BỘ Y TẾ
VIÊN DƯỢC LIỆU
BAO CAO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ
SU DUNG CHi THI PHAN TU ADN KẾT HỢP VỚI CÁC DẤU HIỆU HÌNH THÁI TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI
MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở VIỆT NAM
Chủ nhiệm đẻ tài: TS NGUYỄN VĂN TẬP
6913 01/7/2008
Trang 2BÁO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
THÔNG TIN CHUNG YỀ ĐỀ TÀI
1 Tên để tài: Sử dụng chỉ thị phản tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam
2 Chủ nhiệm để tài : TS Nguyễn Văn Tập
3 Phó chủ nhiệm để tài : ToS Pham Thanh Huyền 4 Cơ quan chủ trì để tài: Viện Dược Liệu (Bộ Y tế)
5 Kinh phí thực hiện _ : 220.000.000 đồng (Hai trăm hai mươi triệu đồng)
6 Danh sách những người thực hiện chính:
TS Nguyễn Văn Tập: Viện Dược liệu - Chù nhiệm để tài
ThS, Phạm Thanh Huyền: Viện Dược liệu - Phó chỉ nhiệm để tài TS Định Đoàn Long: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội CN Ngo Van Trai: Việu Dược liệu
ThS Le Thanh Son: Viga Duc tigu Th§ Ngơ Đức Phương: Viện Dược liệu KTV Cù Hải Long: Việu Dược liệu
Th§ Hồng Thị Hòa: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội
Trang 3ADN AFLP BK DDSH FAO NGBG NGBGL NGBH HN HNPM HNU APLC IUCN KHKT PCR RAPD- PCR DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU YÀ CHỮ VIẾT TÁT Axit deoxyribonucleic
Amplified Fragment Leagth Polymorphism (Đa hình độ đài các phân đoạn khuếch đại)
Ba kích
Dược điểu Việt Nam Da dang sinh học
The Eood and Agricultuee Orgaizarion of the Uaited Nation (Tổ chức tương thực và nông nghiệp Liên hiệp quốc)
Ngũ gia bì gai
Ngũ gia bì gai lông Ngũ gia bì hương
Bảo tàng thực vật (thuộc Việu Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam)
Bảo tàng Dược liệu áhuộc Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu)
Bảo tầng thực vật (huộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)
High perfomance liquid chromatogmphy (Séc ky long cao 4p)
The International Union for Conservation of Natuce and Natucal Resouses (Tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế)
Khoa học kỹ thuật Nhà xuất bản
®olyreras Chain Reaction (Phâu ứng chuỗi trùng hợp ADN)
Trang 4SKIM SSR SVD SNL mm WWE Restricted Fragmeat Length Polymorphism (Đa hình độ đài các đoạn giới hạn) Sắc ký lớp mròng Simple Sequence Repeats @a hiah các trình tự lập lại đơn giảu SSR) Sâm vũ điệp Sâm ngọc linh Nhiệt độ Tung bình Trung gian Tam that hoang
Trang 5MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chương 1 TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam của các đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Về thực vật học
1.1.1.1, Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai
1.1.1.2 Sám vũ điệp, Tran thất hoang và Sám ngọc linh, 1.1.1.3, Ba kích
1.1.2 Về giá tả
1.1.2.1 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai
1.1.2.2 Sám vũ điệp, Tran thất hoang và Sám ngọc linh, sir dung 1.2.Tổng quan vẻ các loại chi thị và dấu chuẩn trong nghiền cứu thảo dược trên thế giới và ở Việt Nam 16 1.2.1 Chỉ thị (kỹ thuật) RAPD-PCR 17
1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị phân tử
ADN 6 Vit Nam 20
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG YẢ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 22
2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa diém thu mai
22
2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Điều tra thu thập mất
2.2.2 Xác định tên khoa học và rnơ tả hình thấi các lồi
2.2.3, Phân tích chỉ thị phân từ ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu
2.2.4 Đánh giá về sự kết hợp giữa việc sử dụng chỉ thị ADN với các dấu chuẩn hình thái trong nghiên cứu phân loại phục vụ công tác bảo tổn
và phát triể các loài cây thuốc - 23 33 24
2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Điều tra thu thập mmất 2.3.2 Xác định têu khoa học 2.3.3, Phân tích ADN
Trang 6
2.5 Trang thiết
Chương 3.KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU YÀ BẢN LUẬN
3.1 Điều tra, thu thập mẫu
bị, dung môi hóa chất
3.1.1 Thu mẫu tiêu bản thực vật 27
3.1.2 Thu thập mẫu nghiên cứu ADN 28
3.1.3 Thu mẫu được liệu chuẩn -Ö°-29
3.2, Xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của các loài Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất
hoang và Ba kích 30
3,3, Kết quả nghiên cứu chỉ thị ADN 3.3.1 Nghiên cứu tách chiết ADN
3.3.2 Sử dụng chỉ thị ADN (RAED-PCR) để đánh giá sự đa dạng di truyền 3.3.3 Bước đầu xác định một số chỉ thị RAPD-PCR đặc trưng của Ngũ gia bì
bương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ điệp, Tam thất hoang và Ba kích góp phầu trong việc xác định loi
3.4 Đánh giá vẻ việc sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ chị ADN (RAPD- PCR) trong nghiên cứu
3.4.1 Áp dụng phương pháp phâu loại hình thất so sánh trong việc xác định các loài NGBH, NGBG, SVD, TTH, SNL và BK và một số vấn đẻ đồi
hdi phải nghiên cứu
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang Bảng 3.1 - Địa điểm và số lượng các mẫu nghiêu cứu ADN của các loài Ngũ
gia bì gai (NGBG), Ngũ gia bì hương (NGBH), Sâm vũ điệp (SVD), Tam thất hoang (TTH), Sâm Việt Nam (SVN) và Ba kích
(BK) phục vụ nghiên cứu 28
Bảng 32 - Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của hai loài Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được sử dụng trong
nghiên cứu phân tích ADN 39
Bảng 3.3 Kết quả do quang phổ hấp thụ của dịch chiết ADN tổng số của các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bi gai (G) 4L Bảng 3.4 - Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của ba loài Sâm
ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian Sâm vũ diệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) 4 Bang 35 Kết quả do mật độ quang phổ của các mẫu Sâm ngọc linh (S),
Sâm vũ điệp (V), dang trung gian (VT) và Tam thất hoang (T) 45 Bảng 36 _ Danh sách, địa điểmthu thập và kí hiệu các mẫu cùa Ba kích(B) 46 Bảng 37 Số bảng RAPD-PCR da hình của các mẫu thuộc hai loài Ngũ gia
bì hương và Ngũ gia bì gai phâu tích với L6 môi ngẫu nhiên 49 Bang38 Số kiểu di truyền biểu hiện khi sử dụng các mỏi RAPD-PCR
+khác nhau từ kết quả phân tích các rnẫu Ngũ gia bì hương thu
thập được trong nghiêu cứu 52
Bảng 3.9 - Số bảng RAPD da hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai thu ở lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơ tính theo từng
méi 52
Bảng 3.10 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài
Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) 56 Bang 3.11 Số bảng RAED-PCR đa hình của các mẫu thuộc ba loài Sâm Ngọc
linh (SNL), Sâm Vũ điệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích
với 13 mdi ngẫu nhiên 58
Bảng 3.12 Bảng hệ số tương đồng di truyền của các mẫu quần thể ba loài Sam ngọc linh (S), Sâm vũ điệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng
trung gian (VT) 63
Bảng 3.13 Thống kê số băng ADN thu được của 25 mẫu Ba kích (B) nghiên
cứu với 12 môi 66
Bang 3.14, Số bảng RAPD-PCR da hình của các mẫu thuộc loài Ba kích với
12 mỏi ngẫu nhiên 67
Bảng 3.15 Hệ số tương đồng ditruyều của 25 mẫu thuộc loai Ba kich (B) 69 Bảng 3.16 Các chỉ thị RAPD-ECR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp
Trang 8phâu phân biệt ba loài Sâm ngọc link (SNL), S4m vii digp (SVD) và Tam thất hoang (TTH)
Trang 9Tình 3.1 Hình 32 Hình 3.3 Tình 3.4a Hình 3.4b Hình 3.5 Hinh 36 Hinh 3.7 Hinh 38 Hinh 3.9 Hinh 3.10 Hinh 3.11 Hinh 3.12 Hinh 3.13 Hinh 3.14, Hinh 3.15 Hinh 3.16 Hinh 3.17 Hinh 3.18 Hinh 3.19 DANH MỤC CÁC HÌNH YẼ, ĐỒ THỊ
Ngũ gia bì hương (Cành mang nụ hoa) Ngũ gia bì gai lông
Ngũ gia bì gai (Cành mrang hoa) Sâm vũ điệp (Cây có quả chín)
Sam vũ điệp lá xẻ nông
Tam thất hoang (Cây có quả chín)
Dang Øznaz có lá xế nông (dạng trung gian của Sâm vũ điệp và Tam thất hoang) Sâm Việt Nam (cây có quả chín) Ba kích có quả tụ Ba kích có quả rời Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G)
Ảnh đện di A DNIs của các mrẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ đệp (V),
Tam that hoang (T) và dạng trung giana (VT)
Kết quả điệu đi ADN tổng số của các mẫu Ba kích sau khi điệu đi trên gel agarose
Aah dign di sta phim RAPD-PCR céc miu Ngii gai bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch dai bang méi OPCS Aah dign di sta phẩm RAED-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương
(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bang mdi OPAS Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của
hai loài Ngũ gia bì hương (H) va Ngũ gia bì gai (G)
Bảng đồng hình (chỉ ra bồi hình đầu rnữi tên) của các ruẫu Sâm ngọc linh (5), Sâm vũ điệp (V) và Tam thất hoang (T) tương ug với môi OPA l4, OPCI và OPA7 cùng biểu đỏ chỉ tiết số băng đa hình (mau ghi) và đồng hình (màu đen) của mỗi loài với từng mồi
cụ thể,
Sơ đồ cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của các loài Sam Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian của Sâm vũ điệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) Cây quan hệ di truyền của các mẫu thuộc loài Ba kích (B)
Trang 10Tình 320 Hình 321 Hình 322 Hình 323 Hình 324 Hình 325 Hinh 3.26 Hinh 3.27 Hinh 3.28
Aah dign di sta phẩm RAPD-PCR céc miu Ngii gia bi huvag (H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bang moi OPALS Ảnh điện di sảu phẩm RAED-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bang moi OPAL2 Aah dign di sta phẩm RAED-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bing mdi OPAL Aah dign di sta phẩm RAED-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bang moi OPA4 Ảnh điệu di sản phẩm RAED-PCR các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vĩ điệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm vũ điệp - Tam thất hoang (VT) được khuếch đại bằng mồi OPA 14 và OPA l6
Kết quả điện di các mẫu Ba kích với mỗi OPAL Kết quả điện di các mẫu ba kích với trôi OPC3
Hình ảnh một số bãng đồng hình từ kết quả điệu di các mẫu Ba kích với môi OPAL?
