Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học

PGS TS Nguyễn Hồng Lộc Giáo trình Nhập mơn Cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học Huế Năm 2007 NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC HUẾ Địa chỉ: 01 Điện Biên Phủ, Huế - Điện thoại: 054.834486 Chịu trách nhiệm xuất bản: Giám đốc: Nguyễn Xuân Khoát Tổng biên tập: Hồng Hữu Hịa Người phản biện: PGS TS Lê Trần Bình Biên tập nội dung: PGS Nguyễn Khải Biên tập kỹ thuật-mỹ thuật: Hồng Minh Trình bày bìa: Nguyễn Hồng Lộc Chế vi tính: Nguyễn Hồng Lộc NHẬP MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC In 500 khổ 16×24 cm, Công ty In Thống kê Sản xuất Bao bì Huế, 36 Phạm Hồng Thái, Huế Số đăng ký KHXB: 151-2007/CXB/01-03/ĐHH Quyết định xuất số: 07/QĐ-ĐHH-NXB, cấp ngày 12/4/2007 In xong nộp lưu chiểu tháng năm 2007 Phần I Các khái niệm nguyên lý Nhập môn Công nghệ sinh học Chương Mở đầu I Định nghĩa công nghệ sinh học Định nghĩa tổng quát Có nhiều định nghĩa cách diễn đạt khác công nghệ sinh học tùy theo tác giả, tất thống khái niệm sau đây: Công nghệ sinh học trình sản xuất sản phẩm quy mơ cơng nghiệp, nhân tố tham gia trực tiếp định tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống thể sinh vật hoạt động lĩnh vực sản xuất xem lò phản ứng nhỏ Đầu năm 1980, bắt đầu hình thành cơng nghệ sinh học đại lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học tế bào biến đổi di truyền Công nghệ sinh học đại đời với xuất kỹ thuật gen Cơ sở sinh học áp dụng bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, ngun lý kỹ thuật máy tính Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học cách tổng quát nhất: - Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ sử dụng phận hay tế bào riêng rẽ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm chúng - Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ chuyển hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm chức gen Sự khác biệt rõ rệt hai định nghĩa thuộc đối tượng tác động công nghệ sinh học: UNESCO xem quan, phận, tế bào chức riêng rẽ sinh vật đối tượng, Trường Luật Stanford lại coi gen đối tượng tác động cơng nghệ Từ định nghĩa trên, phân biệt hai nhóm cơng nghệ sinh học là: Nhập môn Công nghệ sinh học 1.1 Công nghệ sinh học truyền thống (traditional biotechnology) Bao gồm: + Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional fermentations) + Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation technology) + Sản xuất phân bón thuốc trừ sâu vi sinh vật (production of microbial fertilizer and pesticide) + Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass production) + Nhân giống vơ tính ni cấy mơ tế bào thực vật (plant micropropagation) + Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization) 1.2 Công nghệ sinh học đại (modern biotechnology) Bao gồm: + Nghiên cứu genome (genomics) + Nghiên cứu proteome (proteomics) + Thực vật động vật chuyển gen (transgenic animal and plant) + Động vật nhân (animal cloning) + Chip DNA (DNA chip) + Liệu pháp tế bào gen (gene and cell therapy) + Protein biệt dược (therapeutic protein) + Tin sinh học (bioinformatics) + Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology) + Hoạt chất sinh học (bioactive compounds) Nội dung khoa học công nghệ sinh học Cơng nghệ sinh học phân loại theo kiểu khác Xét góc độ tác nhân sinh học tham gia vào trình cơng nghệ sinh học, chia thành nhóm sau: - Cơng nghệ sinh học thực vật (plant biotechnology) - Công nghệ sinh học động vật (animal biotechnology) - Công nghệ sinh học vi sinh vật (microbial biotechnology) Nhập môn Công nghệ sinh học - Công nghệ sinh học enzyme hay công nghệ enzyme (enzyme biotechnology) Gần đây, nhân tố sinh học tế bào cịn hình thành khái niệm cơng nghệ protein (protein engineering) công nghệ gen (gene engineering) Công nghệ protein công nghệ gen xuyên suốt trở thành công nghệ chìa khóa nằm cơng nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật công nghệ sinh học vi sinh vật Nhờ kỹ thuật đọc trình tự gen kỹ thuật DNA tái tổ hợp, công nghệ gen đạt thành tựu to lớn mang tính định, mở giai đoạn phát triển Đó nghiên cứu tồn genome nhiều sinh vật, đáng ý việc giải mã genome người lúa Đó việc hình thành phương hướng nghiên cứu, ứng dụng kinh doanh sinh vật biến đổi gen (gentically modified organism-GMO) thực phẩm biến đổi gen (gentically modified food-GMF) Cơng nghệ protein có tiềm ứng dụng lớn việc sản xuất protein tái tổ hợp (recombinant protein) dùng làm dược phẩm điều trị bệnh hiểm nghèo interferon, interleukin, insulin Mặt khác, tùy vào đối tượng phục vụ cơng nghệ sinh học, chia lĩnh vực công nghệ sinh học khác như: - Công nghệ sinh học nông nghiệp (biotechnology in agriculture) - Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm (biotechnology in food processing) - Công nghệ sinh học y dược (biotechnology in medicinepharmaceutics) - Công nghệ sinh học môi trường (environmental biotechnology) - Công nghệ sinh học vật liệu (material biotechnology) - Cơng nghệ sinh học hóa học (biotechnology in chemical production) - Công nghệ sinh học lượng (biotechnology in energy production) Một số tác giả cho lồi người áp dụng cơng nghệ sinh học từ lâu vào hoạt động sản xuất, ví dụ: công nghệ sản xuất đồ uống (rượu, bia ) cơng nghệ sản xuất thực phẩm (men bánh mì, nước mắm, tương, chao ) Do đó, việc định nghĩa phân loại công nghệ sinh học giai đoạn phát triển ban đầu có ý nghĩa quan trọng để có Nhập mơn Cơng nghệ sinh học sách đầu tư hợp lý ưu tiên cho công nghệ sinh học Dưới lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học quan tâm hàng đầu Các lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học 3.1 Công nghệ sinh học nông nghiệp Lĩnh vực nông nghiệp mục tiêu phát triển hàng đầu công nghệ sinh học nhiều nước công nghiệp giới, thực tế hoạt động nghiên cứu phát triển, sản xuất thương mại hóa lĩnh vực nhiều tập đoàn lớn quan tâm Có thể nêu ba lĩnh vực là: - Giống trồng vật ni nhân vơ tính chuyển gen mang đặc điểm nông-sinh quý phương pháp truyền thống không tạo được, đồng thời lại bảo vệ thông qua quyền tác giả - Các chế phẩm sinh học dùng bảo vệ trồng vật nuôi, như: vaccine, thuốc trừ sâu bệnh phân bón vi sinh - Cơng nghệ bảo quản chế biến nông-hải sản chế phẩm vi sinh enzyme Giá trị nông sản nâng lên nhiều lần quy trình cơng nghệ kèm trang thiết bị dạng hàng hóa kinh doanh chuyển giao cơng nghệ Ngồi liệt kê thêm số lĩnh vực khác: - Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm: Các enzyme (amylase, rennin, β-galactosidase, invertase, gluco-isomerase, pectinase), chất phụ gia thực phẩm (các chất tạo ngọt, hương vị, tạo màu, bột nở làm ổn định, vitamin, amino acid, chất chống oxy hóa, chất bảo quản, chất hoạt hóa bề mặt ) - Các loại thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (kháng sinh ) - Các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ với tính đặc hiệu tăng lên (các sản phẩm Bt, baculovirus, tuyến trùng ký sinh ) - Các hormone sinh trưởng thực vật (các cytokinin ) - Các hóa chất chẩn đốn bệnh cho động-thực vật Nhập môn Công nghệ sinh học 3.2 Cơng nghệ sinh học y dược Có lẽ thành tựu công nghệ sinh học thể rõ nét lĩnh vực y học Hiện nay, hầu hết sản phẩm quan trọng sau sản xuất sở công nghệ sinh học, bao gồm ứng dụng sau: - Các loại kháng sinh chất diệt khuẩn, loại vitamin chất bổ dưỡng, loại amino acid hỗn hợp chúng dịch truyền, loại vaccine loại hormone chữa bệnh - Các kit chuẩn dùng chẩn đốn bệnh chẩn đốn hóa sinh y dược - Cây trồng vật nuôi cấy chuyển gen sản sinh loại protein trị liệu mục tiêu đầu tư nhiều công ty y dược hàng đầu giới Cụ thể nghiên cứu sản xuất dược phẩm, kháng thể đơn dòng, interferon, hormone (hormone sinh trưởng, insulin, erythropoietin, thrombopoietin ), enzyme (urokinase, heparinase, alcohol dehydrogenase), protein khác (các kháng nguyên đặc hiệu, albumin, antithrombin, fibronectin ), kháng sinh, thuốc vitamin mới, dược phẩm có chất protein, loại vaccine viêm gan B, C, HIV, cúm, sốt rét, viêm não, tả tác nhân gây bệnh tiêu chảy, kit chẩn đốn như: chẩn đốn có mặt HIV, virus viêm gan B C máu, số chẩn đoán thai , liệu pháp gen: điều trị gen gây bệnh di truyền Hiện nay, công ty công nghệ sinh học y dược hàng đầu giới tập trung vào nghiên cứu tạo sản phẩm chống lại bệnh HIV/AIDS, loại bệnh ung thư, tiểu đường, bệnh tim mạch, bệnh truyền nhiễm 3.3 Công nghệ sinh học công nghiệp chế biến thực phẩm Công nghệ sinh học công nghiệp bao gồm lĩnh vực sản xuất loại enzyme amylase, cellulase protease dùng cơng nghiệp dệt, cơng nghiệp xà phịng mỹ phẩm, công nghiệp bánh kẹo, rượu bia nước giải khát… Sau loại sản phẩm công nghệ sinh học cơng nghiệp: - Cơng nghiệp hóa chất: Các hóa chất thơng dụng (ví dụ: acrylamide) sản xuất cơng nghệ sinh học Cơng nghiệp hóa