Đánh giá sự đa dạng đi truyền của một số mẫu đậu đen ( vigna cylindrica) địa phương trồng tại tỉnh bắc giang bằng chỉ thị phân tử rapd

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG VĂN HẠNH ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƢƠNG TRỒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa trung tâm học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG VĂN HẠNH ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƢƠNG TRỒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Dƣơng Văn Hạnh i Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, KTV Lê Đức Huấn các cán phịng thí nghiệm Sinh học, khoa Khoa học sống, trường Đại học khoa học tạo điều kiện giúp đỡ hướng dẫn thời gian làm thực nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô giáo Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian làm luận văn Tác giả Dƣơng Văn Hạnh ii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA Axit deoxyribonucleic AFLP Fragment Length Polymorphism ( Sự đa hình chiều dài phân đoạnADN khuếch đại) ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình nhân ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa hình chiều dài cácphân đoạn ADN cắt hạn chế) SSR Simple Sequence Repeats TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan iii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii Mục lục iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu đen 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu đen 1.1.3 Thành phần hoá sinh hạt đậu đen 1.1.4 Vị trí, tầm quan trọng đậu đen 11 1.2 Ngiên cứu tính đa dạng mối quan hệ di truyền thực vật 17 1.2.1 Một số kỹ thuật sinh học phân tử phân tích quan hệ di truyền thực vật 17 1.2.1.1 Kỹ thuật RAPD 17 1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP 19 1.2.1.3 Kỹ thuật RFLP 20 1.2.1.4 Kỹ thuật SSR 20 1.2.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa dạng mối quan hệ di truyền thực vật 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 iv Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.1.1 Vật liệu thực vật 23 2.1.2 Hoá chất thiết bị 24 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 25 2.2.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA tổng số 26 2.2.1.3 Phương pháp RAPD 26 2.2.1.4 Phân tích số liệu RAPD 28 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước, khối lượng 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Đặc điểm hình thái , kích thước khối lương 1000 hạt mẫu đậu đen nghiên cứu 29 3.2 Phân tích đa dạng hệ gen mẫu đậu đen kỹ thuật RAPD 31 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ đậu đen 31 3.2.2 Kết nhân phân đoạn DNA kĩ thuật RAPD 32 3.3 Phan tích ính đa dạng khoảng cách di truyền mẫu đậu đen nghiên cứu 43 3.3.1 Hệ số giống khác phân đoạn DNA đặc trưng mẫu đậu đen nghiên cứu 43 3.3.2 Mối quan hệ khoảng cách di truyền mẫu đậu đen dựa phân tích RAPD 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 Kết luận 47 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Tài liệu tham khảo tiếng Việt 48 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 49 Các trang Web 50 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1.Thành phần dinh dưỡng đậu đen nấu chín cốc đậu đen tương đương với 172g 10 Bảng 2.1 Nguồn gốc mẫu đậu đen nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide 12 mồi sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RAPD 27 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD 27 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, kích thước khối lượng mẫu đậu đen 29 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân đoạn đa hình sử dụng 12 mồi RAPD 33 Bảng 3.3 Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) mồi