Sử dụng chỉ thị phân tử adn kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam

BỘ Y TẾ VIÊN DƯỢC LIỆU BAO CAO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ SU DUNG CHi THI PHAN TU ADN KẾT HỢP VỚI CÁC DẤU HIỆU HÌNH THÁI TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở VIỆT NAM Chủ nhiệm đẻ tài: TS NGUYỄN VĂN TẬP 6913 01/7/2008 HÀ NỘI - 2007 BÁO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ THÔNG TIN CHUNG YỀ ĐỀ TÀI Tên để tài: Sử dụng thị phản tử ADN kết hợp với dấu hiệu hình thái nghiên cứu phân loại số thuốc Việt Nam Chủ nhiệm để tài : TS Nguyễn Văn Tập Phó chủ nhiệm để tài : ToS Pham Thanh Huyền Cơ quan chủ trì để tài: Viện Dược Liệu (Bộ Y tế) Kinh phí thực _ : 220.000.000 đồng (Hai trăm hai mươi triệu đồng) Danh sách người thực chính: TS Nguyễn Văn Tập: Viện Dược liệu - Chù nhiệm để tài ThS, Phạm Thanh Huyền: Viện Dược liệu - Phó nhiệm để tài TS Định Đoàn Long: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội CN Ngo Van Trai: Việu Dược liệu ThS Le Thanh Son: Viga Duc tigu Th§ Ngơ Đức Phương: Viện Dược liệu KTV Cù Hải Long: Việu Dược liệu Th§ Hồng Thị Hịa: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội Thời gian thực hiện: từ tháng LŨ năm 2005 đến tháng 10 nãm 2007 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU YÀ CHỮ VIẾT TÁT ADN AFLP BK DDSH FAO NGBG NGBGL NGBH HN HNPM HNU APLC IUCN KHKT PCR RAPDPCR Axit deoxyribonucleic Amplified Fragment Leagth Polymorphism (Đa hình độ đài phân đoạn khuếch đại) Ba kích Dược điểu Việt Nam Da dang sinh học The Eood and Agricultuee Orgaizarion of the Uaited Nation (Tổ chức tương thực nông nghiệp Liên hiệp quốc) Ngũ gia bì gai Ngũ gia bì gai lơng Ngũ gia bì hương Bảo tàng thực vật (thuộc Việu Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam) Bảo tàng Dược liệu áhuộc Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu) Bảo tầng thực vật (huộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) High perfomance liquid chromatogmphy (Séc ky long cao 4p) The International Union for Conservation of Natuce and Natucal Resouses (Tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế) Khoa học kỹ thuật Nhà xuất ®olyreras Chain Reaction (Phâu ứng chuỗi trùng hợp ADN) Random Amplified Polymorphic DNA(Đa hình phân đoạa ADN khuếch đại ngẫu nhiên) SKIM SSR SVD SNL mm WWE Restricted Fragmeat Length Polymorphism (Đa hình độ đài đoạn giới hạn) Sắc ký lớp mròng Simple Sequence Repeats @a hiah trình tự lập lại đơn giảu SSR) Sâm vũ điệp Sâm ngọc linh Nhiệt độ Tung bình Trung gian Tam that hoang The World Wildlife Fuad (Qui quốc tế bảo vệ động vật hoang đã) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan tình hình nghiên cứu giới Việt Nam đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Về thực vật học 1.1.1.1, Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai 1.1.1.2 Sám vũ điệp, Tran thất hoang Sám ngọc linh, 1.1.1.3, Ba kích 1.1.2 Về giá tả sir dung 1.1.2.1 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai 1.1.2.2 Sám vũ điệp, Tran thất hoang Sám ngọc linh, 1.2.Tổng quan vẻ loại chi thị dấu chuẩn nghiền cứu thảo dược giới Việt Nam 16 1.2.1 Chỉ thị (kỹ thuật) RAPD-PCR 17 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD-PCR nghiên cứu thị phân tử ADN Vit Nam 20 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG YẢ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu địa diém thu mai 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Điều tra thu thập 2.2.2 Xác định tên khoa học rnô tả hình thấi lồi 2.2.3, Phân tích thị phân từ ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu 2.2.4 Đánh giá kết hợp việc sử dụng thị ADN với dấu chuẩn hình thái nghiên cứu phân loại phục vụ công tác bảo tổn phát triể loài thuốc 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Điều tra thu thập mmất 2.3.2 Xác định têu khoa học 2.3.3, Phân tích ADN 2.3.4 Dựng quan hệ di truyễn phần mẻm NTSYS pc 2.02 2.4 Địa điểm nghiên cứt 22 23 33 24 25 26 2.5 Trang thiết bị, dung mơi hóa chất Chương 3.KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU YÀ BẢN LUẬN 3.1 Điều tra, thu thập mẫu 3.1.1 Thu mẫu tiêu thực vật 27 3.1.2 Thu thập mẫu nghiên cứu ADN 28 3.1.3 Thu mẫu liệu chuẩn -Ö°-29 3.2, Xác định tên khoa học mơ tả đặc điểm hình thái lồi Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang Ba kích 30 3,3, Kết nghiên cứu thị ADN 3.3.1 Nghiên cứu tách chiết ADN 3.3.2 Sử dụng thị ADN (RAED-PCR) để đánh giá đa dạng di truyền 49 3.3.3 Bước đầu xác định số thị RAPD-PCR đặc trưng Ngũ gia bì bương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ điệp, Tam thất hoang Ba kích góp phầu việc xác định loi 73 3.4 Đánh giá vẻ việc sử dụng thị hình thái chị ADN (RAPDPCR) nghiên cứu 3.4.1 Áp dụng phương pháp phâu loại hình thất so sánh việc xác định loài NGBH, NGBG, SVD, TTH, SNL BK số vấn đẻ đồi hdi phải nghiên cứu 3.4.2 Xác định mối tương đồng thị hình thái với thị ADN việc xác định loài NGBH, NGBG, SNL, SVD, TTH BK KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO OL DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 - Địa điểm số lượng mẫu nghiêu cứu ADN loài Ngũ gia bì gai (NGBG), Ngũ gia bì hương (NGBH), Sâm vũ điệp (SVD), Tam thất hoang (TTH), Sâm Việt Nam (SVN) Ba kích (BK) phục vụ nghiên cứu Bảng 32 - Danh sách, địa điểm thu thập kí hiệu mẫu hai lồi Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) sử dụng nghiên cứu phân tích ADN Bảng 3.3 Kết quang phổ hấp thụ dịch chiết ADN tổng số mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bi gai (G) Bảng 3.4 - Danh sách, địa điểm thu thập kí hiệu mẫu ba loài Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian Sâm vũ diệp Tam thất hoang (VT) Tam thất hoang (T) Bang 35 Kết mật độ quang phổ mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ điệp (V), dang trung gian (VT) Tam thất hoang (T) Bảng 36 _ Danh sách, địa điểmthu thập kí hiệu mẫu cùa Ba kích(B) Bảng 37 Số bảng RAPD-PCR da hình mẫu thuộc hai lồi Ngũ gia bì hương Ngũ gia bì gai phâu tích với L6 mơi ngẫu nhiên Bang38 Số kiểu di truyền biểu sử dụng mỏi RAPD-PCR +khác từ kết phân tích rnẫu Ngũ gia bì hương thu thập nghiêu cứu Bảng 3.9 - Số bảng RAPD da hình thu từ mẫu quần thể lồi Ngũ gia bì gai thu lào Cai, Cao Bằng Lạng Sơ tính theo méi Bảng 3.10 Hệ số tương đồng di truyền mẫu nghiên cứu hai lồi Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) Bang 3.11 Số bảng RAED-PCR đa hình mẫu thuộc ba loài Sâm Ngọc linh (SNL), Sâm Vũ điệp (SVD) Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mdi ngẫu nhiên Bảng 3.12 Bảng hệ số tương đồng di truyền mẫu quần thể ba loài Sam ngọc linh (S), Sâm vũ điệp (V), Tam thất hoang (T) dạng trung gian (VT) Bảng 3.13 Thống kê số băng ADN thu 25 mẫu Ba kích (B) nghiên cứu với 12 mơi Bang 3.14, Số bảng RAPD-PCR da hình mẫu thuộc lồi Ba kích với 12 mỏi ngẫu nhiên Bảng 3.15 Hệ số tương đồng ditruyều 25 mẫu thuộc loai Ba kich (B) Bảng 3.16 Các thị RAPD-ECR đồng hình đa hình sử dụng góp phâu phân biệt hai lồi Ngũ gia bì hương Ngũ gia bì gai Bảng 3.17 Các thị RAPD-PCR đồng hình đa hình sừ dụng góp Trang 28 39 4L 45 46 49 52 52 56 58 63 66 67 69 74 78 Bảng 3.18 phâu phân biệt ba loài Sâm ngọc link (SNL), S4m vii digp (SVD) Tam thất hoang (TTH) Các thị RAPD-PCR đồng hình đa hình sử dụng góp phâu phân biệt dạng hình thái lồi Ba kích (B) $2 DANH MỤC CÁC HÌNH YẼ, ĐỒ THỊ Tình 3.1 Hình 32 Hình 3.3 Tình 3.4a Hình 3.4b Hình 3.5 Hinh 36 Hinh 3.7 Hinh 38 Hinh 3.9 Hinh 3.10 Hinh 3.11 Hinh 3.12 Hinh 3.13 Hinh 3.14, Hinh 3.15 Hinh 3.16 Ngũ gia Ngũ gia Ngũ gia Sâm vũ Sam vũ Hinh 3.18 Hinh 3.19 điệp xẻ nơng Tam thất hoang (Cây có chín) Dang Øznaz có xế nơng (dạng trung gian Sâm vũ điệp Tam thất hoang) Sâm Việt Nam (cây có chín) Ba kích có tụ Ba kích có rời Ảnh điện di ADN tổng số mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) 34 34 34 34 35 36 37 385 385 Ảnh đện di A DNIs mrẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ đệp (V), Tam that hoang (T) dạng trung giana (VT) 44 Kết điệu ADN tổng số mẫu Ba kích sau điệu gel agarose 48 Aah dign di sta phim RAPD-PCR céc miu Ngii gai bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch dai bang méi OPCS 351 Aah dign di sta phẩm RAED-PCR mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại bang mdi OPAS 31 Sơ đồ hình quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu hai lồi Ngũ gia bì hương (H) va Ngũ gia bì gai (G) Bảng đồng hình (chỉ bồi hình đầu rnữi tên) ruẫu Sâm ngọc linh (5), Sâm vũ điệp (V) Tam thất hoang (T) tương ug với môi OPA l4, OPCI OPA7 biểu đỏ tiết số băng đa hình (mau ghi) đồng hình (màu đen) loài với mồi cụ thể, Hinh 3.17 bì hương (Cành mang nụ hoa) bì gai lơng bì gai (Cành mrang hoa) điệp (Cây có chín) Trang 3L Sơ đồ quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu loài Sam Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian Sâm vũ điệp Tam thất hoang (VT) Tam thất hoang (T) Cây quan hệ di truyền mẫu thuộc lồi Ba kích (B) Ảnh điện di sta phim RAED-PCR mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại nỗi OPA I0 So, 64 70 74 Tình 320 Hình 321 Hình 322 Hình 323 Hình 324 Hình 325 Hinh 3.26 Hinh 3.27 Hinh 3.28 Aah dign di sta phẩm RAPD-PCR céc miu Ngii gia bi huvag (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại bang moi OPALS Ảnh điện di sảu phẩm RAED-PCR mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại bang moi OPAL2 Aah dign di sta phẩm RAED-PCR mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại bing mdi OPAL Aah dign di sta phẩm RAED-PCR mẫu Ngũ gia bì hương (H) Ngũ gia bì gai (G) khuếch đại bang moi OPA4 Ảnh điệu di sản phẩm RAED-PCR mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vĩ điệp (V), Tam thất hoang (T) dạng trung gian Sâm vũ điệp - Tam thất hoang (VT) khuếch đại mồi OPA 14 OPA l6 Kết điện di mẫu Ba kích với OPAL Kết điện di mẫu ba kích với trơi OPC3 Hình ảnh số bãng đồng hình từ kết điệu di mẫu Ba kích với mơi OPAL? Hình ảnh số bãng đồng hình từ kết điện di mẫu ba kích vi méi OPALS 75 75 76 7? 79 80 81 81