DÞch chiÕt tõ t¶o Spirulina cã ho¹t tÝnh sinh häc cao, thÝch hîp cho nghiªn cøu sö dông trong s¶n xuÊt n−íc uèng chøc n¨ng b¶o vÖ søc kháe con ng−êi.. J., 2008: Thermal degradati[r]
(1)33(4): 60-65 T¹p chÝ Sinh häc 12-2011
NGHIÊN CứU TáCH CHIếT Và XáC ĐịNH MộT Số ĐặC TíNH CủA DịCH CHIếT Từ TảO SPIRULINA
HOàNG VĂN TUấN, PHạM HƯƠNG SƠN
Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Viện ứng dụng công nghệ
PHạM THU THủY
Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội
Tảo Spirulina (Arthrospira) thuộc chi
Spirulina, hä Oscillatoriaceae, bé Oscillaloriales
(Nostocales), líp Cyanophyceae
(Cyanobacteria: vi khuẩn lam), ngành Cyanophyta (Cyanochloronta), có dạng hình xoắn lị xo với 5-7 vịng xoắn nhau, sợi khơng phân nhánh Spirulina có giá trị dinh d−ỡng cao nhờ nguồn cung cấp protein dồi dào hàm l−ợng cân nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao nh− phycocyanin, chlorophyll, beta-caroten, axit gama-linolenic, axit alpha-linolenic
Dịch chiết tảo Spirulina chứa nhiều thành phần chức hòa tan, đH đ−ợc chứng minh là có khả kìm hHm phát triển tế bào MCF-7, dạng tế bào gây ung th− vú ng−ời [6] Nghiên cứu tác giả Kumari nnk (2010) [5] đH cho thấy, dịch chiết Spirulina có khả ổn định hàm l−ợng đ−ờng máu của chuột bị tiểu đ−ờng, số cholesterol HDL cũng giảm đáng kể Hoạt tính chống oxy hóa kháng vi sinh vật dịch chiết Spirulina đH đ−ợc nhiều nghiên cứu đề cập đến, đặc biệt có khả kháng đ−ợc nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh nh− Salmonella, Escherichia coli [7]
Trong thành phần dịch chiết tảo Spirulina, chiếm số l−ợng nhiều phải kể đến phycocyanin, dạng chất màu chủ yếu có tảo Spirulina Phycocyanin đ−ợc biết đến với khả bắt giữ gốc tự do, đặc tính quan trọng điều trị số bệnh nh− viêm nhiễm, ung th−, chống oxy hóa… Vì vậy, phycocyanin đH trở thành đối t−ợng nghiên cứu ứng dụng phổ biến lĩnh vực nh− y học, d−ợc phẩm sản xuất thực phẩm [10]
Mục đích nghiên cứu nhằm đ−a ph−ơng pháp tách chiết đơn giản để thu dịch chiết chứa thành phần hịa tan có hoạt tính sinh học cao từ tảo Spirulina, kiểm tra xác định một số đặc tính chức dịch chiết từ làm sở cho q trình ứng dụng dịch chiết
Spirulina s¶n xt n−íc ng chức
I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
1. Nguyên liệu
Bột tảo Spirulina platensis Trung t©m Sinh häc Thùc nghiƯm, ViƯn øng dơng Công nghệ cung cấp
Các hóa chất tinh khiÕt sư dơng cho nghiªn cøu cã ngn gốc từ Anh, Mỹ, Đức, Trung Quốc 2. Phơng pháp
a. Phơng pháp tách chiết
Sinh khối tảo Spirulina đ−ợc phá vỡ tế bào trong dung môi khác gồm: N−ớc, ethanol, methanol, hexane Quá trình phá vỡ tế bào đ−ợc thực qua ph−ơng pháp: Ngâm, lạnh đông nhả lạnh đông Ph−ơng pháp ngâm đ−ợc thực thời gian từ - 18 nhiệt độ phịng Ph−ơng pháp lạnh đơng nhả lạnh đông đ−ợc tiến hành -20oC thời gian lạnh đông (giờ) 1, 2, 3, chu kỳ nhả lạnh đông (lần) 1, 2, 3, 4, Hỗn hợp sau phá vỡ tế bào đ−ợc ly tâm, lọc hút chân không thu dịch chiết chứa thành phần chức hòa tan tảo Spirulina
