BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO
NGHIEN CUU TAC DUNG SINH HOC VA
DOC TINH CUA CAY LƯỢC VÀNG
CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODS
Trang 2BOY TE
BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO
NGHIEN CUU TAC DUNG SINH HOC VA ĐỘC TÍNH CUA CAY LUGC VANG
CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODS
Cha nhiém dé tai: 'TSKH Nguyễn Minh Khởi Cơ quan chủ trì để tài: Viện Dược liệu
Cấp quản lý: Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2009 đến tháng 9/2010
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 565 triệu đồng
Trong đó, kinh phí sự nghiệp khoa học: 565 triệu đồng
Trang 3BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO
1 Tên để tài Nghiên cứu tác dụng sinh học và độc tính của cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woods
2 Chủ nhiệm đề tài TSKH Nguyễn Minh Khởi 3 Cơ quan chủ trì để tài: Viên Dược liệu
4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế 5 Thư ký đềtài: TS Trịnh Thị Điệp
6 Danh sách những người thực hiện chính:
1 TSKH Nguyễn Minh Khởi Viện Dược liệu
2, T8 Trịnh Thị Điệp Viện Dược liên
3 ThS Đỗ Thị Phương Viện Dược liệu 4 TS Phạm Nguyệt Hằng Viện Dược liệu 5 Th8 Nguyễn Thị Phượng Viện Dược liệu
6 T8 Phương Thiện Thương Viện Dược liên
7 Th8 Nguyễn Trang Thúy Viện Dược liệu
8 PG8.T8 Nguyễn Trọng Thông, Đại học Y Hà Nội 9 G8TSEH Phan Thị Phi Phi Đại học Y Hà Nội 10 PG8.TS Phan Thi Thu Anh Dai hoc ¥ HA Ndi 11.Th8 Phạm Thị Vân Anh Đại học Y Hà Nội
12 PG8.TS Nguyén Thi Quy Đại học Khoa học Tự nhiên 13.8 Hoàng Thị Mỹ Nhung Đại học Khoa học Tự nhiên 14.Th8 Bùi Thị Vân Khánh Đại học Khoa học Tự nhiên
15.Th8 Phí Thị Xuyến Viện Dược liệu 16 ThS Nguyễn Quỳnh Nga Viện Dược liệu
17.CN Trần Thanh Hà Viên Dược liệu
18 DSTC Nguyễn Thị Huyền Phương Viện Dược liệu
Trang 4AST BCMTT BSA cD cs cy DMSO ĐƯMD HCC HPLC INF KTMD LVL LVT MDA MHC NE OA, TBTHHMC TBTQDH NHUNG CHU VIET TAT Alanine aminotransferase Aspartate aminotransferase
Bach cầu múi trung tính
Bovine Serum Albumin Cluter of differentiation Công sự Cyclophosphamid Dimethylsulfoxyd Đáp ứng miễn địch Hồng cầu cửu Sắc ký lỏng hiệu năng cao Interleukin Interferon Khang nguyén Kích thích miễn địch
Cao đông khô địch ép lá lược vàng
Cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng
Malonyl dialdehyd
Major histocompatibility complex Natural killer
Ovalbumin
Té bao lympho lach tao hoa hồng mẫn cảm
Trang 5MUCLUC
ĐẶT VẤN ĐẺ 1 TONG QUAN
1.1 Thực vật học
1.2 Thành phần hóa học của chỉ Cøiiisiz Loefling
1.3 Tác dụng sinh học của các cây thuốc chỉ Callisia Loefling 1.4 Tác dụng sinh học của một số chất có trong Ơ agrans 1.5 Một số chế phẩm chứa lược vàng
2 ĐÓI TƯỢNG VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.2 Nguyên vật liệu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu nguyên liệu và xác định về thực vật
2.3.2 Phương pháp thử độc tính cấp
2.3.3 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn
2.3.4 Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn 2.3.5 Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn
2.3.6 Phương pháp thử tác dụng giảm đau
2.3.6.1 Thực nghiệm gây đau bằng tắm nóng
2.3.6.2 Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bing acid acetic 2.3.7 Phương pháp thử tác dụng tăng cường miễn dịch 2.3.7.1.Mô hình gây suy giảm miễn địch bằng hoá chất 2.3.7.2 Mô hình gây suy giảm miễn địch bằng tia xạ 2.3.8 Phương pháp thử tác dụng hạ huyết áp
2.3.9 Phương pháp thử tác dụng chống oxy héa in vivo
2.3.10 Phương pháp thử tác dung trén enzym xanthine oxidase và lypoxigenase
2.3.11 Phương pháp thử tác dụng déc té bao in vitro 2.3.12 Phuong pháp xử lý số liệu
3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU
Trang 63.1.2 Kết quả thử độc tính bán trường diễn
3.1.2.1 Kết quả theo đối tình trạng chung và cân năng động vật thí nghiệm
3.1.2.2 Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học
3.1.2.3.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 3.1.2.4.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 3.1.2.5 Kết quả xét nghiệm mô học
3.2 Kết quả nghiên cứu một số tác dung sinh học của lá và thân bổ
lược vàng,
3.2.1 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn 3.2.1.1 Két qua thir trén chiing S pnewmoniae 3.2.5.2 Kết quả thử trên chủng K pneumoniae 3.2.1.3 Kết quả thử trên chủng #f.iy/luenza 3.2.1.4 Kết quả thử trên chủng 8 aureus 3.2.1.4 Kết quả thử trên chủng P aeruginosa 3.2.2 Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn 3.2.3 Kết quả thử tác dụng giảm đau
3.2.3.1 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau xoắn bụng bằng acid
acetic
3.2.3.2 Tác dụng giảm đau trên rnô hình gây đau bằng tắm nóng 3.2.4 Kết quả thử tác dụng tăng cường miễn dịch
3.2.41 Kết quả thử tác dụng trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng
hóa chất
3.2.4.1.1 Nghiên cứu đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch
3.2.4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của LVL và LVT lên đáp ứng miễn dich dịch thể với kháng nguyên
3.2.4.1.3 Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bảo 3.2.4.2 Kết quả thử tác dụng trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng
tia xa
3.2.4.2.1 Nghiên cứu đánh giá tỉnh trang chung cla hé mign dich
3.2.4.2.2 Nghiên cứu đánh giá đáp ứng mién dich dich thé
3.2.4.2.3 Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bảo 3.2.5 Kết quả thử tác dụng hạ huyết ap
3.2.6 Kết quả thử tác dụng chống oxy hoa in vivo
Trang 7lypoxigenase in vitro 3.2.7.1 Hoat tính ức chế enzym xanthine oxidase của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng 3.27.2 Hoạt tính ức chế enzym lipoxygenase của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng 8 Kết quả thử tác dụng độc tế bào của các mẫu chiết từ lá và thân bô lược vàng
3.2.8.1 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào A549
3.2.8.2 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào 11358
3.2.8.3 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bao Hela
3.2.8.4 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào 11460
3.2.8.5 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào Hep-G2
3.2.8.6 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào Cos-7
Trang 8BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
'VỀ tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH-CN cấp Bộ
8 Tên để tài: Nghiên cứu tác dụng sinh học và độc tính của cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woods
Mã số
9 Thuộc chương trình: KHCN cấp Bộ Y tế 10 Chủ nhiệm đề tài: TRKH Nguyễn Minh Khởi 11 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
12.Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2009 ~ đến thang 9/2010
13.Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 565 triệu đồng
Trong đó kinh phí từ NSNN: 565 triệu đồng,
14 Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:
7.1 Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc:
Đã hoàn thành đầy đủ khối lượng công việc theo để cương nghiên cứu, cụ thể đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu sau:
1 Thu thập mẫu nguyên liệu lược vàng và giám định tên khoa học của đối tượng nghiên cứu
2 Xác định độ an toàn của được liệu
- _ Thử độc tính cấp của cao chiết toàn phần bừ lá và thân bồ lược vàng
- _ Thử độc tính bán trường diễn của lá và thân bổ lược vàng, mỗi mẫu 3 liều
3 Thử một số tác dụng sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá lược vàng trên
thực nghiệm, mỗi mẫu 2-3 liều:
- _ Tác dụng chống viêm, giảm đau
-_ Tác dụng kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn điển hình thường gây viêm răng lợi, viêm họng, viêm phế quản
- _ Tác dụng tăng cường miễn địch trên 2 mô hình thực nghiệm: gây suy giảm miễn dịch bằng héa chất và bằng tia xa
-_ Tác dụng chống oxy hóa
