khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc gây bệnh đốm lá dâu tây của dịch nuôi cấy vi khuẩn bacillus

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỨA HUỲNH MINH THẢO KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM KHÁNG NẤM MỐC GÂY BỆNH ĐỐM LÁ DÂU TÂY CỦA DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Bacillus sp Ngành Mã ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 27 tháng năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Trịnh Ngọc Nam - Chủ tịch Hội đồng TS Bùi Hồng Quân - Phản biện PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương - Phản biện TS Nguyễn Hoàng Dũng - Ủy viên TS Nguyễn Thị Lan Hương - Thư ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HỨA HUỲNH MINH THẢO Ngày, tháng, năm sinh: 17/4/1996 MSHV: 19000031 Nơi sinh: Khánh Hịa Ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Phân lập định danh chủng nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây - Tuyển chọn định danh một chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả ức chế mạnh phát triển hệ sợi tơ nấm gây bệnh đốm dâu tây - Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc từ Bacillus sp - Khảo sát sơ bộ đặc tính hợp chất kháng mốc từ Bacillus sp - Khảo sát tác động dịch nuôi cấy Bacillus sp lên nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây mơ hình in situ II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/5/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/5/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG LỜI CẢM ƠN Để thực tốt luận văn mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo mợt mơi trường học tập nghiên cứu thân thiện phát huy tốt khả Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Đào tạo quốc tế Sau đại học Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh ln hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên môn giúp kịp thời giải vấn đề, đợng viên tơi lúc khó khăn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Tấn Việt, TS Nguyễn Ngọc Ẩn cho tơi lời khun, lời góp ý hữu ích giúp cho tơi có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tập thể Lab Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp ln giúp đỡ tạo đợng lực để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập nghiên cứu Mặc dù cố gắng hoàn thành luận văn phạm vi cho phép khả kinh nghiệm thân nhiều hạn chế, nên luận văn chắn không tránh khỏi tồn tại, hạn chế thiếu sót Tơi rất mong nhận thơng cảm, góp ý tận tình bảo Quý thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Dâu tây (Fragaria ananassa) mợt loại ăn có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Tuy nhiên dâu tây đối tượng nhạy cảm, dễ bị tác nhân gây bệnh thực vật tấn cơng Trong đó, bệnh nấm mốc gây ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng suất Hiện nay, kiểm soát sinh học một biện pháp xanh, thân thiện với môi trường cơng tác bảo vệ, phịng trừ bệnh hại thực vật Do đó, việc xác định tác nhân gây bệnh tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm bệnh điều rất quan trọng Trong nghiên cứu này, bốn chủng nấm mốc có khả gây bệnh đốm dâu tây phân lập định danh Chủng Nigrospora sp MD11 thể khả gây bệnh đốm mạnh sau ngày tái nhiễm dâu Sau sàng lọc khả đối kháng, 10/12 chủng vi khuẩn tḥc bợ sưu tập giống có khả ức chế MD11 Trong đó, chủng vi khuẩn TH5 có hoạt tính ức chế phát triển hệ sợi tơ nấm mạnh nhất, xác định tḥc chi Bacillus có tương đồng với chủng B velezensis Bac57 Chủng cho thấy có khả sinh mợt số enzyme ngoại bào (chitinase, protease) hợp chất bay Khi nuôi cấy môi trường LB cải tiến, sử dụng 1,0% cao trùn quế nguồn nitrogen, bổ sung 1,0% lactose, 35°C, pH 7,0, sau 84 thu nhận dịch nuôi cấy với hoạt tính kháng MD11 5120AU/mL Dịch ni cấy sau 24 tác động lên hệ sợi tơ nấm có khả làm biến dạng, sưng phù tế bào, mỏng vách tế bào gây ly giải tế bào chất Các hợp chất kháng mốc sinh TH5 có khả bền nhiệt, bền pH Các hợp chất bị tác đợng 0,1-1,0% chất hoạt động bề mặt (SDS, tween 20, tween 80 triton-X100) Hoạt tính kháng mốc bị giảm đáng kể xử lý với enzyme lipase protease (5-10 mg/mL) Sự tác động một số dung