ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Loài Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.), thuộc chi Scurrula, họ Tầm gửi (Loranthaceae) sống bán ký sinh thu thập tại Hà Nội và Hƣng Yên
Mẫu nghiên cứu bao gồm các tiêu bản tươi thu thập từ các chuyến đi thực địa và các tiêu bản khô được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Dược liệu thuộc Viện Dược Liệu, Bộ Y tế.
Mẫu nghiên cứu DNA barcode được thu thập từ lá tươi của các mẫu Mộc vệ ký sinh Đồng thời, nghiên cứu cũng bao gồm mẫu của loài Mộc vệ tàu - Taxillus chinensis (DC.) Dans, loài này ký sinh trên cây Dâu và thường bị nhầm lẫn với các loài khác.
Mộc vệ ký sinh (Scurrula parasitica L.) để so sánh
Bảng 2 1 Thống kê các mẫu vật trong quá trình nghiên cứu
DNA Loài Cây chủ Thời gian thu mẫu Nơi thu Người thu mẫu
1 QN11 Taxillus chinesis Dâu 02/2023 Duy Xuyên, Duy
2 QN37 Scurrula parasitica Chanh 04/2023 Mễ Sở, Văn
3 QN39 Scurrula parasitica Dâu 04/2023 Mễ Sở, Văn
4 QN40 Scurrula parasitica Bưởi 04/2023 Bình Kiều, Khoái
Châu, Hƣng Yên Quỳnh Nga,
5 QN41 Scurrula parasitica Đau xương 04/2023 Ông Đình, Khoái
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xác định tên khoa học của các mẫu thu thập
Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được xác định thông qua phương pháp hình thái so sánh, kết hợp với việc sử dụng các khóa phân loại và bản mô tả gốc của loài Đồng thời, việc đối chiếu tiêu bản thu thập với các tiêu bản lưu giữ tại Viện Dược liệu và các phòng tiêu bản thế giới (thông qua bản ảnh trực tuyến) cũng được thực hiện.
2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Bài viết này mô tả và so sánh các đặc điểm hình thái của các loài thực vật, tập trung vào việc phân tích các cơ quan sinh dưỡng như thân, cành, lá và cơ quan sinh sản bao gồm cụm hoa và quả Các thuật ngữ thực vật được sử dụng theo tiêu chuẩn của Võ Văn Chi (2002) nhằm cung cấp một cái nhìn sâu sắc và chính xác về đặc điểm hình thái của các loài thu được.
2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Mô tả các đặc điểm vi phẫu thu đƣợc từ bộ phận thân và lá
Xây dựng dữ liệu trình tự DNA barcode của loài.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp kế thừa tài liệu
Với đề tài khóa luận này, tôi tập trung tham khảo tài liệu để nắm đƣợc các thông tin cơ bản về:
- Vị trí phân loại và danh pháp của loài;
- Nguồn gốc và vùng phân bố của loài;
- Đặc điểm hình thái và sinh thái của loài;
- Giá trị sử dụng loài
Kế thừa các số liệu và phương pháp nghiên cứu:
- Kế thừa số liệu, kết quả từ các bài báo, các nghiên cứu trong và ngoài nước;
- Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái;
- Các tiêu bản được lưu giữ tại các phòng tiêu bản và bảo tàng
2.3.2 Phương pháp thu mẫu và xử lý
Phương pháp thu mẫu: tiến hành thu mẫu ở thực địa theo nguyên tắc và phương pháp thu mẫu của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [8]
Dụng cụ và xử lý mẫu: bản gỗ p mẫu, túi đựng mẫu, k o cắt cây, giấy báo, dây buộc, etyket, bút chì, bút bi, sổ ghi ch p, cồn, máy ảnh
Nguyên tắc thu mẫu cây bao gồm việc thu thập đầy đủ các bộ phận như thân, lá, hoa và quả tại nhiều địa điểm khác nhau Mỗi mẫu cây được đánh số hiệu và ghi chép cẩn thận trước khi cho vào túi đựng mẫu để mang về phục vụ cho nghiên cứu.