Trang 11BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
'Yẻ tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đẻ tài KH & CN cấp Bộ
1 Tên đề tài: Sử đựng chỉ Dị phản tử ADN kết hợp với các đấu hiệu hình thái trong
nghiên cứu phản loại một số cây thuốc ở Việt Nam
2 Chủ nhiệm đẻ tài: TS Nguyễn Văn Tập
3 Phó chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thanh Huyẻn
4, Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu (Bộ Y tẻ) § Thời gian thực hiện đề Từ tháng 10 nãm 2005 đến tháng 12 nam 2007 6, Tổng kinh phí thực hiện đẻ tài: 220.000.000 đồng "Trong đó, kinh phí từ NSNN: 220.000.000 đồng 7 Tình hình thực hiện đẻ tài so với đẻ cương:
7.1 Về mức độ hoàn thành cơng việc
Đã hồn thành tồn bộ các nội dung nghiên cứu để ra trong bản để cương, bao gồm:
- Đã thu thập được số lượng lớn các loại mẫu đáp ứng nhu cầu nghiên cứu: Phân loại hình thái (mẫu tiêu bản thực vật), mẫu nguyên liệu nghiêu cứu ADN và mẫu dược liệu (được coi là chuẩn) của cả 6 loài đối tượng nghiên cứu
- Qua nghiên cứu hình thất đã xác định các rnẫu thu được thuộc 6 loài: Acanthopanax gracilistylus, Acanthopanax trifoliatus, Panax vietnamensis, Panax stipuleanctus, Panax bipinnatifidus va Morinda officinalis Ket qua gidm diah aay còn được giám định bới sự khác biệt về chỉ thị ADN khi áp dụng kỹ thuật RAPD- PCR
- Đã tách chiết được ADN của 6 loài đảm bảo tỉnh sạch, đấp ứng được yêu cầu cho các bước nghiên cứu tiếp theo (đã xây dựng được qui tảnh tách chiết)
Trang 12Sâm vũ điệp (P bipianatifdue ), dạng Ba kích có nhiều lông và không có lông có thể thuộc hai loài khác nhau Đặc điểm này có sự khác biệt di truyền rõ nét hơn so với đặc điểm có quả tụ hay qua cdi Tuy nhiên, vé thé Neil gia bi long (A trifoliatus var setosus) - Với kết quả nghiêu cứu chỉ thị ADN hiện có, chưa thật đầy đủ các
dấu liệu để khẳng định sự khác biệt với loài gốc của nó
- Bước đầu đã đưa ra được sự phân tích vẻ sự kết hợp giữa phương pháp nghiên cứu phân loại hình thái với phương pháp sử dụng chỉ thị ADN trong việc xác định chính xác tên khoa học cũng như vẻ định hướng bảo tồn 6 loài cây thuốc quí hiếm kể trên
7.2, Về yêu câu khoa học và chỉ tiều cơ bản của các sẵn phẩm KHCN:
- Vẻ phương pháp nghiên cứu đã áp dụng là phù hợp và tối ưu trong điều kiện nghiên cứu hiệu nay ở Việt Nam
- Các số liệu thu được cũng như toàn bộ nhưng xkết quả nghiên cứ đảm bảo trung thực, đáng tin cậy và chất lượng khoa học cao
7.8 Về tiến độ thực hiện
Đây là để tài vừa phải đi điều tra thu thập mẫu ở nhiều tỉnh miễn núi khác nhau (cả Miễn Bác và Miễn Nam), vừa phải tiến hành phân tích một số lượng mẫu lớn của 6 loài (nghiên cứu ADN), Tuy nhiên vẻ tiến độ thực hiện vẫn được thực hiện chật chẽ, đúng với yêu cầu về thời gian do dé thi đưa ra
8 Vẻ những đóng góp mới của đẻ tài
Có thể nói gầu như toàn bộ những kết quả nghiên cứu của để tài này đều là những đóng góp rnới đối với Việt Nam, thậm chí có nhiều điểm mnối đối với khoa học, cụ thể:
8.1 Về giải pháp khoa học công nghệ
- Bước đầu đã ứng dụng thành công chỉ thị ADN (RAPD-PCR) với phương pháp phân loại hình thái cổ điển để xác định chính xác bậc phân loại ở taxon Loài Với kết quả nghiên cứu về tính đặc trưng và hệ số khác biệt dĩ truyền còn có thể xác
định được các dạng hình thái trung giau thuộc loài mào Đồng thời hy vọng cũng sẽ xác định được về mật phân loại thực vật ở bậc dưới loài
Trang 13- Đã xây dựng được qui tảnh tách chiết ADN đâm bảo độ tỉnh sạch, phục vụ quá tình nghiên cứu Phương pháp sử dụng chỉ thị ADN sẽ được áp dụng để kiểm định đối với loại dược liệu thuộc 6 loài trên khi có yêu cầu nghiêu cứu kiểm định tại Việt Nam
- Bước đầu đã nắm vững được kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu
8.3 Về những đồng gốp mới và kết quá khu
* Đã góp phẩu đào rạo 3 cử nhân công nghệ sinh học:
(1) Họ và tên sinh vie: DamQuang Hieu Namốtnghiệp:2007
Ten đề tài: Sứ đụng chỉ thị phân tử RAPDL.PCR nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền và góp phân phân loại một số kiểu hình thái của cây Ba lích (Morinda officinalis How) 6 Viet Nam
() Họ và tên sinh viên: Nguyễn Minh Hường, Nam i6t aghigp: 2007 Tên đề thi: Sif dung chf thi RAPD-PCR trong danh gid da dang di truyén và góp phân phân loại một số loài cây thuốc quý thuộc chỉ Panax L ở Việt Nam
(3) Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Tuyển — N&mtốtnghiệp:2007
Tên để tà: Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền hai loài cây thuốc Ngũ gia bi gai (Acanthopanax irifoliatus (L.) Merr.) va Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) & Việt Nam bang chỉ thị RAPD-PCR
* Đào tạo | aghiéa cứu sinh về bảo tồn cây thuốc
Ho wa tén nghiên cứu sinh: Phạm Thanh Huyền Bảo vệ cấp NN: 2008
Tên để tà: Algiiền cứu một số đặc điểm sùth học của bốn loài cây thuốc qui thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ở Việt Nam nhằm bảo tên và phát triển
* Hướng dẫn nhóm sinh viêu tham gia Hội nghị Khoa học sinh viêu của Trường Đại học Khoa học tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội) năm 2007
Ten dé thi: Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD.PCR) trong đánh giá đa dang di truyền và góp phân phân loại một số loài cây thuốc quý ở Việt Nam
Trang 14Người hướng dẫu: TS Đinh Đoàn Long, Th5 Phạm Thanh Huyền Kết quả: Đạt giải Nhì tồn trường
* Cơng bố được 2 bài báo khoa học trong Báo cáo Hội nghị Dược liệu toàn quốc và "Tạp chí khoa học của Đại học Quốc gia Hà Nội
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2007
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
Trang 15DANH SÁCH TÁC GIẢ CỦA ĐỀ TÀIKH & CN CẤP BỘ
1 Tên đề tài: Sử đụng chỉ thị phán tử ADN kết hợp với các đấu hiệu hình thái trong
nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam
2 Thời gian thực hiện đẻ tài: Từ tháng LŨ nam 2005 đến tháng 10 nam 2007
Trang 16ĐẶT VẤN ĐỀ
Phân loại sinh học là một ngành khoa học có lịch sử lâu đời, giúp cho việc nhận biết và phân biệt giữa các taxon cùng với mối quan hệ của chúng trong quá trình tiến hóa
Phương pháp chung được sử dụng trong phân loại các bậc taxon sinh hoc nói chung và thực vật nói riêng là căn cứ vào các đặc điểm hình thái bên ngoài
của các cơ quan sinh dưỡng, đặc biệt là các cơ quan sinh sản (thực vật)
Trong những năm gần đây, trên thế giới cũng như ở nước ta, các chỉ thị
ADN (như RAPD, RFLP, SSR .) ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc
nghiên cứu nguồn gen các tài nguyên sinh vật Trong số các chỉ thị đó, đa hình độ dài các trình tự ADN được khuếch đại ngẫu nhiên RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA) được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá tính đa dạng của các nguồn gen Đây là một phương pháp phân tích hệ gen tương đối đơn giản và nhanh chóng, cho phép so sánh sự đa dạng di truyền trong phạm vi một loài cũng như giữa các loài khác nhau Đối với các loài thực vật, chỉ thị RAPD đã được sử dụng hiệu quả trong việc đánh giá tính đa