môi tỉ lệ 1:1 làm họat tính kháng mốc dịch ni cấy giảm rõ rệt lô xử lý với ethanol, methanol, acetone ethyl acetate Khi thử nghiệm ảnh hưởng dịch nuôi cấy TH5 lên nấm mốc MD11 mô hình in situ, kết bước đầu cho thấy hiệu ức chế nấm bệnh giảm triệu chứng bệnh đốm dâu Do đó, chủng vi khuẩn xem một tác nhân sinh học tiềm kiểm soát bệnh đốm dâu tây, góp phần xây dựng nơng nghiệp bền vững ii ABSTRACT Strawberry (Fragaria ananassa) is a fruit with high nutritional and economic value However, it is a sensitive subject, susceptible to attack by plant pathogens The leaf diseases caused by molds significantly affect the quality and yield Currently, biological control is an eco-friendly method in the protection and prevention of plant diseases Therefore, it is especially important to identify the causative agent as well as to search for bacterial strains that can antagonize the fungus In this study, four mold strains capable of causing leaf spot disease were isolated and identified The strain Nigrospora sp MD11 showed a strong ability to cause leaf spot disease after days of reinfection on strawberry leaves After screening for antagonistic ability, 10/12 bacterial strains were able to inhibit MD11 Among them, the strain TH5 has the strongest inhibitory activity on the growth of mycelium, was identified as belonging to the genus Bacillus and has similarities with B velezensis Bac57 This strain showed the ability to produce extracellular enzymes (chitinase, protease) and volatile compounds When cultured on LB medium, using 1.0% earthworm extract as nitrogen source, adding 1.0% lactose, 35°C, pH 7.0, after 84 hours, the antifungal MD11 stain activity was 5120AU/mL The cultures can distort, expand, and thin the cell wall after 24 hours of impact on the mycelium, leading to cytoplasmic lysis The antifungal compounds produced by TH5 are heat and pH stable These compounds are less affected by 0.1-1.0% of surfactants (SDS, tween 20, tween 80 and tritonX100) The antifungal activity was significantly reduced when treated with lipase and protease enzymes (5-10 mg/mL) The impact of some solvents at a ratio of 1:1 resulted in a significant decrease in the antifungal activity of the cultures in the case treated with ethanol, methanol, acetone, and ethyl acetate When testing the effect of TH5 on the MD11 in an in situ model, the initial results showed the effectiveness in inhibiting the fungal disease as well as reducing the symptoms of strawberry leaf spot Therefore, this bacterial strain is considered as a potential biocontrol agent in controlling strawberry leaf spot disease towards sustainable agriculture iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ bất kỳ mợt nguồn bất kỳ hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên Hứa Huỳnh Minh Thảo iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC… .v DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIỂU xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU…… .1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu .3 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN .5 1.1 Cây dâu tây 1.2 Bệnh đốm dâu tây .6 1.3 Cơ chế tác động tác nhân ức chế nấm mốc .9 1.3.1 Ảnh hưởng lên tế bào nấm mốc 1.3.2 Quần thể vi sinh vật 12 1.3.3 Cạnh tranh dinh dưỡng 12 1.4 Chi Bacillus 13 1.5 Các hợp chất kháng mốc từ Bacillus spp 13 1.5.1 Lipopeptide 14 1.5.2 Enzyme thủy phân ngoại bào .15 1.5.3 Hợp chất bay 16 1.6 Sự ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc từ Bacillus spp 17 v 1.7 Sự tác đợng điều kiện lý hóa lên hợp chất kháng nấm mốc 18 1.8 Chế phẩm vi sinh .20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Phương tiện nghiên cứu .22 2.1.1 Địa điểm thời gian 22 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 22 2.1.3 Hóa chất .23 2.1.4 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phân lập nấm mốc gây bệnh dâu 24 2.2.2 Xác định chủng nấm mốc gây bệnh đốm dâu 24 2.2.3 Quan sát hình thái vi khuẩn, nấm mốc 25 2.2.4 Giữ giống vi khuẩn, nấm mốc 26 2.2.5 Hoạt hóa giống vi khuẩn, nấm mốc 26 2.2.6 Nhuộm Gram .27 2.2.7 Nhuộm nội bào tử 27 2.2.8 Khả sinh catalase .27 2.2.9 Định danh vi khuẩn sinh học phân tử .28 2.2.10 Định danh nấm mốc sinh học phân tử .28 2.2.11 Sàng lọc khả kháng mốc phương pháp khuếch tán đĩa thạch 29 2.2.12 Xác định hoạt tính kháng nấm tương đối (arbitrary units) 30 2.2.13 Khảo sát khả sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào từ chủng vi khuẩn nghiên cứu .30 2.2.14 Khảo sát khả sinh hợp chất bay có khả kháng mốc 31 2.2.15 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn nghiên cứu 32 2.2.16 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc từ vi khuẩn .32 2.2.17 Khảo sát tác động dịch nuôi cấy lên phát triển hệ sợi tơ nấm .34 vi 2.2.18 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lý hóa lên hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn .34 2.2.19 Khảo sát khả ức chế nấm mốc dây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuẩn mơ hình in situ .37 2.2.20 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1 Phân lập nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây .39 3.2 Định danh chủng nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây 42 3.2.1 Chủng MD1 .42 3.2.2 Chủng MD4 .43 3.2.3 Chủng MD7 .45 3.2.4 Chủng MD11 .46 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn ức chế Nigrospora sp MD11 .47 3.4 Định danh chủng vi khuẩn TH5 48 3.5 Khả sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào chủng TH5 50 3.6 Khả sinh hợp chất bay kháng mốc chủng TH5 51 3.7 Đường cong tăng trưởng chủng TH5 53 3.8 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc chủng TH5 54 3.8.1 Ảnh hưởng nguồn nitrogen 54 3.8.2 Ảnh hưởng nguồn carbon 56 3.8.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 58 3.8.4 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 59 3.9 Tác động dịch nuôi cấy chủng TH5 lên hệ sợi tơ N sphaerica sp MD11 62 3.10 Ảnh hưởng mợt số điều kiện lý hóa lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy chủng TH5 64 3.10.1 Khả bền nhiệt hợp chất kháng mốc dịch nuôi cấy chủng TH5 64 3.10.2 Khả bền pH hợp chất kháng mốc dịch nuôi cấy chủng TH5 .65 vii 103 Phụ lục 11: Ảnh hưởng pH mơi trường lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu 12h Số lần pha lỗng cịn hoạt tính pH lần lần lần STT 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 24h Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Trung bình lần lần lần Hoạt tính 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 80 80 80 80 16 16 16 320 320 320 320 4 80 80 80 80 32 32 32 640 640 640 640 1 20 20 20 20 32 32 32 640 640 640 640 0 0 0 4 80 80 80 80 0 0 0 2 40 40 40 40 36h 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 48h Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Trung bình lần lần lần Hoạt tính 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 0 0 0 0 4 80 80 80 80 4 80 80 80 80 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 72h Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Trung bình lần lần lần Hoạt tính 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 Hoạt tính Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 8 160 160 160 160 8 160 160 160 160 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 84h Trung bình Số lần pha lỗng cịn hoạt tính pH lần lần lần STT Hoạt tính 60h 0 Số lần pha lỗng cịn hoạt tính pH lần lần lần STT Trung bình Số lần pha lỗng cịn hoạt tính pH lần lần lần STT Hoạt tính 96h Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Trung bình lần lần lần Hoạt tính Hoạt tính Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 8 160 160 160 160 8 160 160 160 160 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 256 256 256 5120 5120 5120 5120 256 256 256 5120 5120 5120 5120 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha loãng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy 104 105 ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh (AU/mL) by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean 21 21 91.4286 10 21 645.714 21 651.429 21 1097.14 21 1337.14 21 1931.43 LS Sigma 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 Homogeneous Groups A A B B C C D Phụ lục 