Trang 9- Thc dung ddc tf bao trén 8 déng tế bào gây ung thư
7.2 Về các yêu câu khoa học và chỉ tiêucơ bản của các sản phẩm KHCN
Các sẵn phẩm của đề tài
1 Báo cáo kết quả đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của lá
và thân bỗ lược vàng Độc tính cấp
- Cao đông khô dịch ép lá lược vàng gây chết chuột ở liều từ 12,8g đến
28,7g cao khô/kg thể trọng chuột Liều độc gây chết 50% chuột thí nghiệm là LD¿n
S,5 g caofkg tương đương với 1075,6g lá brơifkg thể trọng chuột hoặc 54,3g lá khôfkg thể trọng chuôt
- Cao chiết bằng cồn 50% thân bỗ lược vàng gây chết chuột ở liều từ 16,3g đến 32,5g cao khé/kg thé trong chuột Liền độc gây chết 50% chuột thí nghiệm là LDạ = 21,3g cao/kg tương đương với 1115,2 g thân bổ tươi/kg thể trọng chuột hoặc 56,0g thân bỗ khô/kg thể trọng chuột
Độc tính bán trường diễn
Cao đông khô dịch ép lá lược vàng liều tương đương 6g, 18g, 60g lá tươi
kg/ ngày và cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng liều tương đương 1,2g, 3,6g, 12g thân bổ tươi/ kg/ ngày cho thỏ uống trong 60 ngày liên tục ảnh hưởng
không có ý nghĩa thống kê đến các chỉ số huyết học về chức năng gan, thận và chức năng tạo máu so với đối chứng sinh lý Tuy nhiên, có hiện tượng gan bị viêm khoảng cửa và xung huyết cầu thận, viêm thân kế nhẹ ở một số cá thể
2 Báo cáo kết quả thử các tác dụng sinh học của lá và thân bổ lược vàng,
1 Tác dung kháng khuẩm
Cao đông khô dịch ép lá lược vàng và cao chiết bằng cồn 50⁄4 thân bỗ lược vàng đều có tác dụng kháng khuẩn in vitro trén cả 5 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae va Pseudomonas aeruginosa
2 Tác đụng chồng viêm man
- Cao đông khô địch ép lá lược vàng có tác dụng chống viêm mạn, với liều
uống 0,24g cao khô/ kg thể trọng/ngày trên chuột cống trắng, đã làm giảm trọng
Trang 10- Cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng có tác dụng chống viêm mạn, với 3 liễu uống 0,013g, 0,026 g; 0,052 g cao/ kg thể trọng/ngày trên chuột cổng
trắng ,đã làm giảm trọng lượng ỗ viêm trong ứng 23,04%, 25,20%, 22,01 % so với
1ô đối chứng có ý nghĩa thống kê 3 Tác đụng giảm đau
Trên mô hình gây đau xoắn bụng bằng acid acetie
- Cao đông khô dịch ép lá lược vàng có tác dụng giảm đau ngoại biên, với
liều 0,2g và 0,4g cao khô/kg thể trọng trên chuột nhắt đã làm giảm 23,9 — 30,7%
số lần đau xoắn bụng chuột có ý nghĩa sau 5 phút gây đau, tác dụng kéo dài 20 phút
- Cao chiết bằng cồn 50% thân bổ lược vàng có tác dụng giảm đau ngoại
biên, thử ở cả 3 liều 0,023; 0,046 và 0,092g cao khô/kg thể trọng trên chuột nhất
đã làm giảm 27,7 — 53,6% sé lin dau xoắn bụng chuột có ý nghĩa sau 5 phút gây
đau, tác dụng kéo đài 25 phút
Trên mô hình gây đau bằng tâm nóng
Cao đông khô dịch ép lá lược vàng liều 0,1, 0,2 và 0,4g cao khô/kg thể
trọng và cao chiết bằng cồn 50% thân bổ lược vàng liều 0,023, 0,046 và 0,092g
cao khô/kg thể trọng trên chuột nhắt không thể hiện rõ tác dụng giảm đau theo cơ chế thần kinh trung ương, tuy có làm kéo dai thời gian chịu nóng của chuột nhưng, chưa có ý nghĩa thống kê ở hầu hết các thời điểm theo đối
4 Tác đụng tăng cường miễn dich
Cao đông khô dịch ép lá lược vàng liều 0,1 và 0,4g cao khôíkg thể
trọng/ngày và cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng liều 0,023 và 0,092g cao
khôfkg thể trọng/ngày trên chuột nhất đùng liên tục 5 ngày theo đường uống ở mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng CY và 9 ngày ở mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xa, có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể và miễn địch tế bào thông qua cải thiên các chỉ số đánh giá về tinh trang chung hé mién địch như trọng lượng hương đối các cơ quan lympho, số lượng bạch cầu và các chỉ số đánh giá chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn địch tế bào
5 Tác dung ha huyét ép
Cao đông khô dịch ép lá lược vàng khi đưa vào da dày mào với các liều
0,051g; 0,102g va 0,51g cao khô/kg thể trọng và cao chiết bằng cồn 50% thân bd
Trang 11khôfkg thể trọng không có tác dụng hạ huyết áp đáng chú ý trên huyết áp mèo bình thường,
6 Tác dung chống oxy hóa
- Cao đông khô dịch ép lá lược vàng liều 0,1, 0,2 và 0,4g cao khô/kg thể
trọng và cao chiết bằng cồn 50% thân bổ lược vàng liều 0,023, 0,046 và 0,092g
cao khô/kg thể trọng trên chuột nhất trắng có tác dụng chống oxy hóa, làm giảm 43,24 — 56,59⁄4 hàm lượng MDA trong gan chuột có ý nghĩa so với đối chứng bệnh lý
- Cao chiết toàn phần và các phân đoạn chiết n-heran, ethyl acetat và nước của lá và thân bồ lược vàng không có tác dụng đáng chú ý lên hoạt tính của các enzym xanthine oxidase và lypoxygenase
7 Túc dung độc tẾ bào
Cao chiết toàn phần và các phân đoạn chiết n-hexan, «thyl acelat và nước của lá và thân bồ lược vàng đã được thử trên 3 dòng tế bào ung thư phổi (A549,
H358 và H460), 1 dòng tế bào ung thư cổ tử cung (Hela), 2 dong té bao ung thư vú (MCF-7 và KPL-4), 1 dòng tế bào ung thư gan Œep-G2) và 1 dòng tế bảo
biểu mô thận đã chuyển dạng (CO8-7) Kết quả chỉ có mẫu chiết phân đoạn ethylacetat lá lược vàng LE có tác dụng theo quy luật tăng nồng độ, tăng đô độc
đối với 2 dòng tế bào ung thư phổi (A549 và H358) với các giá trị sp tương ứng
là 20,27+0,89ug/ml và 44,2540,57 pg/ml
7.3 Về tiễn độ thực hiện
Đề tài đã thực hiện các nội dung nghiên cứu theo đúng tiến độ dự kiến
8 Về những đóng gop moi cia dé tai:
Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các Ấn phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc đề tài, để tài có những điểm mới sau đây
- Lần đầu tiên đánh giá được độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của hai bộ phân dùng làm dược liệu từ cây lược vang Callisia fragrans Lindl.) Woods là lá và thân bổ
Trang 12- Lần đầu tiên chứng minh lá và thân bồ lược vàng có tác dụng kích thích miễn dịch địch thể và rniễn dich tế bào trên 2 mô hình gây suy giảm miễn dịch
bang CY và bằng tia xa thông qua 15 chỉ số đánh giá về tình trang chung hệ miễn
dịch và chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào
- Đã chứng minh cao chiết lá và thân bồ lược vàng gây ha huyết áp không đáng kể trên mèo, không gây độc với một số dòng tế bào ung thư, không ảnh hưởng lên hoạt tính của các enzym xanthine oxidase và lypoxygenase in vitro
Các đóng gúp khác
- Đề tài đã giúp đào tạo 1 học viên cao học (D8 Hoàng Thị Diệu Hương) làm luận văn thạc sỹ được học với tên để tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một sổ tác dụng sinh học của cây lược vàng Callisia _fragrans Lindl.) Woods”
Hà Nội, ngày _ tháng 9 năm 2010
Chủ nhiệm đề tài
Trang 13ĐẶT VẤN ĐÈ
Cây lược vàng là một cây cảnh mới được du nhập vào nước ta trong những
năm gần đây Tử năm 2006, bắt đầu rộ lên thông tin một số người dân ở Thanh
Hóa sử dụng lược vàng làm thuốc dựa trên một số tài liệu không chính thức của Nga để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau thấy có hiệu quả như viêm đường hô hấp, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, bệnh đa dày, đau xương khớp, các bệnh tim mạch, huyết áp thậm chí cả ung thư Tử đó, “cơn sốt lược vàng" bắt đầu bùng phát ở Thanh Hóa, sau đó lan truyền ra nhiều tỉnh và thành phố, từ Đắc chí Nam
Ở Viậ Nam, lược vàng là đối tượng hoàn toàn mới chưa từng có tên trong
một tài liệu về cây thuốc nào, thâm chí chưa có tài liệu về thực vật học nào đề cập
đến
Ở Nga đã có một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học nhưng nghiên cứu về tác dụng sinh học của lược vàng còn rất ít Mặc dù vậy, cây lược vàng hiện vẫn đang được ứng dụng rất rộng rãi để chữa các bệnh dạ day — ruột, bệnh búi mật, lá lách, các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu, các bệnh ngoài da như viêm đa, zona, chàm, làm thuốc giảm đau, chống nóng rát, giúp vết thương chóng lành Các sách báo về lược vàng, các loại thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng với lược vàng là được liệu chính đang xuất hiện ngày càng nhiều [41], [42], [43]