dang di truyền và góp phần phân loại một cách chính xác các taxon dưới loài Như chúng ta đã biết, trong nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta, cây thuốc
giữ một vai trồ quan trọng trong việc cung cấp thuốc cho y học cổ truyền Tuy
vậy, phần lớn các loài cây thuốc hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên nên
tất yếu dẫn đến sự suy kiệt nguồn tài nguyên Bên cạnh đó, do thu hái tự phát
trong tự nhiên nên chất lượng dược liệu không đồng bộ, hoặc đã xảy ra sự nhằm lẫn, thậm chí còn bị giả mạo Những vấn đẻ trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết cần có các biện pháp xác định chính xác các loài cây thuốc hoặc dược
liệu, phục vụ cho yêu cầu bảo tổn và phát triển, nhằm cung cấp được các nguyên liệu làm thuốc có chất lượng cao
'Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các chỉ thị phân từ,
Trang 17kiểm định cây thuốc và dược liệu Trong các phương pháp vẻ chỉ thị ADN cần kể đến các chỉ thị RAPD-PCR Đây là kỹ thuật tiên tiến, dễ áp dụng và kết quả mang lại thường khả quan trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền, góp phản phân loại các loài thực vật nói chung và cây thuốc nói riêng một cách chính xác Đặc biệt là những taxon có quan hệ gần gũi về mặt di truyền và có
các đặc điểm hình thái tương tự nhau
Xuất phát từ tình hình thực tế nói trên, chúng tôi tiến hành đẻ tài "Sử đựng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu
phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam”, với các mục tiêu sau đây:
Muc tén chưng: Tiếp cận được với một phương pháp mới trong việc sử dụng chỉ thị phân từ ADN kết hợp với phương pháp phân loại hình thái cổ
điển, nhằm xác định chính xác tên khoa học của các loài cây thuốc, góp phảu định hướng cho công tác bảo tỏa, cũng như góp phảu tiêu chuẩn hóa và kiếm định dược liệu ở Việt Nam
Mục tiêu cụ thể là:
(D) Ap dung chỉ thị ADN (RAPD - PCR) kết hợp với phương pháp phân
loại bình thái cổ điển nhằm xác định chính xác tên khoa học ở bậc phân loại loài hoặc dưới loài của 6 loài cây Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sam ngọc linb, Sim vii digp, Tam that hoang và Ba kích
) Thông qua việc áp dụng kỹ thuật RAPD - PCR bước đầu đánh giá sự da dạng nguồn gen, phục vụ cho yêu cầu bảo tổn, cũng như việc tiêu chuẩn hóa
Trang 18CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.I TỔNG QUAN VE TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VA Ö VIỆT NAM CỦA CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1 Yê thực vật học
1.111 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai
Trên thế giới, Ngũ gia bì hương (NGBH) và Ngũ gia bì gai (ÑGBG) đều thuộc chỉ Acanthopanax Miq., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chỉ nầy trên thế giới hiện đã biết có loài, phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới, nhiệt đới
hoặc vùng ôn đới ấm của châu Á [70, 92]
Ngũ gia bì hương đã được Smith xác định tên khoa học từ năm 1617 là Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith và từ đó cho đến nay không thấy có sự thay đổi nào Trên thế giới, loài này rnới được phát hiện ở Trung Quốc [70, 91
Ngũ gia bì gai được Lianế xác định đầu tiên với tên khoa học là Zanthoxylum trifoliatum L., năm 1733 Đến năm 1789 Ait chuyển thành chỉ
Panax với tên khac la Panax aculeatus Ait Sau đó được Witte (1861), H L
Li (1970) xép vao chi Acanthopanax Đồng thời để ghỉ nhớ cách đặt tên đầu tiên của Linnế (1733), nên các nhà thực vật học đều thống nhất tên khoa học của loài Ngũ gia bì gai là Acanthopanax (rifoliatu (L.) Merc Về sau, khi nghiên cứu phân loại họ Araliaceae ở vùng Đông Á, H.L.Li đã xác định thêm trong loài NGBŒ ở Trung Quốc có một thứ (var.) nữa là A (rÿiiafuz vat setosus Li [70, 92] Thứ (var.) này cũng đã được phát hiện ở Việt Nam [3, 8,
10]
NGBG trêu thế giới có vùng phân bố tương đối rộng, kéo đài từ Trung Quốc, Đài Loan xuống đến Việt Nam, Lào và ở cả Philippia [31, 70, 92]
Ở Việt Nam, chi Acanthopanax Mig dugc R Vigues nghiên cứu đầu
Trang 192 loài Acanthopanax aculeafuz (Ait.) Witte và một loài mới ông thu thập được
ở núi Ba Vì - Hà Tây: A baviensis R.Vig Loai A aculeatus (Ait.) Witt sau ted
thành đồng danh (Syn) của A #ÿolans (L) Mer Loài NGBH (Acanthopanax gracilistyius W.W.Smith) được Grushvitzky và Trương Canh thu được mẫu lần đầu tiên năm 1969 tại Phó Bảng, Hà Giang Về sau, Nguyễn
Tập, Bùi Xuân Chương, Lưu Minh Xư (1973) ghỉ nhận cụ thể thêm vẻ phân
bố Bao gồm ở thị trấn Phó Bảng, xã Phố Là, Sùng Là (huyện Đỏng Văn), xã Mèo Vạc (huyện Mèo Vạc) tỉnh Hà Giang; gần đây cồn thấy trồng tại vườn
một số nhà dân thuộc xã Quyết Tiến (huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang); xã Hầu
Thao (huyện Sa Pa) và thị trấn Bắc Hà, tỉnh Lào Cai [21, 88]
Tổng hợp các chỉ Acanthopanax Miq ở Việt Nam, Nguyễn Quang Hào và Mai Nghị (1972) thống kê có 4 loài là Acanthopanax trifoliatus, A
gracilistylus, A baviensis và A evodiaejolius [10]
Loài A baviensis do R Viguer thu thập ở Ba Vì, nhưng cho đến nay chưa có ai thu lại được mẫu Còn loài A evodiaefolis hiện đã chuyển sang
chỉ mới (Evodiopanax) Như vậy, theo Nguyễn Tập, Nguyễn Chiều, Ngô Văn
Trại và Mai Nghị (1986) [21]; theo Grushvitzky và Hà Thị Dụng (1990) [8] thì
chỉ Acanthopanax Mia ở Việt Nam có 2 loài và 1 thứ (var.) sau:
- Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus (L.) Mere.): phan bố tập
trung ở vùng rừng núi đá vôi, thuộc các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu,
lào Cai và rải rác ở các tỉnh Yên Bái, Sơa La, Điện Biên, Hòa Bình, Thanh
Hóa, Nghệ An, Quảng Nam và Kon Tum
- Ngũ gia bì gai long (Acanthopanax trifoliatus vat setosus L.): phan bố lẫn loài trên ở Lạng Sơn, Lào Cai và Lai Châu
- Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W W Smith): phân bố
Trang 201.1.1.2 Sâm vũ điệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh
Trên thế giới, chỉ Zanax L hiện đã biết có 13 loài và dưới loài, phân bố chủ yếu ở vùng cậ nhiệt đới và ôn đới ấm châu Á và châu Mỹ Trong đó, một số loài như Nhân sâm, Tam thất, Giả nhân sâm, Tây dương sâm đã trở thành cây trồng Các loài mọc tự nhiên còn lại bao gồm cả Sâm vũ điệp (SVD), Tam thất hoang (TTH) và Sâm ngọc linh (SNL) kể trên
Sâm vữ điệp: Tên khoa bọc của loài Sam vũ điệp được nhà thực vật học người Đức Bethold Car Seemana xác định đầu tien a Panax bipinnatifidus Seem vào năm 1868 Đến năm 1879, Charles Baron Clatke đã chuyển loài aay sang chi Aralia la Aralia bipinnatifidus (Seem.) C B Clarke, 1879 Sau Clarke cd cé Isaac Henry Burkill lai xếp Sâm vũ điệp cùng loài với Sảm Mỹ song là thứ (vat.) khác của Aralia quinguejolia (L.) Dec et Plan Var major Burkill, 1902 (Kew Bull, 1902: 7); Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan var elegantior Buckill, 1902 (Kew Bull 1902: 8) [25, 47, 48, 81, 86, 89] Quan
điểm trên tôn tại đến gầu giữa thế kỷ 20, khi Hui-Lia Li (1996) nghiên cứu hệ