12: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu NHIỆT ĐỘ ĐỐI CHỨNG 30 PHÚT Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 60 PHÚT 30 PHÚT Hoạt tính kháng AU/mL 60 PHÚT 30 PHÚT Hoạt tính cịn lại (%) 60 PHÚT 40 7 2560 2560 2560 100 100 100 NHIỆT ĐỘ 128 128 2560 2560 100 100 80 30 PHÚT Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 60 PHÚT 30 PHÚT Hoạt tính kháng AU/mL 60 PHÚT 30 PHÚT Hoạt tính cịn lại (%) 60 PHÚT 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 128 2560 2560 100 100 50 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 90 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 128 2560 2560 100 100 100 128 64 2560 1280 100 50 60 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 70 128 128 2560 2560 100 100 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 128 64 2560 1280 100 50 121 128 64 2560 1280 100 50 64 64 1280 1280 50 50 64 64 1280 1280 50 50 64 64 1280 1280 50 50 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy Đối chứng: Mẫu dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt 106 ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count 121 100 70 80 90 50 40 60 Doi chung LS Mean 50.0 75.0 75.0 75.0 75.0 100.0 100.0 100.0 100.0 LS Sigma 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 107 Homogeneous Groups A B B B B C C C C Phụ lục 13: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu pH Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 128 2560 100 pH Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 128 2560 100 pH Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 128 2560 100 ĐỐI CHỨNG 128 2560 100 3.0 128 2560 100 32 640 25 128 2560 100 128 2560 100 128 2560 100 10.0 128 2560 100 128 2560 100 64 1280 50 6.0 4.0 32 640 25 32 640 25 64 1280 50 128 2560 100 128 2560 100 128 2560 100 64 1280 50 64 1280 50 7.0 5.0 64 1280 50 64 1280 50 128 2560 100 128 2560 100 8.0 11.0 64 1280 50 64 1280 50 128 2560 100 64 1280 50 64 1280 50 9.0 128 2560 100 128 2560 100 12.0 64 1280 50 64 1280 50 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha loãng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy Đối chứng: Mẫu dịch nuôi cấy không xử lý pH 108 ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count 3 11 12 10 DOI CHUNG Mean 25.0 50.0 50.0 50.0 50.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Homogeneous Groups A B B B B C C C C C C 109 Phụ lục 14: Ảnh hưởng enzyme lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu Enzyme mg/mL Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính kháng AU/mL 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính cịn lại (%) 10 mg/mL ĐỐI CHỨNG 128 128 128 128 2560 2560 2560 2560 100 100 100 100 Enzyme mg/mL Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính kháng AU/mL 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính cịn lại (%) 10 mg/mL 128 128 2560 2560 100 100 32 16 640 320 25 12.5 Lipase 32 16 640 320 25 12.5 32 16 640 320 25 12.5 Proteinase K 16 16 8 320 320 160 160 12.5 12.5 6.25 6.25 16 320 160 12.5 6.25 16 320 160 12.5 6.25 16 320 160 12.5 6.25 Trypsin 16 320 160 12.5 6.25 16 320 160 12.5 6.25 Chymotrypsin 8 0 160 160 0 6.25 6.25 0 160 6.25 Pepsin 16 320 160 12.5 6.25 16 320 160 12.5 6.25 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy Li: enzyme lipase Tryp: enzyme trypsin Chy: enzyme chymotrypsin Pep: enzyme pepsin ProK: enzyme proteinase K Đối chứng 1: Mẫu dịch nuôi cấy không xử lý với enzyme Đối chứng 2: Mẫu môi trường nuôi cấy xử lý với enzyme 110 ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Enzyme Method: 95.0 percent LSD Enzyme Count Chymotrypsin Proteinase K Pepsin Trypsin Lipase Doi chung LS Mean 3.125 9.375 9.375 9.375 18.75 100.0 LS Sigma 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 111 Homogeneous Groups A B B B C D Phụ lục 15: Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy ❖ Số liệu Chất hoạt động bề mặt 0.1% Bậc pha lỗng cịn hoạt tính 1% 0.1% Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1% 0.1% 1% Đối chứng Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu Mẫu 100 100 100 100 100 100 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 Tween 20 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 Bậc pha lỗng cịn hoạt tính 1% 0.1% Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1% 0.1% 1% Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu ĐC_CHDBM Mẫu Mẫu 128 128 128 128 2560 2560 2560 2560 2560 Chất hoạt động bề mặt 0.1% CTAB 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 128 2560 SDS 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 Tween 80 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 Triton-X100 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy Đối chứng 1: Mẫu dịch nuôi cấy không xử lý với chất hoạt động bề mặt Đối chứng 2: Mẫu môi trường nuôi cấy xử lý với chất hoạt động bề mặt 112 113 ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Chat hoat dong be mat 0,1% Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups A CTAB 18.75 B Triton-X100 93.75 C SDS 98.4375 D Doi chung 100.0 D Tween 20 100.0 D Tween 80 100.0 Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Chat hoat dong be mat 1,0% Method: 95.0 percent LSD Level Count CTAB Triton-X100 SDS Tween 20 Tween 80 Doi chung Mean 75.0 93.75 99.22 99.22 100.0 Homogeneous Groups A B C D D E Phụ lục 16: Ảnh hưởng dung mơi lên hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy ❖ Số liệu Dung môi Bậc pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính lại (%) 1:9 1:1 1:9 1:1 1:9 1:1 ĐỐI CHỨNG 128 128 128 128 2560 2560 2560 2560 100 100 100 100 128 128 2560 2560 100 100 128 32 2560 640 100 25 Ethanol 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 Methanol 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 1:9 1:1 1:9 1:1 1:9 1:1 Ethyl acetate 64 64 32 32 1280 1280 640 640 50 50 25 25 64 32 1280 640 50 25 128 128 2560 2560 100 100 Chloroform 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 Hexan 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 Dung mơi Bậc pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 128 32 2560 640 100 25 Acetone 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy 114 A: acetone, C: chloroform, E: ethanol, EA: ethyl acetate, M: methanol, H: hexan Đối chứng 1: Mẫu dịch nuôi cấy không xử lý với dung môi Đối chứng 2: Mẫu môi trường nuôi cấy xử lý với dung môi ❖ Kết thống kê Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Dung moi Method: 95.0 percent LSD Dung moi Count Ethyl acetate Ethanol Methanol Acetone Chloroform Doi chung Hexan LS Mean 37.5 62.5 62.5 62.5 100.0 100.0 100.0 LS Sigma 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 115 Homogeneous Groups A B B B C C C Phụ lục 17: Khảo sát khả ức chế Nigrospora sp MD11 dịch nuôi cấy Bacillus sp TH5 điều kiện in situ Phụ lục 18: Danh mục thành phần môi trường nuôi cấy STT Tên môi trường MEA (Malt extract agar) LB (Luria-Bertani) LB + 1,0% casein LB + 1,0% chitin PGA (Potato glucose agar) PGB (Potato glucose broth) Thành phần Malt extract: 20,0g; agar 15,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 5,5 ± 0,2 Cao nấm men: 5,0g; peptone: 10,0g; NaCl: 10,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 7,0 ± 0,2 Cao nấm men: 5,0g; peptone: 5,0g; NaCl: 10,0g; casein: 10,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 7,0 ± 0,2 Cao nấm men: 5,0g; peptone: 5,0g; NaCl: 10,0g; chitin: 10,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 7,0 ± 0,2 Khoai tây: 200,0g; glucose: 20,0g; agar: 20,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 5,6 ± 0,2 Khoai tây: 200,0g; glucose: 20,0g; nước cất đủ 1,0L; pH 5,6 ± 0,2 116 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: HỨA HUỲNH MINH THẢO Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 17/04/1996 Nơi sinh: Khánh Hòa Email: huahuynhminhthao79@gmail.com Điện thoại: 0975606874 II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: 2014 – 2018: Đại học ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 2019 – nay: Thạc sĩ ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh III Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian Nơi cơng tác Cơng việc đảm nhiệm Tp HCM, ngày tháng Năm 20 Người khai (Ký tên) 117