnhau: 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1, 60/1 và 70/1 (ml/g) Sau khi chi ếtrút,l ọc thu dịchchiếtvàxácđịnhhàmlượngpolyphenol,chlorophyll,hoạttínhchốngoxyhóa.Kết quả xác định cao là cơ sở để chọn tỷ lệ DM/NL chiết phùhợp.

* Nghiên cứu tối ưu chiết polyphenol và chlorophyll có hoạt tính chống oxy hóa từ rau má

Thiết kế tối ưu quá trình chiết polyphenol vàchlorophyll có ho ạttínhch ống oxyhóat ừ rau má với mô hìnhBox -Behnken Chọncácy ếu tố tác động trong quátrìnht ốiưu gồm: nhiệt độ chiết [X 1 , (oC)], thời gian chiết [X2,(phút)]và t ỷ lệ DM/NL [X3,

Xác định điều kiện chiết tối ưu

(ml/g)] Các giá tr ị thực của các bi ến X1, X2 và X3 được xác định dựa trên các thí nghiệm khảo sát trước đó.

Bảng 2.1 Các m ức điều kiện thínghi ệm tối ưu công đoạn chiết

Các m ức Các y ếu tố ảnh hưởng

Sơ đồ bố tríthínghi ệm tối ưu điều kiện chiết polyphenol, chlorophyll có ho ạt tính ch ống oxy hóa như hình 2.9.

Các h oạt tính ch ống oxy hóa

Hình2 9 Bố tríthínghi ệm tối ưu chiết polyphenol và chlorophyll có ho ạttínhchống oxyhóat ừ rau má

Cáchàmm ụctiêuc ủa quátrìnht ối ưu là hàm lượng polyphenol [Y1, (mg acid galic/gchấtkhô)],hàmlượngchlorophyll[Y2,(mg/gchấtkhô)]vàhoạttínhchốngoxyhóat ổng [Y3, (mg acid asccorbic/g chấtkhô)].

Bảng 2.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm tối ưu công đoạn chiết

(mg acidascor bic/gchất khô)

Sửdụng phầnmềmDesignExpert12.0hỗtrợxửlýtối ưu,kiểmđịnh tvà đưara được phương trình hồi quy, môhìnhtoánh ọc vàcácbi ểu đồ, đồ thị thể hiện sự ảnhhưởngvàmối tương quan giữacácyếu tố gồm: nhiệt độ chiết (X1), thời gian chiết (X2) và tỷ lệ DM/NL (X3) đến hàm lượng polyphenol (Y1), hàm lượng chlorophyll (Y2) và hoạttínhch ống oxyhóat ổng(Y3).

Sau khi có k ết quả thực nghiệm thìti ếnhành phântíchảnh hưởngcácbi ến độclập (Xi) đến hàm lượng polyphenol, chlorophyll và ho ạttínhch ống oxyhóat ổng bằngviệcthiếtlậpphươngtrìnhhồiquybậc2vềmốitươngquangiữabiếnphụthuộcvàbiến độclập.

Phương trình hồi quy có d ạng: Y = b0+ b1X1+ b2X2+ b3X3+ b11X2+ b X2+

Phần mềm DesignExpert 12.0 sẽtiênđoán và gợi ý các điều kiện tối ưu để chiếttáchđ ư ợ c hàmlượngpolyphenol(Y 1 ),chlorophyll(Y2)vàhoạttínhch ốngoxyhóatổng (Y3) cao nhất (Yi = [max]) Tiếnhànhthínghi ệm để xác định kết quả tối ưu so với kếtquả tiên đoán để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol và chlorophyllcóhoạttínhch ống oxyhóat ừ raumá.

Chọn chất mang phù h ợp

Nồng độ CM 100 g/l Áp suất khínén 2 kg/cm 2 Nhiệt độ sấy 140oC Tốc độ đĩa phun 20.000 v/p Lưu lượng nhập liệu 15 ml/p Thu nhận bột rau má

Phối trộn với các ch ất mang khác nhau

2.3.1.2 Nghiên cứu sấy phun tạo bột rau má chứa polyphenol và chlorophyll có hoạt tính chống oxyhóa

* Nghiên cứu xác định thông số quá trình sấyphun

Tiến hành b ố tríthínghi ệm xác định loại chất mang cho quátrình s ấy phun theo sơ đồ trình bày ở hình 2 10.

Cách oạttínhch ống oxyhóaĐặctínhb ột

Hình 2 10 Bố tríthínghi ệm xác định chất mang

Dịch chiết rau má thìa thu nhận trong quá trình chi ết ở điều kiện tối ưu được cô đặc chân không ở nhiệt độ 60 o C với áp su ất chân không 75mBar và nhi ệt độ ngưng tụ

5 o C đến đạt nồng độ chất khô trong d ịch sau cô đặc là 18 o Bx.

Theo sơ đồ bố tríthínghi ệm ở hình 2.10, c ác m ẫu dịch chiết rau má thìa sau cô đặc được phối trộn 3 loại chất mang (maltodextrin, dextrin vàgum arabic) v ới nồng độ là 100 g/l, áp su ất khínén 2 kg/cm 2 tại nhiệt độ sấy 140 o C, tốc độ đĩa phun 20.000 v/p và lưu lượng nhập liệu 15 ml/p Mẫu bột rau má thìa thu nh ận được sau quá trình s ấy phun có hàm lượng polyphenol, chlorophyll, hoạt tính ch ống oxy hóa cao và đặc tính bột tốt là cơ sở để chọn loại chất mang cho quátrình nghiên c ứu sấy phun.

Chọn tốc độ đĩa phun phù hợp

PHƯƠNG PHÁPPHÂNTÍCH

2.3.1 Phương pháp sinh học phântử

Mẫu rau má thìa (Centella asiatica(L.) Urb) trồng ở Nha Trang - Khánh Hòa được thu nhận và tiến hành thí nghiệm định danh loài Các bước tiến hành định danh loài bằng kỹ thuật phân tích gen DNA như sau:

- Tách chiết DNA: Mẫu rau má được thực hiện tách chiết DNA theo quy trình CTAB I có c ảibiêntrong vi ệc bổ sung SDS vào thành phần đệmphânl ập DNA tổng sốcủamẫuláđượctáchchiếtdựatrênquytrìnhCTABcơbảncủaKurtWeisingcócải tiến [81]. Nghiền 100 mg mẫu lá trong 500 μl CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng.l CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng. Hỗnhợpmẫu/CTABđượcủở65 o Ctrong60phút,lytâmhỗnhợpmẫu/CTABở14.000 rpmtrong10phỳt.Chuyểndịchnổisangốngmới,bổsung4àlRNAase,ủở37 o Ctrong thời gian 5 phút, bổ sung 500 μl CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng.l hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1), lắc đều, lytâmởtốcđộ14.000rpmtrong10phút.ThudịchnổichứaDNAsangốngmới(khoảng 450- 500àl),bổsungethanoltuyệtđốivớitỷlệ1:1sovớithểtớchthuđượcvàẵthểtớch NaCl 5M so với thể tích thu được Hỗn hợp được ủ trên đá trong 1 giờ, ly tâm 13.000 rpmtrong10phút.Hỗnhợpsaulytâmđượcloạibỏdịchnổivàthutủa,bổsung500μl CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng.l ethanol 70% lạnh và đảo ống, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút lặp lại 2 lần, loại bỏ dịch nổi, thu tủa Để khụ kết tủa ở nhiệt độ phũng và hũa DNA trong 200 àl nước khử trựng hailần.

- Nhân bản 02 gene matK và ITS1–5.8S–ITS2 bằng phản ứng PCR vớicácm ồi đặchiệu:

CácphảnứngPCRđượcthựchiệnnhằmkhuếchđạivùngma tK,ITSvớicáccặp primer tươngứng.

+ Vùng matK: matK 2011F: 5' -CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C-3' và matK 2011R: 5'-GTT CTA GCA CAA GAA AGT CG-3'

+ Vùng ITS: 18d: 5’-CAC ACC GCC CGT CGC TCC TAC CGA-3’ và 28cc: 5’-ACT CGC CGT TAC TAG GGG AA-3’

Thànhph ần cơ bản cho 1 phản ứng PCR 20àl:0,2 mM dNTP mix, enzyme DreamTaq polymerase 1U, dream taq buffer 10X, 0,4àMprimerxuụi,0,4àMprimer ngược, nước cất 2 lần khửtrựng,1àlm ẫu với nồng độ DNA từ 100 – 500ng/àl.Chu kỳ PCR tiền biếntính95 o C trong 1phút;30 chu k ỳ (biến tính ở 95 o C trong 30giây;bắtcặp (Ta: matK(49°C),ITS(54°C))trong 30giây;72oC trong 40giây);chu k ỳ kếtthúc72 o C trong 10phút.K ết quả PCR được phân tích đánh giá trên gel agarose 1,2%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30-45phút,nhu ộm với ethidium bromide và ch ụphìnhtrênmáych ụp gel (GelDoc-It®2315 imager UVP-Mỹ).

