Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được môi trường và điều kiện tối ưu giữ chủng liên cầu nói chung và chủng liên cẩu nhóm A chuẩn C203S sử dụng trong sản guất kháng nguyên streptolysin O, đó
Trang 1BOY TE BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO TÊN ĐỂ TÀI : NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN _ STREPTOLYSIN O, SỬ DỤNG TRONG CHAN DOAN THAP TIM VA VIEM CAU THAN CAP GO TRE EM
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS, NGUYEN THETUYEN
GS.TSKH NGUYEN VAN DIP
CO QUAN CHU TRI ĐỀ TÀI : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CAP QUAN LY BOY TE
THO! GIAN THUC HIEN : TU THANG 7 NAM 2001 DEN THANG 6 NAM 2004
TONG KINH PHÍ THỰC HIẾN ĐỀ TÀI: 120 TRIỆU ĐỒNG
TRONG ĐÓ: KINH PHÍ SNKH 120 TRIỆU ĐỒNG
NAM 2004
SDE
Trang 2BÁO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
1 TÊN ĐỂ TÀI: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN
STREPTOLYSIN O, SUDUNG TRONG CHAN DOAN THAPTIM
vA VIEM CAU THAN CAP O TRE EM
2, CHU NHIEM ĐỀ TÀI: Ts, NGUYEN THI TUYẾN
GS.TSKH NGUYEN VAN DỊP
3 CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
4, CƠ QUAN QUẦN LÝ ĐỀ TÀI: BỘY TẾ
5 THƯ KÝ ĐỀ TÀI: CN.NGUYÊN THỊ HẢI
6 DANH SÁCH NHŨNG NGƯỜI THỰC HIỆN CHÍNH:
- 'T§ Nguyễn Thị Tuyến, Bộ môn Vị sinh Y học,
Trường Đại học Y Hà Nộ
- GS.TSKH.Nguyén Van Dip, Vu Khoa hoc va Dao tao, B6 ¥ t€ - PGS.TS.Lé Huy Chính, Bộ môn Vi sinh Y hoc,
Trường Đại học Y Hà Nội
- CN Nguyén Thi Hai, Bé mén Visinh Y hoc, Trường Đại học Y Hà Nội
- KTV.Nguyén Thị Phong, Bộ môn Vi sinh Y hoc, Trường Đại học Y Hà Nội
CN.Phan Duy Hưng, Bộ môn Ví sinh Y hoc, Trường Đại học Y Hà Nội
7 THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỂ TÀI: TỪTHÁNG 7 NĂM 2001 DEN THANG 6
NĂM 2004
Trang 3DANH MUC CAC CHU VIET TAT
-ASLO, ASO: Anti streptolysin O
Trang 4MỤC LỤC
NỘI DUNG
PHẨN A : Tóm tắt kết quả nổi bật của để tài
PHAN B : Noi dung báo cáo chỉ tiết kết quả nghiên cứn 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 TONG QUAN 2.1 Liên cầu nhóm A 2.1.2 Kha nang gay bệnh của liên cầu nhóm A 2.1.3 Độc tố streptolysin O 2.2 Phân ứng ASLO
2.3 Tình hình sản xuất kháng nguyên streptolysin O trên thế giới và Việt Nam
3 ĐỐI TƯỜNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
cou
3.1 Đối tượng
3.2 Vật liệu
3.3 Phương pháp nghiên cứu
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1 Kết quả nghiên cứu các điều kiện giữ chủng liên cầu
nhóm A C2038
4.2 Kết quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O
4.3 Nghiên cứu hiệu quả sản xuất kháng nguyên
streptolysin O trên các môi trường khác nhau
5 BAN LUAN
5.1 Bần luận về các điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A
Trang 5PHAN A
TOM TAT KET QUA NOI BAT CUA DE TAL
LKET QUA NOL BAT CUA DE TAL
a.Dong góp mới của đề tài:
*Đóng góp thứ nhất là: lưu giữ chủng liên cầu nhóm A trong môi trường
'BHI và huyết thanh ngựa với thời gian dài hơn các phương pháp hiện dang
sử dụng
Liên cầu nhóm A cũng giống như một số vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp
khác rất dễ chết khi ra khỏi cơ thể Trong bệnh phẩm liên cầu nhóm A chỉ tồn tại
trong vòng 3 giờ Trong môi trường nuôi cấy thích hợp liên cầu nhóm A cũng chỉ tồn tại được 48 giờ Để án lưu giữ nguồn gen vi sinh vật y học, giữ trong môi trường BHIglyxerol 20% ở
u kiện - 70°C cũng chỉ giữ được 1-2 tháng
Xuất phát từ mục tiêu của để tài: sân xuất kháng nguyên streptolysin O, đo đó