học có Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 10 hiệu dùng chất xúc tác sinh học (enzyme), tái sinh xử lý dung môi đường sinh học - Quá trình chế biến tinh bột: Dùng enzyme công nghệ sinh học tạo để dịch hóa đường hóa tinh bột thành glucose chuyển hóa thành fructose - Cơng nghiệp làm sạch: Các chất giặt tẩy đại đuợc bổ sung protease enzyme khác làm vết bẩn protein, tinh bột chất béo - Công nghiệp bột gỗ giấy: Nhu cầu thị trường bảo vệ môi trường ngày lớn giấy chứa hợp chất chlorine gây ô nhiễm Quá trình sản xuất bột giấy gây nhiễm nặng Công nghệ sinh học đưa giải pháp sinh học để sản xuất bột giấy không gây ô nhiễm cách sử dụng loại nấm phân hủy lignin-cellulose để tạo bột Các enzyme dùng nâng cao chất lượng sợi chất lượng giấy - Công nghiệp khai khống phát khống sản Có hai cơng nghệ: lọc sinh học/oxy hóa sinh học kim loại, xử lý ô nhiễm kim loại tái sinh Công nghệ lọc kim loại dùng vi sinh vật thu kim loại q đồng, kẽm cobalt Công nghệ xử lý sinh học ô nhiễm áp dụng kim loại nặng 3.4 Công nghệ sinh học môi trường Tuy lĩnh vực phát triển ứng dụng công nghệ sinh học môi trường đáng kể Mọi q trình xử lý chất thải khơng khép kín xử lý sinh học khó thành cơng trọn vẹn Các hoạt động công nghệ sinh học môi trường trọng là: - Công nghệ phân hủy sinh học: Dùng thể sống phân hủy chất thải độc tạo nên chất khơng độc nước, khí CO2 vật liệu khác Bao gồm, cơng nghệ kích thích sinh học: bổ sung chất dinh dưỡng để kích thích sinh trưởng vi sinh vật phân hủy chất thải có sẵn mơi trường, cơng nghệ bổ sung vi sinh vật vào môi trường để phân hủy chất ô nhiễm, công nghệ xử lý ô nhiễm kim loại chất ô nhiễm khác thực vật nấm Nhập môn Công nghệ sinh học 11 - Dự phịng mơi trường: Phát triển thiết bị dị theo dõi ô nhiễm môi truờng, đặc biệt việc dị nước khí thải cơng nghiệp trước giải phóng mơi trường II Sơ lược lịch sử hình thành cơng nghệ sinh học Cơng nghệ sinh học phát triển ngày nay, qua ba giai đoạn chính: - Cơng nghệ vi sinh - Cơng nghệ tế bào (nuôi cấy mô tế bào động-thực vật ) - Công nghệ sinh học đại, tức công nghệ gen Cũng có tác giả gắn q trình phát triển nêu với ba cách mạng sinh học - Cách mạng sinh học lần thứ (đầu kỷ 20): sử dụng trình lên men để sản xuất sản phẩm acetone, glycerine, citric acid, riboflavin - Cách mạng sinh học lần thứ hai (sau chiến thứ 2): sản xuất kháng sinh, sản phẩm lên men công nghiệp glutamic acid, polysaccharide; có thành tựu đột biến, tạo chủng vi sinh vật cho suất hiệu cao, phát triển trình lên men liên tục phát phương pháp bất động enzyme để sử dụng nhiều lần - Cách mạng sinh học lần thứ ba (bắt đầu từ thập niên 1970): với phát quan trọng enzyme cắt hạn chế, enzyme gắn, sử dụng plasmid làm vector tạo dịng, đặt móng cho cơng nghệ sinh học hồn tồn cơng nghệ DNA tái tổ hợp Hai giai đoạn đầu, công nghệ vi sinh công nghệ tế bào, sử dụng hoạt động sinh học tế bào tách biệt, chưa biến đổi cấu trúc di truyền chúng, nên xem hai giai đoạn công nghệ sinh học truyền thống Phải đến cách mạng sinh học lần thứ ba nêu trên, đời công nghệ sinh học đại, giai đoạn phát triển cao công nghệ sinh học, mở kỷ nguyên sinh học Cũng chia lịch sử hình thành phát triển cơng nghệ sinh học theo giai đoạn sau: Nhập môn Công nghệ sinh học 12 thực phương pháp ly tâm để làm lắng chất qua gradient nồng độ saccharose CsCl Lymphokine Là cytokine sản xuất từ tế bào lympho Lysosome Một bào quan có màng bao bọc tế bào chất tế bào eukaryote Lysosome chứa nhiều enzyme thủy phân Mã di truyền (codon) Nhóm ba nucleotide nằm kề (bộ ba) phân tử mRNA xác định amino acid chuỗi polypeptide, tín hiệu kết thúc việc tổng hợp polypeptide Mã thoái biến (degenerate codon) Mã di truyền mà amino acid quy định số ba nitrogen base, khơng phải ba Thối biến đặc điểm vốn có mã di truyền tồn phổ biến sinh giới (nonsense codon) hay mã dừng (stop codon) (UGA) Maturation Q trình mRNA vừa phiên mã trải qua số biến đổi hóa học để trở thành mRNA hồn chỉnh sẵn sàng làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp protein Máy đếm nhấp nháy (scintillation counter) Máy dùng để xác định hoạt tính phóng xạ mẫu thí nghiệm Mật độ quang (optical density) Thông số cho phép đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng mơi trường dung dịch Mẫu dị DNA (DNA probe) Một đoạn RNA hay DNA chuyên biệt đánh dấu đồng vị phóng xạ hay hóa chất (chất phát huỳnh quang enzyme), dùng để