thực vật Đông Á, ông đã đưa Sâm vũ diệp trở lại với chỉ Panax Day [A mot quan điểm đúng đắn, bởi vì từ đó đến nay, mặc dù Sâm vũ diệp có thể được xếp vào các loài, loài phụ (ssp.) hoặc thứ (var.) khác nhau, nhưng loài này vẫn thuộc chỉ #anax với các têu khoa học khác nhau như: Pgnax pseudoginseng Wall vat bipinatifidus (Seem.) Li., 1942.; Panax pseudoginseng Wall var major (Burkill) Li, 1942.; Panax major Tiog ex Pei, 1958.; Panax pseudoginseng Wall spp himalaycus Hara, 1970.; Panax pseudoginseng Wall elegantior (Burkill) Hoo et Tseng, 1973; Panax japonicus Mey.var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feag, 1975 [25, 39, 47, 48, 79, 80, 8L, 89, 90, 92]
Trang 21chỉnh, trên cơ sở bổ sung một số chỉ thị ADN [80, 81] Vì thế, Sâm vũ diệp lại
được trở về với tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem do Berthold Carl Seemann xác định từ năm 1868
'Về phân bố, Sâm vũ diệp trên thế giới được ghi nhận ở phía Nam Trung
Quốc, Bắc Myanma, Đông - Bắc Ấn Độ va Népan [25, 47, 48, 81, 86, 89, 92]
Tam thất hoang: Tam thất hoang cồn gọi là Bình biên tam thất, Hương thích hay Bạch tam thất (Trung Quốc) Loài này lúc đầu chỉ được xếp là một
thứ (var) của loài giả Nhân sâm (Panax pseudogimseng vat bipinnatifidus Hoo et Tseng) cùng với loài Sâm vũ diệp [48] Về sau, khi đã đầy đủ dẫn liệu, Tam thất hoang được cơng bố là lồi mới đối với khoa học (Panax afipuleanatus TH T Tsai et K M Feng, 1975) bởi một nhóm các nhà thực vật học Trung Quốc, trong Acta Phyfofaxonomy Siaica, số 13 năm 1975 [86]
Đến năm 2000, trong một công bố của Jun Wen,, tác giả cũng thừa nhận Tam
thất hoang là một loài độc lập [81], với tên khoa học đã được các nhà thực vật
Trung Quốc công bố kể trên [86]
'Về phân bố, Tam thất hoang hiện mới chỉ thấy ở tỉnh Vân Nam - Trung
Quốc Trong công bố năm 1975 của các nhà Thực vật học Trung Quốc cũng
ghỉ nhận cồn có ở Lào Cai - thuộc miễn Bắc Việt Nam [81, 86]
Cả hai loài SVD và TTH cũng có ở Việt Nam; còn SNL là loài đặc hữu hẹp của Việt Nam - chưa phát hiện thấy ở các quốc gia khác trên thế giới
Ở Việt Nam, ngay từ năm 1964 Viện Dược liệu đã thu thập được mẫu
SVD và TTH ở Sa Pa (Lào Cai) — với tên gọi địa phương là "Phan xiết” và ”Xán xì” Gần cuối năm 1964, nhà thực vật học người Trung Quốc - Ngô Chỉnh Dật khi đến thăm Viện Dược liệu đã xác định tên khoa học miu SVD thu ở Sa Pa là Panax bipinnatifidus Seem Tit nam 1969, loài cây thuốc này mới được công bố bởi I V Grushvitzky và một số tác giả trong nước khác [23] Trong khi đó, loài TTH đến giữa thập kỷ 80 của thế kỷ trước vẫn để tên
Trang 221628) sang Liên Xô nhờ giám định Kết quả N Skvottsova đã xác định là Z
pseudoginseng Wall (?) [25] Đến năm 1993, sau khi tham khảo một công bố mới của J Zhou, W G Huang, M I Wu, et al (1975), Nguyễn Tập đã xác
định loài Tam thất hoang của Việt Nam có tên khoa học là amax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng [86] Tir dé cho dén nay, loai nay di
được chính thức ghỉ nhận trong hệ thực vật Việt Nam và các tài liệu khác về cây thuốc [3, 22, 23, 24, 25, 26,27, 31]
Tuy nhiên, trong quá trình điều tra nghiên cứu SVD và TTH ở Sa Pa ao Cai), Viện Dược liệu còn thu thập được mẫu của dạng anaz có lá xẻ
nông Theo tài liệu mô tả vẻ lồi Z zipuleanatù, các tác giả Trung Quốc đã xếp dạng hình thái trên vào loài này [8 1] Đây là một vấn đề cần được xem xét
thêm (?)
Sém ngọc linh: Sâm ngọc lĩnh còa gọi là Sâm khu năm, Sam Việt Nam hay là "Thuốc dấu” và "Rơm con" QXê Đăng) được Đào Kim Long, Nguyễn
Châu Giang và Nguyễn Thị Lê phát hiện năm 1973 tại núi Ngọc Linh [25, 31]
Nhưng đến năm 1985 mới được cơng bố là lồi mới: #anax viemamensis Ha
et Grushv [25, 31, 89] Trước đó, vào năm 1970 Phạm Hoàng Hộ có cơng bố
lồi Panax schinseng var japonicus thu thap được ở núi Lang Bian (Lam
Đồng) [12] Song về sau, Hà Thị Dụng (1996) đã đính chính và cho rằng loài này vẫn chính là Sâm ngọc linh [13, 14, 25]
Như vậy, thuộc chỉ anax L ở Việt Nam hiện có 3 loài mọc tự nhiên, đó là Sam vũ điệp và Tam thất hoang ở Sa Pa (Lào Cai) và Sâm ngọc linh ở núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Kon Tum, Quảng Nam và đã từng có ở Lang Bian (Lam
Đồng) [3, 25] 1.1.L3 Ba kích
Trang 23bố ở một số tỉnh phía Nam của Trung Quốc đỉnh Quảng Tây, Vân Nam ), lào và Việt Nam [3, 5,6, 13, 14, 31, 92]
Ở Việt Nam, Ba kích là một cây thuốc quan trọng, nên đã được đề cập tới
trong tất cả các tài liệu vẻ hệ thực vật cũng như về cây thuốc ở Việt Nam [3, 5,
6, 13, 14, 31]
Theo các tài liệu đã công bố, Ba kích phân bố ở một số tỉnh thuộc vùng núi thấp và trung du phía bắc, bao gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,
lào cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên,
Bic Giang, Sơn La, Hoà Bình, Hà Tây, Thanh Hóa [3, 3, ố, 13, 14, 31] Gần
đây mới phát hiện hai điểm ở phía Nam thuộc tỉnh Quảng Trị và tỉnh Quảng
Nam [6] Theo Dé Huy Bich và cộng sự (2003), cây Ba kich - Morinda
Sicmalis How) còn có tên là Dây ruột ga, tên gọi này cũng để chỉ một số loài
cây khác như cây Sam trắng - Bacopa monnieri Peonel.; cay Moc thong -
Clematis chinensis Osbeck [31] Trên thực tế, dược liệu "Ba kích” được lấy từ
một số loài khác như: cây Ba kích lông (Morinda cochincbinesis (Lour.) DC.), Rubiaceae; cây Mặt quỷ (Morbrda villosa Wall ex Hook.f), Rubiaceae, Dây
giang mit (Zygostelma benthami Bailon vat lineare Cost), Asclepiadaceae;
Đa kích tai Sa Pa (Polygala sp.), Polygolaceae [31]
1.1.2 Về giá trị sử dụng
1.1.2.1 Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai
Trang 24[92] Vị thuốc "ngũ gia bì” cũng được phối hợp với nhiều vị thuốc khác để làm thuốc bổ, thuốc về bệnh thần kinh [73, 93]
Theo Song, Xiang và cộng sự (1983), trong vỏ rễ của NGBH có chứa
một sé hgp chat abu sesamin, beta-sitosterol, syringin, beta-sitosterol
glucosid, eleutherosid B, senticosid và một số acid hữu cơ [67, 82] Trong lá
có các glycosyl ester của nhóm 3 anpha-hydroxyolean [83]
Về tác dụng dược lý, theo Shan và một số người khác (1999) đã nghiên cứu trên tế bào [ympho người cho thấy, dịch chiết của NGBH có hoạt tính điều hòa miễn dịch Vì thế, có thể sử dụng NGBH để điều trị một số bệnh có liên quan đến di ứng và miễn dịch [65]
Đối với loài NGBG, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu vẻ thành phần hóa học của cây thuốc này [37, 58, 91] Trong vỏ thân và vỏ rể đã xác định được nhiêu acid hữu cơ nhóm hydroxy và hydroxylup; ngoài ra còn có nevadesin và faraxerol Vỏ cành và lá NGBG có chứa tình dầu, gồm hơn 80 chất đã được xác định, trong đó chù yếu terpen và các dẫn chất của nó, như:
anpha-pinen, terpinea-4-ol, beta-pinen, p-cynen [37, 58, 91]
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược
lý của 2 loài trên cồn ít Trong một số tài liệu đã công bố như "Selected
Medicinal Plants in Vietnam” (1999) [50] và "Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam” (2004) [31] - về các phản này chủ yếu được trích dẫn từ tài liệu nước ngoài
Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên trong NGBG của Việt Nam đáng chú ý nhất có công trình của
Phan Văn Kiện và cộng sự (2003) Các tác giả đã xác định trong lá NGBG có