ngẫu nhiên phản ứng RAPD nhân DNA mẫu đậu đen địa phương 35 Bảng 3.4 Hệ số giống khác mẫu đậu đen nghiên cứu 44 v Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây đậu đen Hình 2.1 Hình ảnh hạt mẫu đậu đen nghiên cứu 24 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số mẫu đậu đen nghiên cứu 31 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 mẫu đậu đen 36 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 mẫu đậu đen 37 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M5 mẫu đậu đen 38 Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 mẫu đậu đen 40 Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 mẫu đậu đen 42 Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M12 mẫu đậu đen 43 Hình 3.8 Sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu đậu đen sở phân tích RAPD với 12 mồi ngẫu nhiên 45 vi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu đen (Vigna cylindrica) trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Khó có tìm thấy trồng có tác dụng nhiều mặt đậu đen Sản phẩm làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh, gần có khả chống ung thư cải tạo đất tốt Vì đậu đen có vai trò quan trọng kinh tế y học Hiện nay, nước có nhiều nơi sản xuất đậu đen, đặc biệt vùng trung du miền núi phía Bắc, nhiên chưa hình thành vùng chuyên canh số giống đậu trồng khác Các giống đậu đen nước ta phong phú, có giống đậu đen địa phương Đây nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống đậu đen phù hợp với điều kiện sản xuất vùng, miền khác [8] Đánh giá đa dạng di truyền giống đậu đen địa phương tạo sở cho công tác chọn tạo giống nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền giống trồng nói chung họ đậu nói riêng RAPD, RFLP, AFLP, SSR, STS, Các phương pháp phát huy hiệu mà khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống hiệu sàng lọc cao, tiết kiệm thời gian tin cậy Trong năm gần nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích đa dạng di truyền họ đậu cơng bố Chu Hồng Mậu đtg (2002) đánh giá hệ gen số dòng đậu tương đột biến kỹ thuật phân tích đa hình DNA nhân ngẫu nhiên”, Vũ Thanh Trà Trần Thị Phương Liên (2006) nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR Năm 2002, Coulibaly đtg thuộc Đại học Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mồi M2 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 thể hình 3.2 cho thấy, có từ đến phân đoạn DNA nhân Các phân đoạn có chiều dài ước tính từ 0,25Kb đến 0,9Kb Cụ thể sau kích thước 0,9Kb có giống xuất phân đoạn DNA BG3, BG4, BG5 Các giống lại khơng xuất Ở kích thước 0,75Kb có mẫu xuất phân đoạn DNA nhân BG1, BG5, BG6, BG7, BG8, mẫu không xuất BG2, BG3, BG4 Ở vị trí 0,65Kb có mẫu xuất phân đoạn DNA nhân BG3, BG6, BG7, BG8 mẫu cịn lại khơng xuất Ở kích thước 0,4Kb tất mẫu xuất phân đoạn DNA nhân Như vậy, với mồi M2 có tất 20 phân đoạn DNA nhân mẫu đậu đen nghiên cứu Với mồi M2 có phân đoạn đoạn DNA có phân đoạn cho tính đa hình tương ứng với kích thước (0,65Kb; 0,75Kb; 0,9kb) 36 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mồi M3 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết điện di sản phẩm RAPD với M3 thể Hình 3.3 cho thấy Từ giới hạn kích thước 0,25 - 1kb có băng DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 19 phân đoạn DNA nhân tổng mẫu đậu đen nghiên cứu Cụ thể kích thước khoảng 0,85kb có mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, xuất phân đoạn DNA nhân bản, mẫu cịn lại khơng xuất Ở kích thước 0,65kb có mẫu xuất hiên phân đoạn DNA nhân BG1, BG2, BG3, BG5, BG6, BG7, BG8 mẫu cịn lại BG4 khơng xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước 0,45Kb tất mẫu xuất đoạn DNA nhân