NGUYỄN VĂN CƯỜNG (Chủ biên)
NGUYỄN NGỌC TUẤN - PHẠM THỊ HỒNG PHƯỢNG
LÊ TIẾN DŨNG - VŨ ĐÌNH HỒNG - TRẦN ĐÌNH THẮNG
TACH CHIET VA PHAN LAP
CAc HOP CHAT THIEN NHIEN CO H0ẠT TÍNH SINH HỤC
Trang 2
NGUYÊN VĂN CƯỜNG (chủ biên)
NGUYÊN NGỌC TUẦN - LE TIEN DUNG - PHAM THI HONG
PHUONG - VU DINH HOANG - TRAN DiNH THANG
TACH CHIET VA PHAN LAP CAC
HOP CHAT THIEN NHIEN CO
HOẠT TÍNH SINH HỌC
——
@ ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM — _ ; THƯ VIỆN
MA VÀCH:
Trang 3
Lời nói đầu
Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học có nguồn góc từ các nguôn khác nhau, chẳng hạn như thực vật, nắm, địa y, vi sinh vat, sinh vật biển, đã trở thành một phân không thé thiếu của y học
ngày nay Chúng đã được sử dụng rộng rãi như một nguon thuốc từ
thời cổ đại dưới nhiều hình thức khác nhau trong y hoc c6 truyén
Ngày nay, trong y học ching, ta cũng đang sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên hoặc các hợp chất hoạt tính sinh học có ngn góc thiên để bảo vệ sức khỏe Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên bao gồm alkaloid, glycoside, polyphenol, saponin, tannin,
terpenoit va tinh dâu Đáng chú ý, các hợp chất thiên nhiên cải thiện
sức khỏe của con người mà không gáy tác dụng phụ bắt lợi so với các loại thuốc tổng hợp Ngoài ra, chúng tương đổi rẻ hơn và dễ dàng có sẵn
Các hợp chất thiên nhiên thể hiện tính đa dang voi cdc cấu trúc phân từ đặc biệt và có thê ẩược sử dụng như chất dẫn đường trong tông hợp và bán tong hợp thuốc đề tăng hoạt tính sinh học Các hợp chất
thiên nhiên có hoạt tính sinh học được chiết xuất bằng cách sử dung các kỹ thuật chiết xuất khác nhau Có hai phương pháp chiết xuất
chính được sử dụng cho các hợp chất có hoạt tính sinh học: phương pháp cô điển và phương pháp hiện đại Các : phương pháp cô điên bao gồm chiết soxhlet, ngâm dâm, ngâm chiết thấm, ham, stic, hap và chung cất lôi cuốn hơi nước Các phương pháp hiện đại hay còn
là phương pháp xanh như: chiết xuất bằng song siéu dm, enzym, vi
sóng và điện trường, chiết chất lỏng có áp suất và chiết chất lỏng siêu tới hạn
Nhìn chung, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học biêu hiện hiệu quả khác nhau trong việc điều trị các vấn đề sức khỏe con người Các hợp chất hoạt tính sinh học này thể hiện các hoạt động
dược lý phong phú, bao gồm các đặc ¡ tính kháng khuẩn, hoạt động chống viêm, hoạt động kích thích miễn dịch, hoạt động chống ung
thư, hoạt động chống oxy hoi Hoat tinh sinh hoc cua hop chất từ
thiên nhiên được xác định bằng cách sử dụng thứ nghiệm in vitro và
in vivo Tuy nhién, thuốc có ngn sốc từ thiên nhiên phải vượt qua
Trang 4
cúc thủ nghiệm lâm sàng đề được đưa vào sử dụng Từ năm 1981
đến năm 2019, có 1881 hợp chất từ thiên nhiên hoặc bán tổng hợp
được sử dụng như thuốc chữa các bệnh: ưng thư (24 7), tiểu đường
(63), tác nhân đa xơ cứng (13) tăng nhãn áp (19), chong viêm (53),
chồng ký sinh trùng (20), kháng vi rút (186), kháng nắm (34), kháng khuân (162)
Nhằm đáp ứng nhu cầu giảng dạy, học tập cho sinh viên đại học và
sau đại học ngành Cơng nghệ Kỹ thuật Hóa học - Trường đại học
Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, nhóm tác giả đã biên soạn giáo trình nay lam tài liệu học tập đồng thời cũng là tài liệu tham khảo cho các
nhà nghiên cứu, sinh viên đại học và sau đại học nghiên cứu hóa học và dược lý học của các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
Nội dung giáo trình bao gơm: 7 chương Chương 1: Mở đâu:
Chương 2: Kỹ thuật chiết tách các hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính sinh học;
Chương 3: Các kỹ thuật phân lập các hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính sinh học;
Chương 4: Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguon sốc từ
thực vật;
Chương 5: Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn sốc từ
sinh vật biên;
Chương 6: Phân lập các hợp chất thiên nhiên có ngn gốc từ vi
sinh vat;
Chương 7: Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ nấm Trong quá trình biên soạn giáo trình khó tránh khỏi thiếu sót, nhóm
tác giả rất mong nhận được ý kiên đóng góp xây dựng của quý độc
gia đê giáo trình được hồn chỉnh hơn trong các lân tái bản sau
Thư góp ý xin gưi về địa chỉ email: nve@iuh.edu.vn
Trang 5MỤC LỤC
Chương 1 Mở đầu tết
1.1 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh họ
1.1.1 Lịch sử phát triển - Khái niệm
1.1.2 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn được liệu phong phú của Việt Nam
1.2 Tách chiết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.2.1 Mục tiêu của việc tách chiết các hợp chất thiên nhiên
2.2 Các kỹ thuật tách chiết
1.3 Phân lập các hợp chất thiên nhỉ hoạt tính sinh họ:
1.4 Thir ngl hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên 1.4.1 Khái
1.4.2 Phân loại thử nghiệm hoạt tính sinh hoc
1.4.3 Một số nguyên tắc cơ bản trong tìm kiếm sàng lọ chất có hoạt tính sinh học
1.4.4 Các xu hướng chính trong nghiên cứu tìm kiêm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học
Tài liệu tham khảo
Chương 2 Kỹ thuật chiết
hoạt tính sinh học Giới thiệu chung
Các quá trình xảy ra trong chiết tách hợp chat thiên nhiên Xử lý nguyên liệu -. :
Dung môi ch
2.4.1 Dung môi phân cực và không phân
2.4.2 Chất tan trong nước và dung môi phân cực
2.4.3 Chất tan trong diethyl ether và dung môi không phân c 2.5 Các kỹ thuật chiết tách truyền thống
25.1 Chiết ng phương pháp ngâm kiệt (Percolation ng phương pháp ngâm (Maceration 2.5.3 ng phương pháp ngắm kiệt ngư 2.5.4 Chiết bằng phương pháp Soxhlet
2.5.5 Chiết bằng cách đun hồi lưu
5.6 Phương pháp chiết lôi cuốn hơi nưới
2.6 Các kỹ thuật chiết tách hiện đại
2.6.1 Chiết bằng phương pháp siêu âm
Trang 62.6.2 Chiết bằng enzyme (EAE) 2.6.3 Chiết sử dụng vi sóng
2.6.4 Chiết sử dụng xung điện trường (PEF 2.6.5 Chiết lỏng siêu tới han (SFE)
2.6.6 Chiết lỏng điều áp (pressurized liquid extraction) 2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình c
Tài liệu tham khảo
Chương 3 Các kỹ thuật phân lập các hợp chất thiên nhiên
có hoạt tính sinh học tồn E86, 3.1 Giới thiệu chung,
3.1.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký
3.1.2 Các bước của quá trình sắc k 1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký
Sắc ký lớp mỏng, 3.2/1- Nguyên tắc
3.2.3 Dung môi triển khai 268 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng,
Các ứng dụng của sắc ký lớp mỏng 3 Sắc ký cột
3.3.1 Nguyên
3.3.2 Kỹ thuật triên khai . + 33 3 Sắc ký cột nhanh (Flash chromatography)
3.3.4 Sắc ký nhanh -cột khô (Dry-column flash chromatography )
3.4 Sắc ký trao đổi ion 3.4.1 Nguyên tắc co bi
3.4.2 Các tiêu chí lựa chọn c ệ
3.4.3 Các loại nguyên liệu để làm nhựa trao đổi ion và tinh của nó
3.4.4 Sắc ký cột trao đ
3.5 Sắc ký lọc gel
3.5.1 Giới thiệu về sắc ký lọc gel
3.5.2 Các loại hạt gel dùng trong,
3.5.3 Lựa chọn các điều kiện hoạt động
3.5.4 Thực hành sắc ký cột lọc gel
3.5.5 Các ứng dụng của kỹ thuật sắc ký gel
Trang 7
3.6 Kỹ thuật ghép nôi 3.6.1 Giới thiệu 3.6.2 Các kỹ thuật k
Tài liệu tham khảo
Chương 4 Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc
từ thực vậ I19 4.1 Giới thiệu chung
4.2 Thành phần các hợp chất có Mù tính sinh học có nguôn gốc từ thực vật
4.3 Quy trình chung chiêt tách v và à phân lập cá các hợp chất thiên
nhiên có nguôn gốc từ thực vật 21
4.3.1 Thu mẫu — định danh mẫu thực vật 21
4.3.2 Các kỹ thuật chiết tách 22 4.3.3 Các kỹ thuật phân lập 28
4.4 Phân lập một số hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc từ thực vật 4.4.1 Alkaloid 4.4.2 Coumarin 4.4.3 Flavonoid va isoflavonoid 4.4.4 Iridoid và secoiridoid 4.4.5 Saponin 4.4.6 Carotenoid 4.4.7 Ecdysteroid
4.4.8 Tỉnh dầu và các hợp chất dễ bay hơi
Tài liệu tham khảo etc
Chương 5 Phan lap các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc
từ sinh vật biển
5.1 Giới thiệu chung
5.2 Thanh phan các hợp chât có hoạt tinh sinh hoc
từ sinh vật biển
5.3 Quy trình chung ch tách và phân lập các tính sinh hoc tir sinh vat bién
5.3.1 Thu mau — dinh danh mau sinh
5.3.2 Các kỹ thuật chiết tách và phân lập