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hình thái
Phương pháp nghiên cứu dựa vào đặc điểm hình thái của cơ quan sinh dưỡng và sinh sản, chủ yếu tập trung vào cơ quan sinh sản do tính chất bảo thủ và ít phụ thuộc vào môi trường Để thực hiện phương pháp này hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và phân loại các mẫu tiêu bản khô tại các phòng lưu trữ mẫu Các bước tiến hành được thực hiện một cách hệ thống và khoa học.
- Tập hợp, phân tích các tài liệu trong và ngoài nước về các loài cần nghiên cứu
Nghiên cứu và phân tích các mẫu tiêu bản được thu thập và lưu trữ tại các phòng tiêu bản trong nước, bao gồm phòng tiêu bản cây thuốc của Viện Dược Liệu và các mẫu thu được từ các đề tài nghiên cứu.
- Mô tả các đặc điểm hình thái
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Nghiên cứu hình thái vi phẫu được thực hiện theo tài liệu kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, một kỹ thuật vi học cho phép quan sát các đặc điểm vi học trên vi phẫu Quá trình này bao gồm việc cắt và nhuộm kép một vi phẫu dược liệu, tạo ra tiêu bản với hai màu khác nhau để phân biệt các mô và tổ chức dưới kính hiển vi Người nghiên cứu cần nhận biết, mô tả các đặc điểm, chụp ảnh và ghi chú lại các thông tin quan trọng.
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu giải phẫu phần lá và thân của các mẫu thu được theo phương pháp của Trần Văn Ơn Phân tích được thực hiện tập trung vào phần thân và lá của các mẫu nghiên cứu, với các bước thực hiện cụ thể.
Cố định mẫu trên thớt và cắt bằng dao lam thành những lát mỏng qua thân, rễ và lá, chú ý cắt thân rễ ngang, rễ chính có thiết diện phù hợp, và lá cắt ngang gân giữa cùng một phần phiến lá từ cuống lá, tránh chọn lá quá già hoặc quá non Sau khi cắt, ngâm mẫu ngay trong dung dịch nước Javen trong 20-30 phút và rửa kỹ qua nước khoảng 3 lần Tiếp theo, ngâm mẫu trong dung dịch acid acetic 1% trong 10-15 phút để trung hòa, sau đó rửa lại với nước Nhuộm mẫu bằng xanh methylene 1% trong khoảng 10-15 giây cho đến khi bám màu xanh, rồi rửa với nước và tiếp tục nhuộm bằng đỏ carmin 0,5% trong khoảng 5 phút cho đến khi thấy bám màu đỏ Cuối cùng, đậy lamen và soi mẫu trên kính hiển vi với các vật kính 4x, 10x, 20x, 40x, đồng thời chụp ảnh lại bằng phần mềm cellSens Entry.
2.3.5 Phương pháp phân tích bột dược liệu
Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu bằng cảm quan: màu sắc, mùi vị
Tiến hành làm tiêu bản bột dược liệu theo phương pháp hiển vi của Nguyễn Viết Thân (2003) bao gồm các bước tách riêng phần thân và lá mẫu, sấy khô ở nhiệt độ 60°C, và tán thành bột mịn Sau đó, rây để lấy bột mịn, dùng kim mũi mác để lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen và quan sát dưới kính hiển vi Cuối cùng, xác định những đặc điểm vi học của bột phần thân và lá của các loài mộc vệ ký sinh thu được và chụp lại ảnh bằng máy ảnh.
Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu bằng cảm quan: màu sắc, mùi vị
2.3.6 Phương pháp tách chiết ADN tổng số và tinh sạch
Sử dụng phương pháp tách chiết bằng bộ đệm CTAB, quy trình bắt đầu bằng việc nghiền 100mg mẫu lá với nitơ lỏng để thu được bột mịn Sau đó, cho bột vào ống tuýp với 1ml đệm CTAB và 20μl β-mercapthoethanol, ủ ở 65°C trong 90 phút, đảo đều sau mỗi 15 phút Tiếp theo, thêm 500μl chloroform, đảo nhẹ và ly tâm ở 13500 rpm trong 15 phút để thu dịch trong Lặp lại quá trình với chloroform và chuyển dịch chiết vào ống tuýp 1,5ml Thêm isopropanol với tỷ lệ 1:1 để kết tủa DNA, ly tâm ở 13500 rpm trong 15 phút để thu DNA kết tủa Sau đó, loại bỏ dịch nổi, rửa kết tủa với 500μl EtOH 70%, và nếu có màu, ngâm kết tủa trong EtOH 70% Cuối cùng, loại bỏ dịch và để kết tủa khô, thêm 50μl TE để bảo quản.