định vị trình tự nucleic acid định thơng qua kỹ thuật lai phân tử (xem Northern blot, Southern blot ) Micelle Hạt dạng huyền phù dung dịch keo, cấu thành từ tập hợp hạt nhỏ đại phân tử Monomer Là phân tử đơn vị nhỏ, liên kết với phân tử đơn vị giống để hình thành phân tử lớn (polymer) Ví dụ nucleotide monomer nucleic acid amino acid monomer protein Nhập môn Công nghệ sinh học 341 Môi trường LB (LB medium) Môi trường nuôi cấy E coli, thành phần bao gồm (cho 100 mL): g bacto-trypton; 0,5 g dịch chiết nấm men g NaCl Nếu pha chế môi trường rắn để nuôi cấy đĩa petri bổ sung thêm 1,5 g bacto-agar Mồi (primer) Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với mạch DNA khn mẫu có mang đầu 3’-OH tự giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp chuỗi DNA Mucopeptide Dị polymer đại phân tử chứa hai loại đường amine số amino acid Người ta nhận thấy mucopeptide gắn liền với thành tế bào prokaryote Myeloma Nấm men hướng methyl Là nấm men sử dụng chất dẫn xuất methane nguồn carbon lượng chuyển hóa Nấm men Saccharomyces cerevisiae Là vi sinh vật nhân thật sử dụng nhiều công nghệ DNA tái tổ hợp Genome nấm men S cerevisiae khoảng 1,35×107 base-pair nhiều E coli khoảng 3,5 lần Nấm men thường dùng làm tế bào vật chủ để biểu protein có cấu trúc phức tạp cần trình hậu dịch mã mà vi khuẩn E coli đáp ứng Northern blot Kỹ thuật chuyển cố định RNA từ formaldehyde agarose gel (sau phân đoạn điện di) lên màng lai nylon nitrocellulose để lai với mẫu dò (probe) đánh dấu đồng vị phóng xạ [ -32P]dCTP digoxigenin-dUTP Tín hiệu lai sau phát phim X-quang (trường hợp [ -32P]dCTP) màng lai (trường hợp digoxigenin-dUTP) Nucleic acids Những polynucleotide sinh học thiên nhiên, đơn vị nucleotide kết hợp với liên kết phosphodieste thành trình tự DNA RNA riêng biệt Nucleotide Một nucleoside phosphoryl hóa với hydroxyl pentose Phân tử đóng vai trị cấu trúc sở DNA RNA, gồm ba phần: đường pentose (ribose RNA, deoxyribose DNA), nitrogen base gốc phosphate Nhập môn Công nghệ sinh học 342 Nuôi cấy mô tế bào (tissue and cell culture) Kỹ thuật cấy nuôi vô trùng mô tế bào động vật thực vật môi trường nhân tạo bên ống nghiệm bình thủy tinh Về nguyên lý, giống nuôi cấy tế bào vi sinh vật Kỹ thuật có nhiều ứng dụng thực tiễn, ví dụ thực vật dùng để nhân giống nhanh sinh trưởng chậm bị phân ly sinh sản hữu tính, ngồi sử dụng chọn giống; động vật kỹ thuật dùng để nuôi mô phục vụ cho công tác nghiên cứu sản xuất chất có hoạt tính sinh học Oliofilm Cao su xử lý HCl Oligo Tiếp đầu ngữ có nghĩa “ít”, ví dụ: oligonucleotide (polynucleotide) có nucleotide oligopeptide (polypeptide) có peptide Oligo(dT)-cellulose Một đoạn ngắn gồm gốc deoxy-thymidine liên kết với chất cellulose, sử dụng để tinh mRNA eukaryote phương pháp sắc ký lực Oligomer Thuật ngữ chung để đoạn ngắn monomer Oligonucleotide Một đoạn ngắn monomer nucleotide, thường từ 20-30 nucleotide Operon Nhóm gen vi khuẩn chịu điều khiển chung gen điều hòa Cấu trúc operon bao gồm: 1) Nhóm gen cấu trúc mà hoạt động chúng chịu điều khiển chung, 2) Gen điều hòa sản sinh protein điều hòa, 3) Vùng huy (operator) trình tự khởi động (promoter) chịu tác động protein điều hòa Protein điều hịa có tác dụng bám vào vùng huy làm cho bị ”đóng”, nhóm gen cấu trúc ngừng hoạt động Khi môi trường xuất chất gen cấu trúc chất bất hoạt hóa protein điều hịa khiến khơng bám vào vùng huy nữa, vùng huy ”mở” nhóm gen cấu trúc lại hoạt động Phage Viết tắt bacteriophage (thực khuẩn thể), loại virus xâm nhiễm sinh sản bên vi khuẩn Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid (DNA RNA) mà qua nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ Sau trình nhân lên nucleic acid phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị tan biến Loại phage luôn làm tan tế bào vi khuẩn chúng xâm nhiễm vi Nhập môn Công nghệ sinh học 343 khuẩn gọi phage độc, ví dụ phage T4 Ngược lại, cịn có phage ơn hịa, xâm nhiễm vi khuẩn gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa hệ gen phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn chép với nhiễm sắc thể Hệ gen phage trạng thái gắn với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi prophage Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, PCR) Phương pháp dùng phịng thí nghiệm để khuếch đại đoạn DNA đặc biệt lên hàng triệu lần vịng vài thơng qua 20-30 chu kỳ nhiệt, chu kỳ bao gồm ba mức nhiệt độ: biến tính 90-95oC, bắt cặp với mồi 40-65oC tổng hợp mạch nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) 70-72oC PCR có ứng dụng rộng rãi chẩn đốn y học, phân tích đa dạng sinh học, chọn giống nhiều lĩnh vực khác Nhà khoa học Mỹ (Tiến sĩ Mullis) người phát minh kỹ thuật PCR nhận giải Nobel năm 1993 Cùng chia sẻ Giải Nobel với Mullis Smith (Canada) có đóng góp mang tính tảng cho việc gây đột biến điểm định hướng, dựa oligonucleotide việc phát triển chúng nghiên cứu protein Phân hóa hay biệt hóa (differentiation) Một khía cạnh phát triển bao gồm hình thành loại tế bào, loại mơ, loại quan khác từ hợp tử ban đầu điều khiển đặc biệt gen (bioremediation) Phân tích trình tự gen (gene sequencing) Là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc chuỗi nucleotide phân tử nucleic acid Phân tích trình tự DNA có phương pháp hóa học MaxamGilbert phương pháp enzyme Sanger Trong năm gần đây, số phương pháp xác định trình tự nhờ hỗ trợ máy tính xuất Bên cạnh kỹ thuật thơng thường sử dụng polyacrylamide gel để phân ly phân tử DNA có độ dài khác nhau, kỹ thuật liên quan đến phát huỳnh quang nucleotide đánh dấu, phân tích Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 344 trình tự DNA khối phổ, điện di mao dẫn lai với đoạn oligonucleotide tổng hợp nhân tạo đời Năm 1980, Sanger (Anh) Gilbert (Mỹ) trao giải Nobel có đóng góp quan trọng phương pháp xác định trình tự nucleotide phân tử DNA Đóng góp mốc lịch sử to lớn sinh học phân tử, nguyên lý tất máy xác định trình tự DNA tự động sử dụng khắp giới Phiên mã ngược (reverse transcription) Quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Phóng xạ tự ghi (autoradiography) Kỹ thuật phát phân tử có đánh dấu phóng xạ thơng qua hiệu ứng tạo ảnh phân tử phim X-quang Phosphoryl hóa (phosphorylation) Phản ứng tạo thành dẫn xuất phosphate phân tử sinh học tác dụng xúc tác enzyme Phosphatase kiềm (alkaline phosphatase) Enzyme loại bỏ nhóm 5’-PO4 từ đầu phân tử DNA để lại nhóm 5’-OH Phối tử (ligand) Một phân tử ion kết hợp với protein, ví dụ hormone kết hợp với thụ thể (receptor) đặc hiệu Plasmid có cấu trúc mạch vịng kép, nằm tế bào chất ngồi nhân, có khả chép độc lập nhiễm sắc thể tế bào Tồn sinh vật prokaryote eukaryote Ngày nay, plasmid thiết kế nhân tạo sử dụng rộng rãi vector dùng kỹ thuật tạo dòng biểu gen Polyacrylamide Là polymer acrylamide bisacrylamide có cấu trúc gồm liên kết chéo tạo mảng xốp (giống bọt biển) Các chất phải chui vào lỗ gel được, chất có khối lượng phân tử nhỏ trước ngược lại Polymer Một đoạn dài monomer Polynucleotide Trình tự nucleotide nối đồng hóa trị với nhau, vị trí 3’ pentose nucleotide nối với liên kết phosphodieste vị trí 5’ pentose nucleotide Polypeptide Một chuỗi dài amino acid nối với liên kết peptide Nhập môn Công nghệ sinh học 345 Prokaryote Sinh vật đơn bào nhân tế bào điển hình, DNA nằm tế bào chất khơng có màng bao bọc, khơng có ngun phân giảm phân; đại diện điển hình vi khuẩn Prophage Phage ơn hịa xen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tiềm tan Nó chép đồng thời với nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn chủ Protein Một phân tử lớn gồm nhiều chuỗi polypeptide, chuỗi có trình tự amino acid khối lượng phân tử đặc trưng Protein hợp chất quan trọng bậc thể sống Về cấu trúc, protein phân tử mạch dài gồm đơn vị cấu trúc nhỏ amino acid nối với qua mối liên kết peptide Khối lượng phân tử protein từ vài nghìn đến vài triệu Có khoảng 20 loại amino acid Các loại protein phức tạp có liên kết thêm với nhóm bổ sung Protein dung hợp (fusion protein) Là protein tái tổ hợp lai mã hóa gen lai (fusion gene) dung hợp in vitro đoạn gen khác plasmid vector sau biến nạp vào vi sinh vật chủ (chẳng hạn E coli) Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự amino acid hai protein khác biệt tổng hợp từ đầu N vector biểu Protein nguyên thể (native protein) Là protein tái tổ hợp mã hóa gen ngoại lai (foreign gene) vi sinh vật chủ Khác với protein dung hợp, protein nguyên thể tổng hợp từ đầu N từ đầu N vector Purine Một hợp chất dị vịng, kiềm, có nitrogen, thành phần nucleotide nucleic acid Purine chứa nhân pyrimidine kết hợp với nhân imidazol Pyrimidine Một nitrogen base dị vịng có nucleotide nucleic acid Quá trình chuẩn bị chất nguyên liệu sản xuất (upstream processing) Giai đoạn thiết kế môi trường dinh dưỡng (cơ chất) sử dụng chủng