Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv) bằng chỉ thị phân tử est ssr phục vụ cho công tác chọn giống

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG NGUYỄN YẾN VY Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Ngành : Cơng nghệ sinh học Khố : 2018-2022 Sinh viên : Nguyễn Yến Vy Người hướng dẫn : TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Sinh viên Nguyễn Yến Vy i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực cố gắng thân, nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều tập thể cá nhân Trước hết xin bày tỏ lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa thầy, cô khoa Sinh- Môi trường môi trường Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, Ban lãnh đạo cán Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ có nhiều ý kiến quý báu giúp tơi xây dựng hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu suốt q trình tơi nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Yến Vy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .iv TÓM TẮT v MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài .2 Nội dung nghiên cứu .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Tổng quan Sâm Ngọc Linh 1.1.1 Đặc điểm phân bố .4 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Giá trị dược liệu sâm Ngọc Linh .6 1.2 Chỉ thị phân tử 1.2.1 Khái niệm đặc điểm 1.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) 1.2.3 Expressed Sequence Tag (EST) 1.3 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Ngọc Linh thị phân tử 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu phạm vi nghiên cứu 14 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu Sâm Ngọc Linh 17 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 17 2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) 19 2.2.4 Kỹ thuật điện di 20 2.2.5 Phương pháp phân tích kết xử lý số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi EST- SSR .21 3.2 Kết xác định allen đa hình DNA số PIC thị EST- SSR nghiên cứu 22 3.3 Thiết lập mối quan hệ di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 32 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Base pair CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid ISSR Inter- Simple Sequence Repeat Kb Kilobase pair PCR Polymerase chain reaction PIC Polymorphism Information Content RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris-acetate EDTA TE Tris-EDTA iv TÓM TẮT Khảo sát đánh giá đa dạng di truyền trồng có vai trị quan trọng việc thu thập, bảo tồn nguồn gen chọn tạo giống Ở giống Sâm Ngọc Linh, số giống có đặc điểm hình thái gần giống hệt, có vài khác biệt nhỏ, thường dẫn đến nhầm lẫn đánh giá nguồn gen cấp độ loài Trong nghiên cứu này, thị EST- SSR sử dụng để phân tích đa dạng di truyền cấp độ phân tử 15 mẫu Sâm Ngọc Linh Kết nghiên cứu 29 thị EST- SSR, có 26 thị biểu đa hình, khuếch đại 121 allen, trung bình thị cho 4,17 allen, thị L149 khuếch đại nhiều 11 allen, thị Mr2U1, PVM129, VES17 với allen đơn hình 15 mẫu Sâm Ngọc Linh với 29 thị EST- SSR có hệ số PIC dao động từ 0.36 đến 0.9, trung bình 0,57; 68,97% thị có số PIC > 0,5 (20/29 thị) có khác biệt lớn tỉ lệ đa hình Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43-0,88 Ở mức độ tương đồng di truyền 0,68 phân chia 15 mẫu Sâm Ngọc Linh thành nhóm chính, có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 0,54 đến 0,88 Nhóm I: gồm mẫu S1 Nhóm II: gồm mẫu S2, S3, S4, S15, S5, S6 Nhóm III: gồm mẫu S7, S8, S9, S10, S12 Nhóm IV: gồm mẫu S11, S13 S14 Trong 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu, chọn 66 cặp mẫu Sâm Ngọc Linh với độ tương đồng di truyền khoảng 0,41 đến 0,69, phù hợp với công