Nhìn chung, lược vàng hầu như mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dan gian, chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt được liêu học Để có thể sử dụng lược vàng làm thuốc một cách hiệu quả và an toàn thì việc nghiên cứu thử nghiệm tác dụng sinh học, xác định độ an toàn của được liêu là một việc làm cần thiết Trước nhu cầu bức thiết về thông tin khoa học của nhân dân, được phép của Bộ Y tế, Vu
KH-ĐT Bộ Y tế, Viện Dược liệu tiến hành thực hiện để tài “Nghiên cứu tác dung
sinh học và độc tính của cây lược vàng Cøifisia ƒragraws (Lindl) Woods”
Mục tiêu của đề tài:
- Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của thân bổ và lá lược vàng - Đánh giá một số tác dụng sinh học của thân bồ và lá lược vàng
Nội dung nghiên cứu:
Trang 14- Thử độc tinh cấp của cao chiết toàn phần từ lá và thân bỗ lược vàng
- Thử độc tinh bán trường diễn của các cao chiết trên, mỗi mẫu 3 liền (kéo dài thời gian uống thuốc của thỏ thí nghiệm lên 60 ngày)
2 Thử một số tác dụng sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá lược vàng trên thực nghiệm, mỗi mẫu 2-3 liều:
- Tác dụng kháng khuẩn (trên một số chủng vi khuẩn điển hình thường gây viêm răng lợi, viêm họng, viêm phế quản)
- Tác dụng chống viêm, giảm đau
Trang 15Callisia fragrans duoc tréng lam canh 6 nhidu nude bi cé than bd kha dep
va dé trong Ngudi ta thong tring Callisia fragrans trong cdc chu treo dé than
buông rũ tạo đáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà Do khả năng phát triển nhanh, 6 Florida - MY, loài cây này được xếp vào danh sách “Các
loài thực vật nhập trồng xâm lắn” [45],
1.2 Thanh phan hea hoc ciia chi Catfisia Loefling
Trong các loài allisiz có một số loai nhu C elegans, C fragrans, Ơ
insignis, C macdougallii, C repens, C soconusensis đã được Maria A và cs khảo sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng cho thấy đều có chứa flavon C- glycosid, một nhóm chất thường gặp trong các cây thuộc họ Commelinaceae [67] Lá của các loài C elegans, C insignis, C macdougallit duge xAc định có cyaniđin 37,3’ -triglucosid acy! héa [46]
Từ năm 2007, các tác giả Nga và Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sâu về thành
phần hóa học loài Ơ fragrans va cho thầy loài cây này chứa nhiền các nhóm chất khác nhau như chất béo, carotenoid, tepenoid, acid hữu cơ, hợp chất phenol, flavonoid, dfn chất anthocyan, acid amin, đường tự do và polysaccharid [25], [77], [78], [104] Dưới đây là tổng hợp các kết quả nghiên cứu hóa học về loài cây này
Các hợp chất phenol
Đằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế, Olenniov D.N và cs đã phân lập được từ địch ép thân bồ lược vàng 7 hợp chất phenol là aloe-emodin, umbelliferon, scopoletin, quercetin, acid gallic, acid caffeic và acid
chieorie [77] oH 2 on
Š H * 1
Trang 16Scopoletin CgHsO, Quercetin CisHipO7 Ox_0H 7N" 9 ZZ HO’ ‘OH b BH OH on Acid gallic C7H 60s Acid caffeic CoHgOq H HO“ÀS á À OH ‘OH
Acid chicorie CoH sO 2
Khi phân tích dịch ép này bằng HPLC, đối chiếu với các chất chuẩn đã biết,
đã xác định ngoài 7 chất nói trên còn có kaempferol, acid ferulic [78]
Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng các nhóm hợp chất phenol chính trong địch ép này @o với cắn khô kiệt) 1: coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%, acid phenolic (acid gallic, caffeic và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05% [78]
Nam 2009, Châu Văn Minh và cs đã công bố phân lập được 1 hợp chất
Trang 17
1socrientin Saponin
Ginsenosid Rg1 đã được Phan Văn Kiệm và cs phan lập từ cây lược vàng,
trồng tại Việt Nam [13]
Ginsenosid Rgl Các acid hữu cơ
Ngoài các acid phenolie nói trên, trong thân và lá cây lược vàng có acid
ascorbic [77][78] Hàm lượng tổng các acid hữu co trong dich ép thân bồ lược vàng là 37,05% so với cắn khô kiệt [78]
Dầu béo
Phân tích dầu béo trong than va la C fragrans, Chernenco T.V và cs thay
có [25]
- Phân đoạn trung tinh: hydrocarbon parafinic, olefinic, aromatic; carotenoid, sterol va triterpen acetat, triacylglycerid, acid béo ty do, triterpenol, sterol, acid triterpenic và chlorophyL
Trang 18- Phospholipid - Các sắc tố: chlorophy! A va B, caroten œ và B, xanthophyl (neoxanthin va anteraxanthin) Hàm lượng chất béo trong địch ép than bd C fragrans 1a 0,21% so véi clin khô [78] Carbohydrat
Trong địch ép thân bổ lược vàng có chứa tới 25,134 đường tự do và 2,44 polysaccharid so với cắn khô kiệt [78] Thủy phân polysaccharid thì thu được các đường don 1A glucose, mannose, acid glucuronic, glucosamin va galactosamin [104], [76]
Cac acid amin
Phân tích, so sánh thời gian lưu với 24 acid amin chuẩn, Hikolaeva G và cs đã xác định được 18 acid amin, trong đó 15 acid amin tự đo và 14 acid amin liên kết trong dịch ép thân bồ lược vàng tươi: asparagin, acid aspartic, threonin, serin, glutamin, acid glutamic, glycin, alanin, valin, rnethionin, leucin, isoleucin, tyramin, phenylalanin, lysin, histamin, arginin va acid y-aminobutyric [74]
Từ cây lược vàng trồng tại Việt Nam, Phan Văn Kiệm và cs đã phân lập được L-tryptophan [13]
Các nguyên tố vô cơ
Trong thân bổ cây lược vàng trồng ở Nga đã xác định được 11 nguyên tố vô
cơ, trong đó Ba, Mn và Cu có hàm lượng cao nhất [74]
Nhìn chung, chi Callisia cén ít loài được nghiên cứu về thành phần hóa học, chỉ có loài Ơ /hagrans được chú ý nghiên cứu Mặc đủ mới được bắt đầu nghiên cứu từ 2007, nhưng cho đến nay các tác giả Nga và Việt Nam đã có được khá nhiều kết quả về thành phần hóa học của cây lược vàng C /agrans này với 10 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc và những phân tích sâu về thành phần các nhóm chất như carbohydrat, lipid, acid amin
1.3 Tác dụng sinh học của các cây thuốc chi Calfisia Loefling Sử dụng trong dân gian
Các loài thuộc chỉ Cøllisiz chủ yếu được trồng làm cảnh Một số loài sau đây đã được dùng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian của một số nước châu Mỹ
Trang 19= C repens: chtra cim cúm, hoại thư, viêm đạ dày, cao huyết áp, nhiễm trùng, thấp khóp, làm thuốc thư giãn [93]
Loài C f#agrans được dùng như một cây thuốc dân gian ở Nga để chữa các bệnh da dày — ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản, các bệnh đường tiết niệu, các bệnh ngoài da như viêm đa, zona, chàm, bỏng, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung thư [41]443]
Về kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học của các lồi Caliista, chúng tơi tìm
thấy một số công bố trong 2 năm gần đây của các tác gid Nga vé C fragrans và
một bài báo nói đến tác dụng chống herpes virus của địch chiết cồn Ơ grasilis Sau
đây là những kết quả cụ thể
Tac dung chống oxy hóa
Dịch ép thân bồ của loài Œ: jagrars có tác dụng chống oxy hóa in vitro trên mô hình thử nghiệm với DPPE với ICzụ = 1,07mg/ml Các phân đoạn có tác
dụng mạnh nhất lần lượt là phân doan chia ethyl acetat (Cp 0,024mg/ml), phan
đoạn nước Csp 0,032mg/ml), phân đoạn butanol {Csg 0,087mng/ml) và phân đoạn cloroform (sp 0,21mg/ml) Dịch ép thân bồ lược vàng cũng được chứng minh có khả năng liên kết với ion Fe” Can 0,79mg/ml), với Oz” đCsp 0,36mg/ml), gay bat hoạt HạO; đCzp 0,57mg/ml) Thử nghiệm hoạt tính trên NO, dịch ép này có hoạt tinh manh hon tanin (Ơag 2,96mg/ml so với tanin 3,50mg/rl) nhưng yến hơn acid ascorbic sp 1,28mg/ml) [78]
Tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động
Dịch ép thân bồ lược vàng C ƒữagrams khi cho chuột cống trắng uống với
liều 5ml/kg một lần/ngày đã làm tăng thời gian bơi của chuột tử 8,8 phút lên 11,5
phút nhưng chưa có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, khi tăng liều lên 10ml/kg thể trọng/ngày địch ép này đã làm tăng thời gian bơi của chuột có ý nghĩa gấp hơn 2
lần so với nhóm chứng (23,7 phút so với 11,3 phút) Phân tích sinh hóa cho thấy
tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động này là do dịch ép thân lược vàng đã hoạt hóa
quá trình tổng hop ATP trong cơ xương và cơ tim, làm tăng hàm lượng glycogen
trong gan và giảm nồng độ acid pyruvic và acid lactic trong máu Ngoài ra, dịch ép này đã giúp làm giảm sress oxy hóa của chuột bị cưỡng bức chạy, thể hiện ở việc
làm giảm nồng độ MDA trong huyết thanh, trong cơ xương và cơ tim chuột thí
Trang 20Tác dụng chống stress
Trên mô hình gây stress ở chuột bằng cách giữ tình trạng không hoạt động
liên bạc 24h, dịch ép thân C /#agrans uống với liều 5ml/kg/ngày trong 7 ngày
trước khi gây stress không có ảnh hưởng có ý nghĩa lên trọng lượng của tuyến ức,
tuyến tụy, nhưng đã gây tăng có ÿ nghĩa số lượng tế bào có nhân của tuyến ức và tuyến tụy lên tương ứng là 36 và 49% Ở chuột được uống dịch ép thân lược vàng,
tình trạng loét da dày do stress giảm còn 25% so với 100% ở nhóm chứng, không thấy có chuột nào có u đang vân ở nhóm uống lược vàng trong khi nhóm đối
chứng bị u 100% Tác dụng chống stress này cũng được cho là do tác dụng chống osy hóa của dịch ép này, biểu hiện ở việc làm giảm 40% nồng độ MDA trong huyết thanh và làm tăng nồng độ glutation 3 lần, tăng hoạt độ các enzym catalase
(54%) va superoxid dismutase (20%) [106]
Tac dung trên hệ miễn dịch
Thử nghiêm trên mô hình gây ức chế miễn dịch ở chuột bằng azathioprin, dịch ép thân bồ lược vàng đã thể hiện tác dụng tăng cường miễn dich, lam tang trọng lượng tuyến ức (129) và lách (27%) bị suy giảm do azathioprin, tăng 25% số lượng tế bào có nhân của hai cơ quan này Dịch ép này cũng làm tăng chỉ số thực bào 1,5 lần so với nhóm chứng bệnh và đưa các chỉ số này về gần với nhóm chứng sinh lý [106]
Tac dung chống virus
Dịch chiét ethanol cla C gracilis thé hién hoat tinh chéng herpes virus trén
thử nghiệm in vitro với herpes simplex virus type 2 Œ18V -2) với trị số ECa = 10,5
pg/ml [19]
1.4 Tac dụng sinh học của một số chất có trong C /#agrunw
Các chất đã được biết có trong lược vàng đều là những chất quen biết đã
được phân lập từ nhiều cây thuốc khác và đã được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý 8au đây là một số kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của các hợp chất này
Quercetin
Quereetin là một flavonoid rất phổ biến trong thực vật Quercetin được biết
đến là một chất có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chống viêm, ig ony hóa, chồng lão hóa, tác dụng bảo vệ gan, điều biến miễn dịch và phòng,
Trang 21
Hoạt tính chống oxy hóa, chống lão hóa của quercetin được nghiên cứu khá
kỹ trong một số nghiên cứu gần đây Quercetin và dẫn xuất của nó, cụ thể là
quercetin caprylat (QU-CAP) là rnột chất hoạt hóa mạnh proteasom, với tác dụng, chống oxy hóa, do đó nó ảnh hưởng đến tuổi thọ của tế bào và khả năng sống sót của nguyên bào sợi HFL~1 ở người; khi bỗ sung hợp chất này vào các nguyên bào sợi đã hóa già thì quan sat duoc hién tong trẻ hóa [28] Ngoài ra, người ta thấy có mối tương quan giữa stress oxy hóa gây ra bởi quá trình chuyển hóa diethylnitrosamin (DEN) va sw phat triển ung thư gan Quereetin là một flayonoid có tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư qua cơ chế thúc đây hệ thống phòng, thủ chống oxy hóa enzym và không-enzym trong giai đoạn khởi đầu của ung thư gan [97]
Cũng liên quan đến việc phòng chống bệnh ung thư nhưng nghiên cứu ở mức độ phân tử, quercetin tương tác với một số thụ thể, cụ thể là thụ thể aryl hydrocarbon, là một thụ thể có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do các chất hóa học nhất định gây ra Quercetin điều chỉnh một vài tín hiệu của sự truyền
tính trang trong chuỗi các phản ứng hóa sinh liên quan đến MEK/ERK và NEF2/KEAPI, là những chất gắn liền với quá trình viêm và gây ung thư Những
nghiên cứu về loài găm nhấm đã chỉ ra rằng chế đô ăn uống có nhiều flavonol giúp ngăn ngửa các chất hóa học gây ung thư, đặc biệt là trong ung thư ruột kết Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cũng đã cho thấy quercetin có thể có liên quan đến phòng
ngửa ung thư phổi [70]
Quereetin còn được biết đến là một chất có tác dụng bảo vệ các tế bào gan
Trong những nghiên cứu về tác động của quercetin trên những tế bào HepG2
nhiễm aflatoxin B (1) (AFB (1)) cho kết quả là quercetin ức chế sự sản xuất các
loại oxy phản ứng và các chất gây độc tế bào, và ngăn chăn sự giảm giutathion
(GSH) trong các tế bào HepG2 nhiễm AFB (1) Tuy nhién, quercetin làm giảm
không đáng kể nồng độ phosphatase kiềm trong huyết thanh, trong khi alanin
aminotransferase va aspartat aminotransferase & chudt nhiém AFB(1) lại tăng lên
Do đó, tác dụng bảo vệ gan của quercetin là không trực tiếp chéng lai AFB(1) ma
tăng cường hệ thống phòng vệ chống oxy hóa và ức chế sự peroxy hóa lipid [27] Các tế bào đuôi gai (DCs) cần thiết cho hệ thống điều hòa miễn dịch Kết quả nghiên cứu ứ viro về sự tác động của quercetin trên các tế bào đuôi gai cho
thay quercetin giảm độ bám dính của DCs (42%, p<0,05) và sự biểu hiện của CDI1a (21%; p < 0.05) và ức chế một phần sự phân hóa DCs do OxLDL
Trang 22Thiy nghiém in vivo duge tiến hành với 8 tinh nguyén vién nam khỏe ranh, được
dùng 500 mg quercetin 2 lan/ngay trong 4 tuần Kết quả cho thấy quereetin làm
giảm BDCA-2 + DCs trong mau ngoai vi 42% (p<0,05) cũng như đimethylarginin
bắt đối xứng ức chế NO-synthase trong cơ thể (31%, p<0,05) Như vậy, tác dụng
điều biến miễn dịch của queroetin cũng góp phần chống xơ vữa đông mạch [73] Một tác dụng khác của quereetin cũng được quan tâm nhiều là tác dụng
chống viêm Quereetin ức chế đáng ké mire dd mARN cia iNOS, COX-2 va CRP
của tế bào gan Chang Flavonoid nay cting cé tac dụng ức chế trén NF-kappaB
hoạt động và trên protein cô đặc của mẫu phosphoryl hóa của chất ức chế IkappaB alpha va IKK (kappaB kinase) alpha Các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng tác
dụng diéu chinh iNOS, COX-2 va CRP trong té bao gan Chang của quercetin có
thể góp phần vào tác dụng chồng viêm, thông qua các cơ chế có liên quan đến việc
phong tỏa NF-kappaB hoạt động và điều hỏa tăng của các gen tiền viêm [36]
bào
Ngoài ra, quereetin ức chế sự tiết các chất trung gian gây dị ứng trong các
RBL-2H3 và ngăn cản sự biểu hiện mARN CD23 và p38 MAPK hoạt hóa trong IL-4 kich thích các tế bào CaCO-2 Flayonol này cũng ngăn cản IgE-OVA gây thêm tín hiệu hoạt hóa protein kinase RE) và giải phóng chemokin Như vậy, quercetin ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của chứng viêm đị ứng qua trung gian IgE của các mô hình tế bào đường ruột [58]
aempferol
Kaempferol 14 mét flavonoid thién nhién, nó là một trong những flavonol phổ biến trong nhiều loài thực vật như trà, bưởi, bông cải xanh, táo KKaempferol
@, 41,5,7-tetrahydroxyflavon) có cấu trúc hóa học tuong tu quercetin va cting có
nhiều tác dụng sinh học tương tự như quercetin Nó cũng có tác dụng chống oxy
hóa và chống viêm, ngoài ra còn có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trên nhiều đòng tế bào ung thư
Giống như quercetin, tác dụng chống viêm của kaernpferol một phần là do
tác dụng điều chỉnh iNOS, COX-2 và CRP trong tế bào gan Chang thông qua các
cơ chế có liên quan đến việc phong tỏa NE-kappa hoạt động và điều hòa tăng các
gen tiền viêm [36] Kaempferol cũng ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của
chứng viêm dị ứng qua trung gian 1gE của các mô hình tế bào đường ruột [58]
Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác dụng chống oxy hóa của kaempferol
có thể liên quan đến việc cảm ứng apoptosis các tế bào H460 Đây là một kiểu làm
Trang 23caspase-3 (caspase-phu thudc) và AIF (caspase-độc lập), Sự biểu hiện quá mức của
enzym chống oxy hóa Mn-SOD được đây mạnh để tạo một loại gen mới ức chế
khối u trong một vài tế bào ung thư của người, và có thể nó đóng vai trò quan
