Nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu và xác định đoạn dna barcode của mộc vệ ký sinh – scurrula parasitica l thu thập tại hưng yên và hà nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC ˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗ ĐÀO BÍCH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI PHẪU, BỘT DƢỢC LIỆU VÀ XÁC ĐỊNH ĐOẠN DNA BARCODE CỦA MỘC VỆ KÝ SINH – SCURRULA PARASITICA L THU THẬP TẠI HƢNG YÊN VÀ HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC ˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗ ĐÀO BÍCH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI PHẪU, BỘT DƢỢC LIỆU VÀ XÁC ĐỊNH ĐOẠN DNA BARCODE CỦA MỘC VỆ KÝ SINH – SCURRULA PARASITICA L THU THẬP TẠI HƢNG YÊN VÀ HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƢỢC HỌC) Khóa: QH2018Y Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Quỳnh Nga ThS Nguyễn Thúc Thu Hƣơng Hà Nội - 2023 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận này, em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ vô quý báu vật chất lẫn tinh thần, kinh nghiệm kiến thức chuyên môn thầy cô giáo, động viên, chia sẻ gia đình bạn bè Lời đầu tiên, em xin đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Quỳnh Nga - Trung tâm Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu ThS Nguyễn Thúc Thu Hƣơng - Giảng viên Trƣờng Đại học Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội; ngƣời tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian, cơng sức tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phan Văn Trƣởng, KTV Nguyễn Hoàng, KTV Nguyễn Khƣơng Duy cán thuộc Trung tâm Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu giúp đỡ em trình thu thập, xử lý mẫu vật giám định tên khoa học Trong thời gian học tập thực khóa luận, em ln nhận đƣợc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thầy giáo, cô giáo cán công tác Bộ môn Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học Y Dƣợc, ĐHQGHN Qua em xin đƣợc gửi lời cảm tạ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo, giáo tận tình dạy dỗ cho em suốt thời gian học tập trƣờng Em cảm ơn Đề tài “Nghiên cứu khai thác phát triển nguồn gen Tang ký sinh (Scurrula parasitica L.) làm dƣợc liệu” hỗ trợ kinh phí suốt thời gian em thực khóa luận, hộ dân giúp đỡ cung cấp mẫu vật thực hành Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè bên ủng hộ, động viên giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2023 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT (đƣợc sử dụng nội dung khóa luận này) A Kí hiệu chữ viết tắt thuật ngữ latin phân loại thực vật Loc class synonym typus = Locus classicus: địa điểm thu mẫu chuẩn = danh pháp đồng nghĩa = mẫu, mẫu danh pháp B Chữ viết tắt cs CTAB DNA EtOH ITS kb matK PCR = Cộng = Cetrimonium bromide = deoxyribonucleic acid = Ethanol: Cồn = Internal transcribed spacer: vùng đệm trình tự phiên mã = kilobase pair = 1000 bp = Maturase K = Polemerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu phân loại họ Tầm gửi (Loranthaceae) 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2 Tổng quan chi Scurrula 1.2.2 Trên giới 1.2.3 Tại Việt Nam 1.3 Tổng quan loài Mộc vệ ký sinh - Scurrula parasitica L 1.3.1 Vị trí, phân loại, phân bố 1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu loài Scurrula parasitica L 1.4 Nghiên cứu mã vạch ADN (DNA Barcode) 12 1.4.1 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi thực vật tình hình nghiên cứu 14 1.4.2 Ứng dụng DNA Barcode nghiên cứu định danh thực vật 14 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.1 Xác định tên khoa học mẫu thu thập 20 2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 20 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 20 2.2.4 Nghiên cứu DNA barcode 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phƣơng pháp kế thừa tài liệu 20 2.3.2 Phƣơng pháp thu mẫu xử lý 21 2.3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái 21 2.3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 22 2.3.5 Phƣơng pháp phân tích bột dƣợc liệu 22 2.3.6 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số tinh 23 2.3.7 Phƣơng pháp điện di ADN gel agarose 23 2.3.8 Phƣơng pháp khuếch đại vùng trình tự trnH-psbA phản ứng PCR 24 2.3.9 Phƣơng pháp xác định lồi sử dụng cơng cụ BLAST 25 CHƢƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Xác định tên khoa học loài Mộc vệ ký sinh thu hái Hƣng Yên 27 3.2 Đặc điểm hình thái 28 3.2 Đặc điểm vi phẫu 33 3.2.1 Vi phẫu 33 3.2.2 Vi phẫu thân 35 3.3 Đặc điểm bột dƣợc liệu 36 3.4 Xác định loài dựa thị trnH-psbA 37 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số khuyếch đại vùng gen trnH-psbA 37 3.4.2 Kết giải trình tự 40 CHƢƠNG – BÀN LUẬN 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng Thống kê mẫu vật trình nghiên cứu 19 Bảng 2 Trình tự mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCR 24 Bảng Thành phần phản ứng PCR nhân trnH-psbA sử dụng DreamTaq® Master Mix 24 Bảng Kết đo OD mẫu nghiên cứu 38 Bảng Đánh giá mức độ tƣơng đồng bao phủ trình tự DNA vùng trnH-psbA mẫu nghiên cứu với trình tự tƣơng ứng NCBI 41 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Phân bố loài Scurrula parasitica L Hình Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng trnH-psbA 24 Hình Cây ngồi tự nhiên loài Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) 28 Hình Một đoạn cành cụm, hoa, lồi Mộc vệ ký sinh 29 Hình 3 Hình thái cấu trúc loài Mộc vệ ký sinh 30 Hình Hình thái hoa lồi Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) 31 Hình Các cấu trúc hoa loài Mộc vệ ký sinh 32 Hình Các cấu trúc loài Mộc vệ ký sinh 33 Hình Vi phẫu loài Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) 34 Hình Vi phẫu thân loài Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) 35 Hình Đặc điểm bột thân lồi Mộc vệ ký sinh 36 Hình 10 Đặc điểm bột lồi Mộc vệ ký sinh 37 Hình 11 Kết điện di tách chiết DNA tổng số 38 Hình 12 Kết điện di sản phẩm PCR vùng trnH-psbA mẫu nghiên cứu 39 Hình 13 Điện di đồ đoạn trình tự trnH-psbA mẫu 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới, việc sử dụng loài thảo dƣợc để điều trị bệnh thƣờng gặp cộng đồng dân tộc đƣợc hình thành từ lâu đời Việc sử dụng loài thảo dƣợc với loại bệnh khác mang lại hiệu tích cực việc chữa trị thầy thuốc Mỗi dân tộc khác có tri thức giống khác biệt việc sử dụng thảo dƣợc khác biệt hệ thực vật cộng đồng dân tộc giới Theo báo cáo tổ chức Y tế giới, có khoảng 80% dân số giới sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật hỗ trợ điều trị sức khỏe Giá trị y tế, kinh tế mang lại từ nguồn thảo dƣợc vơ q giá Tính đến năm 2016, thị trƣờng thảo dƣợc giới đạt khoảng 71,19 tỷ USD đạt đến 5.000 tỷ USD vào năm 2050 với mức tăng trƣờng bình quân hàng năm 8% Với giá trị kinh tế to lớn mang lại từ nguồn thảo dƣợc, giả mạo nguyên liệu thảo dƣợc thuốc trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dƣợc đƣợc thay loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, chí từ nguyên liệu giả mạo Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) thuốc đƣợc sử dụng phổ biến Y học cổ truyền nhiều quốc gia giới Ở Trung Quốc, loài thuốc đƣợc sử dụng đề điều trị phong thấp đau nhức xƣơng, lƣng gối mỏi đau, trẻ em bị di chứng bại liệt, tay chân tê liệt; thiếu sữa, thai động không yên; cao huyết áp, phù thũng đƣợc dùng chữa viêm khớp đau dày Ở Ấn Độ, nhân dân dùng giã đắp trị mụn nhọt, lở lo t Ở Việt Nam, Mộc vệ ký sinh đƣợc sử dụng Y học cổ truyền để chữa phong thấp, gân cốt, nhức mỏi, đau lƣng gối, đau bụng, động thai, phụ nữ sau sinh khơng có sữa với liều dùng khoảng 12 – 20g dạng thuốc sắc nấu nƣớc uống thay trà Dƣợc điển Việt Nam V (2017) quy định dƣợc liệu Tang ký sinh đƣợc lấy từ loài Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) ký sinh Dâu (Morus alba L.) Tuy nhiên, khả sống ký sinh nhiều nhóm chủ khác nhau, dẫn đến chất lƣợng nhóm dƣợc liệu Mộc vệ ký sinh không ổn DNA khuôn cho thấy: thu đƣợc băng DNA đích; sản phẩm PCR nồng độ mức cao đủ điều kiện đầu vào cho phản ứng giải trình tự 3.4.2 Kết giải trình tự Giải trình tự thành cơng tồn sản phẩm PCR trnH-psbA mẫu nghiên cứu Các gen lục lạp đặc trƣng tính tƣơng đối bảo thủ di truyền đơn dịng, hiệu suất giải trình tự gen lục lạp, thƣờng ổn định Kết giải trình tự gen trnH-psbA thu đƣợc đỉnh tín hiệu đều, khơng nhiễu khơng xuất đỉnh phụ Hình ảnh giải trình tự mẫu đƣợc trình bày phụ lục A B C D E Hình 13 Điện di đồ đoạn trình tự trnH-psbA mẫu A Mẫu QN11; B Mẫu QN37; C Mẫu QN39; D Mẫu QN40; E Mẫu QN41 Qua kết giải trình tự, cho thấy trình tự vùng trnH-psbA thị tiềm năng, có khả ứng dụng mã vạch phân tử (Barcode) nhận diện hai loài Taxillus chinensis Scurrula parasitica 3.4.3 Kết xác định lồi dựa cơng cụ BLAST Hiệu chỉnh trình tự phần mềm Geneious Prime Các trình tự sau đƣợc ghép nối đƣợc tìm kiếm hệ thống BLAST Bảng 3.2 kết xác định loài lần lƣợt mẫu sau tìm kiếm thành cơng cổng liệu NCBI Kết BLAST NCBI cho thấy mức độ tƣơng đồng DNA barcode mẫu nghiên cứu trình tự NCBI 100% Điều cho thấy trình tự vùng trnH-psbA khuếch đại nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng cao so với trình tự đƣợc cơng bố NCBI loài Taxillus chinensis Scurrula parasitica Kết trùng khớp với kết xác định tên khoa học dựa đặc điểm hình thái Bảng Đánh giá mức độ tƣơng đồng bao phủ trình tự DNA vùng trnH-psbA mẫu nghiên cứu với trình tự tƣơng ứng NCBI Mẫu QN11 QN37 QN39 QN40 QN41 Loài tƣơng đồng Taxillus chinensis (KP095917) Scurrula parasitica (NC_040862) Scurrula parasitica (NC_040862) Scurrula parasitica (NC_040862) Scurrula parasitica (NC_040862) Độ tƣơng đồng (%) Độ bao phủ (%) Giá trị mong đợi (E value) 100 93,69 100 88,24 100 94,97 100 88,24 100 87,94 CHƢƠNG – BÀN LUẬN Dƣợc điển Việt Nam V (2017) mơ tả đặc điểm vi phẫu bột lồi Scurrula parasitica L nhƣ sau: Bột dƣợc liệu gồm mảnh bần, mành biểu bì chứa lỗ khí, lỗ khí có kích thƣớc khoảng 25 µm theo chiều dọc Mảnh mô mềm gồm tế bào to, thành mỏng Mảnh phiến lá, tế bào mơ cứng thành dày có chứa tinh thể calci oxalat, sợi riêng lẻ hay tập trung thành đám Mảnh mạch điểm, mạch vạch, mạch vịng Tinh thể calci oxalat hình khối thƣờng vng kích thƣớc khoảng 29 µm Hạt tinh bột trịn đƣờng kính khoảng 20 µm rốn hạt dạng điểm phân nhánh; cỏ hạt phấn cạnh [3] Nhƣ bản, đặc điểm vi phẫu bột loài Scurrula parasitica L nghiên cứu trùng khớp với mô tả Dƣợc điển Việt Nam V (2017) Tuy nhiên nghiên cứu bổ sung thêm đặc điểm chƣa đƣợc đề cập Dƣợc điển Việt Nam V có mặt lơng hình Lơng hình có mặt bột thân, cành bột lồi, phù hợp với mơ tả đặc điểm hình thái lồi mơ tả công bố nghiên cứu Kết xác định DNA barcode loài Scurrula parasitica cụ thể sử dụng gen trnH-psbA làm mã vạch cho kết khả quan so sánh với trình tự cơng bố lồi ngân hàng gen tƣơng đồng đến 100% Đồng thời xác nhận thị trnH-psbA thị đáng tin cậy công tác kiểm định loài Scurrula parasitica Cho đến nay, nghiên cứu lồi Mộc vệ ký sinh cịn chƣa đầy đủ bƣớc đào sâu nghiên cứu, khai thác tiềm loài thực vật Để làm đối tƣợng nghiên cứu điều cần phải nhận biết đối tƣợng loài sử dụng, từ tiến hành bƣớc nhƣ thu thập mẫu, kiểm nghiệm nghiên cứu dƣợc liệu Xác định tên khoa học gắn liền với đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dƣợc liệu DNA barcode có ý nghĩa quan trọng trình nghiên cứu phát triển thuốc Những kết nghiên cứu sở liệu hữu ích, góp phần vào cơng tác tiêu chuẩn hoá kiểm nghiệm dƣợc liệu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thu thập mẫu nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu, bột dƣợc liệu (thân lá), DNA barcode loài Mộc vệ ký sinh số chủ Hƣng Yên Hà Nội, đạt đƣợc kết sau: - Xây dựng liệu đặc điểm hình thái kèm hình ảnh chi tiết loài Mộc vệ ký sinh Loài Mộc vệ ký sinh phân biệt với loài khác đặc điểm: hoa mọc thành cụm gồm nhiều 3-7 hoa, bắc hình trứng đến tam giác, hoa đƣợc bao phủ lơng hình màu trắng đến nâu, có phần gốc thon hẹp lại tạo nên cấu tạo giống cuống - Xây dựng liệu đặc điểm vi phẫu thân, lá, phiến lá, gân lá, bột dƣợc liệu kèm liệu hình ảnh chi tiết Qua bổ sung liệu đặc điểm vi phẫu, bột dƣợc liệu loài cho dƣợc điển Việt Nam V - Xây dựng liệu AND barcode vùng gen trnH-psbA giúp định danh, xác định tính lồi Trình tự ADN barcode có độ dài 200 bp Kết giải trình tự cho thấy trình tự vùng trnH-psbA thị tiềm năng, có khả ứng dụng mã vạch phân tử (Barcode) nhận diện hai loài Taxillus chinensis Scurrula parasitica Kiến nghị - Các kết góp phần xây dựng liệu giúp định danh, kiểm định tính lồi Mộc vệ ký sinh Dƣợc liệu Tang ký sinh Việt Nam - Trong thời gian tới cần tiếp tục nghiên cứu loài Tầm gửi thƣờng bị nhầm lẫn với loài Scurrula parasitica để xây dựng liệu phục vụ công tác so sánh, đối chiếu kiểm định tính dƣợc liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (1994), "Họ Tầm gửi (Loranthaceae Juss.) hệ thực vật Việt Nam", Tạp chí Sinh học; 16(4): 47-54 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học; 2: 138 Bộ Y tế - Hội đồng dƣợc điển (2017), Dược điển Việt Nam V, QĐ số 5358 QĐ-BYT, NXB Y học Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ; 2: 128-140 Trần Văn Ơn (2004), Thực vật dược phân loại thực vật, NXB Y học Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật; 2: 781-784 Nguyễn Tiến Bân cộng (2003), Danh lục Thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp; 2: 1182-1190 Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Barlow B A (1991), "Conspectus of the genera Scurrula L and Taxillus Tieghem (Loranthaceae) in the Malesian region" Blumea: Biodiversity, Evolution and Biogeography of Plants; 36: 63–85 10 Barlow B A (1997) Flora of Malesiana; 13: 336 11 Albach D C., L.H.Q., Zhao N ,Jensen S R (2007), "Molecular systematics and phyotchemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)" Biochem Syst Ecol; 35: 293-300 12 Jhi C (2002), "Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry" J Nat Prod; 65: 1073-1084 13 Orwa C., Mutua A., Kindt R., Jamnadass R ,Simons A (2009), "Agroforestree Database: a tree reference and selection guide Version 4" 14 Shau-Ting Chiu (1996), "Notes on the Genus Taxillus Van Tieghem (Loranthaceae) in Taiwan": 159-160 15 George Don (1834), A General History of the Dichlamydeous Plants J.G and F Rivington; 3: 422 16 E ,E (2006), "Herbal medicines-they are popular, but are they also safe?" Eur J Clin Pharmacol; 62: 1-2 17 Koehn Fe ,C.G (2005), "The evolving role of natural products in drug discovery" Nat Rev Drug Discov; 4: 206-220 18 Bentham G ,Hooker J D (1880), Loranthaceae Genera Plantarum, 3; London: 205-217 19 Group ,C.P.W (2009), "A DNA barcode for land plants" Proceedings of the National Academy of Sciences; 106: 2794-2797 20 Yamaji H., F.T., Yokoyama J., Pak J-H., Zhou C ,Yang C Et Al (2007), "Reticulate evolution and phylogeography in Asarum sect asiasarum (Aristolochiaceae) documented in internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal DNA" Mol Phylogenet Evol; 44: 863-884 21 Newman D J., C.G.M ,Snader K M (2000), "The influence of natural products upon drug discovery" Nat Prod Rep; 17: 215-234 22 Kress J.W., Wurdack K J., Zimmer E A., Weigt L A ,D H Janzen (2005), "Use of DNA barcodes to identify flowering plants" Proc Natl Acad Sci USA; 102: 8369-8374 23 Linnaeus (1753), Flora of China: 229 24 Hebert P D N., C.A., Ball S L ,De Waard J R (2003), "Biological indentification through DNA barcodes" Proc R Soc Lond B Biol Sci; 270: 313321 25 Daniel L Nickrent, Valéry Malécot, Romina Vidal-Russell ,Joshua P Der (2010), "A revised classification of Santalales" Taxon; 59(2): 538-558 26 W.H Traditional Medicine Organization (2008), 05 May 2023 27 Jones W P., C.Y.W ,Kinghorn A D (2006), "The role of pharmacognosy in modern medicine and pharmacy" Current Drug Targets; 7: 247-264 28 Chen S., Y.H., Han J., Liu C., Song J ,Et Al (2010), "Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species" PLoS ONE; 5: 8613 29 Mark Y S ,H.P.D.N (2008), "Barcode of life" Scientific American: 82-88 30 Jarman S.N ,Elliott N G (2000), "DNA evidence for morphological àn cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, "living fossils" from the Triassic" J Evol Biol.; 13: 624-633 31 Gao T., Y.H., Song J., Liu C., Zhu Y ,Et Al (2010), "Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2" Journal of Ethnopharmacology; 130: 116-121 32 Hu Y, Z.Q., Xin H, Qin Lp, Lu Br ,Rahman K Et Al (2007), "Associtation between chemical and genetic variation of Vitex rotundifolia populations from different locations in China: ITS implication for quality control of medicinal plants" Biomed Chromatogr; 21: 967-975 33 Altschul (1990), "Basic local alignment search tool" Journal of molecular biology; 215 (3): 403-410 34 E K Yessoufou, B H Daru, L T Mankga, O Maurin ,and M van der Bank (2013), Incorporating trnHpsbA to the core DNA barcodes improves significantly species discrimination within southern African Combretaceae, Zookeys; 365: 129-147 35 Jinlu Li, Shuo Wang, Jing Yu, Ling Wang ,Shiliang Zhou (2013), "A modified CTAB protocol for plant DNA extraction" Chinese Bulletin of Botany; 48(1): 72 36 Russell ,Nickrent (2008), "Evolutionary relationships in the showy mistletoe family (Loranthaceae)" American Journal of Botany; 95(8): 1015-1029 37 Whitlock BA, Hale AM ,Groff PA (2010), "Intraspecific Inversions Pose a Challenge for the trnH-psbA Plant DNA Barcode" PLoS ONE; 5(7): e11533 38 X Pang, C Liu, L Shi, R Liu, D Liang ,H Li et al (2012), "Utility of the trnH–psbA Intergenic Spacer Region and Its Combinations as Plant DNA Barcodes: A Meta-Analysis" 7(11): Art no e48833 39 Yonghua Li, Jinlan Ruan, Shilin Chen, Jingyuan Song, Kun Luo, Dong Lu ,Hui Yao (2010), "Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique" Journal of Medicinal Plants Research; 4(24): 2706-2709 40 Zainal Muttaqin, R.S.W Budi, Basuki Wasis, Corryanti ,Iskandar Z Siregar (2017), "DNA barcode characterization of mistletoe infestation in teak Clonal Seed Orchard (CSO) in Padangan, East Java Province, Indonesia" Biotropia; 24(2): 140-152 41 Zhang cs (2014), "Molecular Identification of Chinese Materia Medica and Its Adulterants Using ITS2 and psbA-trnH Barcodes: A Case Study on Rhizoma Menispermi" Chinese Medicine; 5(4): 190-198 Tài liệu tiếng latinh 42 Linnaeus C (1762), Species Plantarum ed; 2: 472 43 Jussieu A L (1808), Loranthaceae, Annales du Mus um National d’Histoire Naturelle; 12: 292 44 C Linnaeus (1753), Species Plantarum, 1, London: 110 Tài liệu tiếng Đức 45 Engler A (1919), Syllabus der Pflanzenfamilien, Berlin: 175-177 46 Engler A ,Prantl K (1889), Die Naturlichen Pflanzenfamilien; 3(1), Leipzig: 156-198 Tài liệu tiếng Pháp 47 Lecomte H (1915), Flore Générale de L’ Indochine, 5, Paris, 195 Trang web 48 POWO (2023), 05 May 2023, https://powo.science.kew.org/taxon/550072-1 49 POWO (2023), 05 May https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:550121-1 2023, 50 POWO (2023), 04 May https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:551550-1 2023, 51 POWO (2023), 05 May https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:551499-1 2023, 52 POWO (2023), 05 May https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:551563-1 2023, 53 POWO (2023), 05 May https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:551565-1 2023, 54 WFO (2023), 05 May 2023, http://www.worldfloraonline.org/taxon/wfo0000367152 55 WFO (2023), 05 May 2023, http://www.worldfloraonline.org/taxon/wfo0000366944 56 WFO (2023), 05 May 2023, http://www.worldfloraonline.org/taxon/wfo0001075869 57 WFO (2023), 04 May 2023, http://www.worldfloraonline.org/taxon/wfo0001074735 58 Corperation, MI USA G C Sequencher® version 5.4.6 DNA sequence analysis software: Ann Arbor http://www.genecodes.com/ 59 https://www.nhm.ac.uk/our-science/data/linnaean-typification/search PHỤ LỤC 01 HÌNH ẢNH MẪU TIÊU BẢN CỦA LỒI SCURRULA PARASITICA L TẠI BẢO TÀNG TRÊN THẾ GIỚI Hình A Mẫu lectotype Scurrula parasitica L – Tang ký sinh lƣu trữ Linnean Society of London (Số hiệu 455.1) [59] PHỤ LỤC 02 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN TRNH-PSBA TỪNG MẪU Hình B.1 Kết giải trình tự mẫu QN11 Hình B.2 Kết giải trình tự mẫu QN37 Hình B.3 Kết giải trình tự mẫu QN39 Hình B.4 Kết giải trình tự mẫu QN40 Hình B.5 Kết giải trình tự mẫu QN41 PHỤ LỤC 03 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH LỒI CỦA MẪU NGHIÊN CỨU Hình C.1 Kết giám định lồi mẫu QN11 Hình C.2 Kết giám định lồi mẫu QN37 Hình C.3 Kết giám định lồi mẫu QN39 Hình C.4 Kết giám định lồi mẫu QN40 Hình C.5 Kết giám định loài mẫu QN41