- Giải trình tự gen và đánh giá mức độ tương đồng của DNA phân tích với các trình tự của vùng matK và vùng ITS của loàiCentella asiaticacó sẵn trên NCBI Kết quả giải trình tự gen được hiệu chỉnh bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1 và đánh giámứcđộtươngđồngcủaDNAphântíchvớicáctrìnhtựcủavùngmatKvàvùngITS của loàiCentella asiaticacó sẵn trênNCBI.

2.3.2.1 Xác định hoạttínhch ống oxyhóatổng

Hoạttínhch ốngoxyhóat ổng (TAA) được xác định theo phương pháp của Prieto(1999)[130].Lấy100àlmẫubổsung900àlnướccấtvàthờm3mldungdịchA(H 2 SO40,6

M, sodium phosphate 28 mMvàammoniummolybdate 4 mM, m ỗi loại 1 ml).Hỗn hợp được giữ 90phútở 95 o C, sau đó đo ở bướcsóng695nm v ới chất chuẩn là acid ascorbic.

Hoạttínhkhửsắt(RP)củadịchchiếtđượcxácđịnhtheophươngphápcủaZhuvà cộng sự (2002) [134] Lấy500àldịchmẫu bổ sung 0,5ml đệm phosphate pH = 7,2 và0,2mlK 3 [Fe(CN)6]1%.Giữhỗnhợp20phỳtở500C,sauđúthờmvào500àlCCl3COOH

10%vàbổsung300àlnướccất,80àlFeCl30 ,1 %.Tiếptheođoởbướcsúng655nmvới chấtchuẩnlàFeSO4.

2.3.2.3 Xác định hoạttínhb ắt gốc tự doDPPH

Hoạttínhb ắt gốc tự do (DPPH) được xác định theo Blois M S (1958) [31].Lấy lần lượt200àl, 400àl, 600àl, 800àlvà1000àl d ịch chiếtvào5 ống nghiệm, rồi bổ sung 3ml DPPH 25mg/lvàot ừng ống nghiệmlàmdun g dịch mẫu Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tương tự nhưng thay DPPH bằng 3ml cồn tuyệt đốivàot ừng ống Mẫukiểmsoátchu ẩn bị bằngcáchlàmgi ống như mẫu trắng nhưng thay dịch chiết bằng DPPH Giữcách ỗn hợp trong tối ở nhiệt độphòng,sau 30phútti ến hành đo ở bướcsóng5 5 0 n m P h ầ n t r ă m b ắ t g ố c t ự d o đ ư ợ c tínhtheocôngth ức nhưsau:

AA%: hoạt tính b ắt gốc tự do của mẫu thínghi ệm, (%);

Amau ,Amautrangvà Akiemsoat: giátr ị đo độ hấp thụ ở ở bước sóng 550nm c ủacác m ẫu thínghi ệm, mẫu trắng vàm ẫu kiểm soát.

Xác định hàm lượng polyphenol tổng được thực hiện theokỹthuật của Folin - Ciocalteu[22].Lấy0,3mldịchmẫu,bổsung1mlthuốcthửFolin-Ciocalteau10%,giữ5 phút và sau đó thêm vào 2ml Na2CO310%.

Hỗn hợp được lắc đều, giữ 90 phút ở nhiệt độ phòng, trong t ối và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750nm Ch ất chuẩn sử dụng trong kỹ thuật xác định hàm lượng polyphenol làacid galic.

Dịchchiếtchlorophylltrongethanol95%saukhiđượclọcvàđođộhấpthụquang ở bướcsóng664 nmvà648nmtrên máyquang ph ổ UV-VIS, mẫu trắng là dungmôiethanol 95% Hàm lượng chlorophyll được tính theo phương pháp của

Chlorophyll tổng: C(ChLa+ChLb)= C(ChLa)+ C(ChLa+ChLb), (àg/ml)

Trong đó, A664và A648lần lượt là độ hấp thu quang của dịch chiết tại các bướcsóng 664 nm và 648 nm.

[48].Lấy250àldịchchiết trộn với vanillin-acetic acid (5% w/v, 0.25 ml) và 0,5 ml perchloric acid Hỗn hợp được ủ nhiệt ở 60°C trong 10 phút, sau đó hỗn hợp đượclàml ạnh trong bể đá 15 phút,thêm2,5 ml acid acetic và tr ộn đều trong 6phút.H ỗn hợp được đo độ hấp thụ quang ở bướcsóng538nm Chất chuẩn sử dụng trongkỹthuật xác địnhhàmlượng triterpenoidlàacidoleanolic.

2.3.2.7 Xác định hàm lượng asiaticoside, quercetin vàacid rosmarinic Đối với mẫu dịch chiết rau má được lắc đềuvàl ấychínhxác1,0 ml dung d ịch mẫu chovàobìnhc ầu Cô quay đến cạn, rồihòatan l ại với 1,0 ml methanol. Phaloãngmẫu 10 lần với methanol, lọc quamàngl ọc 0,45 μl CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng.m lấy dung dịchtiêms ắcký. Đối với mẫu bột raumáthìtiếnhànhcânchínhxác500 mg,thêmchínhxác5ml methanol,siêuâm15phút ở 40 0 C, lytâmở tốc độ 3.500vòng/phúttrong 5phút,g ạn dịch nổi phía trên vào bình định mức 25ml Chiết lặp lại lần lượt 4 lần với 5ml dungmôi.Gộpchungdịchchiết,đểnguội,địnhmứcđến25ml,lọcquamànglọc0,45μl CTAB 2% và PVP 2% ở nhiệt độ phòng.mlấy dung dịchtiêms ắcký.

Quátrìnhphântíchm ẫu được thực hiệntrênhệ thống sắc ký l ỏng hiệu năng cao HPHewlettPackardSeries1050,detectorDAD,sửdụngcộtPhenomenexLunaC 1 8 ( 2 ) 1 0 0 A ,

2 5 0 x 4 6 m m , 5àm,cộtPhenomenex Ultracarb ODS(30) 150x4.6mm,5àmvà cột Phenomenex Ultracarb ODS(30) 150x4.6mm,5àmcho việcphõntớcha siaticoside, acid rosmarinicvàquercetin.

2.3.3.1 Xác định hiệu suất thu hồi bột trong sấyphun

Hiệu suất thu hồi bột raumá(Ht) trongquátrìnhs ấy phunlàtỉ lệ phần trămgiữakhối lượng bột thu hồi được sau sấy phun (M) với tổng khối lượng chất khô trong d ịchsấy trước khi bổ sung chất mang (m1) và kh ối lượng chất mang bổ sungvàod ịchsấy(m2),xác định theocôngthức:

M: Khối lượng bột thu hồi được sau sấy, (gam) m1: Khối lượng chất khô trong d ịch sấy trước khi bổ sung chất mang, (gam) m2: Khối lượng chất mang bổ sung vào d ịch sấy, (gam).

2.3.3.2 Xác định độ tan của bột raumá Độ tan của bột raumásấy phun được xác định theo dược điển Việt Nam [1] Cụ thể, cho thể tích nước (ml) nhất địnhvàoc ốc chứa 1 gam bột rau má và duy trì ở25±2( o C) trong 30phút,c ứcách5phútthìl ắc nhẹ đều 30giây.

Bảng 2.5 Tiêu chu ẩn xác định độ tan của bột

STT Độ tan Thể tích nước (ml) dùng hòa tan 1 gam bột

6 Rất khó tan Trên 1.000 đến 10.000

2.3.3.3 Xác định kích thước hạt trung bình và chỉ số đa phântán

Sự phân b ố kích thước hạt (PSD: Particle size distributions) của bột rau má được đo bằng kỹ thuật tán x ạ ánh sáng động (DLS: Dynamic Light Scattering) trên thi ết bị Zetasizer Nano ZS, Malvern, Vương Quốc Anh Mẫu được chứa trong cuvette và được đặt vào buồng đo của thiết bị Chọn góc đo phù hợp và ti ến hành đo 3 lần, lấy giá tr ị trung bình. Đường kính h ạt trung bình (Z) và ch ỉ số đa phân tán (Pdi: polydispersity index) được tính b ằng kết quả đo phân bố kích thước hạt.

2.3.3.4 Xác định đặc tính nhiệt visai Đặctínhnhi ệt vi sai (DSC: Differential scanning calorimetry)làk ỹ thuậtphântích tínhch ất nhiệt phổ biến trongphântíchv ậtlýchất rắn Sử dụng kỹ thuật này đểxácđịnhdòngnhi ệt tỏa ra hoặc thuvàotừ mẫu đốtnóngb ằngdòngnhi ệt có nhi ệt độquétvới tốc độkhácnhau, t ừ đó xác định đượccáctínhch ất chuyển pha nhiệt của mẫu. Quátrìnhphântíchnhi ệt vi sai trongnghiênc ứu được tiến hànhtrênthiết bị phân tích nhiệt quét vi sai bù năng lượng DSC-60, Shimadzu (Nhật).

