Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật và đánh giá khả năng ứng dụng

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định hàm lượng quercetin trong dịch thủy phân của thực vật bằng phương pháp HPLC. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (cao chiết thô, cao bán tinh khiết và tinh khiết) từ thực vật. Đánh giá hoạt tính sinh học một số chế phẩm quercetin thu nhận từ thực vật.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Huy Hoàng NGHIÊN CỨU THU NHẬN QUERCETIN TỪ THỰC VẬT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Quang Huy PGS.TS Hồ Bá Do Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại……………………………………………… vào hồi ngày thánh năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin-Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Do Thi Hai Anh, Le Huy Hoang, Kitsamone Shihavong, Nguyen Thai Uy, Nguyen Quang Huy (2016), “In vitro antibacterial activity of Quercetin containing extract from Hibiscus sabdariffa L Calyxes”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology T 32 (1S), tr 147-152 Lê Huy Hoàng, Đỗ Thị Hải Anh, Đỗ Thị Huế, Trần Thị Kiều Oanh, Nguyễn Quang Huy (2017), “Xác định quercetin dạng tự dịch chiết nụ hoa Hòe (Sophora japonica L.) phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí Khoa học-Khoa học Tự nhiên Công nghệ, ĐHQGHN T 33 (1S), tr 214-223 Lê Huy Hoàng, Phạm Thị Phƣợng, Nguyễn Thị Hạnh, Hồ Bá Do, Nguyễn Quang Huy (2019), “Nghiên cứu điều kiện thủy phân có hỗ trợ siêu âm để thu nhận đánh giá hoạt tính chống oxi hố quercetin từ số thực vật”, Tạp chí Khoa học-Khoa học Tự nhiên Công nghệ, ĐHQGHN (đã chấp nhận đăng) Lê Huy Hoàng, Phạm Thị Phƣợng, Bùi Thị Vân Khánh, Hồ Bá Do, Nguyễn Quang Huy (2019), “Đánh giá hoạt tính chế phẩm quercetin tách từ nụ hoa hòe (Sophora japonica L.) sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”, Tạp chí Dược học T 519, tr 55-58 MỞ ĐẦU Quá trình trao đổi chất lƣợng thể sống đƣợc trì ổn định trạng thái cân oxy hóa khử Trong tình trạng stress oxy hóa, gia tăng tích lũy gốc tự gây tác động bất lợi lên quan tổ chức, làm tăng nguy mắc bệnh mạn tính ngƣời Khi đó, chế phẩm chống oxy hóa ngoại sinh thu nhận từ thực vật dạng cao chiết (cao thô, cao bán tinh khiết) đơn chất tinh khiết, đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng để cải thiện tình trạng stress oxy hóa Trong hợp chất thứ cấp từ thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, polyphenol đƣợc ghi nhận nhóm phổ biến Khi thu nhận polyphenol từ loại thực vật, số nghiên cứu cho thấy chế phẩm dạng bán tinh khiết có ƣu việt dạng tinh khiết hoạt tính chống oxy hóa nhƣ khả phân tán nƣớc Trong polyphenol, flavonoid nhóm lớn nhất, đóng vai trị hoạt tính chống oxy hóa thuốc Hơn 6000 loại flavonoid khác đƣợc xác định số lƣợng phát tăng lên Trong đó, quercetin flavonoid đƣợc trọng nghiên cứu nhiều nhất, với chế phẩm đƣợc sử dụng chủ yếu dạng tinh khiết thu nhận từ rutin Ở Việt Nam số nƣớc châu Á, rutin đƣợc thu nhận chủ yếu từ nụ hoa hòe Cho đến nay, nghiên cứu thu nhận đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết chứa quercetin thu nhận trực tiếp từ nụ hoa hòe Việt Nam, so sánh với dạng quercetin tinh khiết từ rutin, chƣa đƣợc đề cập Quercetin (dạng tinh khiết) đƣợc đánh giá có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với hiệu trị liệu đa dạng Với nhiều đích tác dụng, quercetin đƣợc ghi nhận có hoạt tính adaptogen với khả gia tăng thích ứng thể căng thẳng thần kinh nhƣ thể chất Chính thế, quercetin đƣợc trọng nghiên cứu ứng dụng để cải thiện tình trạng stress oxy hóa liên quan đến tuổi, điều kiện sống, nghề nghiệp độc tính thuốc điều trị (điển hình paracetamol) Gần đây, quercetin thuộc số hợp chất thứ cấp đƣợc đƣợc