Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành biofilm của bacillus subtilis được phân lập trong hợp chất polyme ngoại bào

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH HÀ THƯƠNG NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC PHÂN LẬP TRONG HỢP CHẤT POLYME NGOẠI BÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà Nẵng – Năm 2021 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 16990037823161000000 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH HÀ THƯƠNG NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC PHÂN LẬP TRONG HỢP CHẤT POLYME NGOẠI BÀO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ ĐÔNG PHƯƠNG Đà Nẵng – Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nghiên cứu hồn thiện luận văn này, lời tơi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến người cô trực tiếp bảo hướng dẫn suốt trình nghiên cứu hồn thành luận văn TS Nguyễn Thị Đơng Phương Ngồi tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng giảng dạy cho nhiều kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu quý báu Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới Thầy, Cô môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật – Đại học Đà Nẵng tạo điều kiện hỗ trợ suốt q trình làm nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình học tập nghiên cứu Đà Nẵng, tháng năm 2021 Học viên Đinh Hà Thương LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Đông Phương Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2021 Học viên Đinh Hà Thương NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC PHÂN LẬP TRONG HỢP CHẤT POLYME NGOẠI BÀO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Họ tên học viên: Đinh Hà Thương Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Đông Phương Cơ sở đào tạo: Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng Tóm tắt: Bacillus subtilis (B subtilis) vi khuẩn có lợi ứng dụng nhiều vào lĩnh vực môi trường chế phẩm vi sinh xử lý nước thải, vào dược phẩm sản phẩm trị tiêu chảy, vào trồng chất cố định đạm hay ức chế vi khuẩn làm thúi gốc, rễ trồng, vào phân bón…mà mơi trường sở hữu yếu tố khắc nghiệt độ pH, độ mặn…Những nghiên cứu luận văn thực để cung cấp thêm thông tin khoa học yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hình thành biofilm B subtilis phân lập hợp chất polyme ngoại bào Kết nghiên cứu cho thấy: B subtilis phân lập có khả sinh biofilm mơi trường lỏng rắn Từ đó, khảo sát B subtilis MT300402 có khả sản xuất màng sinh học mơi trường có pH khoảng pH từ 6,5 – 8,0 sống sót điều kiện muối lên đến 4% (w/v) Trong thời gian tới, đề nghị tiếp tục nghiên cứu, xác định gen mã hóa hình thành biofilm xác định thành phần mơi trường dinh dưỡng lý tưởng cho việc hình thành biofilm chủng B subtilis phân lập từ nước thải thủy hải sản Từ ứng dụng vào sản xuất thực tế Từ khóa: màng sinh học, Bacillus subtilis, hợp chất polime ngoại bào, nồng độ muối, độ pH Xác nhận giáo viên hướng dẫn Người thực đề tài Đinh Hà Thương INVESTIGATION OF EFFECTS ON THE GROWTH AND BIOFILM PRODUCTION OF BACILLUS SUBTILIS ISOLATED FROM EXTRACELLULAR POLIMERIC SUBSTANCE Major: Experimental biology Full name of Master student: Đinh Ha Thuong Supervisor: Nguyen Thi Dong Phuong, Ph.D Training Insitution: The University of Da Nang – University of Education Abstract: Bacillus subtilis (B subtilis) is a non-pathogenic bacteria that is widely used in environmental applications such as microbial preparations for wastewater treatment, in pharmaceuticals such as anti-diarrheal products, in plants as a nitrogen fixer or as an inhibitor of inhibiting bacteria that cause root rot, and fertilizers, etc., which have harsh factors such as pH, salinity, nutrient ingredients etc The studies in the thesis were carried out to provide more scientific information such as factors affecting growth and biofilm formation of B subtilis isolated in extracellular polymeric substances Research results pointed out that isolated B subtilis with accession number MT300402 is capable of producing biofilm in both liquid and solid media In addition, it was investigated that B subtilis MT300402 has the ability to produce biofilm in an environment with pH in the range of 6.5 - 9.0 and can survive in salt conditions up to 4% (w/v) In the coming time, it is proposed to continue to research, identify genes encoding biofilm formation as well as determine the ideal nutrient medium composition for biofilm formation of B subtilis strains isolated from aquatic wastewater, seafood From there apply to actual production Key word: biofilm, Bacillus subtilis, extracellular polymeric substance (EPS), salt concentration, pH concentration Supervior’s confirmation Student Đinh Hà Thương MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể 3 Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4 Bố cục đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Tổng quan Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Tổng quan biofilm 1.2.1 Quá trình hình thành màng sinh học .8 1.2.2 Thành phần màng sinh học .11 1.2.3 Ứng dụng biofilm 14 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành biofilm 17 1.3.1 Nhiệt độ 17 1.3.2 Độ pH .18 1.3.3 Độ muối 19 1.3.4 Tính chất bề mặt giá thể 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng 21 2.2 Nội dung nghiên cứu .21 2.3 Hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu .22 2.3.1 Hóa chất 22 2.3.2 2.4 Dụng cụ, thiết bị .22 Phương pháp pháp nghiên cứu .22 2.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu biofloc vi tảo nuôi nước thải thủy hải sản 22 2.4.2 Xác định tính chất sinh hóa B subtilis nghi ngờ 25 2.4.3 Định danh .27 2.4.4 Đánh giá khả đối kháng B subtilis với E.Coli .28 2.4.5 Xác định khả hình thành biofilm 32 2.4.6 Xác định ảnh hưởng nồng độ muối pH đến phát triển hình thành biofilm B subtilis phân lập 33 2.5 Phân tích hình ảnh cộng đồng vi khuẩn biofilm kính hiển vi điện tử quét (SEM) 34 CHƯƠNG 36 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu biofloc vi tảo nuôi nước thải thủy hải sản 36 3.1.1 Phân lập vi khuẩn 36 3.1.2 Đánh giá khả đối kháng B subtilis với E Coli .40 3.2 Xác định đặc tính sinh biofilm B subtilis phân lập 43 3.2.1 Đường thẳng liên hệ sinh trưởng B subtilis phân lập (KL12) mật độ quang .43 3.2.2 Thử nghiệm đặc tính sinh biofilm KL12 43 3.2.3 Phân tích quần thể vi khuẩn lớp màng sinh học kính hiển vi điện tử quét (SEM) 46 3.3 Xác định ảnh hưởng ph nồng độ muối đến phát triển hình thành biofilm B subtilis phân lập 48 3.3.1 Xác