Tiếnhànhcân4mgmẫubộtraumávàniêmmẫuvàođĩanhômchuyêndụngcủathiết bị đo. Mẫu sosánhs ử dụng bộtnhômoxít( Al2O3) cũng đượccânv ới khối lượngvàniêmm ẫu vào đĩa nhôm tương tự Đặt mẫu cần đo và m ẫu so sánh vào buồng nhiệt tương ứng của thiết bịphânt ích nhiệt.Quátrìnhphântíchnhi ệt có s ử dụng khí nitơ đểlàmngu ộicácm ẫu với lưu lượng 50 ml/phút, bước nhảy tăng nhiệt độ trong cung cấp nhiệt là 20 o C/phút và kho ảng nhiệt độphântíchtừ0÷600 o C Kết quảphântíchnhi ệt được xử lý bằng phần mềm TA 60 vớiphiênb ản 3.9Achuyênd ụng theo hệthống.

Xác định hàm lượng ẩm của rau má thìa theo Dược điển Việt Nam V, tập 2 (phụ lục 9.6; PL203).

2.3.3.6 Xác định hàm lượng tro toànphần

Xác định hàm lượng tro toàn ph ần của rau má thìa theo Dược điển Việt Nam

- Xác định thủyngân(Hg) theo QCVN 8-2:2011/BYT

- Xác định Cadmi (Cd) theo QCVN 8-2:2011/BYT

- Xác định chì(Pb) theo QCVN 8-2:2011/BYT

- Xác định Arsen (As) theo QCVN 8-2:2011/BYT

- Xác địnhEscherichia colitheo QCVN 8-3:2012/BYT

Nước rau má được đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm mô ph ỏng theo TCVN 3215:1979 [18] Theo đó, hội đồng đánh giá cảm quan phải cóítnh ất từ 5 đến 12 người được đào tạochuyênnghi ệp để thực hiện việc cảm quan và cho điểm sản phẩm.Tuynhiên,ngườiphụtráchđánhgiácảmquancũngcóthểđượclựachọnnộibộvàsốlượngt ùythuộcmứcđộkinhnghiệmcủa ngườiđượcchọnđánhgiá[8].

THIẾT BỊ VÀHÓACHẤTNGHIÊNCỨU

2.4.1 Máyvà thiết bị nghiêncứu Để phục vụ công tác nghiên c ứu, trong quá trình thực hiện có s ử dụng các máy vàthi ết bị thínghi ệm trình bày theo b ảng 2.8.

Bảng 2.7 Danh mục máy và thi ết bị nghiên c ứu STT Tên máy và thiết bị Đặc điểm kỹ thuật

1 Máy quang phổ tử ngoại – khả kiến UV-VIS

UVD-3200, LABOMED, Mỹ, UV-VIS hai chùm tia, 8 cuvet (2 hàng)

2 Tủ ấm BD 53, Binder, Đức, đối lưu không khí tự nhiên vàsai s ố ±0,1 o C

3 Tủ sấy FD 56, Binder, Đức, đối lưu không khí cưỡng bức, sai số ±0,1 o C

4 Bể điều nhiệt WNB7, Memmert, Đức, sai số ±0,1 o C

5 Bể siêu âm P300H, Elma, Đức, tần số siêu âm 37kHz và

6 Cân kỹ thuật TXB 6201L, Shimadzu, Nhật Bản, trọng lượng cân 6200g, sai số ±0,1g

7 Cân phân tích ATX-224, Shimadzu, Nhật Bản, trọngl ư ợ n g cân 210g, sai số ±0,1mg

8 Máy cất nước hai lần WSC/4D, Hamilton, Anh, công su ất 4l/h, độ dẫn điện nước cất < 1.5 mS/cm

9 Máy xay mẫu A11, IKA, Đức

10 Máy cô quay chân không RV 10 digital V, IKA, Đức, cụm cooler của Ấn Độ có th ể làm l ạnh từ -10 o C đến 25 o C

11 Bộ lọc chân không IKA, Đức

12 Cân phân tích ẩm MB27, OHAUS, MỸ, sai số ±1mg/0,01%

13 Khuấy từ gia nhiệt RH basic 2, IK, Đức,tốc độ khuấy 100÷2.000

14 Thiết bị sấy phun KBC2L, Kybaco, Việt Nam, công suất 2 lít/giờ, sấy phun dạng đĩa

15 Tủ mát phòng thí nghiệm SERIES Bio Compact II, Gram, Đan Mạch

16 Tủ bảo quản hóa chất MPR-S163, Panasonic, Nhật Bản, Khoảng nhiệt độ điều chỉnh 2÷14°C

17 Bộ micropipet Isolab, Đức và Eppendorf, Đức; từ 1àl ữ5000 àl

18 Máy xác định tính chất nhiệt DSC-60, Shimadzu, Nhật

19 Máy xác định đường kính hạt và chỉ số phân tán

Zetasizer Nano ZS, Malvern, Vương Quốc Anh

- Hóach ất định lượng polyphenol, chlorophyll: Acid Galic (Merck - Đức),Folin& Ciocalteu’s phenol reagent (Merck - Đức), Na2CO3(Sigma,Mỹ).

- Hóach ất xác địnhcácho ạttínhch ống oxyhóa:H 2 SO4(Sigma, Mỹ),sodiumphosphate (Sigma, Mỹ), ammonium molybdate (Sigma, Mỹ), acid ascorbic(Merck,Đức), NaH 2 PO4(Sigma, Mỹ), Na2HPO4(Sigma, Mỹ), K3[Fe(CN)6](Sigma,M ỹ ) ,

CCl3COOH(Sigma, Mỹ), FeCl3(Sigma, Mỹ), FeSO4(Merck - Đức), 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(Merck-Đức),methanol(Merck-Đức),Acetone(Merck-Đức),ethanol (Merck - Đức), ethyl acetate (Merck - Đức), chloroform (Merck - Đức), diethyl ether (Merck - Đức)vàn- hexane (Merck -Đức).

- Cácphụliệukhác:Giấylọckhôngtro(Whatman,Anh),maltodextrin(Roquette,Pháp),dextrin(Roquette,Pháp)vàgumarabic(Pháp).

XỬ LÝSỐLIỆU

Mỗi thínghi ệm được lặp lại 3 lần, loại bỏ giá trị bất thường bằng phương phápDuncan Phân tích th ống kê ANOVA và h ồi quy bằng phần mềm MiniTab 18, tối ưu hóa b ằng phần mềm DesignExpert 12.0.

KẾT QUẢNGHIÊNCỨUVÀTHẢO LUẬN

ĐỊNH DANH VÀPHÂNTÍCHM ỘT SỐTHÀNHPHẦNHÓAHỌCCHỦ YẾU CỦA RAUMÁTHÌA

Mẫu nghiên c ứu sau thu nhận được thực hiện tách chiết DNA theo quy trình CTAB I, quy trình có c ải biên trong vi ệc bổ sung SDS vào thành phần đệm phân l ập [81] Tiến hành tách vànhân b ản 02 gene matK và ITS1–5.8S–ITS2.

- Gene matK sẽ đượcnhânb ản bằng phản ứng PCR với hai mồi đặc hiệu: matK 2011F: 5'-CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C-3' và matK 2011R: 5'-GTT CTA GCA CAA GAA AGTCG-3'.

- Gen ITS1–5.8S–ITS2 sẽ đượcnhânb ản bằng phản ứng PCR với hai mồi đặc hiệu: 18d: 5’-CAC ACC GCC CGT CGC TCC TAC CGA-3’ và 28cc: 5’-ACT CGC CGT TAC TAG GGGAA-3’.

TấtcảcácsảnphẩmcủaquátrìnhnhânbảnbằngphảnứngPCRvớimồiđặchiệu có được từcácDNA t ách chiết từ mẫu được giải trình tựvàchokết quả như sau:

Kết quả đọc trình tự gene của đoạn matK:TCGATCTATTCMWTTCAATATTTCCTTTTTTAGAGGACAAAATTTCACA TTTAATTTATGTGTTAGAGATACTAATACCTTACCCAGTCCATCTGGAAATCT TGGTTCAAATTCTTCGCTACTGGTTAAAAGATGCTTCTTCTTTGCATTTATTA CGACTCCTTCTCTACGAGTATCGTAATTGGAATACTTCAAATAAARCCAGTT CTTCTTTTTCAAAAAGATCTCMAAGATTCTTCTTCTTCCTATATAATTCTTATC TATGTGAATMCGAATCCATCTTCGTCTTTTTCCGCAACCAATCTTCTCATTTA CGCTCAACATCTTCTAGAACCCTTCTTGAACGAGTATATTTCTATGGAAAAA TAGAACATCWTGGAGAAGTCTTTGM

TAAGGCTTTTCAAGTCAATMTATGGTTATTGAAGGATCCTTTCATGCATTACGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTCACATCAAAAGGGACGCCTCTTTYGATGAAAAAATGGGTATATTACTTTGTTAATYTATGGCAATGTCATTTTTACCTGTGGTCTCAACCGAGAAGGATCTGTATAAACCAATTATCTAATTATTCGCTCGRCTTTCTGGGCTATCTATCAAGTGCACGGCTAAACCCTTCAATGGTACGCGGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATTGATAATACTATTAATAAGTTCGATACTC

Kết quả đọc trình tự gene của đoạn 5.8S rDNA:

Cáctrìnht ự sau khi hiệu chỉnh được BLASTtrênNCBI [159] cho kết quả tương đồngcácvùngmatKvàITS gi ữa mẫunghiênc ứu vớicáctrìnht ự có s ẵntrênNCBI và được thể hiện ởcácb ảng 3.1vàbảng 3.2 như sau:

Mức tương đồng Mã s ốtrìnhtự tương đồngtrên NCBI

(matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella asiatica voucher Trotta950361 maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella asiatica voucher PS1212MT05 maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella asiatica voucher PS1212MT01 maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella virgata maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella lanata maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella asiatica chloroplast gene for maturase

Centella asiatica isolate shawpc0933K maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella restioides maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella asiatica isolate OSBAR 000593 maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella asiatica isolate shawpc1021Kmaturase K

(matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella asiatica isolate shawpc0944K maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Centella asiatica voucher TuTY1530 maturase

K (matK) gene, partial cds; chloroplast

Centella asiatica voucher US:Suissa158 maturase K (matK) gene, partial cds;chloroplast

Bảng 3.2 Sự tương đồngvùngITSgiữamẫunghiênc ứu vàcác trìnht ự có s ẵntrênNCBI

Mức tương đồng Mã s ốtrìnhtự tương đồngtrênN CBI

Centella asiatica bio- materialChromadex_Lot_00041348-460

5.8SribosomalRNAgene,partialsequence;internal transcribed spacer 2, complete sequence; and largesubunitribosomalRNA gene,partial sequence

Centella asiatica isolate gotu_kola5.8SribosomalRNAgene,partialsequenc e;internal transcribeds p a c e r 2 , c o m p l e t e s e q u e n c e ; a n d

28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Centella asiatica isolate UAS-SEC146 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Centella asiatica voucher TuTY1530 18S ribosomalRNAgene,partialsequence;internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer2,completes e q u e n c e ; a n d 2 6 S r i b o s o m a l R N A gene, partial sequence

Centella asiatica gene for 5.8S rRNA, ITS 2 and 28S rRNA, partial and complete sequence, isolate: CHULA-012

Centella asiatica voucher CMPR8787 small subunitribosomalRNAgene,partialsequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Centella asiatica isolate SBB-1370 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Centella asiatica voucher US:Suissa158 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, partial sequence

Centella asiatica voucher HXX18428 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Centella asiatica voucher PS1212MT04 internal transcribed spacer 2, partial sequence

PS1212MT01internal transcribed spacer 2, partialsequence

Centella asiatica internal transcribed spacer1,5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence

Centella asiatica isolate SBB-1533 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence;a n d internal transcribed spacer 2, partial sequence

Từ kết quảphântíchtrìnht ự DNA của mẫunghiênc ứu đã thu nhận cho thấymức độ tương đồng cao (98,44% - 98,76%) của DNAphântíchv ớicáctrìnht ự củavùngmatK và mức độ tương đồng cao (98,21-100%) của DNAphântíchv ớicáctrìnhtự củavùngITS củaloàiCentella asiaticacósẵntrênNCBI Như vậy, mẫu rau máthìathu nhận tại Nha Trang,KhánhHòadùngcho quátrìnhnghiênc ứu thuộcloàirau máthìa( Centella asiatica(L.)Urban).

3.1.2 Phân tích một số thành phần hóa học chủ yếu của rau máthìa

Tiếnhànhlấymẫu rau máthìat ại Nha Trang, Khánh Hòa đểphântíchm ột số hợp chất có ho ạttínhsinh h ọc (polyphenol, chlorophyll, triterpenoid) và m ột sốthànhphần sinh hóa cơ bản của raumá.K ết quả phân tích đượctrình bàyở bảng 3.3 và 3.4.

Bảng3.3.Hàmlượngmộtsốhợpchấtcóhoạttínhsinhhọccủarau máthu mẫu tại Nha Trang -

Thành ph ần Đơn vị tính Hàm lượng

Polyphenol mg acid galic/g chất khô 13,56 ± 0, 20

Triterpenoid mg acid oleanolic/g chất khô 5,90 ± 0,02

Bảng 3.4 Thành ph ần sinh hóa cơ bản của rau má thu mẫu tại Nha Trang -

Khánh Hòa Thành ph ần Hàm lượng (g/100g chất khô)

Từcáck ết quảphântíchtrìnhbày ởcácbảng3.3và3.4chothấy:

* Về thành ph ần một số hợp chất có ho ạt tính sinh h ọc

Kết quảphântíchm ột số hợp chất có ho ạttínhsinh h ọc của raumáthìathu mẫu tạiNha Trang,KhánhHòa( bảng 3.3) cho thấy raumáthìacó h àm lượng polyphenol là13,56±0,20 (mg acid galic/g chất khô), cao hơn so với rau máthìathu mẫu ở Sri Lanka

(4,71 mg acid galic/g chất khô) [57], thấp hơn so với rau máthìathu m ẫu ở Malaysia (17,41 mg acid galic/g chất khô) [124].Nguyênnhânc ủa sựkhácbi ệt về hàm lượng polyphenolcóthểlàdođiều kiện địalý,khíh ậu, thổ nhưỡng củacácvùngtr ồng rau mákhácnhau K ết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng polyphenol của raumáthìathu mẫu ở Nha Trang - Khánh Hòa cũng cao hơn hàm lượng polyphenol của một sốloàiraumákhácthu m ẫu tạiKhánh Hòa.C ụ thể, hàm lượng polyphenol của rau má thìa cao hơn 146,61% so hàm lượng polyphenol củaloàiHydrocotyle verticillataThunb (9,25 mg acid galic/g chất khô) và cao hơn 222,50% so với hàm lượng polyphenol củaloàiHydrocotyle javanicaThunb (6,09 mg acid galic/g chấtkhô).

Kết quảphântíchv ề hàm lượng chlorophyll của raumáthìacho th ấy hàm lượng chlorophyll của rau máthìathu m ẫu tại Nha Trang là4,73±0,03 (mg/g chất khô), cao hơnsovớiraumáthìathumẫ u ởẤnĐộ(2,5mg/gchấtkhô)[143].Nếusosánhvớimột sốloàirau mákhácthu m ẫu tại Khánh Hòa thì rau má thìa có hàm lượng chlorophyll caohơn115,17%sovớihàmlượngchlorophyllcủaloàiraumáH y d r o c o t y l e verticillataThunb. (4,11mg/gchấtkhô)vàcaohơn138,01%sovớihàmlượngchlorophyllcủaloàirau máHydrocotyle javanicaThunb (3,43 mg/g chất khô).

Về hàm lượng triterpenoid, Theo Đỗ Tất Lợi, triterpenoidlàhợp chất quanghóaquan trọng quyết định đến chất lượng củacâyraumásử dụnglàmthu ốc giải nhiệt trongdângian Do v ậy, tiếp tụcquátrìnhphân tích hàm lượng triterpenoid của raumáthìavà kết quảphântíchcho th ấy hàm lượng triterpenoid của raumáthìathu m ẫu ở Nha Trang

–KhánhHòalà 5,9 ± 0,0 2 (mg acid oleanolic/g chất khô), cao hơn hàm lượng triterpenoid có trong lá rau máthìathu m ẫu ở Ấn Độ [72] Kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng triterpenoid của rau máthìathu m ẫu ở Nha Trang cao hơn hàm lượng triterpenoid của một sốloàiraumákhácthu mẫu tạiKhánhHòa.Ch ẳng hạn, hàm lượng triterpenoid của rau má thìa cao hơn 131,9% hàm lượng triterpenoid củaloàirau máHydrocotyle verticillataThunb (4,47 mg acid oleanolic /g chất khô) và cao hơn 201,57%hàmlượngtriterpenoidcủaloàiraumáH y d r o c o t y l e javanicaThunb.(2,93mg acid oleanolic/g chấtkhô).

Từcácphântíchởtrêncho th ấy rau máthìathu m ẫu tại Nha Trang cóhàmlượngcácchấtcó ho ạttínhsinh h ọc (polyphenol, chlorophyll, triterpenoid) cao hơn hàm lượngcácch ất cóhoạttínhsinh h ọc củacácloàirau mákhácthu m ẫu tạiKhánh

Hòavà cao hơn hàm lượngcácchất cóhoạttínhsinh h ọc củacácloàiraumácùngloàithu mẫu tại một số nướcchâuÁ như Malaysia, Sri Lanka và Ấn Độ.