5.4 Phân lập một só hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc từ sinh vật biển ở Việt Nam
5.4.1 Phân lập một số hợp chât có hoạt tinh sinh hi loai hai mién (Sponge),
Trang 85.4.2 Phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài san hô mềm (Soft coral)
5.4.3 Phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học da gai (Echinodermata
5.4.4 Phan lap cdc hop chất có hoạt tính sinh học từ các loài
vi sinh vật biển (marine microogarnism) Tài liệu tham khảo
Chương 6 Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật
6.1 Giới thiệu về vi sinh v:
6.2 Tách chiết và phân lập các hợpchât từ vi sinh vật
6.2.1 Quy trình phân lập penicillin bằng phương pháp lên men long
6.2.2 Quy trinh phân lập một số hợp chất từ vi sin| sắc ký phân bố ngược dong sae
6.2.3 Quy trinh phân lập một số hợp chất từ vi sinh vật bằng
sắc ký trao đổi ion .cccccccccEEE21111111111111E.1.-ee 166 6.2.4 Quy trình phân lập một số hợp chất từ vi sinh vật băng
nhựa hấp ph
Tài liệu tham khảo —- Chương 7 Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc
từ nấm 75
7.1 Giới thiệu chung 7.2 Các ứng dụng từ nị
72.1 Thanh phn dink dưỡng cua nam
th vật băng
12:3 Nam như một hoạt chất kháng khuẩn,
7.2.4 Nấm là chất chống khối u
_ bò 3 Quy trinh chiết tách và phân lập một số hợp chất có hoạt
Trang 9Danh mục bảng
Bang 1.1 Lịch sử phát triển của các hợp chất thiên nhiên
Bang 2.1 Các dung môi thường dùng được sắp xếp tăng dân tương đối theo chỉ số phân cực
Bảng 3.1 Các chất hấp phụ dùng trong SKLM (sắp xếp theo Stahl
Bang 3.2 Cac loai Silica gel ding trong SKULM
Bang 3.3 Các hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chat
mu 7ớƑớẳỬỪƠƑIơưr 54
Bang 3.4 Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên
bản mỏng [BioMediaViet nam] - ccccceeeerrreerrrrrrre 62 Bang 3.5 Một số hôn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chât phân
cực (dùng cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng)
Bảng 3.6 Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thê tích
dung mơi
Bảng 3.7 Các loại silica gel dùng trong TC
Bảng 3.8 Áp dụng FC để tách các hợp chất thiên nhiên Bảng 3.9 Các dung dịch đệm thông dụng
Bảng 3.10 Các đặc tính tổng quát của các loại nhựa trao đi Bang 3.11 Một số loại nhựa trao đổi i ion thương mại Bảng 3.12 Nhựa trao đổi anion VẾU¡sasssa
Bảng 3.13 Nhựa trao đổi anion mạnh
Bảng 3.14 Nhựa trao đôi cation yếu
Bảng 3.15 Nhựa trao đổi Cation mạnh
Bảng 3.16 Các loại gel Sephadex và khả năng phân đoạn của gel Bảng 3.17 Các loại gel Bio-Gel và khả năng phân đoạn của gel Bảng 3.18 Thời gian trương nở ngâm gel Sephadex trong dung m Bang 3.19 Thể tích gel Sephadex trương nở trong các loại dung môi
Bảng 3.20 Một số protein được sử dụng làm chất chuẩn đề đo trọng lượng phân tử
Bảng 3 m Một số loại gel thương mại sử dụng cho sắc ký gel g 102
Bảng 3.22 Một số loại gel thương mại của nhà sản xuất Pharma 103
Bang 4.1 "Bảng thu mẫu thực vật nghiên cứu 121
Bang 5.1 Mot hop chất hoạt tính sinh học được phân lập từ vi
à thực vật phù du bién
Bang 5.2 Một hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ bọt biên
Bảng 5.3 Một hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ loài khá:
Bảng 5.4 Bảng thu mẫu thực vật nghiên cứu
Bảng 5.5 Một số cơ sở dữ liệu hữu ích cũng như các URL giúp
hành loại trừ lại (dereplication) -.-eeeeesseisseiierrrrrrreee 149
Bang 6.1 Thanh phan môi trị ường lên men cơ bản đê lên men s
xuat penicilin
Trang 10
Bang 6.2 Các hợp chất thiên nhiên phân lập từ vi sinh
phương pháp sắc ký ngược dòng
Bảng 6.3 Các hợp chất thiên nhiên phân lập từ vi sinh vật sử dụng phương pháp trao đổi ion
Bảng 6.4 Các hợp chất thiên nhiên phân lập từ vi sinh vật sử dụng phương pháp nhựa hấp phụ
Bảng 7.1 Các kỹ thuật chiết xuất polysaccharide
10
Trang 11
Danh mục hình
Hình 2.1 Bộ dụng éu Soxhlet
Hinh 2.2 Chi
Hinh 2.3 bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Hình 2.4 lỏng siêu tới hạn (SFE)
Hình 2.5 Chiết lỏng điều áp
Hình 3.1 Hình ảnh trên bản mỏng TLC điển hình và cách xác định
gia tri Ry
Hình 3.2 Lựa chọn giữa dung môi rửa giải nhanh (trái) và dung m làm mất vết tạp chất (phải)
Hình 3.3 So sánh giữa dung môi phân tách rõ (bên trái) và dung môi rửa giải nhanh (bên phải) cho sản phẩm mong muốn
Hình 3.4 Các khả năng có thể xảy ra trên bản mỏng TUC
Hình 3.5 Kỹ thuật sắc ký 2 chỉ Hình 3.6 Kỹ thuật SKLM điều chế
Hình 3.7 Bộ sắc ký cột [BioMedia Việt Nam] Hình 3.9 Nhỏi cột ướt [BioMedia Việt Nan]
Hình 3.10 Nhỏi c‹ ia Vi
Hinh 3.11
Hình 3.12 Đường biểu diễn mối liên hệ giữa trọng lượng phân tử của
bộ mẫu chuẩn lỗ 0 0n
Hình 3.13 Sử dụng ge hemoglobin
Hình 3.13 Kỹ thuật kêt
Hình 3.14 Mơ hình thiệt bị GC-MS
Hình 3.15 Sơ đồ hệ thống của thiết bị LC-MS (giao
phun mù electron)
Hình 3.16 Hệ thống LC-NMR điền hìn
Hình 3.17 Hệ thống CE-MS điển hình
Hình 3.18 Kết nói đa kỹ thuật
Hình 4.1 Quy trình chung phân lập và chiết tách các hợp chât từ thực vậ
Hình 4.2 Quy trình chung tạo dịch chiết CHCl; không chứa tannin Hình 4.3 Quy trình chung chiết tách saponin thô từ thực vật
Hình 4.4 Quy trình chung chiết tách alkaloid từ thực vật
Hình 5.1 Quy trình chung để phân đoạn dịch chiết có nguồn gốc từ sinh vật biển
Hình 5.2 Sơ đồ chiết tách phân đoạn cải tiên của Kupchai
Hình 6.1 Qua trình phân lập amphotericin B sử dụng phương pháp
trao đơi ion
Hình 6.2 Phân lập các ustilaginoidin thu được từ nâm kí sinh trên c6n tring (Metarhizium anisopliae)
Trang 12Hình 7.1 Cấu trúc hóa học của các sản phâm thiên nhiên thuộc ngành Nắm đảm có hoạt tính dược lý
Hình 7.2 Một số hợp chất hoạt tính sinh học terpenoid được phân lập từ nấm = ce
Hình 7.3 Cấu trúc của các ganoderic acid khác nhau và dẫn xuất đi phan lap tir G Lucidum
Trang 13Chương 1
Mở đầu `
1.1 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.L.1 Lịch sử phát triển - Khái niệm
Theo dòng chảy của sự phát triển con người, cây cỏ trong tự nhiên đã được tìm hiểu và sử dụng để điều trị bệnh tật Thời kỳ dau con người chỉ biêt sử dụng cây cỏ với mục đích bồ sung dinh dưỡng Tuy nhiên, sau khi phát hiện được các đặc tính chữa bệnh, các cây thuốc này đã được sử dụng
rộng rãi trong cộng đông và băt đâu được thương mại hóa
Người Ai Cập cổ đại đã chứng minh rau mùi và cây thầu dầu rất có ích
trong việc ứng dụng làm thuốc mỹ phẩm và bảo quản thơng qua hàng nghìn
bài thuốc Hơn 2000 cây thuốc, cây dược liệu từ tự nhiên đã được định danh
và miêu tả chỉ tiết bởi người Do Thái và Trung Quốc Cho đến nay nhiều cây thuốc vẫn được sử dụng Qua tìm hiểu, nghiên cứu các học giả như Hippocrates, Theophastus, Celsus, Dioscorides đã mô tả và đưa ra hàng nghìn phương pháp chữa bệnh sử dụng cây thuốc tự nhiên Galen đã đề lại các tài liệu về hơn 130 loại cây thuốc và dược liệu khác nhau trong thế kỷ thứ 2 và ngày nay chúng vẫn đang tiếp tục được bồ sung (bang 1.1)
Bảng 1.1 Lịch sử phát triển của các hợp chất thiên nhiên
Giai đoạn Loại hình Mơ tả
3000 năm trước
Công nguyên Ayurveda - Hé thong y học Hindu có ngn gốc từ Ấn Độ)
Y học cổ truyền Trung Quốc
Giới thiệu tính chất dược
liệu của thực vật và các sản
phâm từ thiên nhiên khác
1550 năm trước
Công nguyên
Ebers Papyrus (một
trong những tài liệu y Trình bày một số lượng lớn
các loại thuôc thô từ các
Trang 14
học cỗ xưa nhất thể
giới) nguồn tự nhiên (ví dụ: hạt thầu dầu và kẹo cao su)
460-377 năm
trước Công nguyên
Hippocrates Mô tả một số loài thực vật
và động vật có nguồn gốc được liệu 370-287 năm trước Công nguyên Theophrastus Mô tả một số thực vật và động vật có thê là ngn được liệu 23-79 năm sau công nguyên
Pliny the Elder Mô tả một số loài động,
thực vật có ngn gốc từ được liệu
60-80 năm sau
công nguyên
Dioscorides Tac gia cla “De Materia
Medica”, m6 ta hon 600
cây thuốc
131-200 năm | Galen (thảo dược) Thực hành các loại thảo
sau công được (Galenicals) và làm
nguyên cho chúng phổ biến ở
phương Tây
Thể kỷ thứ l§ | Krảuerbuech Trình bày thơng tin và hình ảnh của các cây thuôc
Cách sử dụng cây thuốc của loài người thời xưa đã cho ta thay lich str
phát triển của các hợp chất có hoạt tính sinh học Tại thời điểm đó, con người khơng có khái niệm về các hợp chất có hoạt tính sinh học, tuy nhiên đã biết sử dụng chúng vào nhiều mục đích khác nhau