b. Ph−ơng pháp xác định hiệu tách chiết
(2)bao vây gốc tự (DPPH) hàm lợng phycocyanin (PC) có dịch chiết PC đợc tÝnh theo c«ng thøc sau [9]:
[A620- 0,474(A652)] PC =
5,34
Trong đó: PC hàm l−ợng phycocyanin có trong dịch chiết (mg/ml); A620 độ hấp thụ màu của mẫu b−ớc sóng 620 nm; A625 độ hấp thụ màu mẫu b−ớc sóng 625 nm
c. Ph−ơng pháp xác định hoạt tính
Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đ−ợc thực phiến vi l−ợng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo ph−ơng pháp Vander Bergher Vlietlinck (1991) [12] Các chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng gồm:
Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 25923), Bacillus subtillis
(ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC 12222), Aspergillus niger (439), Fusarium
oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC
7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Xác định hoạt tính chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa mẫu đ−ợc xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự (DPPH) Phản ứng đ−ợc tiến hành theo ph−ơng pháp Shela và cộng (2003) [11] Dựa nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo gốc tự bền dung dịch EtOH bHo hoà Khi cho chất thử nghiệm vào
hỗn hợp này, chất có khả làm trung hoà bao vây gốc tự làm giảm c−ờng độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Hoạt tính chống ơxy hố đ−ợc đánh giá thơng qua giá trị hấp thụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc máy Elisa ở b−ớc sóng 515 nm
C¸c mÉu cã biĨu hiƯn ho¹t tÝnh (SC ≥ 50%)
sẽ đ−ợc thử nghiệm để tìm giá trị SC50 Giá trị SC50 đ−ợc xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động chất thử mà 50% gốc tự tạo DPPH đ−ợc trung hòa chất thử
d. Phơng pháp xử lý số liệu
Cỏc số liệu phân tích đ−ợc xử lý thống kê trên phần mềm OriginPro 8.5, giá trị đ−ợc biểu diễn d−ới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± StDev)
II KÕT QUả Và THảO LUậN
1. nh hng ca cỏc dung mơi khác đến tính chất dịch chiết
ảnh h−ởng dung môi khác đến hiệu tách thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan tảo Spirulina đH đ−ợc nghiên cứu Kết phân tích hàm l−ợng phycocyanin thuộc tính chức dịch chiết thông qua khả bắt gốc tự dịch chiết đ−ợc trình bày bảng hình
B¶ng
ảnh h−ởng loại dung môi tỷ lệ sinh khối đến thuộc tính dịch chiết Loại dung mơi Tỷ lệ sinh khối (g/100 ml) PC (mg/ml) SC (%) StDev
N−íc 7 1,40 32 0,10
Etanol 5 2,33 44 0,15
Hexan 6 1,93 35 0,05
Metanol 4 2,03 43 0,11