tế bào (nguyên liệu sản xuất) thích hợp cho q trình sinh học (bioprocessing) Quá trình phân tách tinh đầu (downstream processing) Gia Nhập môn Công nghệ sinh học 346 Retrovirus Là loại virus RNA chứa enzyme reverse transcriptase sinh sản dạng DNA mạch kép Chúng có khả xâm nhiễm tế bào vật chủ cao Khi xâm nhiễm có khả gắn hệ gen virus với hệ gen tế bào vật chủ, sở để thiết kế vector liệu pháp gen hiệu Ribonuclease Enzyme xúc tác đặc hiệu việc phân hủy RNA cách cắt mối liên kết phosphodiester RNA Ribonucleic acid (RNA) Thường phân tử đa phân mạch đơn gồm đơn vị cấu trúc sở ribonucleotide Về mặt hóa học RNA giống với DNA RNA v Ribonucleotide Đơn vị cấu trúc sở RNA, gồm ba thành phần: đường ribose, nitrogen base nhóm phosphate Ribosome Người ta thấy ribosome ty thể, có tổng hợp số protein ty thể Ribozyme enzyme RNA bổ sung (complementary RNA) RNA kích thước nhỏ nhân (small nuclear RNA, snRNA) RNA polymerase RNA ribosome (ribosomal RNA, rRNA) L 5S; Nhập môn Công nghệ sinh học E coli 347 RNA thông tin (messenger RNA, mRNA) Một loại RNA phiên mã từ trình tự DNA mRNA truyền thơng tin di truyền từ nhiễm sắc thể tới ribosome để ribosome (transfer RNA, tRNA) Sàng lọc (screening) Kỹ thuật nhận dạng dòng DNA thư viện hệ gen (genomic library) thư viện cDNA (cDNA library) phương pháp lai mẫu dị có đánh dấu [ -32P]dCTP với vết tan (trường hợp dùng bacteriophage λ làm vector tạo dòng cho xâm nhiễm vào vi khuẩn E coli) khuẩn lạc (dùng plasmid làm vector tạo dòng) thư viện màng nylon nitrocellulose Tín hiệu lai phát phóng xạ tự ghi phim X-quang Sao chép (replication) Sự nhân vật chất di truyền chu trình phân bào tổng hợp DNA phage phage sinh sản tế bào vi khuẩn Sephadex Là loại dextran có liên kết chéo mạch polysaccharide với tạo thành cấu trúc mạng lưới ba chiều Sephadex trung hịa điện tích nên khơng có tương tác cation anion, loại bột khơ, khơng tan nước, ngâm nước trương tạo thành gel Mắt lưới sephadex gel thường to nhỏ Nhập môn Công nghệ sinh học 348 khác nhau, tùy theo mức độ liên kết Nếu chuỗi polysaccharide có liên kết gel có mắt lưới lớn, ngậm nước nhiều ngược lại Sephadex bền môi trường acid yếu kiềm yếu, mơi trường acid mạnh kiềm mạnh liên kết glucoside gel bị thủy phân Dựa vào độ liên kết người ta chia sephadex làm năm loại: sephadex G-25, G-50, G-75, G-100 G-200 Sinh học phân tử (molecular biology) Khoa học nghiên cứu tượng sống mức độ phân tử Lĩnh vực khoa học trẻ tuổi điểm gặp khoa học kinh điển di truyền học, hóa sinh học, tế bào học, vật lý học, hóa học hữu hóa lý Theo cách hiểu phổ biến nay, sinh học phân tử khoa học nghiên cứu gen hoạt động chúng mức độ phân tử, bao gồm phiên mã, dịch mã, chép, điều hòa biểu gen, tái tổ hợp chuyển gen Sinh tổng hợp protein (protein synthesis) Phản ứng hóa học diễn ribosome tạo nên phân tử protein từ amino acid sở thông tin di truyền nhận từ nhân tế bào thông qua mRNA Somatotropin Southern blot Kỹ thuật chuyển cố định DNA biến tính từ agarose gel (sau phân đoạn điện di) lên màng lai nylon hay nitrocellulose để lai với mẫu dò (probe) đánh dấu đồng vị phóng xạ [ -32P]dCTP digoxigenin-dUTP Tín hiệu lai sau phát phim X-quang (trường hợp [ -32P]dCTP) màng lai (trường hợp digoxigenin-dUTP) Tái tổ hợp (recombination) Quá trình mà nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt phần đứt nối lại theo tổ hợp Q trình xảy tế bào sống (qua trao đổi chéo phân bào giảm nhiễm) hay ống nghiệm nhờ enzyme cắt nối DNA Tạo dòng (cloning) Còn gọi nhân dịng, tách dịng hay dịng hóa, sản sinh nhiều phân tử DNA, thường phân tử DNA tái tổ hợp plasmid vector, cách chép phân tử vật chủ thích hợp chẳng hạn vi khuẩn E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 349 Terminal transferase Enzyme bổ sung gốc nucleotide vào đầu 3’ oligonucleotide polynucleotide Tế bào khả biến (competent cell) Các tế bào vi khuẩn có khả tiếp nhận DNA ngoại lai trình biến nạp Tế bào lympho B (B lymphocyte) Phát triển tủy xương (bone marrow) ký hi Tế bào lympho T (T lymphocyte) Phát triển thục tuyến ức (thymus) nên ký hiệu T Tế bào Hfr (high frequency recombination cell) Tế bào giới tính đực E coli, có mang nhân tố F gắn liền với nhiễm sắc thể vi khuẩn Khi nhân tố F thúc đẩy tiếp hợp tế bào Hfr với tế bào (F-) gen vi khuẩn truyền sang tế bào với tần số cao Tế bào NK Là tế bào lympho có hạt lớn, có khả nhận biết tế bào bị ung thư, vi sinh vật xâm