vấn để đặt ra là: làm thế nào để giữ được chủng chuẩn phục vụ cho sản xuất
kháng nguyên streptolysin O? Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được môi trường và
điều kiện tối ưu giữ chủng liên cầu nói chung và chủng liên cẩu nhóm A chuẩn
C203S sử dụng trong sản guất kháng nguyên streptolysin O, đó là môi trường
BHI và huyết thanh ngựa( tỷ lệ huyết thanh ngựa 50% với môi trường) ở điều kiện bảo quản -70°C Kết quả theo đối của để tài đã cho thấy:chủng liên cầu
nhóm A C203S đã được lưu giữ ở điều kiên trên từ tháng 4 năm 2000 đến tháng
6 năm 2004 vẫn sống và không có sự thay đổi vẻ đặc điểm sinh học Đây là một
vấn đề mới, đáp ứng như cầu giữ chủng liên cầu nhóm A phục vụ sản xuất Kháng
nguyên streptolysin Ó nói riêng và giữ chủng liên cầu nhóm Á trong đẻ án lưu
Trang 6*Đóng góp thứ hai là: đưa ra được các bước cụ thể hoá quy trình và áp đụng sẵn xuất thành công kháng nguyên streptolysin O dưới đạng lồng ở Việt Nam
Hiện nay nhu cầu sử dụng phản ứng ASLO trong chẩn đoán rất lớn Việc sản xuất kháng nguyên streptolysin Q và đưa ra được các bước cụ thể hoá quy trình để các cơ sở có điều kiện ứng dụng sản xuất thay thế kháng nguyên strcptolysin
O nhập ngoại với giá thành cao là một nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn
b.Sản phẩm cụ thể:
-Đưa ra công thức môi trường BHI huyết thanh ngựa 50% và các điều kiện tối ưu sử dụng giữ chủng liên cầu nhóm A
-Đưa ra được các bước cụ thể hoá và các điều kiện tối ưu trong quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin Ơ do TCYT thế giới khuyến cáo
-Ấp dụng quy trình đã được cụ thể hoá với các điều kiện tối ưu, sản xuất thành công kháng nguyên streptolysin O với hiệu giá 1;16 đã được Trung tâm Kiểm
định Vacxin và các Chế phẩm sinh học Quốc Gia ghí nhận kết quả
rast
quả về kinh tế:
-Hiện nay các bệnh viện tuyến Trung ương và một số cơ sở phòng thấp vẫn sử dụng kháng nguyên streptolysin O của nước ngoài với giá thành cao: sản phẩm của Mỹ, Pháp giá 42.000 đông/I mẫu xét nghiệm, sản phẩm Humatex ASO của Đức chỉ bán định lượng được nồng độ kháng thể kháng streptolysin O là 200 đơn vị, giá thành cũng 10.000 đồng/ 1 mẫu xét nghiệm Kháng nguyên streptolysin O
chúng tôi sản xuất giá chỉ khoảng 500-3000 đồng/ 1 mẫu xét nghiệm tuỳ thuộc sử
dụng môi trường tổng hợp hay mới trường tự điếu chế d.Hiệu quả về xã hội:
Hiện nay thấp tìm là một trong những bệnh tim mắc phải thường gặp ở lứa
tuổi học sinh và cũng là một trong những nguyên nhân gây bệnh tìm mạch dẫn
đến tử vong phổ biến nhất ở lứa tuổi dưới 40, Hậu quả nặng nể này không những
Trang 7thành công kháng nguyên streptolysin O dé cung cấp cho nhu cầu chẩn đoán,
cũng như phòng thấp cấp, nhằm làm giảm tỷ lệ mắc thấp tim và bệnh tim đo thấp,
cũng như giảm viêm cầu thân cấp ở trẻ em trong tương lai là một việc làm rất có ý nghĩa thực tiễn
2,BÁNH GIÁ VIỆC THỰC HIỆN ĐỂ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỂ CƯƠNG NGHIÊN
CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT:
a Tiến độ: Để tài dự kiến tiến hành từ tháng 7/2001, nhưng mãi tới tháng 5
nam 2002 mới hoàn thiện việc phê duyệt đề cương và cuối năm 2002 mới
được cấp Kinh phí Song chúng tôi đã cố gắng vay mượn các để tài khác
như (để án lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật Y học) để tiến hành để tài và
hoàn thành đúng thời gian dự kiến trong bản để cương (tháng 6/2004)
b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu để ra: Kết quả của đề tài đã đáp ứng đây đủ yêu cầu của mục tiêu để ra Chúng tôi đã nghiền cứu đưa ra được