* Về một số thành ph ần sinh hóa cơ bản

Kết quảphântíchm ột sốthànhph ần sinh hóa cơ bản của raumáthìathu m ẫu tại Nha Trang cho thấycós ựkhácbi ệt về một sốthànhph ần sinh hóa cơ bản của rau máthìathu m ẫu tại Nha Trang so vớithànhph ần sinhhóac ủa rau máthìado Vi ện dinh dưỡng (Bộ Y tế, 2007)côngb ố [19] Chẳng hạn, trong rau máthìatr ồng tại Nha Trang có hàm lượng proteinlà11,32±0,12g/100g chất khô, hàm lượng chấtbéolà3,15±0,01g/100g chất khô, hàm lượng carbohydrate là28,42±0,02g/100g chất khô, hàm lượng chất xơ là 42,80±0,12 g/100g chất khô và hàm lượngkhoángt ổnglà3,62±0,09 g/100g chất khô) Hàm lượngcácthànhph ần phân tích được ởtrêncho raumáthìalà cao hơn so vớicùngloàicủa Viện dinh dưỡng đã công bố Hơn nữa, số liệuphântíchv ề rau máthìatrồng ở Nha Trang cũng cho thấy hàm lượng protein thấp hơn và hàm lượng chất béo thì cao hơn so với raumácùngloàim ọc ở Malaysiana [147] Sựkhácbi ệt nàyđược giảithíchlàdos ựkhácbi ệt về điều kiện địalý,khíh ậuvàthổ nhưỡng của vùng đất raumámọc.

Ngoài ra, cũng tiếnhành phântíchm ột sốthànhph ần sinhhóakháctrong rau máthìabằng kỹ thuật LC-HRMStrình bàyởhình3.1.

Hình 3 1 Phổ LC-HRMS phân tích dịch chiết rau má

Kết quảphântíchkh ối phổphângi ải cao LC-HRMS cho thấy dịch chiết rau máthìathu m ẫu tại Nha Trang cũng tồn tại nhiềuthànhph ần quanghóaquan tr ọngkhácnhư: acid neochlorogenic, acid chlorogenic, asiaticoside, kaempferol, acid madecassic,

3045607590105120 Độ tuổi thu hoạch (ngày)

3045607590105120 Độ tuổi thu hoạch (ngày)

Hoạt tính chống oxy hóa tổngHoạt tính khử sắt

25.0 10.0 acid asiatic, Tuy vậy, do thời gianvàkinhphícó h ạnnênquátrìnhnghiênc ứu chưa thểphântíchk ỹ vềcácthànhph ầnnàymà sẽ tiếnhành thêmnghiênc ứu vềcáchợp chấtnàykhi có điều kiện.

3.1.3 Xác định thời gian thu hoạch rau máthìa

Tiếnhànhchi ết polyphenol, chlorophyll có ho ạttínhch ống oxyhóat ừ rau máthìaởcácth ời gian thu hoạchkhácnhau từ30÷120(ngày)b ằng phương pháp chiếtcóhỗ trợsóngsiêuâmv ới dungmôiethanol 95%, t ỷ lệ DM/NL 40/1, thời gian chiết 60phútvà nhi ệt độ chiết 50 o C Sau khi chiết, lọcchânkhôngthu dịch chiết và đánh giá hàm lượng polyphenol, chlorophyll, hoạttínhch ống oxyhóat ổng, hoạttínhkh ử sắtvàhoạttínhb ắt gốc tự do DPPH Kết quả đượctrình bàyởcáchình3.2; 3.3 và3.4.

Hình 3 2.Ảnh hưởng thời gian thu hoạch đến hàm lượng polyphenol và chlorophyll trong dịch chiết rau má

Hình3 3 Ảnh hưởng thời gian thu hoạch đến hoạttínhch ống oxyhóat ổng và hoạttínhkh ử sắt của dịch chiết rau má

H oạ t t ín h ch ốn g ox y hó a tổ ng ( m g ac id a sc or bi c/ g ch ất k hô ) H àm lư ợn g po ly ph en ol ( m g ac id g al ic /g c hấ t k hô ) H àm lư ợn g ch lo ro ph yl l ( m g/ g ch ất k hô ) H oạ t t ín h kh ử sắ t ( m g F eS O 4/ g ch ất k hô )

0 3045607590105120 Độ tuổi thu hoạch (ngày)

Hình3 4 Ảnh hưởng thời gian thu hoạch đến hoạttínhb ắt gốc tự do DPPH của dịch chiết rau má

Từcáck ết quảphântíchtrìnhbày ởcáchình3.2; 3.3 và 3.4 cho thấy:

Kết quảphântíchtrình bàyởhình3.2 cho th ấy độ tuổi thu hoạch có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol thu nhận từ rau má thìa và độ tuổi thu hoạchkhácnhau thì hàm lượng polyphenol thu nhận từ rau má thìa cũng khác nhau Hàm lượngpolyphenol thu nhận từ raumáthìaở cácđộ tuổi 30, 45, 60và75ngàytuổi tương ứng là6,97±0,04,11,30±0,23, 12,19±0,29và14,16±0,03 (mg acid galic/g chất khô) Kết quảphântíchcho thấy hàm lượng polyphenol thu nhận từ raumáthìaở các độ tuổi 30, 45và60ngàytuổi chỉ bằng tương ứng 49,22%, 79,80% và 86,09% so v ới hàm lượng polyphenolcao nhất,thunhậntừraumáthìaở độtuổi75ngàytuổi.Nhưvậy,khităngđộtuổithuhoạch từ 30ngàylênt ới

NGHIÊNCỨUCHIẾTTÁCHPOLYPHENOL VÀ CHLOROPHYLLTỪ

a dịch chiết thu nhận từ rau máthìa Hơn nữa, kết quảnghiênc ứu cũng cho thấy cósựtương quan mạnh giữa hàm lượng polyphenol, hàm lượng chlorophyll với hoạttínhchống oxyhóat ổng và hoạttínhkh ử sắt của dịch chiết rau máthìatheo các độ tuổinghiênc ứu Cụ thể, hệ số tương quan giữa hàm lượng polyphenol với hoạttínhch ống oxyhóat ổng, giữa hàm lượng polyphenol với hoạttínhkh ử sắt, giữa hàm lượng chlorophyll với hoạttínhch ống oxyhóat ổng và gi ữa hàm lượng chlorophyll với hoạttínhkh ử sắt tương ứng là 0,757; 0,915; 0,912 và 0,863 Điềunàycó th ể khẳng địnhthànhph ần polyphenol, chlorophyll trong dịch chiết rau má có tác động chủ yếu đến hoạttínhch ống oxyhóat ổng và hoạttínhkh ử sắt của dịch chiết raumáthìa.

Hơn nữa, kết quả phân tích cũng cho thấy rau máthìaở độ tuổi 45ngàytu ổi cóhàmlượngchlorophyllcaonhấtnhưnghàmlượngpolyphenolthìchỉbằng79,80%hàmlượng polyphenol của rau máthìaở độ tuổi 75ngàytu ổi Kết quả phân tích cũng cho thấydịchchiếtraumáthìaở độtuổi75ngàytuổicóhàmlượngpolyphenolcaonhấtvà dịch chiết rau máthìaở độ tuổi 60ngàytu ổi có hàm lượng polyphenol bằng 86,09% hàmlượngpolyphenolcủadịchchiếtraumáthìaở độtuổi75ngàytuổi.Tuyvậy,ởgiai đoạn

75ngàytuổi, rau máthìav ẫn có hàm lượng chlorophyll đạt trên 94% hàm lượng chlorophyll của raum á thìa ở độ tuổi 45ngàytu ổi Trong đồ uống từ raumá,chlorophylllàthànhphầnchủyếutạomàuxanhchođồuốngvàpolyphenollàhợpchất cóhoạttínhsinh h ọc như tiêu viêm, tăng thải độc,… Từcácphântích ởtrêncho th ấy để rau máthìav ừa có hàm lượng polyphenol và chlorophyll caothìnênthu ho ạch rau máthìaở độ tuổi 60÷75ngàytu ổi và giai đoạn 75ngàytu ổithìraumáthìacóhàmlượngpolyphenolcóhoạttínhsinhhọccaonhất.Dovậy,thờigianthuhoạc hthíchh ợp cho rau máthìadùnglàmnguyênli ệu thu nhận polyphenol, chlorophyllcóhoạttínhsinh học là 75ngày.