cá pheaylpropanoid glucosid và acid carboxylic lupan [34, 55] Đến năm 2004, vẫn hai tác giả này còn phân lập và xác định được cấu trúc của 23 hợp
Trang 25Ngoài ra, qua nghiên cứu hoạt tính sinh học, Châu Văn Minh và Phao 'Văn Kiện 2004) cũng đã chỉ ra hợp chất quercittin và acid 3G - acetoxy - 30- bydroxylup - 20(29) - en - 23,28 - điodic có tác dụng kháng Monoamine oxidase (MAO) và Cyclooxygenase (COX) khá cao ngay ở cả nồng độ thấp
ẹt, hoạt tính kháng mạnh này đối với cả 3 chùng tế bào ung thư người
(tế bào biểu mô, màng tim và tế bào gan) [18] Những kết quả bước đầu này
mở ra triển vọng mới cho việc nghiên cứu để sử dụng NGBG để làm thuốc trong tương lai
Về giá trị sử dụng làm thuốc của NGBH và NGBG tại Việt Nam có thể
nói là khá phổ biến Gản như ở bất cứ đâu có 2 cây thuốc này thì ở đồ người đân địa phương cũng biết dùng làm thuốc chữa đau nhức xương khớp, bởi bỏ sức khỏe, tăng cường sức dẻo dai của cơ thể Những công dụng này đều được
dé cap trong hầu hết các tài liệu về cây thuốc đã xuất bản tại nước ta [3, 13,
14, 16, 31] Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm của nhân dân một số địa phương, như Sa Pa (Lào Cai) lá NGBG còn được dùng làm trà uống có tác dụng kích thích ăn ngon, ngủ yên giấc Lá non NGBH có thể làm rau ăn (Sìn Hồ - Lai Châu), hoặc vỏ rễ của NGBH đem nấu với chân giò hoặc thịt gà cho phụ nữ: mới sinh ăn mau khỏe và lợi sữa (Phó Bảng - Hà Giang) Ngoài ra, trong
những năm 70 của thế kỷ trước, chế phẩm "Rượu bỏ Ngũ gia bì” được bào chế
từ vỏ NGBH của tỉnh Cao Bằng và Lạng Sơa đã từng được thị trường ưa
chuộng
Tóm lại, NGBG và NGBH là hai cây thuốc quí của Việt Nam, nhưng việc nghiên cứu cơ bản nhìn chung chưa đáp ứng được với yêu cầu đề ra
1.1.2.2 Sâm ngọc linh, Sảm vũ điệp và Tam thất hoang
đâm ngọc linh (SN)
Trước khi Sâm ngọc linh được các nhà khoa học biết đến, cộng đồng đân tộc Xê Đăng ở xung quanh núi Ngọc linh (Quảng Nam và Kon tum) đã biết sử dụng cây thuốc này làm thuốc bổ, chữa viêm họng, ho và chống khát
Trang 26nước khi bị sốt cao Vì thế, ngay sau khi được phát hiện, từ những năm cuối của thập kỷ 70 cho đến nay đã có hàng chục công trình nghiên cứu về thành
phần hóa học cũng như tác dụng dược lý cita SNL
Tổng hợp lại biện đã biết trong thân cễ (củ) và phần trên mặt đất SNL có các nhóm hợp chất chủ yếu như: Saponin, acid amin ty do, acid béo, đường, hợp chất stetoid, tỉnh dầu, vitamin C và nhiều nguyên tố vi lượng khác Riêng nhóm saponin, các tác giả đã phân lập được 39 loại, trong đó có mnột số chất
mới [9, 42, 43, 44, 71, 75, 76]
Vẻ tác dụng dược lý của SNL cũng đã được nghiên cứu khá đầy đủ vẻ độc tính cấp; về tác dụng tăng lực, cải thiện trí nhớ, giảm sttess; tác dụng bạ cholesterol và lipid máu; tác dụng bảo vệ gau theo hướng chống oxy hóa Y.Y
[15, 49, 62, 76]
Với những nghiên cứu cơ bản trên đây, càng khẳng định Sâm ngọc linh là một cây thuốc có giá trị sử dụng cao
Sâm vũ điệp (SV D) và Tam thất hoang (TTH)
Theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền của vùng Vân Nam (Trung Quốc), SVD và TTH có tác dụng kiện tỳ, hoạt huyết nên được dùng làm thuốc bổ cho người già, người mới ốm dậy bị thiếu mầu Đặc biệt cả 2 loài cây thuốc nầy đều có tác dụng cảm máu tốt nên được dùng để chữa xuất huyết da day,
thổ huyết, chảy máu cam hoặc lao phổi [93] Ở Việt Nam, trong cộng đồng
dân tộc Dao Đỏ và H'Mông ở 8a Pa - Lào Cai có nhiều người cho rằng cả 2 cây thuốc này đều được dùng lầm thuốc bổ cho người già, chống được đau nhức xương khớp Phụ nữ mới sinh cũng có thể dùng SVD hay TTH như vị thuốc Tam thất của Trung Quốc Đồng thời một vài lang y cũng biết sử dụng
SVD bay TTH làm thuốc chữa đau dạ dày, nhất là trong trường hợp bị chảy
du [31]
Trong khi đó, việc nghiên cứu thành phản hóa học và tác dụng dược lý đốt với 2 loài SVD và TTH nhìn chung cồn rat it
Trang 27Công trình được công bố sớm nhất có lẽ do một nhóm tác giả ở Trung Quốc là Zhou J., Huang W G., Wu M.Z et al (1973) Theo các tác giả này, trong SVD có nhóm saponia (16,71%) nhómn sapogenia (3,31%); cồn trong TTH nhóm sapodin (16,38%) và sapogenin (5,46%) Trong nhóm sapogenia của cả 2 loài có 3 thành phần triterpen, chủ yếu là acid oleanolic, panaxadioL va panaxatriol [31] Theo Tanaka (1986), trong than ré (củ) và lá của SVD có saponia thuộc nhóm B (không phải nhóm darnmaran) và đã xác định được tới 13 chất khác nhau [7 I, 72, 77]
Ở Việt Nam, ngay từ khi chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa
học, Phạm Duy Mai, Vii Thi Tam và cộng sự (1974) đã có một công bố đầu tiên về tác dụng dược lý của SVD và TTH, thu thập được ở vùng Sa Pa - Lào Cai Kết quả nghiên cứu này đã xác định được sơ bộ vẻ tác dụng gây động dục, gây ngủ, chỉ số tán huyết và độc tính cấp đối với chuột nhất trắng Hơu nữa, khi sử dụng thử dich chi
dụng phụ, ăn ngủ tốt hơn và có người đã tăng cân [17] Đáng tiếc rằng, những
của SVD cho người cho thấy không có tác
nghiên cứu tương tự đã không được tiếp tục, thậm chí còn bị lãng quên một thời gian quá dài
Cho đến vài năm gần đây (2001-2003), nằm trong một đề tài cấp Bộ về Bảo tồn SVD và TTH, Tria Công Luận, Nguyễn Thu Hương và cộng sự mới
chính thức tiến hành nghiên cứu về thành phản hóa học cũng như về tác dụng dược lý của 2 cây thuốc này Trong đó, vẻ thành phần hóa học của SVD và TTH đã xác định có các nhóm hợp chất saponin, sapogenin, polyacetylen, một số axit béo, nguyên tố vi lượng Về tác dụng dược lý, bước đầu cũng đã xác định vẻ độc tính cấp, tác dụng tăng lực, giảm stress và tác dụng chống ôxy hóa của TTH Những kết quả này đã được lựa chọn công bố trong một chuyên
khảo vé Sam Việt Nam (2007) [7]
'Với những nghiên cứu đã có trên đây, đem so với SNL, 06 ting SVD và TTH mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu về thành phản hóa học cũng như vẻ tác
dụng dược lý của chúng
Trang 281.12.3 Ba kích
Ba kích là vị thuốc được sử dụng khá phổ biến trong Y học Cổ truyền tại Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác
Theo quan niệm của Y học cổ truyền Trung Quốc, Ba kích có tác dụng
bổ thận, tráng dương nên được dùng trong các trường hợp cơ thể bị suy nhược,
người có triệu chứng liệt dương hoặc bị xuất tỉnh sớm Ngoài ra, vi thuốc này cồn được sử dụng chữa viêm dây thần kinh tọa (ở phụ nữ), chứng đi tiểu nhiều
hoặc kinh nguyệt không đều [74, 93]
Ở Việt Nam, qua một số tài liệu đã được công bố cũng đều ghỉ nhận Ba kích có tác dụng bỏ dưỡng và được dùng làm thuốc tăng cường khả năng sinh
dục đối với những nam giới bị yếu vẻ sinh lý hoặc bị suy kiệt Ba kích phối hợp với các vị thuốc khác để chữa đau nhức xương khớp, giảm sơ cứng động mach và bổ thần kinh [5, 16, 31]
là một vị thuốc có giá trị sử dụng cao như vậy, nên Ba kích cũng đã được nghiên cứu khá đầy đủ vẻ thành phản hóa học cũng như về tác dụng được lý
Theo một số công trình đã được công bố thì trong tễ cây Ba kích có
chứa một số chất như anthraglucosid, iridoid, glucosid, sterol, lacton, đường
và một số khống chất vơ cơ Trong đó nhóm aathraglucosid được chú ý nhiều
nhất Theo Yoshikawa M., Yamguchi 5., et al (1995) ngay từ năm 1992 Yang