trọng vào tác dụng apoptosis trên tế bào 11460 của hợp chất kaempferol [60]
aempferol có tác dụng gây apcptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư Các
tế bào MDA-MB-453 được điều trị bằng kaempferol ở các nồng độ khác nhau đử 1 đến 200 pM) trong 24 và 48 giờ Kaemnpferol ức chế một cách đáng kể sự tăng trưởng của tế bào ung thư ở các tế bảo tiếp xúc với 50 và 10 IM kaempferol và
trong thời gian tương ứng là 24 và 48 giờ Kaempferol ức chế sự phát triển của tế
bào bằng cách phá vỡ chu trình tế bào, kết hợp mạnh với việc ngăn cần sự phân chia tế bào ở pha G2/M và có thể gây apoptosis thông quá sự phosphoryl hóa p53
ở các tế bào MDA-MB-453 trong ung thư vú ở người [26] Trong điều kiện
hypoxic (1% oxy), kaenpferol ức chế một cách hiệu quả hoạt động của HIF-1 theo
kiểu phụ thuộc liều C50 = 5,16 microM) Cơ chế của sự ức chế này không liên
quan đến việc ngăn cản mức độ protein HIF-lalpha mà là do bất hoạt p44/42
MAPK béi kaempferol (C50 = 4,75 microM) Khi cho cc té bào Huh7 tiếp xúc
v6i 10 microM kaempferol lam gidm đáng kế khả năng tồn tại của chúng và điều này được thể hiện rõ hơn trong điều kiện hypoxic Như vậy, kaempferol ức chế cả
MAPK và HIF-1 hoạt động ở nồng độ sinh lý (5-10 microM) và ngăn chặn sự sống
sót của các tế bào ung thư gan hiệu quả hơn trong điều kiện cxy giảm Do đó
kaernpfarol là một tác nhân rất có tiềm năng giúp phòng ngửa hay chữa trị ung thư
biểu mô tế bào gan (HCC) [71]
Isoorientin
Hợp chất isoorientin là một flavon cé mat trong mét số loài thực vật bậc
cao Nhiều nghiên cứu đã cho thấy hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học c6 gid tri trong céc thir nghiém in vitro va in vive bao gdm hoạt tính chống oxy hoá, kháng viêm, kháng sinh, bảo vệ gan, chống tiểu đường, giảm đường mau Giống như các chất thuộc nhóm flavonoid, hoạt tính chồng oxy hoá của isoorientin thể hiện rõ rệt trong các nghiên cứu trên hệ DPPH và sự peroxy hóa lipid với giá
tri IC50 khá thdp (9-10 uM) Kha nang chéng oxy hoá này được chứng minh do
isoorientin kích thích sự hoạt hoá của yếu tố phiên mã Nrf2, từ đó thúc đẩy quá
trình tổng hợp các gen liên quan đến khả năng chống oxy hoá như NADŒ)H:
quinon oxidoreductase 1 @ïQO-1), hem oxigenase 1 (HO-1), periaxin @R [22],
Trang 24Hoạt tính chống viêm của isoorientin cũng được nghiên cứu khá chỉ tiết
trong thời gian gần đây Năm 2004, Kupeli và công sự đã thử nghiêm tác dụng
chống viêm của isoorientin trên chuột nhất gây viêm bằng carrageenan Kết quả cho thấy với liều 30 mg/kg thể trọng, isoorientin làm giảm đến hơn 40% thể tích
khối viêm mà hoàn tồn khơng gây độc cho dạ dày [57] Trong một thí nghiệm
khác, isoorientin ở liều 25 rngfkg thể trọng làm giảm đến 57% tế bào bạch cầu và 40% hoạt tính myeloperoxidase trên mô hình chuột nhất gây viêm bằng
carrageenan [103]
Một hoạt tính đáng quan tâm khác của isoorientin là tác dụng chống tăng
đường huyết Thí nghiệm trên mô hình chuột gây tiểu đường bằng streptozotocin
cho thấy isoorientin với liền 15 mg/kg thể trọng làm giảm đáng kể lượng đường glucose trong máu trong vòng 5-15 ngày [31]
Hợp chất isocrientin thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu trên các chủng vi khuẩn và
ấm với giá trị MIC trong khoảng 100-200 ugfmL Trong một số nghiên
cứu, mặc đủ địch chiết các mẫu thực vật chứa isoorientin ức chế mạnh sự phát triển các chủng vi sinh vật kiểm định nhưng khi được phân lập ra, hoạt tính của
isoorientin lại có giá trị thấp hơn dịch chiết ban đầu [32] Ngoài những hoạt tính
sinh học kể trên, isoorientin còn thể hiên những nhiều tác dụng khác như bảo vệ gan, thận [35], [79]
Scopoletin
Seopolein là một coumarin có nhiều tác dụng sinh học Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng scopoletin có tác dụng chống cxy hóa, chống viêm khớp, chống ung thư, làm ha huyết áp và có tác dụng chống trầm cảm
Năm 2003, Shaw CY và cộng sự đã tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa của scopoletin phân lập từ Sinomoniwn acutwn Két quả chi ra ring scopoletin
đóng vai trò dọn sạch các gốc anion superoxid trong hệ thống phản ứng xanthináanthin oxidase theo kiểu phụ thuộc nồng độ, nhưng không ức chế xanthin ogidase Nó có thể được sử dụng trong việc ngăn ngừa các gốc anion superoxid
gây hại trong cơ thể [90]
Co chế làm hạ huyết áp của sccpolein, phân lập từ quả Tetrapleura
fetraptera T AUB (Mimosaceae), đã được nghiên cứu in vivo và ín vữro Các kết
Trang 25nghiêm bơi cưỡng bức (hành vi giống như trầm cảm), được làm giảm bởi
scopoletin (1-100mg/kg, p.o.) Tac dụng giống như thuốc chống trầm cảm của
seopoletin phụ thuộc vào các hệ thống thu thể serotonergic đhụ thể 5-HT (2A)), noradrenergic (alpha (1) - va alpha (2)-adrenoceptors) va dopaminergic (thy thé dopamine D (1) va D (2)) [21]
‘Umbelliferon
Umbelliferon @-hydroxycoumarin), một dẫn xuất của coumarin, 18 benzopyron trong tự nhiên Nó có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, hạ đường huyết và chống béo phì
Ramesh B., Pugalendi K.V đã tiến hành thử nghiệm các tác dụng sinh học của umbelliferon trên chuột bị tiểu đường, Umbelliferon tăng cường khả năng chống oxy hóa nên được xem là một chất chống oxy hóa mạnh Chuột tiểu đường
được điều trị bằng umbelliferon (30 mg/kg trong lượng cơ thể) hỏa tan trong 10%
dimethyl sulfoxide (DMSO) trong 45 ngày, làm giảm mức peroxy hóa lipid va tăng cường những chất chống oxy hóa enzym và không-enzym lên mức gần như bình thường [#7]
Ở chuột tiểu đường, mức duéng huyét, hemoglobin glycosyl hoa GbA (1©) tăng và hoạt động của các enzym tan tao glucose nhwr glucose-6-phosphatase
và fruetose-1, 6-bisphosphatase cũng tăng, trong khi mic insulin huyết tương,
hemoglobin Gib), glycogen gan giảm và các hoạt đông cia glucokinase va glucose-6-phosphate dehydrogenase cfing giảm Tiêm umbelliferon vao mang
bụng chuột tiểu đường đới liều 10, 20 vA 30 mg/kg trong lượng cơ thể) và
glibenclamid (600 micro g/kg trọng lượng cơ thể) trong 10⁄4 DMSO hòa tan trong nước, trong 45 ngày, làm giảm đáng kể mức dé glucose miu, HbA (1¢) va hoat động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase, trong khi đó làm
tăng nồng độ insulin huyết tương, Hb, glycogen gan và hoạt động của glucokinase
va glucose-6-phosphate dehydrogenase lên gần như bình thường Ngoài ra, ở chuột
tiểu đường, các thành phần glycoprotein trong huyét tuong va trong cdc mé (gan,
Trang 26kiểm soát mức đường huyết, do đó giảm sự hình thành các thành phần glycoprotein, gitip chéng lại nguy cơ biến chứng của bệnh tiểu đường [86], [88]
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng umbelliferon ngoài tác dụng chống đái tháo
đường còn có tác dụng chống tăng lipid máu Trong huyết tương của chuột bị tiểu
đường, cholesterol toàn phần (TC), cholesterol lipoprotein ty trong thip (LDL-C),
cholesterol lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL-C), triglycerid (TG), acid béo tự
do (FA) va phospholipid (PL) tăng cao còn cholesterol lipoprotein ty trong cao (HDL-C) giảm sút Trong rô gan và thận của chuột bị tiểu đường TC, TG, FFA, và PL có nồng độ cao Ở chuột được điều trị tiểu đường bằng umbelliferon, các chỉ
số TƠ, TG, PL va FFA trong huyết trong và m6; va LDL-C, VLDL-C, va HDL-C
huyết tương gần trở lại như bình thường [85]
Aloe emodin
Aloe emodin 1A một hydroxyanthraquinon, có một số tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chồng viêm, chống vims và tác dụng chống ung thư
Cơ chế gây viêm chính của đại thực bào là do chúng gây cảm ứng nitric
oxid synthase (NOS) dẫn đến việc sản xuất ra oxid nitric ở mức cao Aloe emodin
có tác dụng chống viêm vì nó ức chế việc sản xuất oxid nitrie (1©), yến tổ hoại tử u TNF- a va interleukin IL-12 tr cic đại thực bào đã hoạt hóa bởi
lipopolysaccharid (LPS) va interferon-garnma (IFN- y) Két qua cho thy, ICs) cla
aloe emodin trén NO, TNF-a va IL-12 từ các đại thực bào ở phúc mạc đã hoạt hóa 1a 30 uM [69]