nhiễm tiêu diệt chúng nên gọi tế bào giết tự nhiên, ký hiệu NK hay TNK (natural killer) Tế bào mầm phôi (embryonic stem cell) Tế bào phơi chưa biệt hóa, đa thể chuột, ni cấy thời gian dài mà giữ tính đa thể, nghĩa khả biệt hóa theo nhiều hướng để phát triển thành tế bào khác tế bào tim, tế bào thần kinh, tế bào gan Tế bào trần (protoplast) Tế bào thực vật bị thành cellulose xử lý enzyme (cellulase, hemicellulase pectinase), thường dùng thí nghiệm dung hợp tế bào (protoplast fusion) hay gọi lai tế bào sinh dưỡng (somatic hybridization) để mở rộng nguồn gen tạo giống cấy trồng mang đặc tính ưu việt Thể Barr Thể Barr nhiễm sắc thể X bị bất hoạt kết đặc có nhân tế bào nữ giới, khơng có nam giới Thể biến nạp (transformant) Tế bào sinh vật nhận gen sinh vật khác trình biến nạp biểu chức gen kiểu hình Thể đột biến (mutant) Sinh vật (hoặc gen) mang đột biến di truyền Thể khảm (mosaic) Phơi thể có tế bào mang hệ gen không giống Nhập môn Công nghệ sinh học 350 Thể tái tổ hợp (recombinant) Các cá thể tế bào mang tổ hợp gen khác với cha mẹ chúng trình tái tổ hợp di truyền sinh Thông tin di truyền (genetic information) Thông tin lưu trữ phân tử DNA sinh vật dạng trình tự xếp bốn nucleotide A, T, C G đóng vai trị ”chữ cái” ”ngơn ngữ” di truyền Trong ngơn ngữ này, từ có ba chữ gọi ba Nghĩa từ amino acid có mặt phân tử protein tương ứng Mỗi ”câu” ngôn ngữ di truyền gen chứa đựng thông tin di truyền để đảm nhiệm chức trọn vẹn Mỗi chức đặc tính sinh lý, hình thái hay cấu trúc sống Do chế chép theo kiểu nửa bảo tồn DNA mà thơng tin di truyền truyền xác từ hệ sang hệ không thay đổi Thư viện cDNA (cDNA library) Tập hợp dòng DNA tạo từ mRNA tế bào mô cụ thể bacteriophage vector, đại diện cho thông tin di truyền mà tế bào biểu Thư viện hệ gen (genomic library) Tập hợp tất đoạn DNA tạo từ phản ứng cắt hạn chế genome bacteriophage vector, đại diện cho toàn cho thơng tin di truyền hệ gen Tính toàn thể (totipotency) Là khả sinh sản tái sinh thể hoàn chỉnh từ phận Trình tự dẫn đầu (leader sequence) Một ba phần chủ yếu phân tử mRNA Trình tự nằm đầu 5’ mRNA mang thông tin để ribosome protein đặc hiệu nhận biết bắt đầu trình tổng hợp polypeptide, trình tự dẫn đầu khơng dịch mã thành trình tự amino acid Trình tự điều hịa (regulatory sequence) Một trình tự DNA tham gia vào q trình điều hịa gen Ví dụ promoter operator Trình tự khởi động (promoter) Trình tự nucleotide đặc hiệu nằm thành phần operon, có chức điều hịa hoạt động operon, nơi RNA polymerase bám vào để bắt đầu trình phiên mã Trình tự đặc trưng promoter có khoảng 20-200 nitrogen base Trình tự Shine-Dalgarno (Shine Dalgarno sequence, SD) Còn gọi vùng liên kết ribosome (RBS), phần trình tự nucleotide đầu Nhập mơn Công nghệ sinh học 351 5’ mRNA prokaryote kết hợp bổ sung cặp base với đầu 3’ 16S rRNA, dùng làm tín hiệu cho khởi đầu dịch mã Trình tự tăng cường (enhancer) Trình tự nucleotide dạng cis làm tăng cường độ phiên mã promoter gen eukaryote Nó nằm cách promoter hàng ngàn cặp base hoạt động theo hai hướng vị trí so với promoter Trypsin Enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide protein thủy phân phần protein, dẫn xuất từ trypsinogen dịch tụy tiết vào ruột non, enzyme ruột non enterokinase tác động chuyển thành Vật chủ (host) Tế bào dùng để nhân phân tử DNA lên nhiều lần Vector Là phân tử DNA đ gen, biểu o vật chủ (E coli V Vector biểu (expression vector) , ví dụ: E coli Để biểu gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: (1) Gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào (2) Một promoter kiểm soát phiên mã cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dịng (3) Các trình tự kiểm soát dịch mã vùng liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG (4) Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Vector liệu pháp (therapeutic vector) Có thể sử dụng viral vector khơng phải virus Các viral vector thường dùng adenovirus, adenoassociated virus (AAV), retrovirus, lentivirus paramyxovirrus Các vector Nhập môn Công nghệ sinh học 352 virus phức hợp cationic liposome GL67, PEI, plasmid, SecR, Integrin Vector tạo dòng (cloning vector) Phân tử DNA mạch kép có khả tự chép tế bào vật chủ Có thể gắn vào phân tử đoạn vài đoạn DNA khác nguồn tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp dùng để nhân dòng Vết tan (plaque) Vòng tròn suốt xuất thảm đục vi khuẩn mọc môi