BG1, BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8 Như vậy, với mồi M3 tổng số có 19 phân đoạn nhân mẫu đậu đen thể sai khác cấu trúc DNA giống đậu đen vị trí 0,85kb, 0,65kb Như có phân đoạn thể tính đa hình 0,8kb, 0,65kb, phân đoạn DNA thể tính đơn hình 0,45Kb Mồi M4 Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 cho thấy, có từ - phân đoạn DNA nhân Các phân đoạn có chiều dài ước tính từ 0.75 – 1,5 kb 37 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Giống xuất nhiều phân đoạn DNA giống BG1, BG2, BG3 (2phân đoạn) Ở kích thước 1,4kb mẫu xuất phân đoạn DNA Ở vị trí 1,1 kb có giống BG1, BG2, BG3 xuất phân đoạn DNA, Còn lại mẫu BG4, BG5, BG6 không xuất hiên phân đoạn DNA vị trí Như vậy, với mồi M4, phân đoạn thể tính đa hình vị trí khác 1.1 kb Với M4 tổng số có 11 phân đoạn DNA nhân mẫu đậu đen nghiên cứu thể sai khác cấu trúc DNA vị trí 1.1 kb Mồi M5 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M5 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết phân tích điện di sản phẩm RAPD mẫu đậu đen với mồi M5 thể hình 3.4 Kết cho thấy xuất từ - phân đoạn DNA nhân bản, chúng có chiều dài ước tính từ 0.25 – 1kb Giống có số phân đoạn DNA nhân nhiều với phân đoạn Còn lại mẫu lại có đến phân đoạn Tại vị trí kích thước 0,9kb có Mẫu BG6, BG7 xuất phân đoạn DNA nhân cịn mẫu 38 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ khác không xuất đoạn DNA nhân Tại vị trí 0,8 kb xuất phân đoạn DNA mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, BG8 Tại vị trí 0,75kb xuất phân đoạn DNA mẫu BG4 Tại vị trí 0,6kb xuất phân đoạn DNA mẫu BG3, BG6, BG7, BG8 cịn lại mẫu khác khơng xuất Tại vị trí 0,4kb xuất phân đoạn DNA tất mẫu nghiên cứu.Với M5 tổng số có 19 phân đoạn DNA nhân mẫu đậu đen nghiên cứu thể sai khác cấu trúc DNA vị trí 0,9kb, 0,8kb, 0,75kb, 0,6kb Như vậy, với mồi M5, phân đoạn thể tính đa hình vị trí khác 0,9kb, 0,8kb, 0,75kb, 0,6kb Mồi M6 Kết điện di sản phẩm RAPD mồi M6 cho thấy, phạm vi vùng phân tích từ 0.25 - 0,75 kb có phân đoạn DNA nhân bản, có tới phân đoạn cho tính đa hình Cụ thể kích thước khoảng 0,6 kb có mẫu xuất phân đoạn DNA nhân Phân đoạn cho tính đa hình kích thước khoảng 0,5 kb với xuất phân đoạn DNA mẫu số BG6, BG7, BG8, mẫu lại khơng thu phân đoạn Với kích thước 0,4 kb có mẫu nghiên cứu BG1, BG4, BG5, BG6, BG8 nhân phân đoạn DNA mẫu cịn lại khơng xuất phân đoạn DNA nhân Như vậy, với mồi M6 có kích thước (0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb) có phân đoạn thể tính đa hình ( 0,4Kb 0,5Kb) 39 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mồi M7 Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 mẫu đậu đen hình 3.5 cho thấy, giếng điện di phân đoạn DNA nhân với kích thước tương ứng khoảng 0,25 kb đến kb Như vậy, với mồi M8 có kích thước (0,8kb, 0,75kb, 0,6kb, 0,35kb) Cụ thể kích thước khoảng 0,8kb có mẫu BG3, BG6, BG7, BG8 xuất phân đoạn DNA nhân Phân đoạn cho tính đa hình kích thước khoảng 0,75 kb với xuất phân đoạn DNA mẫu số BG1, mẫu cịn lại khơng thu phân đoạn Với kích thước 0,6 kb có mẫu nghiên cứu BG5, BG6, BG7, BG8 nhân phân đoạn DNA, mẫu cịn lại khơng xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước 0,35 Kb tất mẫu nghiên cứu xuất đoạn DNA nhân Như vậy, với mồi M7 có kích thước (0,8kb, 0,75kb, 0,6kb, 0,35kb) có kích thước thể tính đa hình 40 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mồi M8 Kết điện di cho thấy, Từ giới hạn kích thước 0,5 - 1kb, có phân đoạn DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 12 phân đoạn DNA nhân tổng mẫu đậu đen nghiên cứu Mẫu thu nhiều phân đoạn BG7 ( phân đoạn) Cụ thể kích thước khoảng 1kb có mẫu xuất phân đoạn DNA nhân BG7 Ở kích thước 0,85 kb lại có tất mẫu xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước khoảng 0,6 kb có mẫu xuất đoạn DNA nhân BG3, BG4, BG7 lại mẫu khác không thu phân đoạn DNA nhân Như vậy, với mồi M8 có kích thước (1kb, 0,85 kb, 0,6 kb) có kích thước thể tính đa hình ( 1Kb; 0,6 Kb) Mồi M9 Kết điện di cho thấy, xuất phân đoạn DNA mẫu đậu đen nghiên cứu vị trí 0,85kb, 0,75kb, 0,45kb Thu 14 phân đoạn DNA tất mẫu đậu đen nghiên cứu Cụ thể kích thươc 0,85kb có mẫu xuất phân đoạn DNA BG1, BG2, BG3, BG4 cịn lại mẫu khác khơng xuất Ở kích thước 0,75kb có mẫu xuất phân đoạn DNA BG1, BG3 mẫu khác khơng xt Ở kích thước 0,45kb tất mẫu xuất phân đoạn DNA nhân Như M9 có phân đoạn DNA nhân trog có phân đoạn DNA cho tính đa hình kích thước 0,85kb, 0,75kb Mồi M10 Kết điện di cho thấy, xuất phân đoạn DNA mẫu đậu đen nghiên cứu vị trí 1,5Kb, 0,9kb, 0,35kb Tổng số phân đoạn DNA nhân mẫu đậu đen 17, mẫu cho nhiều phân đoạn BG5 có phân đoạn Ở kích thước khác cụ thể sau, kích thước 1,5kb có mẫu xuất phân đoạn DNA nhân BG5 lại mẫu khác khơng xuất Ở kích thước 0,35kb 0,9kb tất mẫu đầu xuất 41 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ phân đoạn DNA nhân Như với M10 xuất phân đoạn DNA nhân có phân đoạn cho tính đa hình kích thước 1,5Kb Mồi M11 Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết điện di cho thấy, tính đa dạng thể cách rõ nét mẫu đậu đen nghiên cứu Từ giới hạn kích thước 0,5 – 1,5kb, có phân đoạn DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 21 phân đoạn DNA nhân tổng mẫu đậu đen nghiên cứu Có phân đoạn cho tính đa hình phân đoạn DNA nhân Cụ thể kích thước khoảng 1,4 kb có mẫu BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7 xuất phân đoạn DNA nhân bản, mẫu cịn lại BG1, BG8 khơng xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước 0.7 kb mẫu xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước khoảng 0.65 kb có mẫu thu phân đoạn DNA nhân Như vậy, với mồi M11 có kích thước (1,4 kb, 0,7 kb, 0,65kb) có phân đoạn 1,4 Kb 0,65kb thể tính đa hình 42 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mồi M12 Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M12 mẫu đậu đen M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8 Kết diện di sản phẩm RAPD mẫ đậu đen nghiên cứu với mồi M12 thu phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên dao động từ đến phân đoạn Kích thước phân đoạn dao động 0,5 – 1,5 kb Tại vị trí 1,2 xuất phân đoạn DNA giống BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8,còn lại không xuất số phân đoạn mẫu Ở kích thước khoảng 1,1 kb có mẫu BG1 xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước khoảng kb có mẫu BG5 xuất phân đoạn DNA, cịn lại mẫu khơng thấy xuất phân đoạn DNA nhân Tại vị trí 0,75 có mẫu BG2,BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8 xuất phân đoạn DNA, lại mẫu BG1 không thấy xuất phân đoạn DNA nhân vị trí Tại vị trí 0,7 kb có mẫu BG1 xuất phân đoạn DNA nhân Ở kích thước 0,65 Kb có mẫu BG3 xuất phân đoạn DNA nhân Như với mồi M12 có kích thước (1,2 kb, 1,1 kb, kb, 0,75 kb, 0,7 kb, 0,65Kb) thể tính đa hình 43 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3.3 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VÀ KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN CỦA CÁC MẪU GIỐNG ĐẬU ĐEN NGHIÊN CỨU 3.3.1 Hệ số giống khác phân đoạn DNA đặc trƣng mẫu đậu đen nghiên cứu Từ kết nhân phân đoạn DNA thiết lập bảng ma trận biểu thị hệ số giống khác mẫu đậu đen nghiên cứu (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Hệ số giống nhauvà khác mẫu đậu đen nghiên cứu Hệ số giống di truyền mẫu đậu đen nghiên cứu ( %) BG1 BG2 BG3 BG4 BG5 BG6 BG7 BG8 77,77 77,77 77,77 61,11 61,11 61,11 72,22 BG1 BG2 2,00 77,77 77,77 72,22 61,11 61,11 61,11 BG3 1,79 1,79 BG4 2,00 2,00 1,79 BG5 2,83 1,87 1,84 1,87 BG6 2,83 2,83 1,84 2,83 1,34 BG7 3,21 3,21 1,17 3,21 2,21 6,68 BG8 1,87 2,83 1,04 1,87 1,34 6,45 77,77 72,22 72,22 83,33 83,33 72,22 61,11 61,11 72,22 77,77 66,66 77,77 89,00 89,00 89.00 6,68 Hệ số khác mẫu đậu đen nghiên cứu ( %) Kết phân tích bảng 3.4 cho thấy, hệ số giống di truyền mẫu đậu đen nghiên cứu dao động từ 0,6111 - 0,89, hệ số khác di truyền 0,0104- 0,0668 Trong đó, ba giống có hệ số giống di truyền cao (0,89) là: BG6, BG7 BG8, bốn giống có hệ số giống di truyền nhỏ (0,6111) là: BG5 BG1, BG2, BG4 Kết phân tích RAPD sở để xác định thị RAPD đặc trưng mẫu đậu đen Qua phân tích kết nhân đoạn DNA mẫu đậu đen nghiên cứu xác định thị RAPD 44 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ mẫu đậu đen BG5 kích thước 1,5Kb Giống BG5 giống có khả sinh trưởng, phát triển mạnh Tỉ lệ nảy mầm hạt đạt 99%, kích thước trung bình cao 0,6 - 0,8m, sớm cho hoa, kết chín sớm, có trung bình 10 hạt, kích thước hạt lớn, giống có khả cho suất cao 3.3.2 Mối quan hệ khoảng cách di truyền mẫu đậu đen dựa phân tích RAPD Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê băng điện di xử lý số liệu phần mềm NTSYSpc version 2.1 thiết lập sơ đồ hình nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu đậu đen nghiên cứu (Hình 3.8) Hình 3.8 Sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu đậu đen sở phân tích RAPD với 12 mồi ngẫu nhiên Sơ đồ hình tính theo hệ số SM kiểu phân nhóm UPGMA (hình 3.8) bảng thống kê hệ số sai khác mức độ sai khác di truyền 45 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ mẫu đậu đen Mức độ khác biểu hệ số sai khác giống Các giống có hệ số di truyền giống tương tự xếp thành nhóm, nhóm lại có liên hệ với Sơ đồ hình thiết lập dựa liệu RAPD phân tích mẫu đậu đen với 12 mồi ngẫu nghiên chia làm nhánh: Nhánh thứ Nhất có nhóm bao gồm mẫu BG1, BG2, BG4 Các mẫu đậu đen có hệ số giống 0,77 có khoảng cách di truyền với mẫu cịn lại thuộc nhóm khác 23 % ( 1- 0,77) Các mẫu đậu đen thuộc nhánh thứ Hai phân bố nhánh phụ (nhánh phụ nhánh phụ 2) Nhánh phụ gồm hai nhóm kí hiệu II, III Khoảng cách nhánh phụ với nhánh phụ 26,5% ( 1- 0,735) Nhóm II gồm mẫu BG3, nhóm III gồm mẫu BG6, BG7, BG8 ba mẫu có hệ số giống 0,89 có khoảng cách di truyền 11% ( 1- 0,89) Khoảng cách mẫu thuộc nhóm II nhóm III 19,5 % ( 1- 0,805) Nhánh phụ có nhóm kí hiệu IV có mẫu BG5 Từ kết phân nhóm chúng tơi nhận thấy tính đa hình mẫu đậu đen phạm vi phân tích 12 mồi ngẫu nhiên phản ứng RAPD chứng minh khác cấu trúc DNA hệ gen mẫu đậu đen địa phương nghiên cứu 46 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Các mẫu đậu đen nghiên cứu có đa dạng hình dạng hạt, kích thước hạt, kích thước hạt lớn giống BG1 (dài 0,8mm, rộng 0,8 mm, dẹt 0,5 mm), kích thước hạt nhỏ giống BG7 (dài 0,6mm, rộng 0,4 mm, dẹt 0,3 mm), màu sắc rốn hạt khối lượng 1000 hạt Khối lượng 1000 hạt giống đậu dao động từ 72,5g đến 128,8g Trong đó, giống BG1 có khối lượng hạt cao (128,8g), thấp giống BG6 (72,5g) 1.2 Bằng kỹ thuật RAPD với việc sàng lọc 12 mồi ngẫu nhiên nhân 212 phân đoạn DNA từ hệ gen mẫu đậu đen Trong số mồi sử dụng có 8/12 mồi biểu tính đa hình cao M1, M 5, M7, M8, M12 với giá trị PIC > 0,5 1.3 Hệ số sai khác di truyền cặp mẫu đậu đen nghiên cứu dao động từ 1,04% đến 6,68% Hệ số giống dao động từ 67% đến 89% 1.4 Đã xác định thị phân tử RAPD đặc trưng mẫu đậu đen địa phương (BG5/M5- 1,5Kb) 1.5 Các mẫu đậu đen nghiên cứu phân bố nhóm thuộc nhánh phát sinh với khoảng cách di truyền 33% ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật RAPD với số lượng mồi nhiều hơn, số mẫu nhiều thu thập mẫu phạm vi rộng hơn, kết hợp với số kỹ thuật khác (SSR, AFLP, RFLP) để có thơng tin