Kết quả nghiên cứu của Lin C.W và công sự ở Trung Quốc đã cho thấy
aloe emodin là tác nhân tạo ra IEN với tác động kháng virus, ức chế virus viêm não Nhật Bản (TEV) và enterovirus 71 V71) Aloe emodin có tác dụng gây độc
tế bào thấp đến các tế bào tiền đơn nhân HL-CZ của người và các tế bảo
medulloblastoma TE-671 (bướu nguyên bào ty) và hoạt hóa mạnh yếu tố đáp ứng kích thích interferon TSRE - interferon-stimulated response element) và chuỗi hoat héa gamma (GAS- gamma-activated sequence) ICs của aloe emodin thay
đỗi từ 0,50microg/mL đến 1,51microg/mL đối với JEV va th 0,14microg/mL dén
0,52microg/mL đối với EV71 Aloe emodin cho thấy rõ khả năng ức chế mạnh
su trị cao, đặc biệt với các tế bào HL-CZ [62]
Hợp chất aloe emodin 1a mét loại tác nhân chống ung thư mới với hoạt tính
virus va đạt được các chỉ sị
Trang 27làm chết tế bào theo chương trình Tính chọn lọc chống lại các tế bào khối u thần kinh ngoại bì phụ thuộc hiệu lực cụ thể của việc kết hợp thuốc [#1]
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai đồng
tế bào ung thư gan ở người là Hep G2 và Hep 3B cho thấy aloe emodin ức chế sự
phát triển tế bào và gây apoptosis ở cả hai dòng tế bào được thử nghiêm, nhưng với các cơ chế khác nhau Ở các tế bào Hep G2, aloe emnodin cảm ứng sự biểu hiện
p53 va kèm theo cảm ứng sự biểu hiện p21 kết hợp với việc ngăn cần chu trình tế bao trong pha G1 Ngoài ra, aloe emodin làm tăng đáng kể lượng thụ thể Fas/APO 1 và sự biểu hiện của Bax Ngược lại, với những tế bào Hep 3B thiếu p53, tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào của aloe ernodin qua trung gian phụ thuộc p21
mà không ngăn cần chu trình tế bào hoặc làm tăng lượng thụ thể Fas/APO1 Cơ chế chính là aloe ernodin gây cảm ứng apoptosis bằng cách tăng cường sự biển hiện cia Bax [56]
Những nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy rằng aloe emodin cé thé 1A mét loại thuốc hóa trị liệu mới và phủ hợp để điều trị ung thư đa dày ở người Kết quả điều tra tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai dòng tế bào ung thư da
dày riêng biệt ở người là AG8 và NCI-Nð/, cho thấy aloe emodin làm chết tế bào
theo cách thức phụ thuộc thời gian và liều lượng Nó giải phóng các yếu tố cảm
ứng apoptosis và cytochrorn c từ ty thể, tiếp theo là hoạt hóa caspase-3, dẫn đến co
rút nhân và gây apoptosis Ngoài ra, aloe emodin ngăn cản sự hoạt động của casein kinase II theo cách phụ thuộc thời gian và kèm theo sự giảm phosphoryl hóa Bid
Trong một nghiên cứu khác, các tế bào MGC-803 được điều trị bằng 2,5, 5, 10, 20
và 40 microM aloe emodin trong 1-5 ngày Kết quả cho thấy aloe emodin ức chế
sự tăng trưởng của tế bào ung thư theo cách phụ thuộc liều dẫn đến làm gián đoạn
chu trình tế bào Hơn nữa, nó làm giảm hoạt tính của phosphatase kiềm (ALP) và
gây ra sự khác biệt giữa các tế bào [23], [39] Acid caffeic
Nhiều nghiên cứu cho thấy acid caffeic có tác dụng chống oxy hóa, làm hạ đường huyết, tác dụng chống viêm và làm lành vết thương
Các kết quả nghiên cứu cho thầy việc dùng acid caffeic cho chuột bị nhiễm độc rượu làm giảm bớt những thương tỗn oxy hóa do rượu gây ra trong gan và
thân Uống acid caffeic với liều 12 mg/kg/trọng lượng cơ thể trong 45 ngày làm
Trang 28glutathion peroxidase (GPx), glutathion (GSH), va glutathion S-transferase (GST)) trong gan và thân Những nghiên cứu mô học gan và thận cũng cho thấy việc uống acid caffeic làm giảm rõ rệt những thay đổi bệnh lý do rượu gây ra [51]
Ngoài tác dụng chồng oxy hóa kể trên, acid caffeic còn được chứng minh là có tác dụng làm hạ đường huyết ở chuột C57BL/Ks1-db/đb Ở nhóm sir dung acid caffeic: mức đường huyết và hemoglobin glycosyl hóa giảm nhiều hơn so với nhém đối chứng, mức insulin huyết tương, C-peptid và leptin cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, Tác dung làm tăng insulin huyết tương của acid caffeic có thể là do tác dụng chống thoái hóa trên các đảo nhỏ Acid caffeic cũng làm tăng rõ rệt glucokinase hoạt động và sự biểu hiện mARN của nó và tăng hàm lượng gÌycogen; ddng théi giam glucose-6-phosphatase va phosphoenolpyruvat carboxykinase hoat đông và sự biểu hiện mARN của chúng, kèm theo việc giảm sự biểu hiện của chất
vận chuyển glucose 2 trong gan Ngược lại với chất vận chuyển glucose 2 ở gan,
sự biểu hiện của chất vận chuyển glucose 4 ở tế bào tạo mỡ lại lớn hơn nhóm đối chứng Ngoài ra, acid caffeie còn làm tăng đáng kể hoạt động của các enzym 8OD, CAT, GPx vA mic dé biéu hiện mAEN của chúng, trong khi đó làm giảm mức hydrogen peroxid và các chất phản ứng acid thiobarbituric trong hồng cầu và gan của chuột đb/đb, Các kết quả này cho thấy cơ chế chống đái tháo đường của acid caffeic 1A ngăn chăn sự tiến triển của đái tháo đường tớp 2 do nó làm giảm lượng
glueose sản xuất ở gan và tăng cường hấp thu glucose ở các tế bảo tạo mỡ, tăng tiết insulin và tăng khả năng chống oxy hóa [49]
Ho Sun Song và công sự đã tiến hành nghiên cứu một tác dụng đặc biệt của acid caffeic là tác dụng làm lành vết thương trên chuột bị rạch đa Acid caffeic là một chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và chống viêm trong hệ thống tế bào nuôi cấy, và có thể có liên quan đến việc chữa lành vết thương trên chuột bị rạch da Nó kích thích các polyrner tổng hợp giống như collagen trong tế bào nguyên bào sợi NIH 3T3; nhưng lại ức chế cả hai thể hệ loài oxy phản ứng do silica gây ra,
ức chế sự giải phóng acid arachidonic do melittin sinh ra, tre ché sy sin xuất PGE 2 trong tế bào Raw 261,7, và ức chế sự giải phóng histamin trong các tế bào RBL
2H3 được kích thích bởi melittin hoặc acid arachidcnic [92] Acid gallic
Trang 29Acid gallic 1a mét hợp chất chống oxy hóa tự nhiên Đặc tính chống oxy
hóa hỗ trợ cho tác dụng bảo vệ gan của hợp chất này Các tác dụng này được đánh giá trên chuột bị tổn thương gan do nhiễm độc paracetamol và được so sánh với silymari, một thuốc bảo vệ gan tiêu chuẩn Chuột được nhận một liều paracetarnol (900 rng/kg trọng lượng cơ thổ), và được cho acid gallic (100 rng/kg
trọng lượng cơ thể) và silymarin (25 mg/kg trong long cơ thể) 30 phút sau khi
tiêm paracetamol Khi so sánh với nhóm đối chứng, ở nhóm chuột uống paracetamol: hoạt động của các enzym gan (aspartat transaminase, alanin
transaminase và phosphatase kiềm) được tăng cường, TNF- œ và mức độ peroxy
hóa lipid cũng tăng cao (p < 0,05); trong khi mức chống oxy hóa lại suy giảm ( <
0,05) Điều trị bằng acid gallic làm giảm đáng kể những thay đổi trên (p <0,05) đo
tác dụng chống oxy hóa của acid gallie [89]
Theo kết quả nghiên cứu của Giftson J8 và công sự (năm 2010), acid gallic là một tác nhân có khả năng phòng ngừa ung thư ruột kết do 1,2-dimethyl hydrazin (MH) gay ra, Do acid gallic có tác dụng chống oxy hóa; nó làm giảm các sản phẩm của sự peroxy hóa lipid (LPO) nh các chất phản ứng acid thiobarbituric (BARS), cde hydroperoxid lipid (LOOH) va cée dien lién hop
(CD) và cũng làm tăng mức độ các chất chống oxy hóa như superoxid đismutase
(SOD), catalase (CAT), glutathion GSH), glutathion reductase (GR) va glutathion
peroxidase (GP) trong các mô của chuột nhiễm DMH nên hạn chế được những
tác động do DMH gây ra [37]
Acid gallic có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh với IC50 = 3,59 x 10” M
trên các tế bảo u hắc sắc tố B16 Acid gallie có tác dụng điều hòa ức chế việc sản
sinh các loài phản ứng (8) và tăng cường tỉ 18 glutathion GSH) / glutathion đã oxy hóa (388G) [53]
Acid gallie đã chứng tỏ được khả năng ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào và gây apoptosis trên một loạt các dòng tế bào ung thư
Nghiên cứu in vitro cho thay, acid gallic gây ra những thay đổi về hình thái,
giảm tỷ lệ tế bào sống sót và gây apoptosis trên tế bào hắc sắc tố A375-82 theo
cách phụ thuộc thời gian và liều Quan sát cơ chế apoptosis ở mức độ phân tử