định hƣớng bổ sung vào chế độ dinh dƣỡng, để tăng sức chịu đựng cho quân nhân, vận động viên bệnh nhân Tuy nhiên, với đặc tính khử, sau hoạt động trung hịa gốc tự do, quercetin trở thành tiền chất oxy hóa Trong thể động vật, với đặc tính chất lạ sinh học (xenobiotic) không tan nƣớc, quercetin đƣợc chuyển hóa gan để đào thải Khi đó, hoạt tính sinh học in vivo quercetin chịu chi phối đồng thời dạng khử nhƣ tiền chất oxy hóa Vấn đề tạo thách thức lớn ứng dụng quercetin tinh khiết, đặc biệt mức liều cao nhiều ngày Điều kiện chiết xuất hệ dung môi hữu chứa axit đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu, áp dụng để thu nhận quercetin cho nghiên cứu hàm lƣợng hoạt tính sinh học Trong đó, điển hình điều kiện chiết xuất để nghiên cứu hàm lƣợng quercetin, đƣợc Gray cộng tiêu chuẩn hóa bạch quả, sau đƣợc Watanabe cộng áp dụng vỏ hành gần đƣợc Nishimuro cộng áp dụng số rau, Điều kiện chiết xuất nghiên đƣợc áp dụng thành công để tách đồng thời quercetin với flavonol nhiều thực vật khác nhau, có tiềm phát triển để thu nhận cao chiết chứa quercetin từ thực vật cho nghiên cứu hoạt tính sinh học Tuy nhiên, áp dụng điều kiện chiết xuất nói để thu nhận quercetin từ nụ hoa hòe chƣa đƣợc thực Bên cạnh đó, quercetin có hoạt tính adaptogen nhƣng việc thu nhận mẫu chứa quercetin từ thực vật adaptogen, phổ biến Việt Nam gồm rau má, sen, rau đắng biển, ngũ vị tử, thân rễ cam thảo, chùm ngây, đài hoa bụp giấm chƣa đƣợc trọng nghiên cứu Vì vậy, với giá trị khoa học tiềm ứng dụng quercetin lĩnh vực y dƣợc, luận án “Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật đánh giá khả ứng dụng” đƣợc tiến hành nhằm thực mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu luận án Xác định hàm lƣợng quercetin dịch thủy phân thực vật phƣơng pháp HPLC Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (cao chiết thô, cao bán tinh khiết tinh khiết) từ thực vật Đánh giá hoạt tính sinh học số chế phẩm quercetin thu nhận từ thực vật Nội dung nghiên cứu luận án Nội dung Nghiên cứu điều kiện thu dịch thủy phân; điều kiện sắc ký HPLC để định lƣợng quercetin dịch thủy phân thực vật nghiên cứu, gồm nụ hòe số mẫu thực vật thuộc danh mục có hoạt tính adaptogen (lá sen, ngũ vị tử, cam thảo, vỏ hành tây, chùm ngây, đinh lăng, rau đắng biển, rau má bụp giấm) Nội dung Thiết lập xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (dạng tinh khiết bán tinh khiết) từ số thực vật để nghiên cứu hàm lƣợng hoạt tính sinh học Đánh giá hoạt tính in vitro (chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng tế bào ung thƣ đại trực tràng) chế phẩm quercetin thu nhận đƣợc Nội dung Đánh giá độc tính cấp hoạt tính chống oxy hóa in vivo (trên chuột bị stress oxy hóa độc tính paracetamol sốc nhiệt) mẫu quercetin dạng bán tinh khiết dạng tinh khiết đƣợc thu nhận từ nụ hoa hịe Những đóng góp luận án - Luận án cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống ảnh hƣởng điều kiện chiết xuất đến hiệu thu nhận quercetin mẫu chuẩn quercetin, rutin số thực vật Việt Nam, để tạo mẫu chứa quercetin cho phân tích HPLC nghiên cứu hoạt tính sinh học - Luận án thiết lập quy trình thu nhận mẫu chứa quercetin dạng bán tinh khiết từ dịch chiết tồn phần nụ hoa hịe (mẫu H1) với hiệu suất thu nhận cao so với thu nhận từ rutin (mẫu H2) Theo quy trình, luận án thu nhận đƣợc chế phẩm quercetin có mức độ tinh khiết khác từ mẫu thủy phân từ rutin (H2, 90,02%), mẫu thủy phân từ dịch chiết toàn phần nụ hoa hòe (H1, 59,19%) sen (S, 10,85%) - Luận án đóng góp liệu hoạt tính sinh học mẫu quercetin mức độ tinh khiết khác từ nụ hoa hòe (H1, H2,) hiệu chống oxy hóa DPPH, kháng tế bào ung thƣ HCT116 mức độ cải thiện tình trạng tổn thƣơng stress oxy hóa gan chuột nhắt trắng dƣới tác động tác nhân paracetamol nhiệt độ cao, theo cách thức sử dụng hỗ trợ dự phịng điều trị Trong đó, mẫu quercetin bán tinh khiết thu đƣợc từ nụ hoa hòe (H1) có hoạt tính sinh học cao hơn, gây độc gan so với quercetin chuẩn (Sigma) quercetin tinh khiết thu nhận từ rutin (H2, hàm lƣợng 90,02%) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT Thành phần có hoạt tính sinh học từ thực vật chủ yếu thuộc nhóm chất chuyển hóa thứ cấp, sản phẩm cuối trình biểu gen Ngày nay, chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc xác định hợp chất có trọng lƣợng phân tử thấp, có hoạt tính sinh học thuộc nhóm alkaloid, isoprenoid (các terpenoid) polyphenol Thực vật có khoảng 70% lồi có giá trị làm thuốc, đƣợc 65% đến 80% dân số giới sử dụng chăm sóc sức khỏe Xu hƣớng sử dụng sản phẩm ngày gia tăng 1.1.1 Chế phẩm chứa hợp chất thứ cấp từ thực vật Chế phẩm chiết xuất hình thức sử dụng thực vật đƣợc phát triển y học đại, với hợp chất đích đƣợc thu nhận dạng tinh khiết hỗn hợp với thành phần khác có mức độ tinh khiết tăng dần (từ cao thô đến cao bán tinh khiết) 1.1.2 Thu nhận chế phẩm chiết xuất chứa hợp chất đích từ thực vật Theo hƣớng dẫn tổ chức Y tế giới (WHO), quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ thực vật bao gồm nhiều giai đoạn nối tiếp nhau, gồm chiết xuất thu dịch chiết, sau lọc loại tạp, làm giàu hợp chất mục tiêu Cuối trình phân lập tinh chế để tiêu chuẩn hóa sản phẩm 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu nhận, chất lƣợng hợp chất thứ cấp Quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp kết hợp kĩ thuật chiết xuất theo số phƣơng pháp chiết xuất khác nhau, tùy thuộc vào đối tƣợng mục tiêu chiết xuất Quy trình chịu ảnh hƣởng nhiều giai đoạn thu dịch chiết Hiệu khả lặp lại giai đoạn thu dịch chiết chịu tác động trực tiếp dung môi, kích thƣớc bột nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu dung môi, kĩ thuật chiết (thời gian chiết, nhiệt độ) 1.2 HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ THỰC VẬT 1.2.1 Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính chống oxy hóa Thực vật làm thuốc với đặc tính chống oxy hóa, đƣợc sử dụng thuốc thay để giảm thiểu bệnh liên quan đến stress oxy hóa Trong hợp chất polyphenol, flavonoid nhóm lớn chất chống oxy hóa số thực vật Các nghiên cứu chế độ ăn giàu flavonoid chủ yếu dựa hàm lƣợng hợp chất thuộc nhóm flavonol (quercetin, myricetin, kaempferol) nhóm flavone (apigenin, luteolin) Trong đó, quercetin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, flavonoid có chế độ ăn, chiếm tỉ lệ từ 40 đến 100% tổng lƣợng flavonoid tiêu thụ hàng ngày 1.2.2 Đánh giá hàm lƣợng hợp chất thứ cấp hoạt tính chống oxy hóa mẫu chiết xuất từ thực vật Mẫu chiết xuất từ thực vật đƣợc thu nhận để làm giàu đơn chất nhóm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mong muốn, sử dụng cho mục đích cụ thể 1.2.2.1 Xác định hợp chất đích mẫu chiết xuất Hệ thống HPLC thƣờng đƣợc sử dụng để trực tiếp phân tách, định tính, định lƣợng hoạt chất mẫu nghiên cứu Điều kiện thực nghiệm cần đƣợc chuẩn hóa để đáp ứng yêu cầu phƣơng pháp phân tích HPLC 1.2.2.2 Đánh giá đặc tính chống oxy hóa dịch chiết thực vật Thử nghiệm độc tính hoạt tính chống oxy hóa theo hƣớng bảo vệ tế bào thể động vật bị gây tổn thƣơng chất oxy hóa đƣợc đánh giá thơng qua tiêu huyết học, tiêu hóa sinh máu (ALT,enzym AST, creatinin, ure, ) chất thị cho tinh trạng stress oxy hóa (MDA, GSH, ) tiêu hành vi động vật thí nghiệm 1.3 CHIẾT XUẤT QUERCETIN TỪ THỰC VẬT Với nhiều đặc tính hóa học sinh học độc đáo, quercetin flavonoid đƣợc nghiên cứu nhiều Quercetin đƣợc tiếp cận nghiên cứu từ hai khía cạnh, gồm đặc tính hóa học sinh học để đƣa khuyến nghị tác dụng chống oxy hóa nhƣ áp dụng chất chống oxy hóa lĩnh vực y dƣợc 1.3.1 Cấu trúc hóa học quercetin Quercetin đƣợc xem khung xây dựng cho flavonoid khác với cấu trúc hóa học gồm vịng thơm nhóm hydroxyl, có cấu tạo phân từ C15H10O7 1.3.2 Các điều kiện chiết xuất thu nhận quercetin từ thực vật Quy trình thu nhận quercetin đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp với kĩ thuật chiết xuất, hệ dung môi đối tƣợng chiết xuất khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thu nhận 1.3.2.1 Chiết xuất quercetin từ thực vật sử dụng cho mục đích phân tích Các nghiên cứu thu nhận quercetin đƣợc đề cập chủ yếu đƣợc sử 2.2.1.1 Phương pháp phân tích quercetin HPLC Điều kiện cố định: cột pha đảo ZORBAX SB-C18 (Agilent) có kích thƣớc 4,6  150 mm, cỡ hạt µm, Điều kiện khảo sát, tối ưu: bƣớc sóng 283, 330, 367 370 nm , pha động , tốc độ dòng 2.2.1.2 Phương pháp định tính số nhóm hợp chất thứ cấp 2.2.1.3 Phương pháp định tính sắc ký mỏng, đo điểm chảy, phổ hồng ngoại - Tiến hành sắc ký mỏng silicagel F254, điều chế vết tƣơng đƣơng mẫu chuẩn, đo điểm chảy phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV) mẫu điểu chế đƣợc, so sánh với quercetin chuẩn (QC) quercetin đối chiếu dƣợc lý (QUE) 2.2.1.4 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số 2.2.2 Nhóm phƣơng pháp chiết xuất quercetin từ thực vật Điều kiện thu nhận đƣợc thực theo phƣơng pháp Nishimuro cộng sự, Zhao Zhang, Zhao cộng đƣợc điều chỉnh phù hợp với điều kiện tách chiết mục tiêu nghiên cứu 2.2.2.1 Xử lý để loại tạp mẫu thực vật 2.2.2.2 Khảo sát lựa chọn hệ dung môi, kĩ thuật xác định hàm lượng quercetin thực vật HPLC 2.2.2.3 Khảo sát, lựa chọn điều kiện chiết xuất quercetin từ thực vật cho nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.2.2.4 Thu nhận mẫu chứa quercetin từ cao chiết thủy phân từ rutin chiết xuất từ thực vật lựa chọn để nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 2.2.3 Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vitro 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả cho hydro Hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả cho hydro đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Taskin cộng 10 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả cho electron Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa qua độ hấp thụ quang đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp mô tả Wan C cộng 2.2.3.3 Phương pháp xác định lực khử Đánh giá lực khử qua độ hấp thụ quang đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Ling cộng 2.2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dựa khuếch tán đĩa thạch theo phƣơng pháp Kirby-Bauer đƣợc mô tả Trang cộng 2.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ dựa tác dụng giảm tỉ lệ sống sót tế bào, theo phƣơng pháp mô tả Carmona cộng 2.2.4 Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vivo 2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp mẫu thử hoạt tính gây chết chuột thí nghiệm, theo phƣơng pháp Litchfield - Wilcoxon đƣợc mô tả Tùng cộng 2.2.4.2 Phương pháp gây độc gan thực nghiệm đánh giá khả cải thiện theo cách thức sử dụng mẫu chứa quercetin Phƣơng pháp gây mơ hình viêm gan, sử dụng paracetamol liều cao, đƣợc tiến hành dựa nghiên cứu Mallhi cộng sự, Sabir cộng a Khảo sát mức liều phù hợp paracetamol b Gây mơ hình đánh giá hiệu can thiệp mẫu chứa quercetin theo cách thức sử dụng 2.2.4.3 Phương pháp sốc nhiệt thực nghiệm đánh giá khả cải thiện theo cách thức sử dụng mẫu chứa quercetin Phƣơng pháp sốc nhiệt đƣợc tiến hành dựa nghiên cứu 11 Chen Y cộng (sốc nhiệt mạn tính); cộng (sốc nhiệt cấp tính) a Khảo sát, lựa chọn hình thức sốc nhiệt b Gây mơ hình đánh giá hiệu can thiệp mẫu chứa quercetin 2.2.4.4 Phương pháp nuôi dưỡng, thu thập mẫu, kiểm tra trực quan phân tích số cảm quan, hành vi, hóa sinh, huyết học, MDA, GSH a Điều kiện nuôi dưỡng, thử nghiệm lấy mẫu động vật thí nghiệm b Kiểm tra trực quan gan: c Phân tích số hóa sinh, huyết học d Xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) glutathion (GSH) gan chuột e Phương pháp bơi gắng sức đánh giá mệt mỏi f Phương pháp test hành vi qua mơ hình y-maze để đánh giá hoạt động học tập-trí nhớ g Phương pháp định tính quercetin máu chuột 2.2.5 Xử lý số liệu 2.2.6 Địa điểm nghiên cứu luận án Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học Công nghệ quân sự, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN; Khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng, Bộ Y tế; Các môn Sinh lý, Dƣợc lý Y học Quân binh chủng thuộc Học viên Quân y 2.2.7 Sơ đồ nghiên cứu 12 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG QUERCETIN TRONG MẪU THỰC VẬT LỰA CHỌN Điều kiện chiết xuất áp dụng thực vật chủ yếu thực theo kĩ thuật đun hồi lƣu siêu âm với hệ dung môi chứa methanol ethanol, có khơng có axit HCl [58] Các mẫu dịch chiết đƣợc thu nhận để định tính thành phần hóa học, khảo sát hàm lƣợng flavonoid tổng số định lƣợng quercetin phƣơng pháp HPLC làm sở cho thiết lập quy trình thu nhận 3.1.1 Định tính số thành phần hóa học xác định hàm lƣợng flavonoid tổng số thực vật Nụ hoa hịe có hàm lƣợng flavonoid cao nhất, sau đến sen, chùm ngây, đài hoa bụp giấm, vỏ củ hành tây, thân cam thảo, đinh lăng, toàn rau má, hạt ngũ vị tử thấp rau đắng biển 3.1.2 Xác định hàm lƣợng quercetin thực vật phƣơng pháp HPLC Để đánh giá hàm lƣợng quercetin, điều kiện sắc ký xử lý mẫu cần đƣợc chuẩn hóa để đảm bảo tính phù hợp nhƣ độ tin cậy phƣơng pháp phân tích HPLC mẫu nguyên liệu khác [152] a Tối ưu điều kiện sắc ký Từ kết thu đƣợc, phƣơng pháp HPLC đƣợc xác định với điều kiện sắc ký nhƣ sau: thể tích tiêm mẫu 10 µl, bƣớc sóng 370 nm, hệ pha động có tỉ lệ A/C/D = 15/65/20, tốc độ dòng ml/phút, phân tách theo cách thức đẳng dòng qua cột ZORBAX SB-C18 (Agilent), nhiệt độ phân tích 25oC, thời gian phân tích khơng phút/mẫu 13 b Đánh giá tính phù hợp điều kiện sắc ký Phƣơng trình đƣờng chuẩn phù hợp cho xác định hàm lƣợng quercetin theo diện tích píc phân tích HPLC Các thơng số sắc ký đạt yêu cầu cho phân tích định lƣợng quercetin độ lặp lại, độ xác khoảng tuyến tính 3.1.2.2 Khảo sát lựa chọn kĩ thuật đun hồi lưu siêu âm để thu nhận quercetin từ thực vật Từ kết này, kĩ thuật siêu âm hệ dung môi chứa axit với chu kỳ chiết tƣơng ứng đƣợc sử dụng cho xử lý mẫu định lƣợng quercetin HPLC 3.1.2.3 Xác định hàm lượng quercetin dịch chiết thủy phân từ thực vật - Với píc sắc ký đạt yêu cầu, diện tích píc quercetin đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng quercetin theo đƣờng chuẩn HPLC, mức pha loãng từ đến 250 lần 14 - Hàm lƣợng quercetin cao nụ hoa hòe đến sen chùm ngây thực vật lại; 9/10 mẫu có độ lệch chuẩn tƣơng đối đạt yêu cầu (RSD < 11%) - Vấn đề cần quan tâm nghiên cứu kết hợp siêu âm với ngấm kiệt để giảm thời gian lƣợng dung môi chiết xuất nhằm thu nhận mẫu quercetin từ thực vật từ lƣợng bột lớn (60 đến 100g) cho thu nhận quercetin để nghiên cứu hoạt tính sinh học 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO CỦA CHẾ PHẨM CHỨA QUERCETIN TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Các điều kiện chiết xuất lựa chọn đƣợc đánh giá 10 mẫu thực vật theo tiêu chí hiệu suất thu nhận quercetin, độ lặp lại hoạt tính chống oxy hóa in vitro 3.2.1 Xác định hiệu thu nhận quercetin theo thời gian mẫu rutin quercetin chuẩn Từ kết thu đƣợc, thời gian 15 30 phút đƣợc lựa chọn cho thu dịch chiết thời gian 60 phút đƣợc lựa chọn cho thủy phân dịch chiết 15 3.2.2 Xác định điều kiện chiết xuất phù hợp nụ hoa hòe chuẩn Từ kết nghiên cứu nụ hoa hịe chuẩn, chúng tơi lựa chọn đƣợc điều kiện chiết xuất quercetin từ thực vật gồm ba giai đoạn, sở kết hợp kĩ thuật (siêu âm với ngấm kiệt) điều kiện chiết xuất (gồm trích ly, ngấm kiệt thủy phân) 3.2.3 Thử nghiệm, đánh giá điều kiện chiết xuất 10 mẫu thực vật Kết cho thấy, có 5/10 thực vật có độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD < 11%) Các kết đánh giá cho thấy điều kiện chiết xuất phù hợp để thu nhận mẫu quercetin từ thực vật có hàm lƣợng quercetin khác nhau, với hiệu suất thu nhận khả tái lặp đạt u cầu 3.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết theo hệ dung mơi có khơng có axit Hoạt tính sinh học mẫu thực vật đƣợc đánh giá thơng qua hoạt tính chống oxy hóa cao chiết trƣớc sau thủy phân thực vật 3.2.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết Thứ tự mẫu thực vật theo hoạt tính chống oxy hóa cao chiết bị thay đổi từ chùm ngây Trong đó, phần trăm quét gốc tự dịch chiết nụ hoa hòe gấp khoảng 1,5 lần sen hai thực vật gấp lần với thực vật cịn lại 3.2.4.2 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết thủy phân Kết cho thấy mẫu dịch chiết thủy phân có hoạt tính cao mẫu dịch chiết Các mẫu thực vật có phần trăm quét gốc tự 20%, cao thu nhận từ nụ hoa hòe, sen rau đắng biển Lá chùm ngây có hàm lƣợng quercetin xếp thứ rau đắng biển nhƣng sau pha loãng có hoạt tính chống oxy hóa 16,31% lại thấp rau đắng biển 3.2.5 Thu nhận mẫu quercetin từ nụ hoa hòe sen 16 Các kết đánh giá cho thấy điều kiện chiết xuất cho thu nhận đƣợc quercetin đạt mục tiêu đề hiệu suất thu nhận cao chất lƣợng tốt (hoạt tính chống oxy hóa cao hơn) Từ kết nghiên cứu chúng tơi xây dựng quy trình thu nhận Sơ đồ theo hình 3.15 17 Thực theo quy trình, thực vật, có nụ hoa hịe thu đƣợc loại mẫu chứa quercetin từ dịch chiết toàn phần (H1) từ rutin (H2) Lá sen thu đƣợc loại từ dịch chiết toàn phần (S) Các mẫu thu đƣợc sau loại tạp (H1, H2 S) có hàm lƣợng quercetin tăng lên so với trƣớc loại tạp Kết xác định số đặc điểm vật lý đƣợc thể bảng 3.10 Quercetin flavonoid có tinh thể hình kim, kết tinh màu vàng Quercetin bình thƣờng dạng dihydrat, trở nên khan 95- 97oC, nhiệt độ nóng chảy từ 316-317oC, dễ kết tinh ethanol lạnh [58] Từ kết bảng 3.10, cho thấy mẫu H1, H2 có màu cảm quan tƣơng đƣơng mẫu chuẩn, cịn mẫu S khác biệt Tuy nhiên, ba mẫu có chứa chất có đặc điểm tƣơng đƣơng với hai mẫu quercetin chuẩn QC QUE định tính SKBM, nhiệt độ nóng chảy phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-vis) Kết giải phổ IR vết điều chế SKBM cho thấy tần số theo nhóm –OH, phenol, C=O, C=C, C-H, cấu trúc theo mặt phẳng, C-O aryl, C-O phenol C-CO-C kenton mẫu (H1, 18 H2, S) quercetin chuẩn (QC, QUE) tƣơng đồng với phổ đồ IR quercetin nghiên cứu Catauro, Shaghavi Ratna [42, 147, 156] Nhƣ mẫu thu đƣợc chứa quercetin Hàm lƣợng quercetin mẫu H1, H2 S tiếp tục đƣợc xác định phƣơng pháp HPLC theo điều kiện phân tích chuẩn hóa Kết phân tích HPLC mẫu H1, H2, S nhƣ quercetin chuẩn QC QUE đƣợc thể hình 3.17 Hàm lƣợng quercetin chất chuẩn, mẫu QC, H1, H2, S, QUE đƣợc xác định tƣơng ứng 92,72 %; 59,19 %; 90,02 %; 10,85 % 91,62 % 3.2.6 Kết đánh giá hoạt tính in vitro mẫu chứa quercetin Các mẫu quercetin từ nụ hoa hòe sen, đƣợc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa kháng tế bào ung thƣ so sánh với quercetin chuẩn (QUE) 3.2.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn Các mẫu có hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc nhiều vào dung mơi hòa tan; methanol (MeOH) cao so DMSO 0,5% Do đó, dung mơi MeOH đƣợc sử dụng để nghiên cứu 19 hoạt tính chống oxy hóa in vitro 3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa Nồng độ IC50 (µg/ml) mẫu H1, H2, S, Que vitamin C tƣơng ứng 13,62, 16,35, 23,09, 14,35 15,30 Khả quét gốc tự mẫu H1 mạnh so với mẫu đƣợc nghiên cứu Năng lực khử giá trị Abs1 mẫu S cao so với mẫu cịn lại 3.2.6.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư Ở nồng độ 20 µg/ml, mẫu H1, H2, QUE thể hoạt tính kháng tế bào mức thấp với tỷ lệ sống sót tế bào bị giảm tƣơng ứng 60,76%, 54,42% 48,12% Trong mẫu nghiên cứu, mẫu H1 có hoạt tính cao cao chất chuẩn QUE 3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA QUERCETIN CHUẨN, MẪU CHỨA QUERCETIN THU NHẬN TỪ NỤ HOA HÒE Ở MỨC ĐỘ IN VIVO Các mẫu H1 (thu nhận từ dịch chiết toàn phần nụ hoa hòe), H2 (thu nhận từ rutin tách thừ nụ hoa hòe) QUE (quercetin chuẩn) đƣợc đánh giá mơ hình in vivo sử dụng chuột nhắt trắng để xác định liều phù hợp với hoạt tính chống oxy hóa 3.3.1 Tác động mẫu H1, H2 QUE mức liều khác khau máu gan chuột nhắt trắng 3.3.1.1 Đánh giá độc tính cấp mẫu chứa quercetin Kết nghiên cứu độc tính H1, H2, QUE mức liều mẫu 10, 20 120 mg/kg không thấy chuột chết, nhƣng chuột sử dụng mức liều với nồng độ 250 mg/kg cho thấy triệu chứng ngộ độc 20 3.3.1.2 Tác động mẫu chứa quercetin lên số số huyết học hóa sinh máu chuột Kết số huyết học số hóa sinh đánh giá chức gan, thận cho thây mức liều nghiên cứu, mức liều 250 mg/kg gây tác động tiêu cực tới chức gan thận, nhƣng thời gian ngày, chƣa gây chết động vật thí nghiệm 3.3.1.3 Tác động mẫu lên số MDA GSH gan chuột Các mẫu chứa quercetin (H1, H2 QUE) hai mức liều 10 20 mg/kg gia tăng hàm lƣợng GSH so với nhóm đối chứng, chứng tỏ mẫu chứa quercetin hai mức liều có hoạt tính chống oxy hóa in vivo 3.3.1.4 Xác định dạng tồn quercetin gan máu chuột Mức liều 10 20 mg/kg, không phát thấy quercetin tự máu chuột Ngƣợc lại, mức liều 250 mg/kg có phát thấy quercetin tự 3.3.2 Tác động mẫu H1, H2 QUE máu gan chuột điều kiện có sử dụng paracetamol Mức liều 20 mg/kg đƣợc lựa chọn để nghiên cứu cách thức phối hợp sử dụng mẫu chứa quercetin với chuột sử dụng paracetamol, nhằm cải thiện tình trạng tổn thƣơng gan sử dụng paractamol liều cao dài ngày 3.3.2.1 Khảo sát mức liều paracetamol Mức liều 250 mg/kg đƣợc sử dụng để tạo mơ hình gây viêm gan 21 3.3.2.2 Tác động cách thức sử dụng mẫu quercetin với paracetamol lên máu chuột Các mẫu chứa quercetin dùng trƣớc có hoạt độ enzym AST cao so với dùng sau Kết thu đƣợc cho thấy tác động lên hoạt độ enzym ALT huyết mẫu H1, H2 ổn đinh mẫu QUE - Các mẫu H1, H2 QUE có tác dụng phục hồi tổn thƣơng gan Trong đó, mẫu H1 cho hiệu tốt mẫu H1 cho khả phục hồi men ganenzym AST tốt quercetin chuẩn QUE (giảm 26,62% so với nhóm sử dụng Para) hiệu mẫu H2 - Các nhóm sử dụng mẫu chứa quercetin (H1, H2 QUE), gan đƣợc phục hồi nên tỉ số giảm dần giá trị nhóm ĐC 3.3.2.3 Tác động cách thức sử dụng mẫu chứa quercetin với paracetamol lên gan chuột Chỉ số MDA GSH theo cách thức sử dụng trƣớc cao cách thức dùng sau; hiệu chống oxy hóa in vivo, cách thức sử dụng dự phịng có khả kích thích sinh GSH tốt cách thức hỗ trợ (dùng sau); cách thức hỗ trợ (dùng sau) có khả giảm MDA tốt cách thức dự phịng Trong nhóm sử dụng mẫu quercetin, mẫu H1 có hiệu giảm số MDA tốt mẫu H2 QUE, nhƣng khả kích thích sinh GSH thấp 3.3.3 Tác động mẫu H1, H2 QUE lên gan máu chuột điều kiện bị sốc nhiệt Các mẫu chứa quercetin (H1, H2 QUE) có tác dụng bảo vệ gan theo hƣớng giảm hoạt độ enzym ALT máu chuột; thể hoạt tính chống oxy hóa in vivo (gia tăng GSH giảm MDA) gan chuột bị sốc nhiệt, nhƣng khơng có khác biệt nhiều mẫu Kết thu đƣợc chứng tỏ mẫu chứa quercetin H1, H2 QUE có hiệu cải thiện tình trạng stress oxy hóa sốc nhiệt cấp tính chuột nhắt trắng 22 3.4.4 Tác động mẫu H1, H2 QUE trọng lƣợng hành vi chuột nhắt trắng mức liều lựa chọn Khi sử dụng mẫu, trọng lƣợng chuột có xu hƣớng phục hồi nhƣng thấp nhóm đối chứng Các mẫu có tác dụng bảo vệ hệ thống thần kinh khơi phục lại trí nhớ ngắn hạn bị tác động paracetamol liều cao KẾT LUẬN Đã xác định, chuẩn hoá đƣợc điều kiện sắc ký HPLC cho phân tích quercetin, sử dụng hệ pha động gồm kênh C (methanol/axetonitril/H2O/axetic = 40/15/45/1), A (methanol 100%) D (acetonitril 100%) với tỉ lệ A/C/D = 15/65/20; bƣớc sóng 370 nm; thể tích tiêm mẫu 10 µl; phân tách đẳng dòng tốc độ ml/phút qua cột ZORBAX SB-C18 nhiệt độ 25oC, thời gian phân tích khoảng phút /mẫu Định lƣợng đƣợc quercetin từ dịch thủy phân 10 mẫu thực vật, có ba mẫu nhiều quercetin nụ hoa hòe 15423 mg/100g, sen 5190,8 mg/100g chùm ngây 2840 mg/100g Bảy mẫu thực vật cịn lại có hàm lƣợng quercetin thấp nằm khoảng từ 33,2 đến 130,2 mg/100g Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận quercetin từ thực vật: Nguyên liệu đƣợc trích ly siêu âm (37 kHz, 70oC, 30 phút) methanol/H2O (tỉ lệ thể tích 50:20), sau tiếp tục ngấm kiệt 24 (nhiệt độ phòng) thu dịch chiết Bổ sung HCl vào dịch chiết thu đƣợc theo tỉ lệ dịch chiết/HCl = 70:8 thủy phân siêu âm 60 phút sau thu mẫu Các mẫu quercetin có mức độ tinh khiết khác đƣợc thu nhận gồm mẫu thủy phân từ rutin (H2, 90,02%), mẫu thủy phân từ dịch chiết tồn phần nụ hoa hịe (H1, 59,19%) sen (S, 10,85%) Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cao chiết thơ từ 10 mẫu thực vật xác định cao chiết từ dịch thủy phân cao từ dịch chiết Trong 10 mẫu thực vật, nụ hoa hịe có hoạt tính chống oxi hóa ao nhất, tiếp đến sen Đã xác định đƣợc giá trị IC50 DPPH 23 0,1mM mẫu từ nụ hoa hòe (H1, H2) sen (S) lần lƣợt 13,62, 16,35 23,09 µg/ml Giá trị IC50 tế bào ung thƣ HCT116 mẫu hoa hoè tƣơng ứng 18,79 (H1) 19,53 µg/ml (H2) mẫu từ sen khơng có hoạt tính Sử dụng mức liều 10 20 mg/kg, lần/ngày, liên tục ngày mẫu từ nụ hoa hoè (H1, H2) không gây độc cho gan, thận chuột Sử dụng dự phòng hỗ trợ điều trị mẫu H1, H2 QUE mức liều 20 mg/kg, số AST, MDA, GSH xu hƣớng hành vi tốt so với nhóm dùng paracetamol sốc nhiệt Mẫu H1 thu nhận từ nụ hoa hòe cho xu hƣớng tốt ba mẫu hoạt tính chống oxy hóa in vivo mức độ an tồn cho gan chuột thí nghiệm KIẾN NGHỊ Từ kết thu đƣợc, đề xuất hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: - Nghiên cứu thành phần khác có chế phẩm quercetin bán tinh khiết nụ hoa hòe sen - Nghiên cứu mức độ điều hịa tín hiệu tế bào (cytokin, protein sốc nhiệt, hormone cortisol) để đánh giá sâu hiệu gia tăng sức chịu đựng điều kiện stress bệnh lý (sử dụng paracetamol) điều kiện stress sinh lý (sốc nhiệt) mẫu H1 so sánh với quercetin chuẩn Đồng thời, cần nghiên cứu khối lƣợng thực vật lớn để tạo mẫu tiếp tục tiêu chuẩn hóa thành phần có lợi khác (khơng phải quercetin) có mẫu H1 - Nghiên cứu quercetin từ thực vật gồm chùm ngây, hành tây, ngũ vị tử, bụp giấm, đinh lăng, rau má, rau đắng biển nghiên cứu bổ sung quercetin (H2 quercetin chuẩn) mức độ khác vào mẫu để nghiên cứu hiệp đồng hoạt tính chống oxy hóa in vitro in vivo, làm sở phát triển nguồn nguyên liệu cho thu nhận quercetin từ thực vật 24 ... với giá trị khoa học tiềm ứng dụng quercetin lĩnh vực y dƣợc, luận án ? ?Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật đánh giá khả ứng dụng? ?? đƣợc tiến hành nhằm thực mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu nghiên. .. tính sinh học 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO CỦA CHẾ PHẨM CHỨA QUERCETIN TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Các điều kiện chiết xuất lựa chọn đƣợc đánh giá 10 mẫu thực vật. .. đƣợc thu nhận từ trình thủy phân rutin, chƣa đƣợc thu nhận trực tiếp từ thực vật 1.4 ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG TRỊ LIỆU CỦA QUERCETIN 1.4.1 Đặc tính sinh học quercetin Các cơng trình nghiên cứu