Thông thường, các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sinh vật là các hoạt chất thứ cáp Trong cơ thể sống, từ các vi khuẩn đơn bào cho tới các lồi thực vật có hàng triệu tế bào, có chứa nhiều loại hợp chất khác nhau cần thiết cho sự sông của chúng Những hợp chất này tham gia vào quá
trình trao đổi e ất và giúp cho q trình đó vận hành một cách trơn tru Tất
cả các hợp chât có thể chia ra thành 2 nhóm lớn:
Trang 15~ Thứ nhất là các hợp chát sơ cắp đây là các chất hóa học có nhiệm
vụ cung cấp dưỡng chất cho quá trình lớn lên và phát triển, ví dụ như carbohydrate, amino acid protein và lipid
- Thứ hai là đắc hợp chát thứ cấp đây là nhóm các hợp chất có tác
dụng tăng cường khả năng sinh tồn của sinh vật và giúp sinh vật vượt qua những trở ngại thơng thường Nói một cách khác các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh ra sau khi phát triển, khơng có đóng góp gì trong q trình phát triển (mặc dù chúng có tác dụng trong việc giúp duy trì sinh tồn) Các hợp chat này được sinh ra với một số lượng hạn chế trong sinh vat, chung có cầu trúc khơng pho biến và hình thành bằng việc kết hợp các nhóm chất có cấu trúc liên quan Quá trình sản sinh các hợp chất thứ cấp trong các loài sinh vật đa phần trải qua nhiều giai đoạn khác nhau cũng
như bắt nguồn từ nhu cầu, từ chính bản thân lồi đó Ví dụ: các lồi hoa
tơng hợp nên chất thơm đề thu hút côn trùng phục vụ cho quá trình thụ phần và nở hoa của chúng, đồng thời sản sinh các độc tố để gây bệnh hay
kích thích các lồi thú ăn cỏ nhằm tiêu điệt sự phát triển của loài thực vật khác Trong số các hợp chất thứ cấp, một số chất có tác dụng lên hệ thống sinh học nên được gọi là các chất có hoạt tính sinh học Do đó, một định nghĩa đơn giản của các hợp chất có hoạt tính sinh học đó là: các hợp chất thứ cấp có khả năng kích thích tạo ra các hiệu ứng được học và độc tổ trong co’ thé con người và động vật
1.1.2 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu phong phú của Việt Nam
Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng do có
khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và âm, đây chính là nguồn nguyên liệu tự
Trang 16loài động vật và 75 loại khoáng vật trong đó các lồi cây thuốc có khả năng
khai thác là 206 loài, số cây thuốc có khả năng đe dọa cần bảo vệ là 136
loài 152 động vật làm thuốc đã ghi trong sách đỏ ở Việt Nam
Ở Việt Nam mỗi năm y học cô truyền công nghiệp dược và xuất khâu đã tiêu thụ khoảng từ 30 — 50 ngàn tan các loại dược liệu Riêng từ nguồn được liệu từ tự nhiên đã chiếm khoảng trên 20.000 tắn/năm
Trong thực tế, đã có nhiều loài cây thuốc được dùng để chiết tách các
hợp chất có hoạt tính sinh học làm thuốc điển hình như hợp chất taxol từ
cay Thong d6 (Taxus wallichiana); curcuminoid tir ci Nghé (Curcuma longa): rutin từ cay Hoa hoe (Shophora japonica); vinblanstin va vincristin tir cy Dita can (Catharanthus roseus); berberin từ cây Vàng đắng (Cosecinium fenestratum); artemisinin tit cdy Thanh cao hoa vàng (Artemisia annua); beta carotene va lycopene tir Gace (Momordica cochinchinensis), D-strophanthin tir hat qua sừng dé (Strophantus divaricatus); menthol va tinh dau tir Bac ha (Menth arvensis); rotundine tit nhiều loại cây Bình vơi (Sep hania spp.): papain từ cây Du di (Carica papaya): diosgenin tir cay Cu mai (Dioscorea deltoidea) và cay Rau him (Tacca chantrieri), morantin tir cay Muép dang (Momordica charantia); andrographolide từ cây Xuyên tam lién (Andrographis paniculata); shikimic acid tir hoa Hồi (Ilicium verum); Hàng năm, tổng sản lượng được liệu được ước tính khoảng từ 3.000 — 5.000 tắn Đặc biệt chú ý là cây Thanh cao hoa vàng (gần 500 tắn/năm), cây Kim tiền thảo (gần 300
tan/nam) và cây Quế (300 tắn/năm), Bên cạnh đó, diện tích trồng một
số loại cây dược liệu truyền thống cũng mở rộng phát triên và được quy hoạch thành các vùng dược liệu trọng điểm giúp tăng chất lượng và số lượng cây dược liệu
Người Việt Nam có truyền thống sử dụng dược liệu để phòng và chữa
bệnh hàng ngàn năm nay, nhờ có điêu kiện tự nhiên, khí hậu và thô nhưỡng
thuận lợi nên nguồn dược liệu Việt Nam khá phong phú, đa dạng và có nhiều tiềm năng tự nhiên cho sự phát triển của nhiều loài dược liệu đặc hữu khác nhau ở từng địa phương
Theo Tô chức Y tế Thế giới (WHO) có tới 80% dân số
ứng việc chăm sóc sức khỏe ban đầu bằng y học cổ truyền, hầu hết số này hiện đang sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo được thiên nhiên Xu hướng dùng dược liệu tự nhiên ngày càng được ưa chuộng do độ an toàn cao và
Trang 17
đó là nguồn tài nguyên tái tạo được Thị trường thuốc từ thảo mộc cho tới nay với hơn 3.000 sản phâm chiêm 10% toàn bộ thị trường dược phẩm và gan 1/3 thị trường thuộc Trong những năm gản đây việc sử dụng các loại dược liệu thảo mộc ngày cảng được người tiêu dùng ưa chuộng
Các hoạt chất tự nhiên trong được liệu được sử dụng vào 5 nhóm sản
phẩm sau:
1) Thuốc biệt dược: là dạng sản phẩm chứa các hoạt chất tỉnh khiết
phân lập được từ các cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau
2) Thuốc cỗ truyền: gồm các dịch chiết cô đặc chứa các hoạt chất từ
toàn phân của cây hay từng bộ phận của cây dùng cho việc chăm sóc sức khỏe
3) Thực phẩm chức năng: là các thực phẩm chứa những hoạt chất bổ sung có ngn gơc tự nhiên giúp phòng ngừa và điều trị bệnh
4) Mỹ phẩm, dược dụng: là mỹ phẩm trong thành phần có chứa các
hoại chất chiết đặc hiệu từ được liệu
5) Dược liệu thô: là nguyên liệu thô chứa các hoat chdt — mét dạng
sản phâm có tiêm năng giá trị cao
Trong cả 5 nhóm sản phẩm dược liệu trên đều đã bao hàm giá trị các hợp chất có hoạt tính sinh học Tùy theo mỗi loại sản phẩm sẽ có những cách thức sử dụng và mức độ yêu cầu về thành phần, hàm lượng của hoạt chất khác nhau Do vay quan trọng nhát vẫn là các phương pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh hoc dé str dụng vào các loại sản phẩm phù hợp với thực tiễn mà vẫn giữ được nguyên hoạt tính
1.2 Tách chiết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
Dựa trên số lượng lớn các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên đa dạng như các loài thực vật, động vật, nắm, vỉ sinh vật trên cạn và dưới biển cho thấy sự cần thiết phải xây dựng các kỹ thuật tách chiết phù hợp để thu được các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trên nhằm phục vụ cuộc sống con người
1.2.1 Mục tiêu của việc tách chiết các hợp chất thiên nhiên
Hai vấn đề cần được xác định khi ¬ đầu tách chiết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học chính là: 1 ¢ ‘ning ta đang cố g ing chiét tach
những hợp ci hát nào? 2 Tại sao chấn ø ta cỗ gắng tách chiết chúng? Từ
¡@ ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM THƯ VIỆN
Trang 18việc giải đáp 2 vấn đề này ta xác định được mục tiêu của việc c tách chiết các hợp chất thiên nhiên
Một số mục tiêu của việc tách chiết các hợp chất thiên nhiên:
a Xác định thành phân hóa học của một loài mới: Loài mới này chưa được các nhà khoa học nghiên cứu về thành phân hóa học Đề khảo sát thành phân hóa học cân phải chiết tách phân lập các hợp chất đạt độ tinh
khiết > 95%, sử dụng các phương pháp phô đê xác định cấu trúc, tiền hành
thử nghiệm các hoạt tính sinh học của các hợp chất đó;
b Đối với các hợp chất đã biết cấu trúc hóa học: tiễn hành thừ
nghiệm thêm các hoạt tính sinh học tinh sạch đê tạo thành chât chuẩn sử dụng cho kiềm nghiệm phân tích, nêu có kết quả tơt, hiệu quả cao có thê
xem xét thể tông hợp hóa học hợp chất đó đề có số lượng nhiều hơn;
c Các hợp chất đã biết hoạt tính sinh học: cân nghiên cứu con đường sinh tông hợp và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh
vật;
d Khao sat sw anh hưởng của điều kiện sinh thải tới sự khác biệt của
những hợp chất thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguôn tự nhiên Vi dụ: xác định hàm lượng của những hợp chất có trong 2 loài thực vật cùng
họ (family) cùng chỉ (genus), cùng loài (species) ở những điêu kiện khí
hậu đât đai thơ nhưỡng khác nhau
1.2.2 Các kỹ thuật tách chiết