tác chọn tạo giống ưu lai Từ khóa: Chỉ thị phân tử, đa dạng di truyền, Sâm Ngọc Linh, EST- SSR v MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sâm Ngọc Linh có tên khoa học P.vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), gọi với tên khác sâm Việt Nam, Sâm khu năm (sâm K5), … (Pua, 2007) Sâm Ngọc Linh xác định thuốc quý giá trị sử dụng giá trị nguồn gen Từ phần mặt đất sâm Ngọc Linh phân lập 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin biết 26 saponin có cấu trúc Các saponin xem hoạt chất định cho tác dụng dược tính, sinh học sâm Ngọc Linh như: ngăn ngừa tế bào ung thư, bảo vệ gan, kích thích hệ miễn dịch,… (Nguyễn Thượng Dong & cs., 2007) Do khai thác mức nạn chặt phá rừng làm cho trữ lượng loài thuốc bị suy giảm Từ nhiều năm nay, Sâm Ngọc Linh đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ thuốc Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn (Nguyễn Tiến Bân & cs., 2007; Nguyễn Tập, 2006; Đỗ Huy Bích & cs., 2003) Đối với loài thuốc, yêu cầu hàng đầu công nghiệp dược phẩm dựa dược liệu tự nhiên yêu cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu Việc lựa chọn nguồn gen có chất lượng phục vụ cơng tác chọn tạo giống lồi thuốc có vai trị quan trọng (Phạm Thanh Huyền, Đinh Đồn Long, 2017) Với phát triển cơng nghệ sinh học, công cụ phân tử đời tỏ rõ ưu công tác phân loại, bảo tồn, chọn, tạo nhân giống loài thực vật, chúng không chịu ảnh hưởng từ điều kiện ni trồng, đồng thời thao tác số lượng lớn mẫu định với độ xác cao để đáp ứng yêu cầu trình phát triển công nghiệp chế biến dược liệu bền vững Các thị phân tử khác nghiên cứu phát triển trở thành công cụ để phân tích đa dạng di truyền xác định mối quan hệ giống trồng RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats),… Trong đó, thị SSR loại thị sử dụng phổ biến, xác hữu hiệu giúp phân loại giống trồng khác lồi thực vật có ưu điểm vượt trội so với thị khác khả phát đa hình cao Dựa theo nguồn gốc, thị SSR chia thành loại: SSR từ thư viện gen SSR từ sở liệu EST Các dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản có nguồn gốc từ thẻ biểu (EST-SSRs) dấu hiệu lựa chọn sử dụng nghiên cứu chúng phong phú, có tính đồng trội, đa hình cao dễ dàng lập đồ di truyền lồi có mối quan hệ gần gũi với Hiện nhu cầu sử dụng Sâm Ngọc Linh Việt Nam lớn Vấn đề đặt làm để khai thác phát triển bền vững loài thuốc đáp ứng nhu cầu thị trường nước Để có sở cho cơng tác bảo tồn chọn lọc nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc việc đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen Sâm Ngọc Linh thực cần thiết Trên sở đó, tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thị phân tử EST-SSR phục vụ cho công tác chọn giống” Mục tiêu đề tài Đánh giá mức độ đa dạng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh giống gốc thị phân tử EST-SSR phục vụ công tác chọn giống Ý nghĩa đề tài a Ý nghĩa khoa học Kết đề tài đóng góp đáng kể vào nghiên cứu xác định tính đa dạng di truyền giống sâm Ngọc Linh nói chung lồi dược liệu q Việt Nam nói riêng Kết nghiên cứu đề tài bổ sung tư liệu khoa học đặc điểm di truyền sâm Ngọc Linh, góp phần làm phong phú thêm kho tư liệu sâm làm sở cho nhà chọn tạo giống nghiên cứu b Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đánh giá đa dạng di truyền cấp độ phân tử 15 mẫu giống Sâm Ngọc Linh, cho phép phân loại mẫu giống hệ số tương đồng di truyền với nhóm, từ chọn cặp để lai tạo giống Sâm Ngọc Linh có ưu lai cao phục vụ cho công tác chọn giống Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi EST- SSR Nội dung 2: Xác định mức độ đa hình thị phân tử EST- SSR Nội dung 3: Đánh giá mức độ đa dạng di truyền dòng sâm Ngọc Linh