định ảnh hưởng pH đến phát triển hình thành biofilm B subtilis phân lập .49 3.3.2 Xác định ảnh hưởng nồng độ muối đến phát triển hình thành biofilm B subtilis phân lập .52 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 PHỤ LỤC 72 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát kính hiển vi Hình 1.2 Cơ chế hình thành biofilm vi sinh vật phù du Hình 2.1 Kỹ thuật phân lập 24 Hình 2.2 Kháng khuẩn dựa theo phương pháp khuếch tán 29 Hình 2.3 Các giai đoạn phát triển vi sinh vật 30 Hình 2.4 Sơ đồ pha loãng mẫu 31 Hình 2.5 Ống nghiệm nuôi cấy qua đêm máy lắc 333 Hình 2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn biofilm cách pha lỗng trãi lên mơi trường LBA, xác định mật độ vi khuẩn CFU/ml 34 Hình 3.1 Các khuẩn lạc mọc lên bề mặt mơi trường LBA 36 Hình 3.2 Taxanomy chủng định danh 38 Hình 3.3 Khả kháng khuẩn B subtilis phân lập đối kháng E coli ATCC25922 40 Hình 3.4 So sánh tính đối kháng vi khuẩn B subtilis phân lập từ EPS B subtilis có nguồn gốc phân lập từ đất 42 Hình 3.5 Mối quan hệ sinh trưởng KL12 mật độ quang bước sóng 600nm 43 Hình 3.6 a Biofilm tạo thành bề mặt môi trường rắn LBA KL12; b Biofilm tạo thành bề mặt môi trường lỏng LB KL12 44 Hình 3.7 Cấu trúc màng sinh học quan sát kính hiển vi điện tử quét SEM 47 Hình 3.8 Mật độ vi khuẩn B subtilis lớp màng sinh học 49 Hình 3.9 Sự thay đổi nồng độ muối ảnh hưởng đến việc sản xuất màng sinh học chủng B subtilis MT300402 52 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc tính sinh hoá đặc trưng vi khuẩn B subtilis 37 Bảng 3.2 Kết giải trình tự kí gửi liệu ngân hàng Genome.39 Bảng 3.3 Sự hình thành màng sinh học theo thay đổi pH môi trường dinh dưỡng 50 Bảng 3.4 Sự ảnh hưởng nồng độ muối đến sản xuất màng sinh học KL12 môi trường rắn LBA 54 BAI HQC DA NANG CQNG HOA xA HQI cnu NGHiA V~T NAM TRUONG D~I HQC SU PH~M DQc I~p - T\f - H~nh phuc s6:M4IQD-DHSP £Ja Nang, ngayi5thang b nam 202 I QDYETDJNH v~vi~c I~p HQi dAng chim lu~n van thac si HIED TRUONG TRUONG DAI HOC SU PHAM - DAI HOC DA NANG Can ctr Nghi dinh s6 321CP 041411994 cua Chfnh ph!', vJ viec ldp Dai hoc D« Nang; Can ctr Quyet dinh s6 2762IQ£J-H£J£JN 141812020 cua ci« tich Hri a6ng Dai hoc Da Nang vJ viec Ban hanh Quy chi t6 chuc va hoat dong Dai hoc £Ja Nang; Can CLCThong tu s6 1512014ITT-BGD£JT 151512014 cua va Dao tao vJ viec ban hanh Quy chi Dao tao trinh thac sf,' ar Br Giao due Can ctr Quyet dinh s6 1060IQD-£JHSP 01/1112016 cua Hieu truong Truong Dai hoc Sicph am - Dai h9C £Ja Nang vJ viec ban hanh Quy dinh dao tao trinh ar thac sf,' Xet aJ nghi cua Truong phong Phong Dao tao QVYETDJNH: Di~u Thanh lap HQi dong chfrm lu~n van thc l~p - T\l' - H~nh p hu c DA NANG TRUONG D~I HQC SU PH~M DANH SACH THANH VIEN HOI DONG CHAM LU~N VAN TH~C st (Thea Quytt dinh ldp H(;i dong s6 39!iIQD-DHSP d5 thong b nam 202 J cua Hieu truong Truong Dai h9C Su pham- DHDN) - HQc vien thuc hien: Dinh Hit Thuong - Ten d~ tai: Nghien ctru anh hutrng cua m{>tsa y~u ta d~n s,! hinh biofilm cua Bacillus subtilis dlfQ'Cphan l~p hop ch§t polyme ngoai bao, - Nguoi huang dftn: TS Nguyin Th] Dong Phuong TRAcHNHI~M STT HQ vA TEN, Nffi CONG TAc TRONGHOI DONG TS, VO Chau Tuan l 2, Chil tich HD Truong Dai h9C Su pham - DHDN TS Trinh Dang Mau ThukyHD Truong Dai h9C Sir pham - DHDN TS Pharn Thi My TS VG Thi Bich H~u Phan bien Truong Dai h9C Sir pham - DHDN Phan bien SO'Khoa hoc Cong nghe TP Da Nang TS Nguyen Dire Huy 5, f)~i h9C Hu~ H9i d6ng g6m c6 vien~ Uy vien HD Di}.I HOC DA NANG TRU'ONG Di}.I HOC SU PHi}.M HO sa H(H DONG CHAM LU~N VAN TH~C sr H(le vien: Dinlt H(I Thuong Bien ban H(>i dong I:{ Bang di~m cua hoc vien cao hoc IIZI Ly.lich khoa hoc cua hoc vien l!{ Bien ban kiem phieu Phi~u ghi noi dung diu hoi va tra 16'icua hoc vien g Nhan xet G( Phi~u ch:1m diem ~ HO vA TEN STT TS VO Chau TU:1n TS Trinh Dang M~u ThukjHD TS Pham Thi My ria« bien TS TS Nguyen Dire Huy TS Nguyen Thi Dong Phuong Blch H~u Ban Phiiu ili~m nhlin xet v Chit tich HD vu Thi NH~NXET TRAcHNHI~M TRONGHQI DONG I/' V \/ v' v/ Ph an bien V Uy vien / N'guoi huang ddn t/ t/' V r= Do Nang, ngoyll thangb namsra Thu ky H(>i d6ng CONG HoA XA HOI CHU NGHiA VI~T NAM DQc I~p - Tl)' - Hanh phuc D~I HQC DA NANG TRUONG D~I HQC SU PH~M BIEN BAN HQP HOI DONG CHAM LU~N VAN TH~C st Ten d~ tai: Nghien ciru anh huong cua mot s6 y~u t6 den SlJ hinh biofilm cua Bacillus subtilis duoc phan l~p hop chllt polyme ngoai baa Nganh: Sinh hoc thuc nghiern Lap K38.SHTN Thea Quyet dinh l~p HQi dong cham luan van thac Sl s6 jjCfQD-DHSP {&thang (; nam WI 14 Ngay hQP HQi dong: ngayZ6 thang Ob nam 2-0 Danh sach cac vien HQi dong: CUONG VI TRONG HOI DONG HQ vA TEN STT l TS V5 Chau Tulln Chll tich TS Trinh Dang M~u Thuky TS Pham Thi My TS TS Nguyen Dire Huy vu Thi Phim bien Phan bien Bich H~u a Thanh vien co mat: :&::_, -""'~' Uy vien _ b Thanh vien vang mat: _ _,O:, ===-_ Thu ky HQi dong baa cao qua trinh hQCtap, nghien ciru cua hoc vien cao hQCva dQC ly lich khoa hoc (co van ban kem thea) HQc vien caa hQc trinh bay lu~n van Cac phan bi~n dQc nh~n xet va neu cau hoi (co van ban kem thea) HQc vien caa hQc tra Uricac cau hoi clla vien HQi d6ng 10 HQi d6ng hQp rieng d~ danh gia 11 Truong ban ki~m phi~u cong b6 k~t qua 12 K~t lu~n clla HQi d6ng a) K~t lu~n chung: b) Yeu du chinh, sua ve noi dung: - - c) Cac y ki€n khac: d) Di~m danh gia: B~ng s6: 13 Tac gift luan van phat bien 1; &lJ B~ng chfr: y ki€n 14 Chu tich Hoi dong tuyen b6 b€ mac THV KY nor DONG CHU TICH H(H DONG Cngnhu m(>tprobiotic nhien dSu chua co d§,nchUng tai li~u tham kh~tOClfth~ III Phuong phap nghien ciru Cac phuong phap nghien elm co ban bam sat yeu cau, mang tinh k~ thira va co co sa khoa hoc Tai phan thir nghiem kha nang d6i khang B subtilis, e~n giai thieh ly dieu ehinh, cai tien phuong phap thir tinh d6i khang so voi phirong phap chuan cua Moore (2013) va Sertae (2014) C~n mo ta r5 cac phuong phap nghien elm cac nQi dung da thirc hien, chir khong phai hinh anh cac phuong phap IV K~t qua nghien ciru Cac k~t qua nghien elm duoc trinh bay theo nQi dung nhimg e~n phai trinh bay chi ti~t han K~t luan dam bao ngan gon, d~y du thong tin, bam sat theo muc tieu luan van d~ V Hinh thirc lu~n van Luan van duoc trinh bay dap ung yeu e~u Tai lieu tham khao tuong d6i phong phu, e~n trieh din tai li~u eho phil hqp han LUll y each danh s6 cae chuang b~ng s6 la rna thay vi s6 d~m va th6ng nh~t format cae mve, can ehinh hang cae d~ mve eho hqp lY (Vi dv nhu tC;li"Chuang 2: £>6ituqng, phC;lmvi, nQi dung nghien elm" e~n dUQ'ecan ehinh eho tu "elm" khong bi xu6ng