trường thạch đặc, tan vỡ lặp lại nhiều chu kỳ tế bào vi khuẩn bị bacteriophage xâm nhiễm sinh tan Vi khuẩn hiếu khí (aerobe) Vi khuẩn sống khơng khí sử dụng oxygen tự để sinh trưởng Vi khuẩn kỵ khí (anaerobe) Vi khuẩn sống điều kiện khơng có khơng khí hay oxygen tự do, ngược lại với hiếu khí Trong trình kỵ khí, H2S tạo gây mùi khó chịu Virus Phức hợp chứa nucleic acid (DNA RNA) nằm vỏ bọc protein, có khả gây nhiễm tái bên tế bào vật chủ đặc hiệu, tạo nhiều virus, lan truyền từ tế bào sang tế bào khác Virus dạng sống khơng có cấu trúc tế bào, có khả xâm nhập vào tế bào sống xác định sinh sản bên tế bào Giống tất sinh vật khác, virus có máy di truyền riêng mình, mã hóa việc tổng hợp hạt virus từ chất có tế bào vật chủ Như vậy, virus vật ký sinh nội bào Virus phân bố khắp nơi tự nhiên, xâm nhập vào tất nhóm sinh vật Người ta biết khoảng 500 loại virus xâm nhập động vật máu nóng, 300 loại xâm nhập thực vật bậc cao Một số khối u ung thư động vật người virus Virus tồn hai dạng: dạng nghỉ hay ngoại bào dạng sinh sản hay nội bào Kích thước hạt virus từ 15-350 nm, chiều dài số loại virus đạt tới 2000 nm Phần lớn virus nhìn thấy qua kính hiển vi điển tử Chất mang thông tin di truyền virus nucleic acid: DNA RNA Vì vậy, phân virus thành hai loại: loại mang DNA loại mang RNA Vi tiêm (microinjection) Kỹ thuật đưa DNA vào nhân vào tế bào chất tế bào kim mao dẫn bơm áp lực Toàn thao tác tiến hành kính hiển vi ngược pha (inverted microscope) Nhập môn Công nghệ sinh học 353 Vị trí cos (cos site) phage λ Vị trí liên kết kháng nguyên đơn (unique antigen combining site) Vị trí liên kết với kháng thể nằm phân tử kháng ngun Vịng cặp tóc (hairpin loop) Vùng chuỗi đơn bổ sung tạo nếp gấp chứa cặp base tạo thành xoắn kép, Vùng hướng (downtream region) Đề cập đến vị trí đoạn trình tự nằm phía đầu 3’ gen đoạn gen quan tâm Vùng đa nối (polylinker hay polycloning site) Một trình tự DNA mạch kép tổng hợp nhân tạo có mang loạt vị trí nhận biết enzyme hạn chế Trình tự gắn vào vector dùng kỹ thuật tạo dòng gen (như vùng tạo dòng) Vùng liên kết ribosome (ribosome binding site, RBS) (xem trình tự Shine-Dalgarno) Vùng ngược hướng (upstream region).Vị trí trình tự nucleotide nằm phía đầu 5’ phân tử DNA so với gen quan tâm Vùng tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) t số enzyme cắt hạn chế thông dụng, thiết kế để chèn đoạn DNA ngoại lai vào Western blot Kỹ thuật chuyển protein tổng số phân tách điện di SDS polyacrylamide gel lên màng nylon nitrocellulose để lai với kháng thể thứ đặc hiệu sau kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme nhằm phát protein kháng nguyên tương ứng Xenobiotic Một loại hợp chất tìm thấy thể sống khơng sản xuất bình thường mong đợi có mặt thể Nó bao gồm chất diện với nồng độ cao bình thường nhiều lần Đặc biệt, loại thuốc kháng sinh xem xenobiotic người thể người khơng tự sản xuất chúng Tuy nhiên, lĩnh vực môi trường thuật ngữ thường sử dụng để chất gây Nhập môn Công nghệ sinh học 354 ô nhiễm dioxin, polychlorinated biphenyl , ảnh hưởng chúng lên khu hệ sinh vật (biota) X-gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl- -D-galactopyranoside) Cơ chất sinh màu với -galactosidase cho sản phẩm có màu xanh lam YAC (Yeast artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, dùng làm vector để tạo dịng đoạn DNA có kích thước lớn nấm men Yếu tố tác động cis (cis-acting element) Đoạn trình tự DNA biểu hiệu phân tử DNA mà tác động Ví dụ: hộp CAAT phần tử tác động cis trình phiên mã sinh vật eukaryote Yếu tố tác động trans (trans-acting element) Yếu tố di truyền biểu hiệu mà khơng cần nằm phân tử với đoạn trình tự đích Thường yếu tố mã hóa cho sản phẩm protein (có thể enzyme hay protein điều hịa) sản phẩm khuếch tán đến điểm tác động Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ban Từ điển-NXB Khoa học Kỹ thuật 2002 Từ điển Bách khoa Sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press Inc New York, USA Lawrence E 1995 Henderson’s Dictionary of Biological Terms 7th ed Longman Group Ltd Singapore Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Singleton P and Sainsbury D 2001 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed John Wiley & Sons, Ltd UK Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology ed The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK th Nhập môn Công nghệ sinh học 355