2.3.7 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
ADN tổng số của các mẫu thực vật sẽ được tách chiết và điện di trên gel agarose 1% trong đệm TBE 1X với hiệu điện thế 90V Kết quả sẽ được so sánh với thang chuẩn marker 1kb để kiểm tra chất lượng.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ tại bước sóng 260 và 280nm Dịch chiết được pha loãng để thực hiện kiểm tra.
Trong nghiên cứu này, 100 lần thử nghiệm được thực hiện (bao gồm 5 mẫu và 450 mẫu DDW), với mỗi mẫu được đo ba lần để lấy giá trị trung bình làm kết quả cuối cùng Độ tinh sạch của mẫu được đánh giá qua chỉ số A260/280, với giá trị từ 1,6 đến 2,0 được coi là mẫu tinh sạch Nồng độ ADN của mẫu được tính dựa trên giá trị 1,0 A260 = 50 ng/µl.
2.3.8 Phương pháp khuếch đại vùng trình tự trn H -psb A bằng phản ứng
Bảng 2 2 Trình tự của các mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ - 3’) trnH_F CGCGCATGGTGGATTCACAATCC psbA_R GTTATGCATGAACGTAATGCTC
Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl và được thực hiện trên máy PCR 9700 Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen đích được tóm tắt trong Hình 2.1 Thể tích cụ thể của các thành phần trong phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 2.3.
Hình 2 1 Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân bản vùng trn H- psb A
Bảng 2 3 Thành phần phản ứng PCR nhân bản trn H -psb A sử dụng
STT Thành phần Thể tớch 1 phản ứng (àl) Nồng độ phản ứng
Kết quả PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%, với hiệu điện thế 100V trong 15 phút, sử dụng marker PCRSizer 100bp DNA Ladder (Norgen, Canada) Gel được ngâm trong Ethidium bromide (EtBr) trong 10-15 phút, sau đó kết quả được kiểm tra và chụp ảnh bằng máy soi gel AlphaImagerMINI Nếu băng DNA đích có kích thước đúng, các sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và gửi đi giải trình tự hai chiều tại 1st Base (Malaysia).
2.3.9 Phương pháp xác định loài sử dụng công cụ BLAST
It seems that this video doesn't have a transcript, please try another video.
Các trình tự sẽ đƣợc so sánh trên công cụ BLAST với lựa chọn bộ dữ liệu nucleotide, phương pháp tìm kiếm megablast.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xác định tên khoa học của loài Mộc vệ ký sinh thu hái ở Hƣng Yên
Bài viết phân tích các đặc điểm hình thái thực vật của mẫu Tầm gửi được thu thập, đồng thời so sánh những đặc điểm này với khóa định loại của chi.
Scurrula của Lê Ngọc Hân (2014) khi nghiên cứu phân loại họ Loranthaceae ở
Việt Nam, kết hợp với việc kiểm tra mẫu tiêu bản (và hỉnh ảnh tiêu bản) của loài
Scurrula parasitica L đang được lưu trữ tại một số bảo tàng, phòng tiêu bản:
Kew (K000844724), phòng tiêu bản Trung tâm Tài nguyên Dƣợc liệu-Viện Dƣợc Liệu (NIMM-140719, NIMM-160719),… Tôi kết luận mẫu thu thập đƣợc có tên khoa học là Scurrula parasitica L
Qua kết quả thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra một số thông tin kèm theo loài đƣợc định danh mẫu nhƣ sau:
Tên khoa học : Scurrula parasitica L
Tên Việt Nam : Tầm gửi quả chùy, Mộc vệ ký sinh, Tang ký sinh
Synonym : Loranthus scurrula L 1762 Sp Pl ed 2, 1: 472; Lecomte,
Loc Class : China Typus : Lectotype (LINN, 455.1)
Phân bố : Loài của Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Campuchia, Thái Lan,
Malaysia, Indonesia, Philippines và Việt Nam là những quốc gia có sự hiện diện của cây Tại Việt Nam, cây mọc trải dài từ Lào Cai, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nội, qua Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, cho đến Sông B và thành phố Hồ Chí Minh.