Kết phân tích rằng, sử dụng dung môi etanol cho hiệu tách chiết cao nhất, hàm l−ợng PC đạt 2,33 mg/ml Tiếp theo metanol (2,03 mg/ml), hexan (1,93 mg/ml), thấp nhất n−ớc (1,4 mg/ml) (hình 1) Tuy nhiên, số liệu bảng cho thấy, sử dụng dung môi metanol, hàm l−ợng sinh khối cho hiệu chống oxy hóa dịch chiết t−ơng đ−ơng với etanol, lần l−ợt SC 43%,
44% Trong nghiên cứu tác giả Cho nnk (1999) [4] cho thấy, khả chống oxy hóa dịch chiết sử dụng dung môi metanol cao so với dung môi n−ớc Điều đ−ợc nghiên cứu Mala nnk.(2009) [7], acetone dung mơi đ−ợc tác giả lựa chọn
Tuy nhiên, mục đích sử dụng dịch chiết
(3)trÞ phycocyanin có dịch chiết, nghiên cứu ethanol (5 g Spirulina/100 ml etanol) đợc lựa chọn dung môi tách chiết thu dịch chiết chứa thành phần chức từ tảo
Spirulina tÝnh an toµn thùc phÈm Sư
dụng etanol dung môi tách chiết đợc lựa chọn nghiên cứu Herrero nnk (2005) [8]
0 10
0
Metanol Etanol N−íc Hexan
Tû lƯ sinh khèi/dung m«i (g/100 ml)
Ph
yc
oc
ya
ni
n
(m
g/
m
l)
Hình Hàm lợng phycocyanin có dịch chiết từ tảo Spirulina ở dung môi tỷ lệ sinh khèi kh¸c
2. ảnh h−ởng nồng độ dung mơi đến tính chất dịch chiết
Sử dụng etanol dải nồng độ khác từ 30 - 75% nhằm nghiên cứu ảnh h−ởng nồng độ etanol đến khả phá vỡ tế bào tảo
Spirulina KÕt qu¶ cho thÊy, sư dơng dung m«i
etanol 55% cho hiệu phá vỡ tế bào cao nhất, biểu thị hàm l−ợng PC đạt 2,42 mg/ml, khả năng bắt gốc tự dịch chiết đạt SC 52% ở nồng độ etanol 60%, hàm l−ợng PC đ−ợc giải phóng nhiều (2,45 mg/ml) (hình 2)
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1.4
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 PC
PC (mg/ml) SC (%)
Tỷ lệ etanol/nước (% etanol)
20 30 40 50 SC
Hình ảnh h−ởng tỷ lệ etanol/n−ớc đến tính chất dịch chiết từ tảo Spirulina
3. ảnh h−ởng ph−ơng pháp phá vỡ tế bào đến tính chất dịch chiết
Sinh khối tảo Spirulina đ−ợc phá vỡ tế bào trong dung môi etanol 55% sử dụng ph−ơng pháp khác ngâm, lạnh đông nhả lạnh đông Do đặc tr−ng phycocyanin bền nhiệt độ phòng [3] nên ảnh h−ởng nhiệt độ
q trình ngâm khơng đ−ợc xem xét nghiên cứu Dịch sau phá vỡ tế bào đ−ợc ly tâm tốc độ 6000 vịng/10 phút, lọc hút chân khơng chân không để loại dung môi thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan tảo
Spirulina
Kết từ bảng hình cho thÊy, ph¸ vì
(4)tế bào theo ph−ơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông với thời gian lạnh đông (Ft) giờ, chu kỳ nhả lạnh đông (Tc) lần cho hiệu tách chiết cao rút ngắn đ−ợc thời gian so với ph−ơng pháp ngâm thơng th−ờng Hàm l−ợng phycocyanin khả bắt gốc tự do dịch chiết Spirulina đ−ợc xác định lần l−ợt 2,67 mg/ml, 65% Chu kỳ nhả lạnh đông đ−ợc đ−a nghiên cứu Li nnk
(2005) [2] lần Trong nghiên cứu tác giả Rachen nnk (2009) [9] nhằm nghiên cứu khả năng ổn định phycocyanin khoảng nhiệt độ pH khác nhau, ph−ơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông đ−ợc đề cập đến Khả chống oxy hóa thơng qua phản ứng bao vây gốc tự dịch chiết Spirulina đ−ợc đ−a nghiên cứu Herrero nnk (2004) [8] 66,8%.