trong tế bào A375-82 cho thấy acid gallie điều hòa tăng các protein pro-apoptotic
như Bax va gay cam ứng hoạt động của dòng thác caspase, nhưng lại điều hòa ức chế các protein anti-apoptotic như Bel-2 Acid gallic kích thích giải phóng nguyên
sinh chất của các phân tử apoptotic, cytochrom c, thúc đây sự hoạt hóa caspase-9
Trang 30tiết insulin Kết quả cho thầy rằng acid chicoric làm tăng sự hấp thu glucose ở các tế bào cơ Ló, một tác dung chỉ được quan sát khi có mặt insulin ở nồng độ kích
thích, và có thể kích thích tiết insulin từ dòng tế bào tiết insulin TN8-1E và các đảo
nhỏ Langerhans của chuột Như vậy acid chicoric chống đái tháo đường theo cơ
chế vửa tăng hấp thu glucose vửa có khả năng làm nhạy cẩm insulin và tăng tiết
insulin [95]
Ginsenosid Rgl
Ginsenosid Rg1 (GRg1), một trong những thành phần chính có hoạt tính mạnh của rễ Panax nofagirseng, đã được chứng minh là có nhiều the dung sinh học đáng chú ý
GRg1 cho thấy một tác dụng bảo vệ thần kinh mạnh bằng cách giảm dang
kế nhồi máu não và các chỉ số thần kinh trong mô hình chuột MCAO Tuy khả năng vận chuyển của GRg1 qua hàng rào máu não khá hạn chế, nhưng GRg1 lại
thể hiện tác dụng bảo vệ tương đối mạnh, chống lại những tổn thương hàng rào
máu não và có thể tác dung này xuất phát tử tác dung bảo vệ trực tiếp chống lại thiếu máu cục bộ gây ra bởi thương tổn ở hàng rào máu não Ngoài ra, GRg1 còn
có tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại độc tính do 6-OHDA, (6-hydroxydopamin)
gây ra trên tế bào ME823.5 Cơ chế của nó bao gdm việc tăng điều chỉnh sự biểu
hiện gen và protein của Bcl-2, kích hoạt sự phosphoryl hóa Akt cũng như ức chế sw phosphoryl héa ERK 1/2 gây ra bởi 6-OHDA [52], [99]
Ngoài tác dụng trên hệ thần kinh trung ương, GRg1 còn có khả năng thúc
đẩy sự phục hồi dây thần kinh sau những tổn thương thần kinh Liều cao GRg1 giúp tái tạo và phục hồi chức năng của sợi trục thần kinh tốt hơn liều thấp GRg1 và
mecobalamin Như vậy, GRg1 có thể được sử dụng như một tác nhân bảo vệ thần
kinh có tác dụng phục hồi thần kinh ngoại vi [50]
Với tác dụng bảo vé thần kinh, đRg1 còn được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson, Co ché bao vé thin kinh cha GRg1 là chống lại apoptosis gay ra boi
dopamine ngoại sinh trong các tế bào PC12 GRg1 làm giảm rõ rệt việc sản xuất
các loại oxy phản ứng gây ra bởi depamin và giải phóng eytochrom e từ ti thể vào
trong tế bào chất và sau đó ức chế sự hoạt động của caspase-3 Ngoài ra, GRg1 cũng làm giảm mức protein iNOS và giảm sản xuất NO GRg1 có thể làm hạn chế
Trang 31Ngoài những tác dụng trên hệ thần kinh, Ginsenoside Rg1 còn có tác dụng
bảo vệ mạch máu GRg1 có thể hạn chế sự giảm sản xuất NO do TNF-œ gây ra
theo cách phụ thuộc liễu Thêm nữa, GRgi có thể làm cho mức độ biển hiện của các protein như MEKE3, phosphoglycerat mutase giảm đi, còn niric-oxid
synthase, mineralocorticoid receptor tăng lên ở HUVECs (tế bào nội mạc tĩnh
mạch rốn của con người) được kích thích bởi TNF-ơ Việc GRg1 làm tăng sản xuất NO đóng một vai trò quan trọng trong tac dung bao vé céc HUVECs bi TNF- œ kích thích [102]
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng GRg1 là một phytoestrogen có hoạt tính như estrogen, mà không cần có sự tương tác trực tiếp với thụ thể estrogen (ERs) trong cdc té bao ung thu vi ở người (MCF-7) Tác dụng giống như estrogen
của GRgl théng qua trung gian cdc ERs nội sinh GRgicé thé kich hoat ERE-
luciferase hoat déng qua trung gian ER-ø theo cách phụ thuộc liều (10! dén 10
M), trong khi đó, việc kích hoạt EEE-luciferase hoạt động qua trung gian EE-B
của GRg1 chỉ xây ra ở nồng độ cao (105M) [98]
Kết quả nghiên cứu của Xi-Sheng Xie và công sự (năm 2009) cho thấy GRg1 ngăn cẩn sự biến đổi hình thái trong NEK-52E và ức chế sự biểu hiện của P-ERK 1/2 tại NEK-52E gây ra bởi TGF- B1 GRg1 còn ức chế sự biểu hiện của ơ-
SMA và sự thiếu hụt E -cadherin, sau đó giảm mức collagen I va fibronectin theo
cách phụ thuộc vào liều GRg1 có thể ức chế EMT qua cơ chế ngăn cản sự biểu
hién cha P-ERK 1/2 in vitro và do đó nó cũng có vai trò chống xơ hóa ở thận [ 100] Các phân tích mô học cho thấy rằng GRgl cải thiện đáng kể mức độ xơ hóa gan gay ra béi thioacetamid ở chuột như ức chế các chỉ số xơ hóa trong huyết thanh và hàm lượng hydroxyprolin gan GRg1 làm giảm mie alanin transaminase,
aspartat transaminase à phosphatase kiểm trong huyết thanh và làm suy giảm các
chat phan tmg acid thiobarbituric trong gan ở chuột nhiễm thioacetamid Như vậy,
GRgI vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả năng chống xơ hóa gan [47]
Ginsenosid Rg1 có thể là một tác nhân có tiểm năng phòng và điều trị ung thư GBg1 điều trị các tế bào u xương ác tinh MG-63, làm giảm sự biểu hiện
nucleophosmin, là một phosphoprotein nhân chính có liên quan đến sự tổng hợp +RNA, duy trì sự Ổn định của hệ gen và sự phân chia của tế bào bình thường Nueleophosrnin cũng có chức năng như một phân tử chaperon có thể ương tác với nhiều cncogen và gen ức chế ung thư GEg1 điều hòa các oncogen c-myc, c-fos va
gen ức chế khối u, P53, Rb [94]
Trang 32cho thấy GRg1 giúp tế bào vật chủ chống lại sự lan rộng của nấm candida do phản
ứng miễn dịch qua trung gian tế bào CD4+T tử một phản ứng cytokine do Tạ1 chỉ phối [48] Bảng 1.1 Tổng hợp tác dụng sinh học của một số chất có trong cây lược vàng Stt 'Tên hoạt chất Tac dung sinh hoc 1 Quercetin Chống oxy hóa, chống lão hóa [28], [#7] ảo vệ gan [27] Điều biến miễn địch [73] Chống viêm [36], [58] Phòng chồng ung thư [70] Kaempterol Chéng oxy héa [60] Chéng viém [36], [58]
Tác dụng gây chết tế bào theo chương trình trên nhiều dòng,
tế bào ung thư, phòng chống ung thư [26], [71] Isoorientin Chống oxy hoá [22], [29], [61] Chống viêm [57] Kháng khuẩn [32] ảo vệ gan, thận [35], [79] 11a đường huyết, chống đái tháo đường và chống béo phi [31] | Scopoletin Chống oxy hóa [90] Hạ huyết áp [75] Chống ung thư [64], [66] Chống viêm khớp [S0] Chống tram cảm [21]
'Umbelliferon Chống oxy hóa [87] ;
Hạ đường huyết, chống đái tháo đường, chống tăng lipid máu [85], [86], [88] Aloe emodin Chống ung thư [23], [38], [56], [81] Chống virus [62] Chống viêm [69] Acid caffeic Chồng oxy hóa [49], [51] Hạ đường huyết [49] Chống viêm, làm lành vết thương [92]
‘Acid gallic Chồng oxy hóa, bảo vệ gan [37], [44], [53], 185] —_
Tác dụng gây chết tế bào theo chương trình trên nhiều ding tế bào ung thư, phòng chống ung thư [37], [44], [53], [65], [101] Acid chieoric Chỗng đái tháo đường [95] Tác dụng chống HIV [18], [40], [63], [s3]
10 Ginsenosid Rg1 Tác dụng bảo vệ thân kinh [24], [50], [52], [99]
Tac dung giống estrogen [98]
Chống xơ hóa [47], [100]
Trang 33Điều biển miễn dịch, chống nắm Candidas [48] Chéng ung thu [84]
1.5 Một số chế phẩm chứa lược vàng
em bôi Callisia fragrans với nọc ơng [42]
Dạng bào chế: tuýp kem 75ml Mới sản xuất: Nga ~ Ucraina
Thành phẩn: nước với ion bạc, sáp ong, noc ong, dich chiết lược vàng, dầu bách xủ, mật gầu
Chỉ định: có tác dụng giảm đau, chồng viêm, làm ấm nóng, hồi phục, phòng tránh
tích lũy muối, làm đĩa đệm cột sống đàn hồi và mềm dẻo hơn Hỗ trợ điều trị viêm đầu dây thần kinh, đau thần kinh tọa, gout
Trà túi lạc Tâm Lan [12]
Dạng bào chế: trà túi lọc 120g/ hộp GO thi x 4g)
Noi sản xuất: Cơ sở V6 Thi Lan, Tây Ninh
Thành phân: Cây hoàn ngọc (ễ, thân, lá) 40%, Cúc hoa 20%, Kim ngân hoa 20%,
Cây lược vàng 2094
Chúc năng: Hỗ trợ điều trị rồi loạn tiêu hóa, thanh nhiệt giải độc cho cơ thể
Trang 342 DOI TUGNG VA PHUONG PHAP NGHIEN cUU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối hrợng nghiên cứu là lá và thân
bổ lược vàng tươi thu tại Thanh Hóa, Hà
Nội, Bắc Giang bử tháng 6/2009 đến tháng 3/2010 Mẫu cây được các chuyên
gia thực vật, Khoa Tài nguyên cây thuốc Viện Dược liệu xác định tên khoa học là Callisia fragrans (Lindl) Woods họ Commelinaceae (Thai lai)
Tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại
2 nơi
+ Khoa Tài nguyên cây thuốc,
'Viện Dược liệu: số hiệu mẫu: LV01, 02,
0305 và 06 INPM)
+ Phòng tiêu bản Quốc gia Việt
Nam, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam: số hiệu mẫu: Nga - 04 GIN)
Hình 2.1 Ảnh cây lược vàng
Dược liệu để điều chế mẫu thử được thu tại Bắc Giang vào lúc cây trồng
được 4 tháng tuổi, thân bồ vươn dài 10-12 đốt, chưa có hoa
2.2 Nguyên vật liệu
2.2.1 Mẫn thử
_Mẫu thử độc tính và tác dụng được lý của lá (ký hiệu L V1):
Lấy lá tươi, rửa sạch đất cát, tránh lá gẫy, giập Vây hết nước để không còn git nước trên lá Cân khối lượng lá tươi Xay lá cho nhuyễn, ép lấy dịch, bỏ bã
Lọc, lấy dịch lọc Sấy đông khô dịch lọc được bột đông khô lá lược vàng Bảo quản bột đông khô lá lược vàng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5" Hiệu suất thu được
cao đông khô LVL so với khối lượng dược liệu tươi là 1,72%, so với khối lượng
được liệu khô buyệt đối là 34,061
_Mẫu thử độc tnh và tác dụng dược lý của thân bô (lý hiệu LVT):
Trang 352.3 Phương pháp nghiên cứu
liệu và xác định vỀ thực vật:
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu nguyên
- Thu thập mẫu nguyên liệu: thu thập cả cây tươi Đối với lá: chọn lá đã phát triển đầy đủ, không non, không héo úa Đối với thân bồ: chọn thân bồ đã mọc đài
hơn 7 đốt,
Trang 362.3.2 Phương pháp thử độc tính cấp [4], [6], [96] _Mô tả phương pháp:
Chuột nhất trắng có trọng lượng 18-22g, khoẻ mạnh, không phân biệt
giống, được chia ngẫu nhiên thành các lô Để chuột nhịn đói 16 giờ trước khi thí nghiệm Dùng kim đầu tù cho chuột uống thuốc theo mức liều quy định cho từng
1ô, mỗi lần 0,2 — 0,4 ml /10g thể trọng, với các mức liều tăng dần Theo đõi tỉnh
trạng chung, hoạt đông by nhiên, hơ hấp và tiêu hố của chuột liên tục trong 7 ngày sau dùng thuốc Đếm số chuột chết ở từng lô để xác định liều thấp nhất gây chất
100% và liều cao nhất gây chết 0 Chuột chết được mỗ để đánh giá tổn thương
đại thể
Tính LD¿y theo phương pháp của Karber-Behrens Công thức tính: LDp= LDip - [E (4 * 2)] x lứa Trong đó: _- đ là hiệu số liều của 2 liều kế tiếp
z là số chuột chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp
n là số chuột trong 1 lô thí nghiệm
2.3.3 Phương pháp thừ độc tính bán trường điễu [17]
+ Nguyên vật liệu:
- Đông vật thí nghiêm: Thỏ trưởng thành, cả thỏ đực và thỏ cái, trọng lượng từ 1,8 — 2,2 kg, là những thỏ khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
- Mẫu thử: Cao đông khô lá lược vàng LVL và cao chiết bằng cén 50% thân
bồ lược vàng LVT
- Các bộ kít định lượng AST, ALT, ure, creatinin, protein toan phat
bilirubin toàn phần đo hãng Human cung cấp
-_ Hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin được xác định trên hóa chất do hãng
8ysmex cung cấp,
- Máy định lượng sinh hoá bán tự động 8eout — Italia - Máy phân tích máu tự động Sysmex KX 21 — Mỹ - Cân phân tích điện tử
- Các hoá chất, dụng cụ thông thường khác: cối chày sứ, Ống xông, bơm
Trang 37+ Phương pháp nghiên cứu:
Sử dụng các lô thé thi nghiệm - 1 lô đối chứng sinh lý
- Các lô thử, uống cao chiết từ lược vàng với các liều khác nhau
Mỗi ngày cho thỏ các lô thử thuốc uống thuốc và thỏ lô chứng uống nước đã đun sôi để nguội 1 lần, kéo đài 60 ngày liên tiếp Lầy máu thỏ vào các thời điểm
trước khi đủng thuốc, sau khi dùng thuốc 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và sau khi ngửng đủng thuốc 15 ngày
Các chỉ số theo dõi:
Theo dõi chúc năng gam:
+ Định lượng AST và ALT trong máu theo phương pháp Reitman— Frankel
dùng cơ chat L- Aspartat va L — Alanine
+ Định lượng protein toàn phần trong máu bằng phương pháp Biuret
+ Định lượng bilirubin trong máu bằng phương pháp so màu Theo dõi chức năng thận:
+ Định lượng creatinin trong máu bằng phương pháp Jaffe
+ Định lượng ure trong máu bằng phương pháp Rappoport dùng men urease
Theo dõi chúc năng tạo máu:
+ Đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu và xác định huyết sắc tổ trên máy phân tích máu tự đông
Xét nghiệm mô học
+ Cất và đọc tiêu bản gan, thận sau khi dùng thuốc 60 ngày và sau khi ngừng dùng thuốc 15 ngày
+ Đơn vị thực hiện: Bộ môn giải phẫu bệnh - Trường Đại học Ÿ Hà Nội Đánh giá kết quả thí nghiệm
So sánh sự thay đổi của các chỉ số sinh hoá và huyết học cũng như mô bệnh
học của thỏ trước khi đủng thuốc với sau khi dùng thuốc 15 ngày, 30 ngày, 60
Trang 38+ Mô tả thí nghiệm:
Thỏ mới nhập về được nuôi tại nhà chăn nuôi 1 tuần trước khi thí nghiệm để thỏ thích nghỉ với điều kiện sống mới, đồng thời để loại bỏ những thỏ yếu không đạt tiêu chuẩn thí nghiêm
Chia thỏ ngẫu nhiên thành các lô: 1 lô đối chứng và các lô thử thuốc (mỗi lô 10 cơn)
Lô 1: Lô uống LVL liều 0,1g cao khô kg thể trọng chuột Lô 2: Lô uống LVL liều 0,3g cao khô /kg thể trọng chuột Lô 3: Lô uống LỰL liều 1,0g cao khô /kg thể trọng chuột Lô 4: Lô uống LỰT liều 0,02 g cao khô/kg thể trọng chuột Lô 5: Lô uếng LỰT liều 0,06 g cao khô/kg thể trọng chuột Lô 6: Lô uống LỰT liều 0,2 g cao khô/kg thể trọng chuột
Lê 7: Lô đối chứng sinh lý
Các lô thỏ trên được uống với cùng thể tích 1a 5 ml/kg thé trong Lấy máu thỏ theo đường tĩnh mạch tai và phân tích máu để có các chỉ số sinh hoá và huyết học vào các thời điểm sau
- Lần 1: trước khi thí nghiệm
- Lần 2: sau khi uống thuốc 15 ngày - Lần 3: sau khi uống thuốc 30 ngày - Lần 4: sau khi uống thuốc 60 ngày
- Lần 5: sau khi ngừng uống thuốc 15 ngày
Sau 60 ngay uống thuốc: Lấy ngẫu nhiên mỗi lỗ 2-3 cơn thỏ để làm xét nghiêm
mô học của gan và thận
Trước khi huỷ thỏ kết thúc thí nghiệm, lấy ngẫu nhiên mỗi lô 2-3 con để làm xét nghiêm mô học của gan và thận
2.3.4 Phương pháp thử tác đụng kháng khuẩn [17]
Tác dụng kháng khuẩn được thử bằng phương pháp khuếch tán, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch
Trang 39trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn
1 Môi trường, dụng dịch pha lỗng
~ Mơi trường định lượng và môi trường tăng sinh chủng BA /)
Beef heart, infusion 500,00 g
Tryptone 10,00 g
Natri clorid 15,00 g
Thạch 15,00 g
ước cất 1000m1
pH sau khi tiệt khuẩn 7,3+ 0,2
Sau khi hấp tiệt trùng, để nguội tới 50°C, thêm 5% (w/v) máu thỏ vô trủng,
trộn đều
~ Môi trường định lượng Mueller Hinton Agar (g/D
Beef, infusion from 300,00 g Casein acid hydrolysate 17,50 g
Starch 1,50 g
Thạch 17,00 g
Nước cất 1000m1
pH sau khi tiệt khuẩn 7,3+ 0,2
- Môi trường tăng sinh vi khuẩn Plate Count Agar (g/l) Cao nắm men 2,50 Casein enzymic hydrolysate 5,00 Dextrose 1,00 Thach 15,00 ước cất 1000m1 pH sau khi tiệt khuẩn 7,0% 0,2 - Dung địch đêm pH 8,0
Dung dich kali dihydrophosphat 1M 50,0ml Dung dich natri hydroxyd 1M 46,8ml
Nước cất vừa đủ 1000ml
2 Chẳng chỉ thị:
Trang 40Sau khi thăm đò các nềng độ khác nhau của mẫu nghiên cứu, chúng tôi chọn được ra những nồng độ thích hợp để tiền hành nghiên cứu như sau Chủng Nồng độ chuẩn Nồng độ thử Streptococcus pneumoniae 81, 82, $3, 84, 85 T3, P4 Klebsiella pneumoniae 82, 83, $4, 85, 86 TI,PI Haemophilus influenza 85, 86, S7, 88, 89 T4, P4 Staphylococcus aureus 81, 82, $3, 84, 85 T1,P2 Pseudomonas aeruginosa 85, 86, 88, 89, $10 T1,P1 Xử lý kết quả:
Sau khi đo đường kính vòng vô khuẩn, xây dựng đường đáp ứng của gentamycin sulfat với từng chủng vi sinh vật:
y =alg8 +b Trong đó
y: đường kính vòng vô khuẩn đnm) §: ndng dé khang sinh (U/ml) a: hệ số góc
behing ss
Từ đó tính được hoạt lực kháng khuẩn của dich chiét so véi gentamycin
2.3.5 Phương pháp thử tác đụng chỖng viÊm man
Tác dụng chống viêm mạn được thử trên mô hình gây u hạt thực nghiệm
bằng amian [17], [30]
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột cống trắng trưởng thành Chuột mới mua về được nuôi tại nhà chăn nuôi của Khoa ít nhất 3 ngày để chuột thích nghỉ với điều kiên môi trường mới
Chia chuột ngẫu nhiên thành các 16 thí nghiêm: