Nghiên cứu chẩn đoán bệnh héo xanh do vi khuẩn lelliottia amnigena gây ra trên cây cà chua bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ KIM CÚC NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN BỆNH HÉO XANH DO VI KHUẨN LELLIOTTIA AMNIGENA GÂY RA TRÊN CÂY CÀ CHUA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà Nẵng – Năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ KIM CÚC NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN BỆNH HÉO XANH DO VI KHUẨN LELLIOTTIA AMNIGENA GÂY RA TRÊN CÂY CÀ CHUA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng – Năm 2022 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý Thầy, Cô giáo Khoa Sinh- Môi trường hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Minh Lý người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đưa góp ý, động viên, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng khoa học cho suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp, người anh, người chị và bạn sinh viên phòng sinh học tế bào động viên tinh thần, đồng hành suốt thời gian hoàn thành luận văn Cuối cùng, với tình u từ đáy lịng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, chồng, anh, chị, em, người thân yêu bên cạnh, động viên vật chất lẫn tinh thần để vững tâm hoàn thành luận văn mình Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả! MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể 3 Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Bố cục đề tài .3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cà chua .4 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại giá trị dinh dưỡng cà chua 1.1.2 Đặc điểm thực vật học cà chua 1.1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh 1.2 Khái quát héo xanh vi khuẩn 1.2.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn 1.2.2 Tác hại bệnh héo xanh vi khuẩn .8 1.2.3 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh 10 1.3 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Lelliottia amnigena 11 1.3.1 Phân loại 11 1.3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn L amnigena 12 1.3.3 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn L amnigena 13 1.3.4 Phương thức tồn tại, xâm nhập lây lan L amnigena .13 1.4 Chẩn đoán bệnh trồng 15 1.4.1 Khái quát chẩn đoán bệnh 15 1.4.2 Phương pháp chẩn đoán bệnh 15 1.5 Ứng dụng thị phân tử chuẩn đoán bệnh HXVK 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu .22 2.3.1 Tìm trình tự DNA đặc trưng cho loài L amnigena 22 2.3.2 Thiết kế trình tự đoạn mồi 22 2.3.3 Đánh giá hiệu cặp mồi thiết kế .23 2.3.4 Xây dựng quy trình chẩn đốn phân tử L amnigena gây bệnh héo xanh 25 2.3.5 Phương pháp tính tốn xử lí số liệu .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Xác định trình tự dna đặc trưng cho loài L amnigena 28 3.2 Thiết kế cặp mồi dựa trình tự dna đặc trưng loài L amnigena 33 3.2.1 Thiết kế trình tự cặp mồi 33 3.2.2 Kiểm tra tính đặc hiệu trình tự mồi thiết kế 35 3.2.3 Phản ứng PCR mô hệ gen chủng L amnigena 37 3.3 Đánh giá hiệu cặp mồi thiết kế phương pháp thực nghiệm 40 3.3.1 Phản ứng PCR với cặp mồi Pec431 40 3.3.2 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp với cặp mồi Pec431 43 3.4 Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh HXVK L amnigena gây .44 3.4.1 Đánh giá khả gây bệnh vi khuẩn L amnigena phương pháp gây bệnh nhân tạo .44 3.4.2 Tái phân lập vi khuẩn xác định tác nhân gây HXVK 45 3.4.3 Định danh vi khuẩn gây bệnh thị phân tử 47 3.4.4 Quy trình chẩn đoán bệnh HXVK L amnigena cà chua .49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Kết luận 52 Kiến nghị 52 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair cs Cộng CTPT Chỉ thị phân tử CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid HXVK Héo xanh vi khuẩn Kb Kilobase PCR Polymerase chain reaction SP Sucrose peptone SPA Sucrose peptone agar TBE Tris-Borate acid-EDTA TZC 2,3,5- triphenyl tetrazolium clorua DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh sách chủng vi khuẩn loài sử dụng nghiên cứu 21 3.1 Mức độ tương đồng số locus thuộc loài L amnigena 30 3.2 Thông tin đoạn mồi thiết kế dựa trình tự đặc trưng loài L amnigena 35 3.3 Kết BLASTn trình tự đoạn mồi đặc hiệu 39 3.4 Kết chạy PCR mô phần mềm FastPCR 41 3.5 Tỉ lệ héo xanh vi khuẩn L amnigena gây hại cà chua (%) 45