B¶ng
ảnh h−ởng ph−ơng pháp phá vỡ tế bào n tớnh cht ca dch chit
Phơng pháp phá vỡ tế bào Thời gian (giờ) PC (mg/ml) SC (%) StDev
Ng©m 14 2,46 51 0,12
Lạnh đông nhả lạnh đông 8 2,67 65 0,09
Hình ảnh h−ởng thời gian lạnh đông chu kỳ nhả lạnh đông
đến hàm l−ợng PC có dịch chiết (Ft Thời gian lạnh đông; Tc Chu kỳ nhả lạnh đơng) 4. Xác định số hoạt tính dịch chiết từ tảo Spirulina
B¶ng
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ tảo Spirulina
Ký hiệu mẫu Chủng vi sinh vật kiểm định Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: ààààg/ml)
E coli 50
P aeruginosa 200
B subtillis 50
S aureus 100
A niger 200
F oxysporum -
S cerevisiae 200
Sp-ex
(5)Bảng
Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tảo Spirulina
Kớ hiệu mẫu Nồng độ mẫu (àg/ml) SC% SC50 (àg/ml) Kết
§èi chøng (+) 50 78,5 ± 0,3 28,19 D−¬ng tÝnh
§èi chøng (-) - 0,0 ± 0,0 - ¢m tÝnh
Sp-ex 100 65,68 ± 0,1 20,18 D−¬ng tÝnh
Ghi chú: Sp-ex Dịch chiết Spirulina; Đối chứng (+) Vitamin C; Đối chứng (-) DPPH ĐH tiến hành kiểm tra xác định số hoạt
tính sinh học dịch chiết từ tảo Spirulina, từ đó làm sở cho nghiên cứu ứng dụng dịch chiết sản xuất n−ớc uống chức Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật hoạt tính chống oxy hóa dịch chit t to
Spirulina đợc trình bày bảng Kết
qu cho thy, chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng có F oxysporum C
albicans không biểu thị hoạt tính kháng, khả
năng kháng mạnh E coli v B
subtillis Khả chống oxy hóa cđa dÞch
chiết đạt 65,68%, giá trị SC50 20,18 àg/ml Nghiên cứu tác giả Mala nnk (2009) [7] cũng rằng, dịch chiết từ tảo Spirulina có khả kháng vi sinh vật cao, chủng vi sinh vật đ−ợc sử dụng nghiên cứu thể hiện kết kháng Salmonella typhi,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, E coli vµ Staphylococcus aureus
III KÕT LUËN
Nghiên cứu đH xác định đ−ợc ph−ơng pháp tách chiết đơn giản nhằm thu dịch chiết chứa các thành phần hòa tan từ tảo Spirulina với điều kiện nh− sau: Tách chiết theo ph−ơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông với thời gian lạnh đông giờ, chu kỳ nhả lạnh đông lần, sử dụng dung môi etanol 55%, tỷ lệ sinh khối sử dụng là g/100 ml dung môi Dịch chiết đ−ợc tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa kháng vi sinh vật kiểm định với kết quả: khả bắt giữ gốc tự dịch chiết đạt SC 65,68%, SC50 20,18 àg/ml; kháng đ−ợc chủng vi sinh vật kiểm định gồm E coli, P aeruginosa, B subtillis, S aureus, A niger S cerevisiae
DÞch chiết từ tảo Spirulina có hoạt tính sinh học cao, thích hợp cho nghiên cứu sử dụng sản xuất nớc uống chức bảo vệ sức khỏe con ngời Năm 2005, tác giả Trần Bích Lam vµ
nnk [1] đH tiến hành nghiên cứu tách chiết thành phần chức từ tảo Spirulina Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung vào thu nhận phycocyanin, thành phần khác không đ−ợc cp ti
TàI LIệU THAM KHảO
1. Trần Bích Lam, Nguyễn Thị Mỹ Phúc, Phạm Quang Sơn, 2005: Nghiên cứu thu nhận phycocyanin tõ t¶o Spirulina Science & Technology Development, 8(7): 70-74 2. Li B., Zhang X., Gao M., Chu X., 2005:
Effects of CD59 on antitumoral activities of phycocyanin from Spirulina platensis Biomedicine & Pharmacotherapy, 59: 551-560
3. Francine S Antelo, Jorge A V Costa, Kalil S J., 2008: Thermal degradation kinetics of the phycocyanin from Spirulina platensis Biochemical Engigeering Journal, 41: 43-47