3.2 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH POLYPHENOL VÀ CHLOROPHYLL TỪ RAU MÁTHÌA

3.2.1 Xác định thông số chiết tách polyphenol và chlorophyll từ rau máthìa

3.2.1.1 Xác định dung môi và phương thứcchiết

Tiến hành chiết polyphenol, chlorophyll có ho ạt tính ch ống oxy hóa t ừ rau má thìa bằng các dung môi chi ết khác nhau : Nước cất, methanol, aceton, ethanol, ethyl

EthanolEthyl Acetat Chloroform Diethyl ether n-Hexan Dung môi

Chiết hỗ trợ sóng siêu âm Chiết hồi lưu Ngâm chiết

Dung môi n-Hexan Diethyl ether

Chiết hồi lưu Ngâm chiết 2.00

Chiết hỗ trợ sóng siêu âm 2.50 acetat,chloroform,diethylethervàn- hexantheo3phươngphápchiếtkhácnhau:ngâmchiết,chiếthồilưuvàchiếtcóhỗtrợsóngsiêuâm(ởt ầnsốsiêuâm37kHzvàcôngsuấtsiêuâm80W ), tỷ lệ DM/NL 30/1, thời gian chiết 30phútvà nhi ệt độ chiết 30 o C Kếtthúcquátrìnhchi ết mẫu được đánh giá hàm lượng polyphenol, chlorophyll, hoạttínhchống oxyhóat ổngvàhoạttínhkh ử sắt Kết quả đượctrình bàyởcáchình3.5 ÷ 3 8

Hình3 5 Ảnh hưởng của dung môi và phương thức chiết đến hàm lượng polyphenol trong dịch chiết raumá

H àm lư ợn g ch lo ro ph yl l ( m g/ g ch ất k hô ) H àm lư ợn g po ly ph en ol (m g ac id g al ic /g ch ất k hô )

Hình3 6 Ảnh hưởng của dung môi và phương thức chiết đến hàm lượng chlorophyll trong dịch chiết raumá n-Hexan

Ethanol Ethyl Acetat ChloroformDiethyl ether Dung môi

Chiết hỗ trợ sóng siêu âm Chiết hồi lưu Ngâm chiết

EthanolEthyl Acetat Chloroform Dung môi

Chiết hồi lưu Ngâm chiết

Chiết hỗ trợ sóng siêu âm 9.0

Hình3 7 Ảnh hưởng của dung môi và phương thức chiết đến hoạttínhch ống oxyhóat ổng của dịch chiết rau má

Hình3 8 Ảnh hưởng của dung môi và phương thức chiết đến hoạttínhkh ử sắt của dịch chiết rau má

Từ các k ết quả trình bày ở các hình 3 5÷3.8 cho thấy:

Kết quảphântíchtrình bàyởhình3 5 cho thấy dungmôichi ết và phương pháp chiết có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol của dịch chiết raumáthìa.Trongcácphương pháp chiết màquátrìnhnghiênc ứu đã sử dụng thì phương pháp chiết cóh ỗ trợsóngsiêuâmchohàmlượng polyphenol cao hơn các phương pháp chiếtkhác.C ụ thể,

H oạ t t ín h kh ử sắ t ( m g F eS O 4/ g ch ất k hô ) H oạ t t ín h ch ốn g ox y hó at ổn g ( m g ac id a sc or bi c/ g ch ất kh ô ) khi chiết polyphenol từ raumáthìab ằng dungmôiethanol với phương pháp chiếtcóhỗ trợsiêuâmthìdịch chiết thu được có hàm lượng polyphenol là3,88±0,13(mg acid galic/g chất khô), cao gấp tương ứng 1,67 lần và 1,87 lần so với hàm lượng polyphenol củadịchchiếttrongethanolbằngphươngphápchiếthồilưuvàphươngphápngâmchiết Như vậy, phương pháp chiết có h ỗ trợsiêuâmluôncho d ịch chiết có ch ứa hàm lượng polyphenol cao hơn các phương pháp chiết khác và phương pháp ngâm chiết cho dịch chiết trong ethanol có hàm lượng polyphenol thấpnhất.

Kết quảphântíchcòncho th ấy trong cùng điều kiện chiếtthìdịch chiết trong ethanol luôn có hàm lượng polyphenol cao hơn các dung môi chiếtkhác.Cụ thể, dịch chiếtethanolbằngphươngphápchiết cóhỗtrợsóng siêu âmcóhàm lượngpolyphenol cao gấp tương ứng 1,17, 1,25, 1,40, 2,21, 2,26, 2,90 và 2, 98 (lần) so với hàm lượng polyphenol của dịch chiết trong methanol, aceton, ethyl acetat, chloroform, diethyl ether, nước cấtvàn-hexan.

Từ kết quảphântíchởtrêncho th ấy dịch chiết rau máthìab ằng ethanol theophươngchiếtcóhỗtrợsiêuâmcóhàmlượngpolyphenolcaohơnsovớidịchchiếttrongcácdung môikhácvà theocáck ỹ thuật chiết khác đã sử dụng trong luậnán Do vậy, nếuxéttheokhíac ạnh hàm lượng polyphenol cao thì dungmôiethanol và phương pháp chiết cóhỗtrợsóngsiêuâmnênđược lựa chọn cho quátrìnhchi ết polyphenol từ raumáthìa.

Kết quảphântíchtrìnhbày ởhình3 6 cho thấy hàm lượng chlorophyll của dịch chiết rau máthìacũng bị ảnh hưởng mạnh bởi dungmôichi ết và phương pháp chiết Trong phạm vi các phương pháp chiết đãnghiênc ứu thì phương pháp chiết có h ỗ trợsóngsiêuâm chohàml ư ợ n g c h l o r o p h y l l t r o n g d ị c h c h i ế t r a u m á thìa cao hơncácphươngphápchiếtcònlại.Chẳnghạn,khichiếtchlorophylltừraumáthìab ằ n g phươngphá pchi ết có h ỗ trợsóngsiêuâmvới dungmôiacetonthìdịch chiết thu được cóhàmlượngchlorophylllà2,04±0,04(mg/gchấtkhô),caogấptươngứng1,48lầnvà1,82lần so với hàm lượng chlorophyll trong dịch chiết aceton bằng phương pháp chiết hồi lưu và phương pháp ngâm chiết Như vậy, phương pháp chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmcho dịch chiết trong aceton có ch ứa hàm lượng chlorophyll cao hơn các phương pháp chiết khác và phương pháp ngâm chiết cho dịch chiết trong aceton có hàm lượngchlorophyll thấpnhất.

Kết quảphântíchcũng cho thấy trong cùng điều kiện chiếtthìdịch chiết trong aceton luôn có hàm lượng chlorophyll cao hơn các dung môi chiếtkhác.C ụ thể, dịch chiết aceton với phương pháp chiết có h ỗ trợ sóng siêu âm có hàm lượng chlorophyll cao gấp tương ứng 1,33, 1,37, 1,45, 1,66, 1,79, 2,15 và 3,00 (lần) so với hàm lượng chlorophyll của dịch chiết trong ethanol, methanol, diethyl ether, ethyl acetat, chloroform, n-hexan và nước cất Mặtkhác, khi sử dụng dungmôiethanol với phươngphápchi ết có h ỗ trợsóngsiêuâmthìdịch chiết rau máthìathu được có hàm lượng chlorophyll cao hơn khá nhiều khi chiết bằngcácdungmôikhác( methanol, diethyl ether, ethyl acetat, chloroform, n-hexan và nước cất) nhưng thấp hơn so với hàm lượng chlorophyll của dịch chiết raumáthìatrong acetone Kết quả này cũng phù hợp với đặctínhsinh lý của chlorophyll là tan trong acetone t ốt hơn tan trong ethanol và cũng phù hợp vớicácnghiênc ứutrênth ế giới khi sử dụng dungmôiacetone trong chi ếttáchchlorophyll [73,152] Nhiều kết quảnghiênc ứukháccũng chứng minh cho thấyngoàidungmôiacetone thì ethanol cũng rất hiệu quả để chiếtcácchlorophyl l [12,171] đối vớinguyênli ệu là thực vậtvàrongt ảo biển.

Từkếtquảphântíchởtrênchothấykhichiếtcácchấttừraumáthìat h e o phươngphápchiết cóhỗtrợsóngsiêuâmsử dụng dungmôiaceton sẽ cho dịch chiết cóhàmlượng chlorophyll cao hơn so với hàm lượng chlorophyll của dịch chiết rau máthìabằngcácdungmôikhácvà theocáck ỹ thuật chiết khác đã sử dụng trong luậnánnày. Tuyvậy,đốivớithựcphẩmthìchlorophyllchủyếugópphầntạochodịchthựcphẩmcó màu xanh,cònhoạttínhsinh h ọc của dịch chiết chủ yếulàdopolyphenol Như vậy, khi xét theo hàm lượng chlorophyll cao thì sử dụng dungmôiaceton để chiếtcácchấttừ rau máthìatheo phương pháp chiết cóhỗtrợsóngsiêuâmsẽ cho dịch chiếtcóhàmlượng chlorophyll cao nhất Tuy vậy, khi chiếtcácchấttừ raumáthìab ằng ethanol thì dịchchiếtthulạicóhàmlượngpolyphenolvớihoạtsinhhọccaonhấtnhưnghàmlượng chlorophyll của dịch chiết cũng khá cao và bằng 75,49% hàm lượng chlorophyll của dịch chiết rau máthìabằng acetone Hơn nữa, dung môi acetone là dung môi độc và giáthànhcao hơn ethanol nên người taítkhi s ử dụng acetone trong lĩnh vực chiếtcácchất dùng trong lĩnh vực thựcphẩm.

* Về hoạt tính ch ống oxy hóa t ổng

Kết quảphântíchtrìnhbày ởhình3 7 cho thấy dungmôichi ết và phương pháp chiết cũng ảnh hưởng lớn đến hoạttínhch ống oxyhóat ổng của dịch chiết raumáthìa.

Chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmcho dịch chiết từ rau máthìacó hoạttínhch ống oxyhóatổngcaohơncácphươngphápchiếtkhác.Cụthể,dịchchiếtraumáthìat r o n g dungmôietha nol sử dụng phương pháp chiết có h ỗ trợsiêuâmthu nhận đượccóhoạttínhch ống oxyhóatổnglà2,12±0,04(mgacidascorbic/gchấtkhô),caogấptươngứng1,63lầnvà 2,33 lần so với hoạttínhch ốngoxyhóat ổng của dịch chiết trong ethanol bằng phươngphápchi ết hồi lưu và phương pháp ngâm chiết Như vậy, phương pháp chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmluôncho d ịch chiết trong ethanol có hoạttínhch ốngoxyhóat ổng cao hơn các phương pháp chiếtkhác.

Hơn nữa, trong cùng điều kiện chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmthìdịch chiết trong ethanolluôncó hoạttínhch ốngoxyhóat ổng cao hơn so với dịch chiết trongcácdungmôikhác.C ụ thể, dịch chiết ethanol bằng phương pháp chiết có h ỗ trợsóngsiêuâmcó hoạttínhch ống oxyhóat ổng cao gấp tương ứng 1,40, 1,50, 1,72, 1,23, 2,59, 2,83 và 3,42 (lần) so với hoạttínhch ống oxyhóat ổng của dịch chiết trong aceton, methanol, ethyl acetat, diethyl ether, nước cất, n-hexan vàchloroform.

Từ kết quảphântíchởtrêncho th ấy dịch chiết rau máthìab ằng ethanol theophương chiếtcóhỗtrợsóngsiêuâmcó hoạttínhch ống oxyhóat ổng cao hơn so với dịch chiết trongcácdungmôikhác( a c e t o n , m e t h a n o l , e t h y l a c e t a t , d i e t h y l e t h e r , n ư ớ c c ấ t , n - h e x a n v à c h l o r o f o r m ) v à t h e o cáck ỹ thuật chiếtkhác(kỹ thuậtngâmchi ết và kỹ thuật chiết hồi lưu) Do vậy, khixéttheokhíac ạnh để dịch chiết có hoạttínhch ống oxyhóat ổng cao thì dung môi ethanol và phương pháp chiết cóhỗtrợsóngsiêuâmnênđược lựa chọn là dung môi và phương pháp chiếtcácchấtcóhoạttínhsinh h ọc từ raumáthìa.

* Về hoạt tính kh ử sắt

NGHIÊNCỨUSẤY PHUN TẠO BỘT RAU MÁTHÌACH ỨAPOLYPHENOLVÀCHLOROPYLL

3.3.1 Xác định thông số sấy phun tạo bột rau máthìa

Tiếnhànhthí nghi ệm sấy phun thu bột rau máthìachứa polyphenolvàchlorophyll với hoạttínhch ống oxyhóasử dụng 3 loại chất mangkhácnhau g ồm: maltodextrin, dextrinvàgumarabic có nồng độ là 100 g/l vớiápsu ấtkhínén2 kg/cm 2 ở nhiệt độ sấy

140 o C với tốc độ đĩa phun 20.000 v/p và lưu lượng nhập liệu 15 ml/p Quátrìnhs ấy phun sử dụng dịch chiết rau má thu nhận theocácthôngs ố tối ưu đãnghiênc ứu và được cô đặc ở điều kiệnchânkhôngở nhiệt độ 60 o C vớiápsu ấtchânkhông75mBar và nhiệt ngưng tụ 5 o C đến khi dịch chiết đạt được nồng độ chất khô 18 o Bx Sau khi sấy phun thu bột rau máthìa, lấy mẫuxácđịnh hàm lượng polyphenol, hàm lượng chlorophyll,cácho ạttínhch ống oxyhóavà kích thước hạt, đặctínhnhiệt vi sai Kết quả đượctrìnhbàyởcáchình3.23÷3.34vàcácb ảng3.7÷3.9.

Hình3 23 Ảnh hưởng của chất mang đến hàm lượng polyphenol và chlorophyll trong bột rau má

Dextrin Loại chất mang MaltoDextrin

Hoạt tính khử sắt (mg FeSO4/g DW) Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbic/g DW) 40

Hình3 24 Ảnh hưởng của chất mang đến hoạttínhch ống oxyhóat ổng và ho ạttínhkh ử sắt của bột rau má

Hình3 25.Hìnhảnh bột rau má với chất mang gum arabic dướikínhhi ển vi quang học với độ phóng đại 1.000x

Hình3 26.Hìnhảnh bột rau má với chất mang dextrin dướikínhhi ển vi quang học với độ phóng đại 1.000x

Hình3 27.Hìnhảnh bột rau má với chất mang maltodextrin dướikínhhi ển vi quang học với độ phóng đại 1.000x

Hình3.28.Phổphânbốkíchthướchạtvàchỉsốđa phân táncủabộtrau mávới chất mangdextrin

Hình3.29.Phổphânbốkíchthướchạtvàchỉsốđa phân táncủabộtrau mávới chất mangmaltodextrin

Hình3.30.Phổphânbốkíchthướchạtvàchỉsốđa phân táncủabộtrau mávới chất mang gum arabic

Hình 3 31 Phổ nhiệt vi sai của bột rau má không có ch ất mang

Hình 3 32 Phổ nhiệt vi sai của bột rau má với chất mang dextrin

Hình 3 33 Phổ nhiệt vi sai của bột rau má với chất mang maltodextrin

Hình 3 34 Phổ nhiệt vi sai của bột rau má với chất mang gum arabicBảng 3.7 Độ tan và đặc tính c ủa bột rau má v ới các lo ại chất mang

STT Loại bột Độ tan Màu sắc, trạng thái Kiểu bao phủ của chất mang

1 Bột rau máv ới chất mang gum arabic

Dễ tan Màu xanh tươi sáng, bột mịn, tơi xốp

Hoạt chất được bao phủ vào giữa hạt

2 Bột rau máv ới chất mang dextrin

Dễ tan Màu xanh hơi đậm, bột thô, tơi xốp

Hoạt chất liên kết trong thành hạt

3 Bột rau máv ới chất mang maltodextrin

Dễ tan Màu xanh sẫm, bột thô, vón nhẹ

Hoạt chất liên kết bề mặt thành hạt

Bảng3.8 Kíchthước vàđộđa phântáncủa bộtrau mávớicácloạichất mang

STT Loại bột Kích thước hạt trung bình (nm) Chỉ số đa phân tán (Pdi)

1 Bột rau máv ới chất mang gum arabic 157,8 0,517

2 Bột rau máv ới chất mang dextrin 318,5 0,662

3 Bột rau máv ới chất mang maltodextrin 278,5 0,756

Bảng 3.9 Kết quảphântíchn hiệt vi sai của bột rau má vớicáclo ại chấtmang

2 Bột rau máv ới chất mang gum arabic

3 Bột rau máv ới chất mang dextrin

4 Bột rau máv ới chất mang maltodextrin

Từ các k ết quả trình bày ở hình 3.23÷3.3 4 vàb ảng 3.7÷3.9 cho thấy:

Kết quảphântíchởhình3.2 3 cho thấy loại chất mang sử dụng có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol có trong bột raumáthìa tạothànhsau sấy phun Hàm lượng polyphenol trong bột raumágiảm dần theo loại chất mang được bổ sung trongquátrìnhsấy phun là gum arabic, maltodextrin và dextrin C ụ thể, hàm lượng polyphenol trong bột raumásử dụng chất mang gum arabic cao nhất là13,72±0,31 mg acid galic/g Bột rau má s ử dụng chất mang là maltodextrin và dextrin có hàm lượng polyphenol là10,35±0,39 mg acid galic/g và9,21±0,24 mg acid galic/g, tương ứng bằng

75,44% và 67,13% so với hàm lượng polyphenol có trong bột sấy sử dụng chất mang gumarabic.

Kết quảnàycó th ể lý gi ải là gum arabic có c ấutrúcpolyme,phânt ử dạngphânnhánhđều trongkhônggian, trongphânt ử có ch ứa nhiềunhómhydroxyl(-OH) và cacboxyl (- COOH)nênd ễliênk ết vớicácnhómho ạttínhtrong c ấutrúcc ủa polyphenolvàcó thể gắn kết với polyphenol tốt hơn maltodextrin và dextrin - đây là hai chất mang trong cấutrúcchỉchứanhómhydroxyl(-OH).Dovậy,khisửdụnggumarabiclàmchấtmang thì hàm lượng polyphenol có trong b ột rau má thìa cao hơn khisửdụng chất mang maltodextrinvàdextrin.

Từcácphântíchởtrêncho th ấy trong 3 loại chất mang mà lu ận án đã khảosátthì gum arabicgiúpt ạo bột rau má có hàm lượng polyphenol cao nhất Do vậy, khixéttheo hàm lượng polyphenol cao, luậnánchọn gum arabiclàmchấtmang choquátrìnhsấy phun tạo bột raumáthìa.

Kết quảphântíchởhình3.2 3 cho thấy hàm lượng chlorophyll trong bột rau máthìacũng chịu ảnh hưởng bởicáclo ại chất mang được sử dụng trongquátrìnhsấy phun.