Y.1 đã chiết tách được 8 loại anthraquinon thuộc nhóm anthraglucosid [34] Ngoài ra, một số chất thuộc nhóm này cũng đã được xác định như: †ecfoquinon, alizadin - 1- metyl ete, lucidia - w - metyl ete, 1 - hydroxy - 2,3 - dimetyl - anthraquinon c [84] Thuộc nhóm hoạt chất iridoid glucosid hiện đã
biết có monotropein, asperulosid, moriadolid, morofficiaalosid, acid deacetyL
asperulosidic, acetat asperulosid Cũng theo Yoshikawa M., et al thì hợp chất monotropein có vai trồ quan trọng trong tác dụng giảm đau và chống viêm [84]
Trang 29Về tác dụng dược lý của Ba kích cũng đã được nhiều tác giả trên thế
giới nghiên cứu, như Zbang Z.Q., Yuan L., Yang M., et al (2002) [85]; Soon Y ¥., Tan B K (2002) [68]; Choi J., et al (2005) [40] và Kim J.T,, et al
(005) [57] v.v Theo các tác giả này thì rễ Ba kích có tác dụng tăng lực rõ nết; tác dụng giảm đau, chống viêm, chống stress lâm sàng trên chuột cái;
[40, 57, 68, 85] Ngoài ra, Soon Y Y Tan B K (2002) còn chứng minh dịch
chiết rễ Ba kích có tác dụng chống oxy hóa và làm giảm hàm lượng đường trong huyết thanh của chuột thí nghiệm bị gây đái tháo đường [68]
Ở Việt Nam, trong các tài liệu về cây thuốc xuất bản gần đây đều khẳng định trong rễ Ba kích có chứa các hợp chất tự nhiên như: anthraglucosid,
iridoid glucosid, các hợp chất sterol, lacton, đường, nhựa, acid hữu cơ, tỉnh
đầu, một số chất khống vơ cơ Trong rễ tươi còn thay ca Vitamin C [ố, 16,
31]
Nghiên cứu về tác dụng dược lý cũng cho thấy, nước sắc từ Ba kích đem
thử trên chuột nhất trắng và chuột cống có tác dụng tăng lực, chống độc,
chống viêm, làm tăng cường co bóp ruột và hạ đường huyết Ngoài ra, với chỉ số LD„„ = 193g/kg chứng tỏ Ba kích có độc tính thấp [31]
Như vậy, với những trích dẫn khái quát trên đây có thể nhận định rằng
cả 6 loài cây thuốc: NGBŒ, NGBH, SNL SVD, TTH và Ba kích là những cây
thuốc đã được sử dụng khá lâu đời theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền Qua nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý còn cho thấy giá trị sử dụng hiện tại và tiêm năng của những cây thuốc này là khá phong phú
1.1.3 Vài nét về van dé bao ton
Hiện tại chưa có nhiều thông tin về vấn đề bảo tồn 6 loài cây thuốc kể
trên Tuy nhiên, ngay từ trước năm 2000 loài SVD (P bipinnatifidus Seem.)
đã được TUCN đưa vào Danh lục Đỏ của thế giới [22] Trong một vài nghiên cứu về tính đa dạng nguồn gen các loài thuộc chỉ ZamaxL mọc hoang dại ở
Trung Quốc, Cheng - Li Duan, Xing - Long Yan, Guo - Song Wen, et al
Trang 30(2006), Shi - Liang Zhou, Gao - Ming Xiong, Zhong - Yi Li va Jun Wen (2005) va Jun Wen (1999, 2000) déu chi ra rằng SVD cũng như TTH là những loài cầu được bảo tồn ở các quốc gia [66, 80, 81] Còn đối với NGBH (Acanthopanax gracilistylus W W Smith) va Ba kich (Morinda officinalis How) đang được sử dụng làm thuốc ở Trung Quốc là do trồng trọt và đường như không được khai thác cây mọc tự nhiên
Ở Việt Nam, trong tất cả các tài liệu đã công bố [3, 5, 12, 13, 14, lố,
31], NGBG, NGBH, SVD, TTH, SNL và Ba kích đều thừa nhận đây là những cây thuốc quí vẻ giá trị sử dụng và có giá trị kinh tế cao Trải qua nhiều năm tìm kiếm khai thác khốc liệt, cả 6 loài cây thuốc này được xếp vào diện đã bị suy giảm nghiêm trọng (NGBG và Ba kích) hoặc có nguy cơ bị tuyệt chủng cao (SVD, SNL, TTH, NGBH) Tất cả chúng là những đối tượng cần phải bảo
tồn khẩn cấp và cần được đưa vào trồng thêm ở Việt Nam
Trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) có 3 loài trong số 6 loài trên được xếp
hạng như: NGBH: R (Hiếm - dễ bị rùi ro); NGBG: T Œị đe doa); SVD: E
@ang bị nguy cấp; SNL: E; Ba kích: K (Bị đe dọa nhưng chưa đủ dẫn liệu cụ
thể) - Xếp theo khung phân hạng TUCN (1970) [2]
Trong Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam, cả ố loài trên đều được ghỉ
nhận trong cả 3 lần công bố (1996, 2001 - 2006) [22, 23, 27]
Cụ thể trong Danh Lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006), chúng được xếp
hạng cụ thể như: NGBH: CR.B2a,b (iijiii,v); NGBG: VU.A 1c,d; B2a,bđi,iii,x); SVD, SNL và TTH đều ở mức CR.Alc,d và Ba kích: EN.Ala,c,d Trong đó
CR: Đang cực kỳ bị nguy cấp; EN: Đang bị nguy cấp và VU: Sắp bị nguy cấp
Các tiêu chí A, B là tình trạng quần thể và phân bố [27]
Ngoài ra, trong Nghị định số 32/2006/NĐ-CP của Thủ tướng Chính phù (30/3/2006) vẻ việc Quản lý Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quí, hiếm cũng đưa SVD, SNL và TTH vào Danh sách II.A để tăng cường quản lý
chặt chế [29]
Trang 31Mặc dù hiện nay chưa có đủ thông tin về vấn đẻ bảo tỏa NGBG, NGBH, SVD, SNL, TTH và Ba kích trên thế giới, song ở Việt Nam chúng đều là
những đối tượng cần ưu tiên nghiên cứu để bảo tồn
1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI CHỈ THỊ VÀ DẤU CHUAN TRONG
NGHIÊN CỨU THẢO DƯỢC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ö VIỆT NAM Ngày nay, trên thế giới, các nhóm thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc
ngày càng được quan tâm phát triển, nhờ vào tính an toàn cũng như lợi thế về
chỉ phí sản xuất của chúng Thị trường thế giới về thuốc có nguồn gốc thảo
mộc, bao gồm cả dược liệu thô, ước tính đạt trung bình 62 tỷ đô la Mỹ một
năm Ước tính đến năm 2050, doanh thu của thị trường này có thể đạt đến 5 nghìn tỷ đô la Mỹ (Kalpana, 2004) [52] Trong hoàn cảnh đó, việc chứng minh cơ sở khoa học và tiêu chuẩn hố cơng nghệ bào chế thuốc từ thảo dược
có vai trò hết sức quan trọng Các sản phẩm từ thảo dược thường kém ổn định vẻ thành phần và được tính, trái ngược với các sản phẩm tân dược được tổng
hợp nhân tạo từ hoá chất tỉnh khiết và các quy trình công nghệ ổn định Chính vì vậy, công tác kiểm định và đảm bảo chất lượng nguồn nguyên liệu ban đầu là yêu cầu thiết yếu để tạo được các loại thuốc có nguỏn gốc thảo dược với
chất lượng ổn định và an toàn
Việc nhầm lẫn các loài thảo dược với nhau trong quá trình thu hái, chế
biến và sử dụng là hiện tượng hay gặp, do trong tự nhiên có thể tỏn tại nhiều loài có hình thái tương tự khó phân biệt Thêm nữa, trong nhiều nên y học cổ truyền khác nhau, một cây dược liệu có thể được gọi bằng nhiều tên khác
nhau hoặc các cây dược liệu khác nhau lại có tên trùng nhau Vì vậy, yêu cầu trước tiên đối với ngành công nghiệp chế biến thuốc từ thảo dược là phải xác
định chính xác nguồn nguyên liệu ban đầu
Có nhiều phương pháp để định loại các cây dược liệu, như sử dụng chỉ
thị cảm quan (hình thái, màu sắc, mùi, vị ) và chỉ thị hoá học Trong đó, chi
thị hóa học thường được sử dụng là các kỹ thuật sắc ký (sắc ký lớp mỏng - TLC, sắc ký lớp mỏng cao áp - HPLC, sắc ký khí, sắc ký cột, sắc ký lòng cao
Trang 32áp - HPLC ) và các phương pháp khối phổ Cả phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa học đều có những ưu điểm adi bat nhất định Song đối với các dược liệu và cây thuốc là các loài cùng chỉ (genus) hoặc cùng loài nhưng khác thứ (var.) thì hai phương pháp trên sẽ khó phân biệt được chính
xác [36]
Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cung cấp thêm một công cụ