4. Cho J Y, Jin H J, Lim H J, John N C Whyte, Hong Y K., 1999: Growth activation of the microalga Isochrysis galbana by the aqueous extract of the seaweed Monotroma nitidum Journal of Applied Phycology, 10: 561-567
5. Jalaja K D., Praveen J D., 2010: Ameliorative potential of aqueous cell extract of Spirulina platensis on diabetes associated metabolic alterations The Bioscan, 5(3): 487-489
6. Ravi M., Lata De S., Azharuddin S., Paul S F D., 2010: The beneficial effects of Spirulina focusing on its immunomodulatory and antioxidant properties Nutrition and Dietary Supplements, 2: 73-83
(6)Umadevi G., 2009: Screening for antimicrobial activity of crude extracts of Spirulina platensis Journal of Cell and Tissue Research, 9(3): 1951-1955
8. Herrero M., Ib¸nez E., Senorans J., Cifuentes A., 2004: Pressurezed liquid extracts from Spirulina platensis microalga determination of their antioxidant acitvity and preliminary analysis by micelar electrokinetic chromatography Journal of Chromatography A, 1047: 195-203
9. Rachen D., Natapas Ph, Suwayd N., 2009: Phycocyanin extraction from Spirulina platensis and extract stability under various pH and temperature As J Food Ag-Ind., 2(04): 819-826
10.Romay Ch., Gonz¸lez R., Ledãn N., Remirez D., Rimbau V., 2003:
C-Phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects Current Protein and Peptide Science, 4: 207-216
11.Shela G., Olga M B., Elena K., Antonin L., Nuria G M, Ratiporn H., Yong-Seo P., Soon-Teck J., Simon T., 2003: Comparison of the contents of the main biochemical compounds and antioxidant activity of some Spanish olive oils as determined by four different radical scavenging tests The Journal of Nutritional Biochemistry, 14(3): 154-159
12.Vanden Berghe D A., Vlietinck A J., 1991: Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants Academic Press, London In: Dey, P Mp Harbone, J B (Eds) pp 47-69
A STUDY ON EXTRACTION AND DETERMINATION OF SOME PROPERTIES OF SPIRULINA EXTRACTS
HOANG VAN TUAN, PHAM HUONG SON, PHAM THU THUY
SUMMARY
The purpose of this study is establish a simple method for obtaining extracts containing soluble bioactive from Sprulina algae Determination of functional properties of extracts to give the basis to apply for the production of functional beverage The cyanobacterium Spirulina platensis has been considered to be an important subject for biotechnological research due to its nutritional importance S platensis is a blue-green microalgae which can produce large quantities of high value products such as beta carotene, phycoyanin, chlorophyll, gama linolenic acid… In this study, various solvents for included methanol, ethanol, hexane and water were used to select extracted solvent obtaining aqueous extracts from Spirulina algae The process of extraction was done by two methods: Soaking, freezing and thawing The extracts were tested antioxidant activity by free radicals scavenging capacity and antimicrobial activity The data indicated that using ethanol 55%, the rate of biomass/solvent is g/100 ml The freezing and thawing extraction method with freezing time (Ft) in hours, thawing cycle in times gave the highest result Phycocyanin level in the extract reached 2.67 mg/ml, scavenging capacity (SC) reached 65,68%; SC50 20.18 µg/ml The extract can against six tested microorganism including E coli, P aeruginosa, B subtillis, S aureus, A niger and S cerevisiae
Keywords: Spirulina, extracts, phycocyanin, Freezing, Thawing