Cụ thể, hàm lượng chlorophyll trong bột rau máthìagi ảm dần theotrìnht ựcácch ất mang được bổ sungkhácnhau trong quátrìnhs ấy phun là gum arabic, dextrin và maltodextrin.Trongđóhàmlượngchlorophylltrongbộtraumásửdụngchấtmanggum arabic cao nhất là4,14±0,14 mg/g Bột rau má sử dụng chất mang là dextrin và maltodextrin có hàm lượng chlorophyll là3,46±0,09 mg/g và2,87±0,11 mg/g, tương ứng bằng 83,58% và 69,32% so với hàm lượng chlorophyll có trong bột rau máthìas ử dụng chất mang gumarabic.

Từ các phân tích ở trên cho th ấy trong 3 loại chất mang đã sử dụng thì gumarabic là ch ất mang giúp t ạo bột rau má có hàm lượng chlorophyll cao nhất Do vậy, gum arabic nên được lựa chọn làm chất mang cho quá trình s ấy phun thu bột rau má chứa chlorophyll.

Kết quảphântíchởhình3.2 4 cho thấy loại chất mang có ảnh mạnh đến hoạttínhchốngoxyhóat ổng của bột rau má thìa thu được qua quátrìnhs ấy phun Cụ thể,hoạttínhch ống oxyhóat ổng của mẫu bột rau má s ử dụng chất mang gum arabic đạt mức cao nhất là10,62±0,38 mg acid ascorbic/g Bột rau má s ử dụng chất mang là maltodextrinvàdextrincóhoạttínhchốngoxyhóatổnglà8,98±0,07mg/gvà8,07±0,13 mg/g, tương ứng bằng 84,55% và 7 5,99% so với bột rau má s ử dụng chất mang gum arabic.

Từcácphântíchởtrêncho th ấy sử dụng chất mang gum arabic sẽgiúpt ạo bộtraumáthìas a u sấyphuncóhoạttínhchốngoxyhóatổngcaonhất.Dovậy,gumarabiclàchấtm angphùhợpchoquátrìnhs ấy phun thu bột rau máthìacóchứacáchợpchất sinh học cóhoạttínhch ống oxyhóatổng cao.

Kết quảphântíchởhình3.2 4 cho thấy hoạttínhkh ử sắt của bột raumáthìach ịu ảnh hưởng bởicáclo ại chất mang được sử dụng trongquátrìnhs ấy phun Cụ thể, hoạttínhkh ử sắt của mẫu raumáthìas ử dụng chất mang gum arabic cao nhất là 32,96±1,16mg FeSO4/g Bột raumáthìas ử dụng chất manglàdextrinvàmaltodextrin có ho ạttínhkhửsắtlà26,37±0,28mg/gvà18,29±0,22mg/g,tươngứngbằng80,00%và55,49%so với bột raumásử dụng chất mang gumarabic.

Từcácphântíchởtrêncũng cho thấy gum arabic là chất mangphùhợp cho quátrìnhs ấy phun thu nhận bột rau máthìachứacáchợpchất sinh học có ho ạttínhkh ử sắt cao.

Kết quảphântíchởcáchình3.25÷3.27 và b ảng 3.7 cho thấy độ tan của bột rau máthìakhi s ử dụngcácch ất mang là gum arabic, maltodextrin và dextrin đều dễ tan Bột rau má sử dụng chất mang gum arabic có màu xanh tươi sáng, bột mịn, độ tơi xốp caovàhoạtchấtđượcbaophủvàogiữahạt.Bộtraumávớichấtmanglàdextrincómàuxanh hơi đậm, bột thô, tơi xốp và hoạt chất được bao phủ, liên kết trong thành hạt Bột rau má v ới chất manglàmaltodextrin thìchomàuxanh sẫm, bột thô, vón nhẹ và hoạt chất liên kết trên bề mặt hạt Kết quả phân tích đặc tính bột rau má sấy phun cho thấy chấtmanggumarabiccókhảnăngbaobọcvàbảovệcáchợpchấtsinhhọc(polyphenol, chlorophyll) có trong dịch rau má tốt hơn các loại chất mang khác đã khảosát.

Kết quảphântíchởcáchình3 28 ÷ 3 30 và bảng 3.8 cũng cho thấy bột rau máthìas ử dụng chất mang gum arabic có kích thước hạt trungbìnhnh ỏ nhất là 157,8 nm Trong khi đó bột rau máthìas ử dụng chất mang dextrin thì kích thước hạt trungbìnhlớnnhấtlà381,5nm,gấp2,42lầnsovớikíchthướchạttrungbìnhcủabộtraumásử dụngchấtmanggumarabicvàbộtraumásấyphunsửdụngchấtmangmaltodextrinthì kích thước hạt trungbìnhlà 278,5nm, gấp 1,77 lần so vớikíchthước hạt trungbìnhcủa bột rau má sử dụng gum arabic Mặt khác, kết quả phântíchchỉ số đaphântáncho thấy bột raumáthìas ử dụng chất mang gum arabic có ch ỉ số đa phân tán thấp nhất là0,517 Trong khi đó, bột raumáthìas ử dụng chất mang maltodextrin có chỉ số đa phân táncao nhất là 0,756 và bột rau máthìas ử dụng chất mang dextrin có chỉ số đa phân tán là 0,662 Như vậy, sử dụng gum arabic làm chất mang tạo được bột rau má chứa chlorophyll, polyphenol có kích thước hạt trungbìnhnhỏ nhất nhưng hạt có mức độ đồng đều thấp hơn các loại chất mang khác đã sử dụng.Ngoàira, kết quả phân tích còn cho thấy bột rau má thìa sử dụng chất mang gum arabic dễ tan nhất so với bột rau máthìasử dụng các loại chất mang khác như dextrin hoặcmaltodextrin.

Kết quảphânt ích nhiệt vi saihình3 31 cho thấy bột raumáthìakhikhôngdùngchấtmangcópeakthunhiệtT mở 132,94oCthểhiệntạinhiệtđộnàycósự mấtnướchấp thụ trongphânt ử bột rau má, có peak thu nhi ệt Tđở 180,11oC - kết quảnàythể hiệnnhiệt độ có s ự đứtgãycácliênk ết có trongthànhph ần của bột rau má và có peak t ỏanhiệtT nở 256,85oCvà288,80oCthểhiệntạinhiệtđộnàycósựphânhủycácnhómchức chủ yếucótrongphânt ử bột rau má.Ngoàiracòncó m ột peak tỏa nhiệt Tpở 422oClànhiệt độphânh ủyhoàn toàncácphânt ử trong bột rau máthìakhikhôngs ử dụng chất mang.

Bột rau máthìasử dụng chất mang dextrin(hình3 32) có peak thu nhiệt

Tmở86,14 o C thể hiện tại nhiệt độnàycó s ự mất nước hấp thụ trongphânt ử của bột rau mávà khôngpháthi ện thấy peak thu nhiệt T đ đểlàmphá h ủycácliênk ết có trongthànhphầncủabộtraumá,cópeaktỏanhiệtTnở289,44oCvà415,68oCthểhiệntạicácnhiệt độnàycós ựphânh ủycácnhómch ức chủ yếu có trongphânt ử bột.Ngoàiracòncómột peak tỏa nhiệt Tpở 549,01oClànhiệt độphânh ủyhoàn toàncácphânt ử trong bộtraumá.

Kết quảphânt ích phổ nhiệt vi sai ởhình3 33 cho thấy bột rau máthìasử dụngchất mang maltodextrin có peak thu nhiệt Tmở 69,60oC thể hiện tại nhiệt độnàycó s ự mất nước hấp thụ trongphânt ử, có peak thu nhi ệt Tđở 128,03oC thể hiện tại nhiệt độnàycó s ự đứtgãycácliênk ếtcótrongthànhph ần của bột, có peak t ỏa nhiệt Tnở282,99 o C và417,08 o C thể hiện tạicácnhi ệt độnàycó s ựphânh ủycácnhómch ứcchủyếucótrongphântửbộtraumávàloạibộtnàykhôngcópeaktỏanhiệtT p- kếtquảnày thể hiện không đo được nhiệt độphânh ủyhoàn toàncácphânt ử trong bột rau má Kết quảnàych ứng tỏ khi sấy phun sử dụng chất mang maltodextrin thì độ bền nhiệtphânhủy bột tăng lên và có thể dự đoán rằng nhiệt độ đểphânh ủyhoàn toàncácphânt ử trong bột rau má với chất mang làmantodextrinlàtrên600 o C.

Bột rau máthìasử dụng chất mang là gum arabic (hình3 34) có peak thu nhiệtT m ở 94,05oC thể hiện tại nhiệt độnàycósự mất nước hấp thụ trongphântử bột rau má Đối với loại bộtnày,khôngtìmth ấy peak thu nhiệt Tđđểlàmphá h ủycácliênk ết cótrongthànhph ần của bột, chứng tỏ không đo được nhiệt độphânh ủy bột rau má. KếtquảđocũngchothấycópeaktỏanhiệtT nở 317,48oCvà375,35oCthểhiệntạicácnhiệtđộnàyc ó s ựphânh ủycácnhómch ức chủ yếu có trongphânt ử bột rau má.Ngoàiracòncó m ột peak tỏa nhiệt Tpở 549,33oC là nhi ệt độphânh ủyhoàn toàncácphânt ửtrong bột raumá.