mới cho công tác định loại thảo dược là các chỉ thị ADN Những chỉ thị ADN
thường được dùng có thể kể đến là RFLP (Restricted Fragment Length
Polymorphism), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP-
PCR, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple
Sequence Repeat) Các chỉ thị ADN có nhiều lợi thế đáng kẻ so với các chỉ thị cảm quan hoặc hoá học vì nó hầu như không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, ngoại cảnh, tuổi cây hay tình trạng sinh lý khi thu hái Đồng thời, sử dụng các chỉ thị ADN còn có thể đánh giá được mức độ đa dạng di
truyền trong các loài cây thuốc.Như vậy, sử dụng các chỉ thị ADN trước hết sẽ
giúp cho việc phân tích chính xác các loài cây thuốc hay giữa các loại dược liệu gây nhầm lẫn Hơn nữa, với việc đánh giá được vẻ mức độ đa dạng di truyền trong các loài còn là cơ sở để chọn tạo giống cây thuốc có năng suất
cao, cũng như trong việc bảo tồn chính xác được nguồn gen quí
1.2.1 Chỉ thị (kỹ thuật) RAPD-PCR
Kỹ thuật RAPD-PCR được Wiliams và cộng sự đưa ra năm 1990 John
G.K Williams, 1990) Về nguyên tắc, đây là kỹ thuật khuếch đại ADN hệ gen
sử dụng các mỏi tổng hợp ngắn (phổ biến nhất là 10 nucleotid) có trình tự
ngẫu nhiên trong điều kiện nhiệt độ gắn mỏi thấp Điểm khác biệt rõ nét nhất
của kỹ thuật RAPD-PCR so với các kỹ thuật PCR truyền thống là chỉ có một
trình tự oligonucleotid được sử dụng làm mỏi trong một phản ứng, và
hiểu biết về các đoạn gen được nhân lên là không cản thiết Theo nguyên tắc tương tự còn có một số kỹ thuật khác, chẳng hạn AP-PCR (Arbitrarily Primed-
Trang 33PCR, được Welsh và McClelland đưa ra, 1990) [78] sử dụng các mỏi có trình
tự ngẫu nhiên dài 15 nucleotid với điều kiện khuếch đại khác với RAPD-PCR,
hay DAF (DNA Amplification Fiagerpriating, Caetano-Annoles, 1991) sử
dụng các môi ngẫu nhiên ngắn hơn 10 aucleotid và cho phổ điện di tương đối
phức tạp [35]
Với nhiệt độ gắn môi phù hợp, các mỏi oligonucleotid trình tự ngẫu
nhiên sẽ gắn vào một vài vị trí có trình tự bổ sung trên sợi khuôn ADN và cho
sản phẩm khuếch đại
đại được Sự khác biệt vẻ trình tự nucleotid của các khuôn ADN khác nhau
u các vị trí gắn môi nằm trong phạm vi có thể khuếch
được thể hiện ở sự có mặt hay vắng mặt của các băng khuếch đại
So với hầu hết các chỉ thị ADN khác, chỉ thị RAPD-PCR có những ưu điểm nổi bật như nhanh chóng, rẻ tiên và dễ thực hiện Mặc dù vậy, chỉ thị RAPD-PCR cũng có những nhược điểm khó tránh khỏi là tính ổn định không
cao, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm, đặc biệt là nồng độ ADN
khuôn và nhiệt độ gắn mỏi trong một phản ứng (Aitchitt M., 1998, C.J Jones,
1997, Liu, 2004) [32, 51] Đồng thời, phổ điện di thu được khi sử dụng phản
ứng RAPD-PCR thường có rất nhiều băng, đôi khi gây khó khăn cho việc xác định chính xác Bên cạnh đó, chỉ thị RAPD-PCR cũng có thể cho các kết quả đa hình giả do cạnh tranh giữa các trình tự khuôn (Halldén, 1996) hoặc do cấu trúc kết cặp khơng tương đồng hồn tồn (heferoduplex) như cấu trúc được
hình thành giữa các trình tựalen trong hệ gen (Ayliffe, 1994) [46, 59]
Việc ứng dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu thảo dược đã được
tiến hành bởi một số phòng thí nghiệm trên thế giới va thu được những thành công nhất định Chẳng hạn, vào những năm 40 và 70 của thế kỷ trước, khi căn cứ vào các đặc điểm hình thái, một số nhà thực vật học Nhật Bản (Hana, H.,
1970) và Trung Quốc (Lỉ, H.L., 1942; Hoo, Œ & Tseng, C., J., 1978) đã đưa ra
quan điểm đồng nhất một số loài #anax mọc tự nhiên ở Trung Quốc (đã được xác định trước đó) xuống ở bậc dưới loài Đến năm 1999 - 2000, Jua Wen va
Trang 34một số người khác dựa trên cơ sở phân tích chỉ thị ADN đã khẳng định các bậc dưới loài thuộc chỉ anax ở Trung Quốc kể trên, hoàn toàn có đủ cơ sở để xếp chúng ở bậc phân loại loài, như trước kia đã có [80, 81]
Mặc dù vậy, từ năm 1985 trở lại đây, việc áp dụng kỹ thuật RAPD-PCR đã trở thành phương pháp khá phổ biến, mang lại nhiều thành công trong nghiên cứu cây thuốc
Nghiên cứu tính đa hình di truyền và đặc trưng cá thể có lên quan tới khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của cây thuốc, tiêu biểu có các
công trình của: Baun, của Feng - hui Xiao, Gou - song Wen, et al (2006) đã
xác định tính đa hình di truyền có liên quan tới hàm lượng giasenoid của các
giống Tam thất (Panax notoginseng) trông RAPD- PCR, Gavidia, et al (1996)
va Steck, et al (2001) đã đánh giá được về mức độ đa hình của các loài cây thude Digitalis obscura, Hypericum perforatum để phục vụ cho công tác chọn
tạo giống [34, 45, 69] Năm 2004 còa kết hợp giữa 2 chỉ thị RAPD với
allozym để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của hai loài Nhân sâm (Parax
ginseng) và Tây dương sâm (P quinquefolius) [33]
Gan day, Cheng - li Duan, Xing - long Yan, Gou - song Wen, et al
(2006) qua nghiên cứu 5 taxon Zanaxz mọc tự nhiên ở Trung Quốc (P stipuleanatus, P japonicus, P bipinnatifidus, P bipinnatifidus var
angustifolius va P japonicus vat major) cho thay ching cé mit d6 da dang đi truyền cao hơn hẳn so với các loài anaz trồng trọt Với kết quả này, các tác giả đã đưa ra kiến nghị phải bảo tỏn khẩn cấp quần thể hoang dại của các
loài Panax ké trén [38]
Ngoài ra, áp dụng chi thi RAPD-PCR, Ke-jun Deng, Zu - jua Yang,
Cheng Liu, et al (2006) còn chỉ ra có một chuối nucleotid đặc trưng có thé sit
dụng để phân biệt céc loai thude chi Rhodiola (Rh crenulata, Rh fastigiata, Bh sachelinensis ) ho Crassulaceae phan bo & ving Sichuan va Jilin-Trung Quốc [53] Vẻ lĩnh vực này đáng chú ý hơn cả là một số công trình của Jun
Trang 35'Wen và cộng sự (1996, 1999, 2000), ứng dụng chỉ thị phân tử ADN, tác giả đã
góp phần quan trọng trong việc phục hỏi một số bậc taxon dưới loài (var.) của chỉ Zanax L ở Trung Quốc trở lại với bậc phân loại loài hoàn chỉnh [79, 80,
81] Hoặc áp dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị ADN, Padk
Sy, et al 004) còn đánh giá được về mối quan hệ di truyền giữa một số loài
trong chi Acanthopanax [63]
1.2.2 Ung dung ky thuat RAPD - PCR trong nghién cứu chỉ thị phân tứ ADN ở Việt Nam
Khoảng hơn chục năm trở lại đây, với những thành tựu của công nghệ sinh học và Di truyền học phân tử, việc sử dụng các kỹ thuật gen bước đầu đã có những thành công đáng kể trong nghiên cứu - xác định tính đa dạng di truyền; xác định loài và chọn tạo giống cây Trong đó, riêng vẻ kỹ thuật
RAPD - PCR cé thé nêu ra một số công trình nghiên cứu như:
Trương Quốc Phong và Nguyễn Văn Mùi (004) đã sử dụng chỉ thị phân từ ADN để góp phản phân loại 2 loài Trà hoa vàng (Camellia cucphuongensis va C flava) [20] Hoặc để phân biệt giữa các loài Trà hoa trắng ở Vườn quốc gia Tam Đảo (Nguyễn Văn Mùi và Bùi Thị Mai Hương (2004)) [19] Trong khi đó, Nguyễn Minh Ví và Nguyễn Văn Mùi (2004) cũng sử dụng kỹ thuật RAPD - PCR để đánh giá vẻ sự đa dạng di truyền của một số loài cây rừng giữa 2 điểm phân bố khác nhau ở Trường Sơn [30] Hoặc
trong các nghiên cứu của Hoàng Thị Hòa, Đinh Đoàn Long, et al (2005),
Trang 36'Với những nghiên cứu bước đầu kể trên cho thấy, việc ứng dụng các kỹ
thuật chỉ thị ADN đã góp phần quan trọng trong việc phân định chỉ, loài một
cách chính xác hơn, cùng với các dạng đa hình trong loài của chúng Bên cạnh đó, sừ dụng phương pháp RAPD-PCR, chúng tôi hi vọng bước đầu có thể xác định được một số tập hợp chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt nhanh các loài
cây thuốc thuộc chỉ Acanhopanax Miq., Panax L và Morinda L kể trên,
cung cấp một công cụ bổ sung cho công tác kiểm định dược liệu ở Viêt Nam trong tương lai
Tuy nhiên, ding tiếc rằng vẻ cây thuốc hầu như chưa có nhiều nghiên cứu nào vẻ lĩnh vực này Mặc dù trong nguồn tài nguyên cây thuốc ở Việt Nam hiện còn nhiều vấn đề vẻ tên khoa học loài, cũng như về tính đa
Trang 37CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 DOL TUGNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU
Đối tượng nghiên cứu là ố loài cây thuốc cùng với các đạng hình thái của
chúng, được thu thập tại các địa điểm sau:
2.1.1 Ngũ gia bì hương - Acanfhopanax gracilistylus W.W.Smith - Thị trấn Phó Bảng, huyện Đỏng Văn, tỉnh Hà Giang
- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai 2.1.2 Ngii gia bi gai - Acanthopanax trifoliatus (L.) Voss
- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai - Huyện Thạch An, tỉnh Cao Bằng
- Huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn
2.1.3 Sâm vũ diệp - Panax bipinnafjfidus Seem (gôm cả loại lá xế nông)
- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai
2.1.4 Tam that hoang - Panax stipuleanatus H.T.Tsai & K.M.Feng - Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai
2.1.5 Sâm ngọc linh (Sâm Việt Nam) - Panax viefnamensis Ha et Grushy
- Xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam - Xã Ngọc Lây, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum - Xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai
2.1.6 Ba kich - Morinda officinalis How (gồm các dạng hình thái) - Xã Chân Mộng, huyện Đoan Hùng, tỉnh Phú Thọ
~- Lâm trường Tân Lạc, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình
- Huyện Hoành Bỏ, tỉnh Quảng Ninh
Trang 38- Thôn Hòa Bình II, xã Quân Chu, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1 Điều tra thu thập mẫu
Căn cứ vào các điểm phân bố đã biết, tiến hành các đợt điều tra khảo sắt, thu thập mẫu của 6 loài Mẫu nghiên cứu gồm 3 loại:
- Tiêu bản thực vật cây thuốc có đủ hoa hoặc quả, để phân tích xác định tên khoa học và mô tả Mối loại dự kiến thu ít nhất 3 tiêu bản, với các dạng
hình thái khác nhau
- Mẫu nguyên liệu nghiên cứu ADN là cành lá tươi (NGBH và NGBG)
hay cả cây có cả củ và ré (SNL, SVD, TTH và Ba kích) Loại mnẫu này thu ở nhiều cá thể khác nhau (cả các dạng hình thấi khác nhau), tại các điểm phâo bố khác nhau
- Mẫu nguyên liệu làm được liệu chuẩn lưu trữ: Là các bộ phận dùng chủ yếu của 6 loài cây thuốc Gồm: Lá, vỏ thâu - cành, vỏ rễ (NGBH và NGBG); thân rễ (củ) và rễ (SNL, SVD, TTH và Ba kích) Mẫu dược liệu thường được
lấy trên các cá thể đã lấy tiêu bản và mnẫu nghiên cứu ADN
2.2.2 Xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của các loài
- Đối chiếu với các khoá phân loại loài, thuộc các chi Panaz, Acanthopanax, Morinda L trong các bộ Thực vật chí biện có để khẳng định vẻ tên loài, dưới loài (nếu có) của 6 đối tượng nghiên cứu trên
~ Mô tả đặc điểm bình thái của các loài
2.2.3 Phân tích chỉ thị phân tử ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu * Tiến hành tách chiết, tỉnh sạch ADN và xây dựng qui trình tách chiết ADN của các đối tượng nghiên cứu
* Phân tích sự đa dạng đi truyền của các loài
* Bước đầu xác định một số chỉ thị đặc trưng phân biệt các loài và dưới
Trang 39loài
2.2.4 Đánh giá về sự kết hợp giữa việc sử dụng chỉ thị ADN với các dấu chuẩn hình thái trong nghiên cứu phân loại phục vụ công
tac bao ton và phát triển các loài cây thuốc
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.3.1 Điều tra thu thập mẫu được thực hiện theo "Qui trình điều tra được liệu" của Bộ Y tế năm 1973 và Phương pháp điều tra và nghiên cứu bảo tổn
cây thuốc của Nguyễn Tập [4, 28] Trong đó có một số hoạt động được thực
hiện như sau:
- Căn cứ vào thông tin về nơi phân bố của các loài, tiến hành các đợt điều
tra thực địa để thu thập
~ Trước khi thu mẫu (các loại) đều xác định toạ độ địa lý (bằng GPS) agi có cây thuốc nghiên cứu Ghỉ chép các thông tin về môi trường cây mọc, đo
đếm số cá thể hiện có và ghỉ nhận xét vẻ hiện trạng của từng cây thuốc
- Tiến hành thu mẫu bao gồm: Mẫu tiêu bản thực vật, mẫu nguyên liệu
nghiên cứu ADN và mẫu dược liệu (bộ phận dùng) Các mẫu này đều có nhãn ghỉ đầy đủ Lý lịch mẫu
2.3.2 Xác định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái, sử dụng khóa phân loại các loài thuộc chỉ Acanthopanx Mig va Panax L., Morinda
trong các bộ thực vật chí hiện có [1, 13, 14, 60, 87, 88, 92]
2.3.3 Phân tích ADN
2.3.3.1 Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp Mimi-CTAB cải tiến
Để thu ADN tổng số (ADNIs) phục vụ cho các phân tích RAPD-PCR
tiếp theo, chúng rôi đã tiến hành tách chiết ADNIs từ các mẫu thu được của mỗi loài theo phương pháp Mini-CTAB, dựa vào các qui trình tách chiết của
Shagai-Maroof và cộng sự (1984) [41]
Trang 40Vật liệu để tách chiết ADNEs là thân, tễ và lá của các mẫu đã được nghiển mịn Sau đó tiến hành tách chiết riêng rẽ các phần của mẫu thực vật và so sánh hàm lượng ADN thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% để xác định bộ phận cho hiệu suất thu ADN cao nhất, sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết tiếp theo
2.3.3.2 Kiểm tra chất lượng ADN tổng số (ADN) bằng phương pháp điện đi và quang phổ
Sản phẩm ADNIs thu được sau đó được phân tích bằng cách chạy điện
dĩ trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose + 100 ml TBE 1x) & 60-80 V trong 30
phiit Néag độ và kích thước tương đối của sản phẩm ADNIs được xác định bằng cách so sánh với marker Larnbda / HindIII
Sau đó, sản phẩm ADNIs được pha loãng 100 lần (10 pl ADNts + 990
il ddH,O) cho thi nghiệm đo mật độ quang phổ (OD) bằng máy đo quang phổ Ulttospec 1100 Pro ở các bước sóng 260 và 280 am Mức tỉnh sạch của sản
phẩm (mức độ lẫn ARN và protein) được xác định bằng tỷ số quang phổ hấp thụ Az„s/A„„; Nông độ ADN của dung dịch gốc được tính theo công thức 10
Aggy = 50 g/l
2.3.3.3 Phan tich di truyén bang phdn tmg RAPD-PCR
- Phản ứng RAPD-PCR được tiến hành trên tất cả các mẫu Sử dụng các mổi ngẫu nhiên 10 nueleotid (Operoa Techaologies, Mỹ)
- §äa phẩm khuếch đại được phân tích trên gel điện di agarose 1 — 1,3% chạy ở hiệu điện thế 60 - 80 V trong 45 phút bằng phương pháp nhuộm hiệu hình với ethidium bromide Kích thước tương đối của các băng khuếch đại được so sánh với mnatker IEb (Fermenfas, kb DNA Ladder)
2.3.4 Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h
Sử dụng phản mềm NTSYSpc 2.02h (Numerical Taxonomy System
Applied Biotstatistics, Setauket, New York), các kết quả điện di sản phẩm
RAPD-PCR được chuyển thành dạng ma trận nhị phân theo nguyên tắc: sự có