Sinh học và sinh thái : Mùa hoa tháng 10-12, ra quả tháng 12-1 năm sau
Bán ký sinh trên cây Dâu (Morus alba) và các cây thân gỗ, gặp ở mọi cao độ tới 1500m
Cây này có giá trị sử dụng cao trong việc bổ gan thận, tăng cường sức mạnh cho gân cốt và hỗ trợ lợi sữa Ngoài ra, nó còn được dùng để chữa viêm khớp, đau dạ dày, cao huyết áp, và giúp trẻ em phục hồi từ di chứng bại liệt.
Đặc điểm hình thái
Cây thân gỗ sống bán ký sinh có thân tròn, mảnh, thường được bao phủ bởi lớp lông hình sao màu trắng hoặc vàng nâu dày ở các bộ phận non Lớp lông này thưa dần ở các bộ phận trưởng thành, và trên thân cây có nhiều lỗ vỏ.
Hình 3 1 Cây ngoài tự nhiên loài Mộc vệ ký sinh ( Scurrula parasitica L.) Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Hình 3 2 Một đoạn cành cụm, hoa, lá của loài Mộc vệ ký sinh
( Scurrula parasitica L.) Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Lá cây có hình bầu dục, kích thước từ 2,3-9,5 cm chiều dài và 1,0-6,1 cm chiều rộng, với đỉnh tròn hoặc nhọn và gốc lá không dài Mặt trên lá có màu xanh đậm hơn, trong khi mặt dưới có màu xanh nhạt hơn Lá non được bao phủ bởi lớp lông hình sao, nhưng khi trưởng thành thì trở nên nhẵn hơn, chỉ còn lông tập trung ở cuống và gân lá Cuống lá ngắn, dài từ 0,5-1,1 cm, và gân lá hình lông chim, dễ dàng quan sát ở mặt trước nhưng khó thấy hơn ở mặt sau, với 4-5 cặp gân bên.
Hình 3 3 Hình thái và các cấu trúc của lá của loài Mộc vệ ký sinh
1 – Cành mang lá, 2 – Mặt trên lá, 3 – Mặt dưới lá Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Hoa mọc thành cụm ở nách lá, mỗi cụm gồm 2-4 hoa chung gốc, dài 3-3,5 cm Hoa đối xứng mẫu 4, được bao phủ bởi lớp lông hình sao màu trắng hoặc vàng nâu Tràng hoa hợp dưới thành hình ống, dài 1,5 cm khi nở và 2,5 cm khi chưa nở, có màu đỏ - xanh hoặc vàng trắng - xanh, với đỉnh tràng chia 4 thùy hình thuôn nhọn Thùy tràng xẻ đến giữa hoặc 2/3, khi nở nhị xếp về một phía Mỗi hoa có lá bắc hình tam giác với nhiều lông hình sao Nhị 4, chỉ nhị màu đỏ, phần tự do dài bằng 1/3 tổng chiều dài, đầu nhị dẹt chứa nhiều hạt phấn Chỉ nhụy và đầu nhụy tròn, màu đỏ sẫm Bầu hình trái lê, thuôn dần về gốc, có hạt hình lăng trụ 4 góc, màu hồng.
Hình 3 4 Hình thái hoa của loài Mộc vệ ký sinh ( Scurrula parasitica L.)
1 - Vị trí cụm hoa, 2 - Kích thước cụm hoa, 3 - Kích thước bông hoa Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Hình 3 5 Các cấu trúc của hoa loài Mộc vệ ký sinh
1 - Kích thước các bộ phận của hoa, 2 - Đầu nhị, 3 - Lá bắc, 4 - Đầu nhụy,
5 - Bầu Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Quả hình trái lê, nhỏ, dài 0,9-1,5 cm, khi non có màu đỏ - xanh, khi chín có màu đỏ - vàng, đỉnh quả có chứa vết tích của gốc nhụy
Hình 3 6 Các cấu trúc của quả loài Mộc vệ ký sinh
1 - Hình thái quả chín, 2 - Mặt cắt ngang quả chƣa chín, 3 - Mặt cắt dọc quả chƣa chín, 4 - Áo hạt, 5 - Hạt Ảnh: Đào Bích Phương, 2022
Mộc vệ ký sinh có đặc điểm nổi bật là hoa mọc thành cụm với 3-7 bông, lá bắc hình trứng hoặc tam giác Hoa được bao phủ bởi lông hình sao màu trắng đến nâu, kết hợp với lông phân nhánh Quả của loài này có phần gốc thon hẹp, tạo hình giống như cuống quả.
Đặc điểm vi phẫu
Quan sát hỉnh ảnh vi phẫu lá cho thấy:
Gân lá có đặc điểm phía trên hơi lồi và phía dưới lồi nhiều, với biểu bì trên và dưới được cấu tạo từ hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ, xếp đều đặn và được phủ lớp cutin mỏng Dưới lớp biểu bì là một lớp mô dày, trong đó mô mềm gồm các tế bào thành mỏng, hình đa giác hoặc hình trứng Mô mềm chứa các đám mô cứng rải rác quanh bó libe-gỗ, trong khi có ba bó libe-gỗ lớn ở ba gân chính, với cung libe bao quanh bó gỗ ở cả hai phía Cấu trúc gỗ được hình thành từ mạch gỗ xếp xen kẽ trong nhu mô, tạo thành các bó riêng biệt.
Phiến lá có biểu bì trên và dưới được cấu tạo từ một hàng tế bào hình chữ nhật, tương tự như gân lá Mô giậu không rõ ràng, trong khi mô mềm có thể cứng và chứa rải rác các tinh thể canxi oxalate hình khối.
Hình 3 7 Vi phẫu lá của loài Mộc vệ ký sinh ( Scurrula parasitica L.)
(1 - Biểu bì; 2 - Mô dày; 3 - Mô giậu; 4 - Mô mềm; 5 - Mô cứng; 6 - Gỗ; 7 - Tinh thể canxi oxalate; 8 - Libe)
Quan sát hình ảnh vi phẫu thấy:
Mặt cắt của thân hình gần tròn với đặc điểm mặt cắt ngang có thiết diện tròn Lớp bần bao gồm nhiều hàng tế bào xếp thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, bề mặt ngoài được phủ một lớp cutin mỏng Mô mềm vỏ được cấu tạo từ những tế bào hình trứng hoặc đa giác mỏng Trong mô mềm, có sự hiện diện của các đám mô cứng hay đám sợi Libe bao gồm các bó nhỏ, mỗi bó có bó sợi bên ngoài, trong khi tầng phát sinh libe-gỗ không rõ ràng Phần libe-gỗ phát triển rất mạnh, với libe nằm ở phía ngoài và phần gỗ phía trong được sắp xếp thành dải Ở trung tâm là mô mềm ruột, được tạo thành từ các tế bào hình tròn hay đa giác lớn với thành mỏng, rải rác có chứa các tinh thể canxi oxalate hình khối.
Hình 3 8 Vi phẫu thân của loài Mộc vệ ký sinh ( Scurrula parasitica L.)
(1 - Bần; 2 - Mô mềm vỏ; 3 - Bó sợi; 4 - Libe; 5 - Gỗ)
Đặc điểm bột dƣợc liệu
Bột thân và cành của Mộc vệ ký sinh chứa các thành phần quan trọng như: mảnh biểu bì có lỗ khí, mô mềm, tế bào sợi thành dày, tinh bột, bần, mạch điểm, mảnh mạch vòng, mảnh mang màu, tinh thể canxi oxalate, và lông che chở hình sao.
Hình 3 9 Đặc điểm bột thân của loài Mộc vệ ký sinh
Bột lá Mộc vệ ký sinh chứa các thành phần chính như mảnh mô mềm với các tế bào hình đa giác có chứa tinh thể canxi oxalate và bó sợi.
(3) - Mảnh mạch vòng, (4) - Mạch điểm, (5) - Tinh bột, (6) - Biểu bì, (7) - Mảnh mang màu, (8) - Tinh thể canxi oxalate, (9) - Lông che chở hình sao.