Để tìm hiểu về sự chiết tách chọn lọc từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, trải qua thực tiễn hàng trăm năm rất nhiều kỹ thuật tách chiết đã được áp dụng cho các đối tượng mẫu cụ thể Tuy nhiên, nguyên tắc của tất cả các kỹ thuật trên đều dựa trên một nguyên lý chung, đó là tiến hành nghiên cứu chuyên sâu trên các trạng thái phù hợp của mẫu từ nguyên liệu
thô ban đầu
Các mục tiêu chung của các kỹ thuật trên bao gồm:
a Xử lí nguyên liệu ở trạng thái ban đầu;
b Tăng cường độ chọn lọc của phương pháp:
c Cải thiện chất lượng của phương pháp bằng cách tăng cường tập trung vào phân tích những yêu tô cân thiệt để xác định hợp chất và phân lập;
d Cải tiến các kỹ thuật phân tích cho phù hợp hơn;
Trang 19e Đưa ra một phương án hiệu quả có thẻ áp dụng nhiều mà không
bị phụ thuộc vào sự khác nhau của các loại mẫu nguyên liệu
1.2.2.1 Các kữ thuật tách chiết truyền thống
Các hợp chất thiển nhiên có hoạt tính sinh học trong dược liệu có thể
được chiết ra bằng rất nhiều kỹ thuật khác nhau Người ta vẫn sử dụng 3 kỹ thuật chính đề tách chiết: 1) chiết soxhlet; 2) ngâm chiết; 3) chưng cat Đa phần các kỹ thuật này dựa trên khả năng chiết của từng loại dung môi
khác nhau dưới sự tác động thêm bởi các yếu tố nhiệt độ hay các kỹ thuật
bổ sung khác
Việc lựa chọn hệ dung môi phù hợp ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất
của các thuật tách chiết Rất nhiều hệ dung môi khác nhau đã được áp dung để tách chiết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Trong q trình chọn cần chú ý đến độ phân cực của các chát cần tách Ngoài ra, các yếu tố như ái lực phân tử, môi trường, khả năng kết hợp dung môi, hiệu quả kinh tế cũng cần được quan tâm chú ý
Thách thức lớn đối với kỹ thuật tách chiết truyền thống đó là thời gian
lâu yêu cầu dung môi đất tiền, có độ tỉnh sạch cao, bay hơi dung môi nhiều, khả năng phân tách chọn lọc thấp và dé gây phân hủy đối với các
chất nhạy nhiệt Các hạn chế này đã được khắc phục bằng các sử dụng các kỹ thuật tách chiết mới Một số kỹ thuật mới đã được áp dụng nhiều hiện nay như là: 1) chiết siêu âm 2) chiết sử dụng enzyme, 3) chiết sử dụng vỉ sóng, 4) chiết sử dụng xung điện trường, Š) chiết lỏng siêu tới hạn, 6) chiết
lỏng điều áp (pressurized liquid extraction) Trong đó, một số phương pháp đã đáp ứng được chỉ tiêu của cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ đưa ra như sử dụng các dung mơi an tồn, tiết kiệm năng lượng, có thé tai str dung, giảm các tạp chat, đạt hiệu qua kinh tế cao không gây 6 nhiễm và
an toàn với người sử dụng
1.3 Phân lập các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
Dịch chiết thô của các mẫu nghiên cứu thường chứa các hợp chất có
độ phân cực khác nhau với cấu trúc từ đơn giản đến phức tạp Do vậy việc phân lập các hợp chất này cần sử dụng nhiều kỹ thuật tách chiết kết hợp với nhau
Trang 20Các dịch chiết thô trước hết phải được phân bố thành các phân đoạn cụ thê khác nhau nhăm thu được các phân đoạn có chứa các hợp chât gân giống nhau về độ phân cực hoặc các phân tử có kích cỡ tương tự nhau
ác ký để phân lập các hợp chất thiên nhiên với đa dạng
2 loại cô điển và hiện đại Các kỹ thuậ
cấu trúc có thê chia
1) Kỹ thuật sắc ký cô điện gồm:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin layer chromatography):
- Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC - Preparative thin layer
chromatography):
ky cot (CC - Column chromatography);
ic ky nhanh (FC - Flash chromatography)
2) KỸ thuật sắc ký hiện đại gom:
- Sac ký lớp mỏng hiệu nang cao (HPTLC);
- Sắc ký nhanh đa chức năng (Multiflash chromatography)
~ Sắc ký lỏng chân không (VLC- Vacuum liquid chromatography);
~ Chiết pha rắn (SPE- S
- Sac ký nhỏ giọt ngược đòng (DCCC - Droplet counter-current
chromatography):
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High perfomance liquid chromatography);
~ Các kỳ thuật ghép nói thiết bị như HPLC-PDA: sắc ký lỏng ghép khối phỏ (LC-MS): sắc ký lỏng ghép phổ cộng hưởng từ hạt nhân (LC-
NMR): sac ký lỏng ghép phô khối và phỏ cộng hưởng từ hạt nhân (LC-
MS-NMR )
Khối lượng các hợp chất thu được trong quá trình phân lập và làm sạch
rất quan trọng trong nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên Danh giá khả năng
thu hồi trong q trình phân lập có thể được thực hiện dựa vào các kỹ thuật
phân tích đa dạng ví dụ như sử dụng chất chuẩn Trong phương pháp phân
lập dựa trên cơ sở xét nghiệm sinh học, các hoạt chất được theo dõi băng
phân tích sinh học ở từng giai đoạn và đánh giá khôi lượng hoạt chât thường được tiền hành bằng phương pháp phân tích pha lỗng
Trang 21
Hàm lượng các hợp chất thiên nhiên trong nguyên liệu thấp hay khả năng thu hồi các hợp chất thấp là một trong những khó khăn hay gặp phải trong phân lập các hợp chất thiên nhiên Vi du 15 tan la dita can khé (Vinca rosea) chỉ thu được khoảng 30 g vincristine Tương tự như vậy từ khoảng 27.3 tân vỏ của 6.000 cây thông đỏ (7axzs brevj/olia) mới thu được khoảng 1,9 kg taxol Khó khăn về nguồn cung, cấp Taxol đã được, viện ung bướu Quốc gia Hoa Kỳ đề xuất một số giải pháp như:
~ Tìm nguồn cung cấp taxol khả quan hơn nhự các loài khác của chỉ
Taxus hoặc cải thiện điều kiện trồng trot chon giéng:
- Ban téng hop taxol tir tiền chất có hàm lượng lớn; ~ Tổng hợp toàn phan taxol;
~ Nuôi cấy mô tạo sản phẩm taxol hoặc các chất giống nó
Mặc dù taxol đã tổng hợp được toàn phần tuy nhiên phương pháp này
lại không hiệu quả về mặt kinh tế Cho nên cách khả thi nhất là bán tổng hợp taxol
1.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên
1.4.1 Khái niệm
Các phân tích hố học, sinh học hoặc vật lý rất cần thiết trong việc xác
định các hợp chất từ một dịch chiết Ngày nay, việc nghiên cứu sản phẩm tự nhiên tập trung nhiều hơn vào việc phân lập các hợp chất theo định
hướng hoạt tính sinh học hơn là có gắng phân lập tất cả các hợp chất có
trong dịch chiết Vì vậy, các thử nghiệm hoạt tính sinh học thích hợp nên
được kết hợp đồng thời với các quá trình chiết tách và phân lap (so dé 1.1) Thử nghiệm các hợp chất có hoạt tính sinh học là phương pháp chính
đê phát hiện các nguồn thuốc mới, được liệu mới có nguôn gốc từ tự nhiên Do đó, (hứ nghiệm các hoạt tính sinh học có thê được định nghĩa là các
thứ nghiệm được sử dụng đề phát hiện các hoạt tinh sinh học của một phan
dịch chiết, hoặc của một chất nhận được từ một sinh vật sống hoặc được
tông hợp cân thiết cho sự phát triên một thuốc mới
Trang 22Chiết bằng MeOH
Khơng có hoạt tính (HT) Dừng lại hoặc a thir hoat tinh
Thir hoat tinh
l Có hoạt tinh 'TTách phân đoạn dịch chiết MeOH
Phân đoạn AI Phân đoạn A2 Pian Gog AS
LL Li Có hoạt tính dne cé HT hơng có I ' Khơng có HT {k ones Tách chất sạch và—— Ý Không e Dừng lại tỉnh chế Dừững lại Chit 1 Chất 2 Chất 3 Thử hoạt tính
Khơng có HT Có hoạt tính Khơng có HT
Dừng lại Các nghiên cứu sâu hơn về dược lý Dững lại
Sơ đồ 1.1 Qui trình kỹ thuật phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học
Trang 231.4.2 Phân loại thử nghiệm hoạt tính sinh: lọc 1.4.2.1 Thứ nghiệm in vitro
Các kỹ thuật này dựa sử dụng dừa trên sự nuôi cấy tế bào của một hệ sinh học dé nghiên cứu tac dung của hợp chất đưới điều kiện tiêu chuân
không giống như của môi trường sống Sự nuôi cấy tế bao ton tai do sử
dung | dinh dưỡng trong mơi trường Ví dụ sử dụng các tế bào gốc, nuôi cây tế bào và các vi khuẩn
Ưu điểm: nhanh cần lượng mẫu nhỏ có thé thực hiện các thử nghiệm
lặp lại
Nhược điểm: hoạt tính có thể bị mat trong thử nghiệ
cơ chế khác với cơ chế được thử nghiệm — chất chuyên hóa có thê có hoạt
tính hơn là các chất có ban đầu trong dịch chiết hoặc phân đoạn
in vivo do mot
1.4.2.2 Thứ nghiệm in vivo
Các kỹ thuật này sử dụng trên một động vật sống được cho phép sử dụng
cho mục đích thử nghiệm Các kỹ thuật này có mục đích nghiên cứu tác dụng sinh học hoặc sự đáp ứng của hợp chất trong một hệ sống, ví dụ: chuột, thỏ, mèo, chó, thường được sử dụng trong các thử nghiệm được lý
Ưu điểm: các kết quả thích hợp nhất với điều kiện lâm sàng, các tác
dụng phụ thường được thẻ hiện
Nhược điểm: giá thành cao, thiếu chỉ định cho cơ chế tác dụng của hoạt chất, khó sử dụng trong phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học, cần các thiết kế cẩn thận và phân tích xử lý số liệu phù hợp các kết quả
1.4.2.3 Thử nghiệm lâm sàng
Các thử nghiệm trên dong vat (in vivo) va thir nghiệm lâm sàng cơ bản
để nghiên cứu hiệu quả và độc tính của các hợp chất thiên nhiên đã được chứng tỏ là có hoạt tính sinh học bằng các thử nghiệm sàng lọc ¡? virø
Thử ngị lâm sàng là các nghiên cứu y sinh hoặc hành vi trên con
người được thiệt kế để trả lời các câu hỏi cụ thê và sự can thiệp y sinh hoặc hành vi (các vaccine, thuốc, điều trị, thực phẩm chức năng mới hoặc các phương pháp điều trị mới) tạo ra các dữ liệu về an toàn và hiệu lực
1.4.3 Một số nguyên tắc cơ bản trong tìm kiếm, sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học
Trong thời gian qua, kỹ thuật thử hoạt tính sinh học là lĩnh vực được phát triển mạnh mẽ đặc biệt về mức độ tự động hóa và số lượng mẫu được
Trang 24thử theo một đơn vị thời gian (Automated and high-throughput screening
HTS) Do sự hiểu biết sâu rộng của con người về các quá trình sinh học của một số căn bệnh cùng với việc có được nhiều thụ thể, enzyme gene
và hệ tế bào nên kỹ thuật thử hoạt tính sinh học đã có những thay đổi cơ
bản đã hạn chế bớt việc sử dụng động vật thí nghiệm hoặc các cơ quan
nội tạng của chúng cho các phép thử hoạt tính sinh học
Nhờ có các kỹ thuật thử hoạt tính mới mà nhiều chất đã biết và có lượng
lớn trong tự nhiên đã được phát hiện là có hoạt tính thậm chí hoạt tính một cách chọn lọc đối với một số enzyme và thụ thé (receptor) Gan day, các hop chat duge phát hiện với phô hoạt tính mới rộng bao gồm các flavonoid
và triterpenoid Các flavonoid có hoạt tính ức chế rất nhiều loại enzyme, có hoạt tính sinh estrogen cao, chống đột biến và ung thư Một số flavonoid đang được nghiên cứu lâm sàng
Y nghia img dung của hợp chất sẽ được nang cao néu co ché tac dung của nó cùng với các enzyme liên quan đến hoạt chất này được làm sáng tỏ
Vi du: paclitaxel tir Taxus brevifolia va camptothecin tir Camptotheca
acuminata Hai hợp chất này được phân lập nhờ quá trình sang lọc theo hướng hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô (KB) Taxol đã được bán trên thị trường còn camptothecin đang được thử lâm sàng tại Trung Quốc
Cơ chế tác dụng của hai hoạt chất này thuộc loại độc nhất hiện nay
Camptothecin ức chế enzyme topoisomerase I va taxol kich thich qua trinh polymer hoa tubulin
Phương pháp thử hoạt tính sinh học sử dụng các hệ thống sinh học để
phat hién cde hoat tinh (khang khuan - antibacterial, khang nam - antifungal, chống ung thu - anticancer, khang HIV- anti-HIV, chống tiểu
dường - antidiabetic ) cua cac dich chiết thô, các phân đoạn sắc ký, hỗn
hợp các chất hay các hợp chất sạch Các phép thử sinh học bao gồm sử
dụng hệ thống im vivo (thử nghiệm lâm sàng hay trên động vật), hệ thống
ex vivo (trên các mô tế bao tách biệt hay các cơ quan sống) hoặc hệ thống
in vitro (trong ống nghiệm - các tế bào nuôi cấy)
Các nghiên cứu ¡ vivo lién quan nhiều hơn đến các điều kiện lâm sang nên cung cáp được nhiều số liệu về độc tính trong cùng thời điểm Nhược điểm của các nghiên cứu này là chỉ phí cao thời gian dài cân khối lượng
chất thử lớn thiết kế phức tạp cần có bệnh nhân và khó chọn phương pháp
xác định hoạt tính Các phép thử # vửrø cần ít thời gian, khối lượng mẫu
Trang 25
thử nhỏ nhưng các kết quả có khi khơng liên quan đến các điều kiện lâm sàng
Xu hướng nghiên cứu hiện nay dang ưu tiên từ hệ thống thử nghiệm in vivo chuyén sang in vitro Ngay nay phép thử sinh học rat manh, siéu nhay thậm chí có thẻ chỉ cần sử dụng khối lượng chất thử rất nhỏ khoảng vài picogram (pg) Phần lớn các phép thử (sử dụng đĩa 96 hoặc 384 giếng) được tiền hành tự động hoặc bán tự động
Những điểm cơ bản khi tiến hành các thử nghiệm các sản phâm tự nhiên:
a Cac mau hoa tan hoặc các chất lơ lửng trong các dung môi khác
nhau của dịch chiết ban đầu phải được lọc hoặc ly tâm đề loại bỏ
bắt kỳ chất khơng hịa tan nào:
b Các mẫu acid hóa hoặc base hố phải được điều chỉnh lại với độ
pH như ban đầu của dịch chiết đề ngăn ngừa chúng gây trở ngại cho phép thử nghiệm sinh học;
c Các chất đối chứng dương tính và âm tính nên được kết hợp trong
bắt kỳ thử nghiệm sinh học nào:
d Điều kiện lý tưởng nhất là phép thử nghiệm tối thiểu bán định
lượng hoặc các mẫu phải được khảo sát trong một loạt các nồng
độ pha loãng khác nhau đề xác định phần lớn các hợp chất đích;
e Các phép thử phải đủ độ nhạy đẻ phát hiện các thành phần hoạt tính ở nịng độ thấp
1.4.4 Các xu hướng chính trong nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất mới
có hoqf tính sinh học
Ngày nay các xu hướng chính trong nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học nguồn gốc tự nhiên tập trung chủ yếu vào các
lĩnh vực bao gồm:
~ Nghiên cứu đánh giá hoạt tính liên quan đến ung thư;
Nghiên cứu đánh giá hoạt tính liên quan đến bệnh nhiễm trùng:
'
Các hợp chất có hoạt tính trong miễn dịch: Các chất có liên quan đến tim mạch:
Trang 26Tài liệu tham khảo lb
4
John M (1992), Murder, magie and medicine, Oxford University Press
Newman D J., Cragg G M (2007), Natural products as sources of new drugs over the last 25 years, J Nat Prod., 70, 461-477
Newman D J., Cragg G M (2004), Advanced preclinical and
clinical trials of natural products and related compounds from marine cources, Curr Med Chem 11, 1693-1713
Kinghorn A D., Chin Y W Swanson S M (2009), Discovery of
natural product anticancer agents from biodiverse, Curr Opin
Drug Discov, Devel., 12(2) 189-196
Dewick P M (2009), Medicinal natural products: A biosynthetic
approach, United Kingdom, John Wiley & Sons
Samuelsson G (1999), Drugs of natural origin: A Textbook of
pharmacognosy 4th revised ed., Swedish Pharmaceutical Press,
Stockholm, Sweden
Cannell R J P (1998), How to approach the isolation of a natural
product, in Natural products isolation, Humana Press
Cragg G M., Newmann D J., Snader K M (1997), Natural products
in drug discovery and development, J Nat Prod., 60, 52-60
Steinbeck C (2004), Recent developments in automated structure
elucidation of natural products, Nat Prod Rep 21, 512-518
Tringali C (2012), Bioactive compounds from natural sources,
Taylor and Francis
Melanie F., Elke M., Mathias D., Robert P (2006), Natural products:
sources and databases, Nat Prod Rep., 23, 347-356
Võ Văn Chỉ (2012 và 2019), Từ điển cây thuốc Việt Nam NXB Y học
Oksana S và Iryna S Bioactive Compounds from Natural Sources
Trang 27Chương 2
Kỹ thuật chiết tách các hợp chất thiên nhiên
có hoạt tính sinh học
2.1 Giới thiệu chung
Chiết tách hợp chất tự nhiên chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như
là việc lựa chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách tiến hành tách chiết
Không thể có phương pháp tách chiết chung cho tất cả các hợp chất thiên nhiên bởi vì các hợp chất khác nhau có khả năng hịa tan khác nhau
trong từng loại dung mơi Do đó phải biết rõ về thành phần hóa học mới
có thê lựa chọn được phương pháp chiết tách phù hợp nhất
Lựa chọn phương pháp trích ly đề có được cao chiết thô là công việc rất quan trọng đề hạn chế sự biến đổi các hợp chất, giảm các phản ứng phụ, các phản ứng chuyền vị và giảm hoạt tính sinh học
Trong sinh vật thường chứa một số cầu tử được xem như chất gây cản
trở trong quá trình chiết tách hoặc tinh chế các hợp chất như diệp lục tố Đôi khi các chất dùng để bôi trơn dụng cụ thủy tỉnh như vaseline, silicon cũng bị nhiễm vào dung dịch trích ly
Có nhiều cách sử dụng dung môi đề trích ly mẫu nguyên liệu Khi cho
dung môi chiết vào, dung môi sẽ thấm qua màng tế bào của cây, các hoạt chất trong tế bảo sẽ hòa tan vào trong dung môi Khi đó sẽ xuất hiện một quá trình thâm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung mơi bên
ngồi Quá trình thấm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng nồng độ các
hợp chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào Như vậy, trong quá trình chiết sẽ xảy ra 2 quá trình: quá trình hịa tan và q trình thâm thấu Hai quá trình này thực hiện liên tục cho đến khi quá trình chiết kết thúc Đê nâng cao hiệu quả và thúc đây hiệu quả của quá trình tách