đầy đủ đa dạng di truyền giống đậu đen địa phương, tạo sở cho việc sử dụng hợp lý giống đậu đen địa phương sản xuất chọn tạo giống 47 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nxb Khoa học&Kỹ thuật Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), “Đánh giá đa dạng di truyền mức phân tử số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương”, Tạp chí Khoa học&Cơng nghệ-Đại học Thái Nguyên: 57(9): 85-90 Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học Nxb Giáo dục Nguyễn đăng Khôi ( 1997), “ Các đậu ăn hạt Việt Nam” , Tạp chí Sinh học, số 2, Tr 18 - 40 Nguyễn Thị Kim Liên (2003), Nghiên cứu định vị locus số tính trạng hình thái lúa cạn phục vụ cho việc chọn dòng lúa chịu hạn, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, tr 24 - 34 Đỗ Tất Lợi (1997), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB KH &KT Hà Nội 7.Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nxb Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học Hà Nội Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Xn Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình (2002), “Đánh giá genome số dịng đậu tương đột biến kỹ thuật phân tích đa hình DNA nhân ngẫu nhiên”, Tạp chí sinh học 22, tr 21 - 26 10 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chị hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Hà Nội 48 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 11 Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả chịu cóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 12 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, Nxb Khoa học&Kỹ thuật 13 Tạp chí hố học – 2008 – No.2 – Tr180 -188 – ISSN0866 – 7144 14 Tạp chí nghiên cứu y học – 2006 – No3 – Tr87- 91 – ISSN TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Awan F S., (2007), “Study of genetic divergence among wheat genotypes through random amplied polymorphic DNA, centre of Agricultural biochemistry and biotechnology”, Unversity of Agricultural Faisalabad Pakistan, 6(3), pp 476 - 481 16 Chen Y., Wang D., Arelli P., Ebrahimi M., Nelson R.L., (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome; 49, 8; ProQuest Central 17 Dey N., Subarsana B., Chaudhuri T.R.,Dey S.R., mitu De,Ghose T.K., (2005), “RAPD - base genetic diversity analysis of aromatic rice”, Cababstractsplus, 6(3/4), pp 133 - 142 18 Doldi M., Vollmann J., Lellry T., (1997), Genetic doversity in soybean as determined by RAPD and microsatellite analysis, pp 331 - 335 19 Foolad, Arusekar, Rodriguer (1995), Applicationof polymerase Chain Reation (PCR) to plant genome analyis In: Tissue and organ culture, Fundamenatal mathods Springer Verlag, Berlin, heidelerg, 282 – 289 20 Gawel N.J., Jarret R.H., (1991), A modified CTAB DNA extraction procedure forMusaand Ipomea.Plant Mol Biol Rep 9: 262–266 21 Li Z., Nelson R.L., (2002), “RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Soybean Accessions from Four Chinese Provinces”, Crop Science, 42, pp 1737 - 1744 49 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 22 Ranade R., Gopalakrishna T (2001), “Characterization of blackgram [Vigna mungo (L.) Hepper) varieties using RAPD”, Plant varieties & Seeds, 14(3), pp 227-233 23 Sholihin, Hautea D.M., (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(12), pp 17 - 61 24.Yiwu Chen, Randall L Nelson (2005), “Relationship between Origin and Genetic Diversity in Chinese Soybean Germplasm”, Crop Science; 45: 16451652 CÁC TRANG WEB 25 http://vi.wikipedia.org/wiki/Đậu_đen 26.http://tintuccaonien.com/docs/docs_4/4_2_36.htm 27 http://caythuoc.net/cay-thuoc/other/194- 195 /dau-den.htm 28 http://www.duoclieu.org/2011/12/dau-den-hat-vigna-cylindrica.html 50