Hình 3 10 Đặc điểm bột lá của loài Mộc vệ ký sinh
Xác định loài dựa trên chỉ thị trnH-psbA
3.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số và khuyếch đại vùng gen trn H -psb A 3.4.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
Hình 3 11 Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số
Kết quả tách chiết DNA tổng số các mẫu được trình bày trong Hình 3.11 Sử dụng phương pháp tách chiết DNA của Doyle&Doyle, mẫu DNA sau khi điện di hiện rõ băng trên ảnh soi gel Để xác định hàm lượng và độ tinh sạch, ADN tổng số được đo mật độ quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm.
Bảng 3 1 Kết quả đo OD các mẫu nghiên cứu
Mẫu DNA cont (ng/àl) A260/280
QN41 174 2,1 λ 300ng QN11 QN37 QN39 QN40 QN41 λ 30ng
Kết quả phân tích cho thấy các mẫu đạt độ tinh sạch cao với tỷ lệ A260/280 từ 1,5 đến 2,1 Nồng độ DNA tổng số trong các mẫu dao động từ 95 đến 175 ng/µl, đảm bảo tiêu chuẩn và chất lượng cho các bước tiếp theo.
3.4.1.2 Kết quả khuyếch đại vùng trn H -psb A
Hình 14 hiển thị kết quả điện di của sản phẩm PCR nhân bản vùng trình tự trnH-psbA từ các mẫu nghiên cứu Các băng DNA thu được rõ nét, không có băng phụ và đạt đúng chiều dài thiết kế.
Hình 3 12 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng trn H -psb A của các mẫu nghiên cứu
Phusion polymerase đã thể hiện hiệu quả đáng kể khi đã nhân bản thành công đƣợc 5 mẫu (Hình 3.12) Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ƣu nồng độ
Ladder 1kb QN11 QN37 QN39 QN40 QN41
DNA khuôn đã cho thấy rằng chúng tôi đã thu được băng DNA đích với sản phẩm PCR đạt nồng độ cao, đủ điều kiện cho phản ứng giải trình tự.
3.4.2.Kết quả giải trình tự
Giải trình tự thành công gen PCR trnH-psbA của 5 mẫu nghiên cứu cho thấy các gen lục lạp có tính bảo thủ và di truyền đơn dòng, dẫn đến hiệu suất giải trình tự ổn định Kết quả cho thấy các đỉnh tín hiệu rõ ràng, không nhiễu và không có đỉnh phụ Hình ảnh giải trình tự của 5 mẫu được trình bày trong phụ lục 2.
Hình 3 13 Điện di đồ một đoạn trình tự trn H -psb A của các mẫu
A Mẫu QN11; B Mẫu QN37; C Mẫu QN39; D Mẫu QN40; E Mẫu QN41
Kết quả giải trình tự cho thấy vùng trnH-psbA là một chỉ thị tiềm năng, có thể ứng dụng trong mã vạch phân tử để nhận diện hai loài Taxillus chinensis và Scurrula parasitica.
3.4.3 Kết quả xác định loài dựa trên công cụ BLAST
Phần mềm Geneious Prime đã được sử dụng để hiệu chỉnh trình tự DNA, sau khi ghép nối, các trình tự này đã được tìm kiếm trên hệ thống BLAST Kết quả xác định loài từ bảng 3.2 cho thấy mức độ tương đồng 100% giữa DNA barcode của 5 mẫu nghiên cứu và các trình tự trên NCBI Điều này chứng tỏ rằng các trình tự vùng trnH-psbA khuếch đại của 5 mẫu nghiên cứu có sự tương đồng cao với các trình tự đã được công bố trên NCBI của Taxillus chinensis và Scurrula parasitica, đồng thời phù hợp với kết quả xác định tên khoa học dựa trên đặc điểm hình thái.
Bảng 3 2 Đánh giá mức độ tương đồng và bao phủ của trình tự DNA vùng trn H -psb A của các mẫu nghiên cứu với trình tự tương ứng trên NCBI
Mẫu Loài tương đồng Độ tương đồng (%) Độ bao phủ (%)
Giá trị mong đợi (E value)
BÀN LUẬN
Dƣợc điển Việt Nam V (2017) đã mô tả đặc điểm vi phẫu bột của loài
Scurrula parasitica L có bột dược liệu bao gồm các mảnh bần và mành biểu bì chứa lỗ khí, với kích thước lỗ khí khoảng 25 µm theo chiều dọc Mảnh mụ mềm chứa tế bào lớn, thành mỏng, trong khi mảnh phiến lá có tế bào mô cứng dày chứa tinh thể calci oxalat, sợi có thể tồn tại riêng lẻ hoặc tập trung thành từng đám Các mảnh mạch bao gồm mạch điểm, mạch vạch và mạch vòng Tinh thể calci oxalat có hình khối, thường hơi vuông với kích thước khoảng 29 µm, trong khi hạt tinh bột có đường kính khoảng 20 µm, có thể có rốn hạt dạng điểm hoặc phân nhỏ, và đôi khi có hạt phấn ba cạnh.
Nhƣ vậy về cơ bản, đặc điểm vi phẫu bột của loài Scurrula parasitica L trong nghiên cứu này trùng khớp với bản mô tả trong Dƣợc điển Việt Nam V
Nghiên cứu năm 2017 đã bổ sung một đặc điểm mới chưa được đề cập trong Dược điển Việt Nam V, đó là sự hiện diện của lông hình sao Lông hình sao xuất hiện trong bột thân, cành và bột lá của loài, phù hợp với mô tả hình thái loài trong các tài liệu đã công bố và trong nghiên cứu này.
Kết quả xác định DNA barcode ở loài Scurrula parasitica cho thấy gen trnH-psbA là mã vạch hiệu quả, với sự tương đồng 100% so với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen Điều này khẳng định trnH-psbA là chỉ thị đáng tin cậy trong công tác kiểm định loài.
Các nghiên cứu về loài Mộc vệ ký sinh vẫn còn đang trong giai đoạn phát triển và cần được khai thác tiềm năng Để tiến hành nghiên cứu, việc xác định chính xác loài là rất quan trọng, từ đó mới có thể thu thập mẫu, kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu Việc xác định tên khoa học của cây, cùng với các đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu và DNA barcode, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển cây thuốc Kết quả nghiên cứu sẽ tạo ra cơ sở dữ liệu hữu ích, hỗ trợ cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Qua quá trình thu thập mẫu và nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu (thân và lá), cũng như DNA barcode của loài Mộc vệ ký sinh trên một số cây chủ tại Hưng Yên và Hà Nội, chúng tôi đã đạt được những kết quả đáng chú ý.
Xây dựng dữ liệu chi tiết về đặc điểm hình thái của loài Mộc vệ ký sinh, bao gồm hình ảnh minh họa Loài này được phân biệt bởi các đặc điểm nổi bật như hoa mọc thành cụm từ 3-7 hoa, lá bắc có hình dạng từ trứng đến tam giác, và hoa được bao phủ bởi lông hình sao có màu trắng đến nâu Đặc biệt, quả của loài này có phần gốc thon hẹp, tạo nên cấu trúc giống cuống quả.
Xây dựng dữ liệu chi tiết về đặc điểm vi phẫu của thân, lá, phiến lá, gân lá và bột dược liệu, kèm theo hình ảnh minh họa Qua đó, bổ sung thông tin về đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu của loài cho dược điển Việt Nam.
Việc xây dựng dữ liệu và mã vạch vùng gen trnH-psbA đóng vai trò quan trọng trong việc định danh và xác định tính đúng của các loài Trình tự ADN barcode có độ dài hơn 200 bp, và kết quả giải trình tự cho thấy vùng trnH-psbA là một chỉ thị tiềm năng, có khả năng ứng dụng trong mã vạch phân tử để nhận diện hai loài Taxillus chinensis và Scurrula parasitica.
Các kết quả này đóng góp vào việc xây dựng bộ dữ liệu nhằm xác định và kiểm định tính chính xác của loài Mộc vệ ký sinh và Dƣợc liệu Tang ký sinh tại Việt Nam.
Trong thời gian tới, cần tiếp tục nghiên cứu các loài Tầm gửi thường bị nhầm lẫn với Scurrula parasitica Việc này sẽ giúp xây dựng bộ dữ liệu phục vụ cho công tác so sánh, đối chiếu và kiểm định tính chính xác của dược liệu.