chiết nguyên liệu cần phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung môi
Trang 282.2 Các quá trình xảy ra trong chiết tách hợp chất thiên nhiên
Trong lĩnh vực nghiên cứu nhất là y học và nơng nghiệp; các đợ;› chất thứ cấp chính là dối tượng nghiên cứu quan trọng do các tác dụng sinh lý và được lý của chúng như tác dụng kháng sinh diệt nấm tác dụng ức chế hoặc gây độc đối với tế bào; tác dụng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng, và các tác dụng dược lý, sinh lý khác
Về mặt phân loại hoá học, hợp chất thiên nhiên được sắp xếp theo các
nhóm chức cơ bản: carbohydrate lipid và acid béo amino acid, acid hữu co hgp chat phenol, saponin, glycoside, alkaloid
Trong sinh vật các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng hòa tan trong nước,
dầu béo hoặc tỉnh dầu
Các chất hòa tan trong nước (dịch tế bào) là các carbohydrate phân tử kích thước nhỏ (monosaccharide, oligosaccharide), một số polysaccharide (Cellulose, chitin, peetin ), các glycoside (saponin, flavonoid, iridoid ), muối alkaloid của các acid hữu cơ acid amine Các hợp chất phenol hòa tan dưới dang glycoside (flavonoid, tanin) hoặc dạng phức hợp khác Các chất tan trong dầu béo và tỉnh dầu là các hydrocarbon,
monoterpene, sterol, carotenoid
Dầu và tỉnh dầu được được tìm thấy trong những bộ phận riêng biệt
của sinh vật như đối với thực vật là ở hạt, vỏ, thân
Nói chung các chất tan trong nước (dịch tế bào) là những chất phân
cực còn những chất tan trong dầu hoặc tỉnh dầu là các chất kém phân cực
Độ phân cực của mỗi hợp chất tùy thuộc vào cấu trúc mạch carbon và các
nhóm chức
Thơng thường mạch carbon càng dài thì độ phân cực càng giảm Các nhóm chức có mang điện tích âm có thể liên kết với 1 nguyên tử hydro của H-O-H để hình thành liên kết hydro gọi là nhóm phân cực Các nguyên tử mang điện tích âm có thé la: O, N, S, F, Cl Nhu vay, các nhóm như: -OH -CO -NOs -NHa, -COOH -SOa và các halogen đều là những nhóm phân cực Các phân tử càng có nhiều nhóm phân cực thì tính phân cực càng
mạnh nhưng nếu mạch carbon càng dài thì độ phân cực sẽ giảm
Ví dụ: các glycoside là những chất phân cực mạnh do phần đường của
Trang 29cực càng cao Nếu glycoside bị thủy phân gốc đường chỉ còn lại phần aglycone thì tính phân cực của aglycone sẽ giảm rõ rệt
Một yếu tố khác ảnh hưởng đến vấn đề chiết xuất là các enzyme có trong sinh vật Trong quá trình chế biến, nếu khơng kiểm sốt được hoạt
động của các enzyme thì các glycoside có thê bị thủy phân một phần hoặc
toàn phan làm thay đổi tính phân cực do đó làm thay đơi độ hịa tan của các hợp chát đối với dung môi
2.3 Xử lý nguyên liệu
Việc lựa chọn, thu hái xác định nguyên liệu cần nghiên cứu là giai
đoạn đầu tiên phải tiến hành trong quá trình khảo sát
Khi thu mẫu nghiên cứu cần kết hợp với các nhà sinh học để xác định
tên khoa học (vì các sinh vật thường được gọi bằng tên địa phương rất dễ
gây nhằm lẫn) Phải ghi rõ mẫu nghiên cứu được thu ở vùng nảo (thậm chí
ghi tọa độ nào) thời gian, độ tuổi phát triển của sinh vật Phải ghi rõ
người thu hoặc cơ quan giám định và nơi mẫu được lưu trữ
Việc thu mẫu phải chú ý loại bỏ các đấu hiệu mang mầm bệnh Đối với các bộ phận của thực vật như vỏ, thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh thu hái cây có mang những sinh vật ký sinh Nhiều trường hợp đã có kết luận sai về thành phần hóa học vi cây có mang những loại nắm ký sinh
Mẫu cây sau khi thu hái về được rửa sạch dé rao nước, làm khô tự
nhiên trong mát có quạt hoặc nơi thống gió Mẫu có thẻ được phơi khô ở
nhiệt độ phòng hoặc sấy ở nhiệt độ thấp hơn 60 °C Không được phơi dưới
ánh năng mặt trời vì tỉa tử ngoại có thê kích thích phản ứng hóa học, tạo nên những chất giả goi la artefact Mot vai trường hợp đặc biệt, người ta
khảo sát trên cây tươi (nghiên cứu thành phần tỉnh dầu của thực vật Trong,
trường hợp này mẫu thực vật cần được nhanh chóng cắt nhỏ và ngâm ngay trong dung mơi ly trích để tránh quá trình lên men hay phản ứng hóa học
Muốn loại bỏ các enzyme có sẵn trong cây, có thê thực hiện bằng nhiều
ách: nhúng mẫu cây vào methanol hoặc ethanol ngay sau khi thu hái: đối nh dầu cần phải tiến hành ly trích ngay trên mẫu cây tươi dé tránh
thất thoát do tỉnh dau bay hơi
Mẫu nghiên cứu cần được xay nhỏ để dung mơi có thể thầm thấu vào
màng tê bào và trích ly những chất biên dưỡng thứ cấp Nếu các chất biến
dưỡng thứ cấp trong mẫu nghiên cứu cần trích ly có tinh dé bay hơi hay
Trang 30
kém bên nhiệt có thể bỏ qua giai đoạn xay nghiên, vì quá trình tán nghiền nhuyễn sẽ phát sinh ra nhiệt, làm hao hụt sản phâm Đôi khi người ta dùng kỹ thuật ngâm đông lạnh mẫu cây (mẫu khô hay mẫu tươi) trong nitơ lỏng, rồi nghiền giã cây trong một cái cối hoặc trong một cái bao bằng polyethylene dày
2.4 Dung môi
Dung môi được sử dụng để chiết xuất các hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay đổi dựa vào đặc tính của các hợp chất muốn trích ly Để lựa chọn dung mơi thích hợp cần dựa vào độ phân cực của các hợp chất trong mẫu nghiên cứu
2.4.1 Dung môi phân cực và không phân cực
Đặc tính của dung môi và chất tan là yếu tố quan trọng trong quá trình
hình thành dung dịch Để tạo ra dung dịch, cần phải có sự phá vỡ các liên
kết trong chất tan và trong dung mơi, hình thành liên kết mới giữa chất tan và dung môi Chang hạn, diethy] ether và nước, hằng số điện môi của nước ở 20°C là 80.4 trong khi diethyl ether là 4.34 Nguyên tử hydro của phân tử nước có khả năng liên kết với một nguyên tử mang điện tích âm của một hợp chất khác, hình thành liên kết hydro trong dung dịch nước, trong khi
điethyl ether không hình thành loại liên kết này Liên kết hydro hình thành
ảnh hưởng lớn đến tính hịa tan của hợp chất đối với dung môi Nước vừa có tác dụng như một acid, vừa là một base còn ether là một base rất yếu khơng có đặc tính như một acid Do những đặc điểm trên, nước được xem như một dung mơi phân cực mạnh cịn diethyl ether là một dung môi không phân cực Độ phân cực của các dung môi thường dùng được sắp
xếp tăng dần theo chỉ số phân cực ghi ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Các dung môi thường dùng được sắp xép tang dần tương đối
theo chỉ số phân cực - Ha = 5
Nhiệt | 4 ang eh - - Độ tan
ra „ x, | $0 dién so Độ nhớt trong
Dung môi độ sôi Am x 2 &
Trang 31Carbon 77 22 1.6 0.97 0.08 tetrachloride Toluene 111 238 24 0,59 6.51 Xylene 5 139 2,5 0,61 0.018 Benzene 80 23 27 0,65 0.18 Diethyl ether 35 434 2.8 0,32 6.89 Dichloromethane|_ 4l] 8.9 3.1 0,44 1,6 Isopropanol 82 18.3 3.9 2,3 100 n-Butanol 118 39 2,98 7.81 Tetrahydrofuran 65 7.58 4.0 0,55 100 n-Propanol 92 20,1 4.0 2,27 100 Buty! acetate 125 4.0 0,73 0,43 Chloroform 61 4.87 4.1 0,57 0,815 Ethyl acetate at 6.0 44 0.45 8,7 Methyl ethyl 80 4,7 0,45 24 ketone Dioxane 101 2,2 4,8 1,54 100 Acetone 56 20,7 5,1 0,32 100 Methanol 65 33,6 5,1 0,6 100 Ethanol 78 24,3 3,2 12 100 Acetonitrile 82 S155 5,8 0,37 100 Acetic acid 118 6,2 6,2 1,26 100 Dimethyl 189 47 y2 2,0 100 sulfoxide Nước 100 78,5 9,0 1,0 100
2.4.2 Chất tan trong nước và dung môi phân cực
Các dung môi phân cực có khả năng hòa tan tốt các chất điện ly như muối vô cơ
Các hợp chất hữu cơ nều có chứa các nhóm hoặc nguyên tử mang điện tích âm như -OH, CO NO, NH: và các halogen gọi là nhóm phân cực có
thể hình thành liên kết hydro với nước thì chúng sẽ tan được trong nước
Sô lượng nhóm phân cực trong hợp chất càng nhiêu thì khả năng hòa tan
Trang 32hòa tan càng kém khi trong hợp chất có chứa mạch hydrocarbon dài và
ngược lại
2.4.3 Chất tan trong diethyl ether và dung môi không phân cực
Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực gọi là các chất không phân cực Thông thường các chất không phân cực đều tan trong diethyl ether và dung môi không phân cực, không tan trong nước và các dung môi phân cực khác Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước đều không tan trong diethyl ether
Nếu một chất vừa tan trong nước vừa tan trong ether thì chất đó phải là chất không ion hóa có s6 carbon khéng qua 5, cé 1 nhóm phân cực tạo liên kết hydro nhưng khơng phải là nhóm phân cực mạnh
2.5 Các kỹ thuật chiết tách truyền thống
2.5.1 Chiết bằng phương pháp ngắm kiệt (Percolation)
Phương pháp ngắm kiệt là phương pháp trích ly dé dàng tiền hành, ít địi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian nên được sử dụng khá phé biến trong chiết tách
Dụng cụ sử dụng trong phương pháp ngắm kiệt g: gồm một bình ngắm
kiệt hình trụ đứng, bằng thủy tỉnh, ở dưới đáy bình có van khóa đề điều khiển tốc độ dung môi chảy ra Khi đã ngâm mẫu nghiên cứu trong dung môi sau một thời gian nhất định, dung dịch chảy ra được hứng trong một
erlen bên dưới ở trên có một bình chứa dung mơi chảy vào bình ngắm kiệt này
Mẫu nghiên cứu được ngâm trong dung môi khoảng 1-2 ngày để dung môi chiết bão hòa được hoạt chất, sau đó dung mơi được cho chảy ra rồi
mới cho dụng môi mới vào tiếp tục thực hiện quá trình trích ly Dé khao
sát sự chiết tách hoàn toàn chưa, người ta thường theo dõi bang cách lấy
dịch trích ly thử với các thuốc thử đặc trưng của hoạt chất cần trích ly
2.5.2 Chiết bằng phương pháp ngâm (Maceration)
Đối với phương pháp ngâm mẫu bột được ngâm trong bình chứa bang thủy tỉnh hoặc thép không ri có nắp đậy đê yên ở nhiệt độ phòng dung
môi sẽ ngắm dẫn vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên Hiệu quả
tách chiết được gia tăng bằng cách khuấy hoặc dùng máy lắc nhẹ Sau 24
Trang 332.5.3 Chiết bằng phương pháp ngắm kiệt ngược dòng
Đây là sự kết hợp giữa phương pháp ngắm kiệt và phương pháp ngâm dam Bột cây được cho vào nhiều bình chiết khác nhau, ví dụ có 3 bình A, B, C Cho dung mơi vào bình A, ngâm và lấy ra dung dich Aj, lay dung địch Ai để riêng Cho dung môi mới vào bình A, ngâm và lấy ra được dung dịch A› Lay dung dịch A› làm dung môi đầu cho bình B tương tự như trên có được dung dịch B¡ và dung dich Bz Dung dich Bz lam dung môi đầu cho vào bình C, quá trình diễn ra tương tự như trên Như vậy, dung dịch được chiết ra từ bình trước được dùng làm dung môi để ngâm bột cây
của bình sau Trong sản xuất quy mô lớn phương pháp này được sử dụng
khá nhiều Phương pháp này chỉ khác với phương pháp ngắm kiệt là dịch chiết sau khi lấy ra không theo phương pháp nhỏ giọt mà mở khóa cho chảy thăng dòng sau khi ngâm một thời gian nhất định
2.5.4 Chiét bang phuong phap Soxhlet
Bộ dụng cụ Soxhlet được bán sẵn với nhiều loại kích cỡ Phương pháp chiết soxhlet chỉ sử dụng một lượng ít dung mơi, q trình trích ly tự động,
liên tục nên nhanh chóng và các hoạt chất được chiết tách tr iệt đề
Hình 2.1 Bộ dụng cụ Soxhlet
Muốn biết quá trình chiết đã cạn kiệt chưa tháo phan 6 ống ngưng hơi dùng pipet hút lấy vài giọt dung dịch trong bình chứa mẫu nghiên cứu, nhỏ
lên mặt kính hoặc giấy loc, dé dung môi bay hơi hết đề lại vết trên bề mặt
Trang 34kính Nếu khơng thấy vết thì đã chiết kiệt nếu thấy vét thì phải chiết thêm
một thời gian nữa
Bên cạnh những ưu điểm, lượng mẫu chiết đối với phương pháp này khơng nhiều do đó thích hợp sử dụng trong các nghiên cứu quy mơ phịng thí nghiệm Một nhược điểm lớn nữa là trong suốt quá trình chiết những hợp chất kém bền nhiệt có thẻ bị thủy phân, phân giải hoặc biến đổi thành
chất khác do nhiệt độ chiết bằng nhiệt độ sôi của dung môi chiết
2.5.5 Chiết bằng cách đun hồi lưu
Bột nguyên liệu và dung môi hữu cơ được chứa trong một bình cầu có gan ống sinh han Dun hồi lưu trên bếp cách thủy ở nhiệt độ sôi của dung môi Sau một thời gian cần thiết, dung dịch chiết được lấy ra và lọc qua
giấy lọc Dung môi mới được đưa vào và chiết thêm 3-4 lần nữa cho đến khi kiệt
Hiếm khi người ta đun bột nguyên liệu với dung môi là nước, dù đây là phương pháp trong dân gian vẫn hay dùng đề sắc thuốc uống và một số chất cũng tan được trong nước, nhưng vì nước có nhiệt độ sôi cao và áp suất hơi nhỏ nên rất khó cơ can Dé chiết xuất những hoạt chất tan nhiều trong nước, người ta hay dùng hỗn hợp methanol-nước hoặc ethanol-nước
~- Bình hấp thụ
1 Bình phản ứng
} N3 Z
Trang 352.5.6 Phương pháp chiết lôi cuốn hơi nước
Phương pháp này được sử dụng để chiết tách tỉnh dầu và những hợp chat dé bay hơi có trong thực vật Dụng cụ được sử dụng trong phương pháp này là một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn
đi vào bình có chứa mẫu thực vật hơi nước đi qua mẫu thực vật và lôi cuốn
những cầu tử dễ bay hơi theo; hơi nước tiếp tục bay hơi và được ngưng tụ bởi một ống sinh hàn ta thu được hỗn hợp nước-tinh dầu Dùng ether dau hỏa hay diethyl ether đề tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc đề yên
một thời gian sẽ có sự tách giữa 2 pha tinh dầu - nước
1 Binh cấp hơi nước
2 Binh chủa nguyên liễu chung cất
3 Lớp tình đầu
4 Lớp nuớc
Hình 2.3 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
2.6 Các kỹ thuật chiết tách hiện đại
2.6.1 Chiết bằng phương pháp siêu âm
Đối với phương pháp này, các hợp chất hữu cơ và vô cơ bị phân tách ra khỏi trạng thái ban đầu dưới tác dụng của sóng siêu âm Bản chất của quá trình là do sóng siêu âm có khả năng làm tăng nhanh quá trình vận chuyền sinh khối và tăng tốc độ thâm nhập của dung môi vào trong tế bào sinh vật Cơ chế của kỹ thuật này bao gồm 2 hiện tượng vật lý sau: l) sự phân rã xảy ra dọc theo màng tế bào; 2) Phân rã các thành phần bên trong tê bào
Trang 36Phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm là tiết kiệm được thời gian chiết tách năng lượng cũng như lượng dung môi cần dùng Q trình chuyền hóa năng lượng giúp tăng nhanh quá trình chun hóa năng lượng, giảm biến đồi nhiệ lượng và nhiệt độ tách chiết tăng khả năng chiết chọn lọc, hiệu suất và giảm các bước phải xử lý
Chiết siêu âm là phương pháp đạt được hiệu quả cao trong việc chiết
tách các hợp chất có hoạt tính từ sinh vật Ví dụ chiết tách 4 dẫn xuất
isofTavone có tên lần lượt là daidzin, genistin glycitin và malonyl genistin từ đậu nành khi so sánh với phương pháp chiết khuấy trộn về thời gian và dung môi chiết khác nhau Kết quả cho thấy rằng chiết siêu âm làm tăng hiệu suất dựa trên dung môi sử dụng Khi chiết các hợp chat phenolic nhu rutin, naringin, naringenin, quercetin, acid ellagic va kaempferol tir dau tay sử dụng chế độ siêu âm lặp 0.8 giây cứ mỗi 30 giây một Từ lá tươi và thân cla cay Dé trong (Eucommia ulmodies Oliv) đã thu acid clorogenic voi
hiệu suất cao bằng cách sử dụng siêu âm ở điều kiện: 70 °C, methanol tỉ
lệ dung môi:mẫu = 20:1; và thời gian chiết 30 phút so với phương pháp chiết thông thường Chiết siêu âm đề chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học có tén rutin va quercetin tir cdy bui phat sang (Evonvmus alatus (Thunb.) Siebold cho thay rang str dung siéu 4m cho hiệu suất cao hon thông thường Chiết siêu âm sử dụng chất lỏng ion có một tiềm nang to
lớn để chiết 3 alkaloid (vindoline, catharanthine và vinblastine) từ cây
Catharanthus roseus Chiết siêu âm sử dụng chất lỏng ion có một tiềm
năng to lớn đề chiết 3 alkaloid (vindoline, catharanthine và vinblastine) từ
cdy Catharanthus roseus Cac anthocyanin va cac phenolic cing duge chiét tir qua nho str dụng chiết siêu âm Các acid phenolcarboxylic, acid carsonic va acid rosmarinic được chiét tir cay Rosmarinus officinalis cing
sử dụng kỹ thuật chiết siêu âm với dung dịch ion cho kết quả thu được tốt
hơn phương pháp truyền thống
2.6.2 Chiết bằng enzyme (EAE)
Một số hợp chất trong sinh vật phân bồ trong tế bào chất, một số khác
lại nằm trong mạng lưới polysaccharide-lignin thông qua các liên kết hydro
và liên kết kị nước chúng rất khó dé tách ra nếu sử dụng các dung môi
theo phương pháp chiết tách thông thường Phương pháp chiết tách bằng
enzyme là phương pháp hiệu quả đẻ giải phóng các hợp chất trên cũng như tăng hiệu suất quá trình tách chiết Việc thêm vào một enzyme đặc hiệu
Trang 37
như cellulase, -amylase và pectinase trong quá trình tách chiết sẽ làm tăng
hiệu quả do chúng có khả năng phá vỡ màng tế bào và thủy phân cấu trúc của các polysaccharide, lipid
Phương pháp chiết enzyme gồm 2 kỹ thuật chính: 1) Chiết lỏng sử dụng enzyme (EAAE); 2) Ép lạnh sử dụng enzyme (EACP)
Thông thường, kỹ thuật enzyme lỏng được dùng chủ yếu cho chiết đầu từ hạt Trong kỹ thuật EACP enzyme được dùng để thủy phân màng tế bào của hạt vì trong hệ này không tổn tại liên kết polysaccharide-protein
trong khi EAAE lại có
Q trình tách chiết bằng phương pháp này phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như thành phần cấu tử enzyme và nịng độ kích thước mẫu, tỉ lệ rắn: lỏng, thời gian thủy phân và độ âm của mẫu EACP là một phương
pháp được sử dụng đẻ tách chiết các hoạt chất từ dầu hạt nhờ đặc tính của
nó là ít độc và không dễ cháy Sử dụng tách chiết dầu dùng enzyme cho kết quả hàm lượng acid béo tự do và các phosphorus cao hơn so với phương pháp chiết hexane thông thường Phương pháp EAE được cho là một kỹ thuật thân thiện với môi trường trong tách chiết chất có hoạt tính và dầu bởi vì nó sử dụng nước thay cho các dung môi hữu cơ
Thực tế đã thử nghiệm sử dụng phương pháp EAE trong tách chiết các hợp chát chống oxy hóa từ bã nho trong quá trình sản xuất rượu và đã tìm thấy mối tương quan giữa hiệu suất tổng phenol thu được với tỉ lệ màng tế bao mau bị phá hủy bởi enzyme, nồng độ của các phenolic từ bã cây &#i»es nigrum tăng khi sử dụng các lại enzyme khác nhau Khi tách chiết hàm lượng tổng phenolic tir v6 5 loai cam quýt khác nhau (Yen Ben lemon, Meyer lemon, grapefruit, quyt va cam) bằng kỹ thuật EAAE sử dụng nhiều
loại enzyme khác nhau và đã thu nhận được rất nhiều celluzyme MX Một
phát hiện khác là hàm lượng các chất phenolic chống oxy hóa tăng đáng kể khi tăng nồng độ sử dụng enzyme Hỗn hợp enzyme pectinolytic và
cellulolytic đã sử dụng với tỉ lệ 2:1 để tách chiết các hoạt chất (acid
Trang 38loại enzyme khác nhau: celluclast, peclinex và novoferm trong kỹ thuật EAE và thấy rằng novoferm đạt hiệu quả tốt nhất thu được phenolic
2.6.3 Chiết sử dụng vi sóng
Chiết lị vi sóng (MAE) được sử dụng như là một phương pháp tiêu chuân đề gom các chất tan được vào trong một hỗn hợp lỏng từ một lượng lớn mẫu sử dụng năng lượng vi sóng Vi sóng là năng lượng điện trường có tần số trong khoảng 300MHz - 300GHz Vi sóng được tạo ra từ hai trường dao động vng góc giữa là điện trường và từ trường
Nguyên tắc gia nhiệt trong phương pháp này dựa vào các tương tác trực tiếp trên các cực của mẫu Năng lượng điện trường được chuyền thành
nhiệt năng theo hai cơ chế sau: sy dan điện ion và sự quay lưỡng cực Đối
với cơ chế dẫn điện ion, nhiệt năng được tạo ra do sự cản trở của môi
trường với dòng di chuyền của các ion Mặt khác, các ion cũng thường xuyên đi chuyển do sự thay đổi về điện trường thường xuyên Việc di
chuyên liên tục này làm các phân tử va chạm với nhau và tạo ra nhiệt Cơ
chế của phương, pháp này bao gồm 3 bước cơ bản như sau: ï) tách các chất
tan được ra khỏi mẫu sử dụng nhiệt và áp suất, ii) khuếch tán dung môi vào mẫu iii) giải phóng các chất tan được vào dung mơi
Phương pháp MAE có một số ưu điểm như gia nhiệt nhanh, giảm khoảng cách gia nhiệt, giảm bớt thiết bị và tăng hiệu suất sản phẩm Kỹ thuật này giúp chiết tách nhanh hơn so với phương pháp thông thường MAE được xem là kỹ thuật thân thiện với môi trường do nó sử dụng nước hoặc cồn thay cho dung môi hữu cơ
Đối với chiết tách các polyphenol và cafeine từ lá chè tươi, chạy MAE trong 4 phút cho hiệu suất sản phẩm cao hơn so với các phương pháp khác ở điều kiện nhiệt độ phòng và tiến hành trong 20 giờ Các ginsenoside chiết từ rễ cây sâm thu được xử lý MAE trong 1Š phút cũng cho hiệu quả cao hơn chiết truyền thồng trong 10 giờ Chiết MAE đối với các hợp chất
flavoligin va silybinin tir Silybum marianum da cho thay uu điểm so với
các kỹ thuật khác như Soxhlet và ngâm chiết Chiết một số hợp chất có
hoạt tính (E- và Z- gi sgolsterone, cinnamaldehyde và tanin) từ nhiều cây khác nhau dưới điều kiện tối ưu và thấy rằng sử dụng MAE cho hiệu quả
nhanh và đễ dàng hơn so với phương pháp truyền thống Sử dụng MAE đề
chiết các acid phenolic từ cám bột mì và ngô; và MAE cũng được sử dụng dé chiét flavonoid va phenolic tir qua Chaenomeles sinensis của Trung
Trang 39
Quốc và đã được tối ưu hóa các yếu tố: nồng độ dung môi thời gian chiết và năng lượng của vi sóng
2.6.4 Chiết sứ dụng xung điện trường (PEF)
Kỹ thuật š xung điện trường (PEF) đã được sử dụng một cách hiệu quả để tăng cường các quá trình như nén, ép, chiết khuếch tán trong nhiều thập kỉ qua
Nguyên lý của phương pháp này là phá hủy cấu trúc màng tế bảo đề tăng hiệu suất chiết tách Khi xử lý tế bào trong điện trường một xung diện chạy xuyên qua màng của tế bào đó Dựa trên độ lưỡng cực của các phân
tử màng tế bào, xung điện đó làm chia tách phân tử ra theo điện tích của
chúng Sau khi vượt qua giá trị giới hạn là IV của màng tế bào, lực đây bắt đầu xuất hiện giữa các phân tử mang điện tích và hình thành nên các lỗ hỏng trên một số vùng ở màng tế bào từ đó làm tăng tính thấm Thông thường, một mạch đơn giản với các xung phân rã theo cấp số nhân được sử dụng trong chiết tách Cấu tạo của nó là một buồng có hai điện cực nguyên liệu thực vật được đặt vào buồng này Tùy theo cách thiết lập chế độ mà có thể sử dụng kỹ thuật này liên tục hoặc gián đoạn Hiệu quả của phương pháp này tương quan chặt chẽ tới các thông số của quá trình bao gồm: độ mạnh từ trường, năng lượng đầu vào, số lượng xung điện, nhiệt độ phản ứng và đặc tính của nguyên liệu mẫu Phương pháp PEF có the lam tăng tốc độ chuyền khối bằng cách phá hủy cấu trúc màng tế bào của nguyên liệu qua đó làm tăng hiệu suất và giảm thời gian tách chiết
Kỹ thuật này được áp dung nhằm tăng cường khả năng giải phóng các chất nội bào trong tế bào sinh vật Sử dụng phương pháp này ở điện trường,
trung bình (E- 500 va 1000 V/em; trong 107 — 10? giây) cho thấy nó phá
hủy màng tế bào mà chỉ làm tăng nhiệt độ không đáng kể Qua đó, phương pháp này có thể hạn chế đến tối thiểu sự phân hủy của các hợp chất nhạy
nhiệt PEF còn được sử dung đề xử lý bước đầu nguyên liệu trước khi tiến
hành chiết tách theo phương pháp truyền thống
Ứng dụng PEF (tại IkV/em với độ tiêu thụ năng lượng thấp 7k.J/kg)
trong quá trình chiết lỏng rắn của betanin từ củ cải đường cho thấy hiệu suất cao rõ rệt hơn so với việc làm đông rồi đem ép truyền thống Hiệu
suất thu phytosterol từ ngô tăng 32.4% và isoflavonoid (genistein và daidzein) từ đậu nành tăng 20 — 21% khi áp dụng PEF vào quá trình xử lý
bước đầu Tách chiết các hợp chất có hoạt tính như anthocyanin từ sản
Trang 40phẩm phụ của nho bằng rất nhiều phương pháp khác nhau và nhận xét rằng việc chiết các anthocyanin monoglucoside bằng PEF đạt hiệu quả cao nhất Việc ứng dụng kỹ thuật PEF lên nho trước khi đem ngâm có thể làm giảm thời gian ngâm chiết và tăng hoạt tính của chúng (hàm lượng anthocyanin va tong polyphenolic) trong qua trinh san xuất rượu Tính thắm của bề mặt Merlot khi sử dụng xung điện trường làm tăng khả năng chiết tách polyphenol va anthocyanin
2.6.5 Chiết lỏng siêu téi han (SFE)
Sử dụng chất lỏng siêu tới hạn đề tách chiết được đề xuất bởi Hannay và Hogarth (1879) tuy nhiên người có cơng lớn là Zosel vào năm 1969 đã cơng bó quy trình tách loại caffeine khỏi cà phê Từ đó tới này, phương pháp này đã có được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như dược học, phân tích polyme, phân tích
thực phẩm, môi trường Hiện nay, rất nhiều ngành công nghiệp đã ứng dụng công nghệ này trong sản xuất đặc biệt công nghiệp sản xuất cà phê
dịch chiết CO; lỏng
làm nóng Bom nén làm lạnh
Hình 2.4 Chiết lỏng siêu tới hạn (SFE)
Bất kì nguyên tổ trái đất nào đều nằm trong 3 trạng thái sau: rắn, lỏng,
khí Trạng thái siêu tới hạn là một trạng thái đặc biệt khi một chất đạt tới nhiệt độ và áp suất vượt ngoài ngưỡng tới hạn của nó Theo định nghĩa, điểm tới hạn là trạng thái khi nhiệt độ (Te) và áp suất (Pe) vượt khỏi
ngưỡng mà khí có thê hóa lỏng Trong trạng thái siêu tới hạn các đặc tính riêng của khí và lỏng biến mắt, nghĩa là hợp chất đó khơng thé hóa lỏng
bằng cách điều chỉnh áp suất hay nhiệt độ Trạng thái tới hạn lỏng sở hữu
nhưng đặc tính của khí như độ khuếch tán, độ nhớt và sức căng bé mat,
mật độ như chất lỏng và khả năng hòa tan tốt Các đặc tính này giúp ta có