dong; Ph~n mve IVe e~n th6ng nh~t in d~m cae d~u mve, tiSu mve ) B6 sung danh mve vi~t t~t eho mQt s6 tu vi~t t~t nhi~u l~n lu~n van VI Danh gia chung Co ban dam bilO mve tieu, nQi dung d~ Lu~n van e~n ehinh sua, hoan thi~n theo cae gop y a tren Da Nang, 24 thang nam 2021 NgU'iri nh~n xet TS Vii Thi Blch H~u ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc BẢN TƯỜNG TRÌNH BỔ SUNG, SỬA CHỮA LUẬN VĂN Họ tên học viên: ĐINH HÀ THƯƠNG Ngành: Sinh học thực nghiệm Khóa: 38 Tên đề tài luận văn: “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hình thành biofilm Bacillus subtilis phân lập hợp chất polyme ngoại bào” Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Đông Phương Ngày bảo vệ luận văn: 26/06/2021 Sau tiếp thu ý kiến Hội đồng bảo vệ luận văn họp ngày 26/06/2021, chúng tơi giải trình số nội dung sau: 1.Những điểm bổ sung, sửa chữa: - Tính cấp thiết đề tài: bổ sung, chỉnh sửa: “Nguyễn Như Ngọc cộng phân lập chủng Bacillus NT1 có khả phân giải hợp chất hữu xylan, cellulose, tinh bột, protein ứng dụng xử lý nước thải giảm COD từ 80 đến 90%[1] Ngoài sinh tổng hợp enzyme ngoại bào, khả tạo màng sinh vật (biofilm) Bacillus xem tiềm xử lý nước thải Biofilm tập hợp gồm nhiều tế bào vi sinh vật gắn kết với bề mặt giá thể, giúp hỗ trợ loại bỏ chất ô nhiễm nhanh hơn, hiệu dạng sống tự vi khuẩn Nghiên cứu Morikwa tế bào vi sinh vật sống biofilm liên kết với nhau, chống lại tác động yếu tố bất lợi môi trường sống thiếu chất dinh dưỡng, tác dụng chất kháng khuẩn, nhiệt độ cao tốt so với tế bào sống tự do[62] Ở Việt Nam cơng trình nghiên cứu, phân lập, định danh B subtilis chủ yếu từ đất, tài liệu yếu tố độ pH hay độ mặn môi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng B subtilis cịn Trong đó, nước ni thủy hải sản chứa nguồn vi khuẩn lớn, điều kiện môi trường khắc nghiệt so với môi trường truyền thống dùng để tăng sinh vi khuẩn độ pH nhỏ cao 7.0 chứa nhiều hợp chất vô hữu cơ, độ mặn cao, kết hợp với việc xử lý nước thải vi tảo nguồn nguyên liệu dồi để nghiên cứu, phân lập B subtilis ứng dụng B subtilis vào chế phẩm mà chưa quan tâm nhiều.” - Dụng cụ, thiết bị: đưa vào phần phụ lục - Phương pháp nghiên cứu: rút gọn - Kết thảo luận: lượt bỏ phần trùng lặp với nội dung phương pháp nghiên cứu - Chỉnh sửa số lỗi tả, trích dẫn tài liệu tham khảo Những điểm bảo lưu ý kiến, khơng sửa chữa, điều chỉnh (nếu có) lý sau: Trước bắt đầu thí nghiệm nghiên cứu vi sinh vật bất kì, đường chuẩn hiệu chỉnh mối quan hệ sinh trưởng chúng với mật độ quang bước sóng 600nm phải xây dựng, nhằm xử lý số liệu tính chất chúng ngày tiến hành thí nghiệm chúng Ví dụ, xây dựng đường liên hệ sinh trưởng B subtilis mật độ quang bước sóng 600nm, tiến hành thao tác tăng sinh để chuẩn bị cho thí nghiệm tính kháng khuẩn, yếu tố ảnh hưởng đến khả sản xuất màng sinh học B subtilis, ta tiến hành đo mật độ quang bước sóng 600nm để tính mật độ vi khuẩn có mẫu Vì thế, kết quan trọng bước đầu xác đính đặc tính khác B subtilis, nên không điều chỉnh vào phụ lục Đà Nẵng, ngày 05 tháng 09 năm 2021 Học viên Cán hướng dẫn xác nhận Đinh Hà Thương - Đã kiểm tra luận văn lỗi sau chỉnh sửa - Đã kiểm tra thông tin luận văn tiếng Việt tiếng Anh Xác nhận BCN Khoa Xác nhận luận văn sau chỉnh sửa đồng ý cho học viên nộp lưu chiểu