các bước cụ thể hoá và các điều kiện tối ưu trong quy trình khuyến cáo của
TCYTIG Ap dụng quy trình, sản xuất thành công kháng nguyên streptolysin O Sản phẩm đã được Trung tâm Kiểm định vacxin và các chế
phẩm sinh học Quốc gia kiểm định hiệu giá kháng nguyên đạt 1:16 cao
hơn so với mức quy định cần đạt trong quy trình khuyến cáo(1:8)
Ngoài ra chúng tỏi đã nghiên cứu sản xuất kháng nguyên treptolysin O
từ môi trường tự điểu chế từ những nguyên liệu trong nước(theo khuyến cáo của Kalbak ), thay thế môi trường tổng hợp Todd- Hewith và BHI giá thành đất hon Day là một khuyến cáo có giá trị về kinh tế để các cơ sở sắn
xuất kháng nguyên streptolysin O sau này tham khảo áp đụng, giúp hạ giá thành sẵn phẩm khi sản xuất hàng loạt
c Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Trang 8-Kinh phí của để tài chỉ đủ chỉ trả thuê khoán nhân cơng ngồi giờ và
ngun vật liệu tiêu hao, kiểm định sản phẩm, mua 2 phéu lọc và máy hút
Trang 9PHAN
NOI DUNG BAO CAO CHI TIET
KET QUA NGHIEN CUU
1.ĐẶT VẤN ĐỀ:
Tiện nay thấp tìm và viêm cầu thận cấp vẫn là hai bệnh thường gặp ở trẻ em
đặc biệt lứa tuổi học sinh(1,301 Để làm giảm tỷ lệ mắc, việc xác định yếu tố
nguyên nhân là rất quan trọng Mối liên quan giữa nhiễm liên cẩu nhóm A ở
đường hô hấp trên và sự xuất hiện bệnh thấp tìm và viêm cầu thận cấp ở trẻ em
sau đó đã được nhiều tác gid dé cap va ching minh một cách rõ
ràng[1,3,4,/23,25,301 Dịch tễ học của bệnh thấp tim và bệnh tim đo thấp liên
quan chặt chẽ với dịch tế học của nhiễm liên cầu nhóm A ở họng[1,21,23] Thấp
tim và viêm cầu thận cấp thường xảy ra sau viêm họng đo liên cầu nhóm A từ 2-3
tuần, tương đương với giai đoạn tìm thấy kháng thể chống liên cầu táng cao trong
máu Song liên cầu nhóm A gây bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp theo cơ chế
nào vẫn còn là vấn đề tiep tục nghiên cứu Tuy nhiên cơ chế tự miễn đã được nhiều tác giả để cập đến Các tác giả cho rằng: có sự phản ứng chéo giữa các kháng thể chống kháng kháng thể chống kháng nguyên protein M phân ứng chéo với các tổ chức của cơ tim và một số tổ chức
nguyên của liên cầu nhóm A với các tổ chức của ngư
liên kết khác, giữa kháng thể chống kháng nguyên carbohydrare phản ứng chéo véi thanh phdn glycoprotein cia van tim[6,24,30} Khing thể chống kháng
nguyén glycoprotein cla mang tế bào với thành phần glycoprotein của màng đáy cầu thận vv [6]
Vi vay, trong tiêu chuẩn chấn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ngoài tiêu
Trang 10kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng streptolysin O bằng phản ứng ASLO là kỹ thuật đơn giản và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong chẩn đoán gián tiếp
tiên cầu nhóm A ở Việt Nam cũng như trên thế giới
Hiện nay ở Việt Nam, phản ứng ASLO được sử dụng ở hầu hết các phòng xét nghiệm ở các bệnh viện tuyến trung ương và một số bệnh viện tuyến tỉnh Ngoài
ra còn sử dụng trong chương trình phòng chống bệnh thấp tìm Vì vậy, nhu cầu sử
đụng kháng nguyên streptolysin © là rất lớn Song cho tới nay ở Việt Nam van
chưa có cơ quan nào nghiên cứu thành công sản xuất kháng nguyên streptolysin O Đo đó các phòng xết nghiệm vẫn phải mưa kháng nguyên của nước ngoài với giá thành cao Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứa
sản xuất kháng nguyên streptolysin O, sử dựng trong phản ứng ASLO để chẩn
đoán thấp tìm và viêm cầu thận cấp ở trẻ em với các mục tiêu sau:
1-Nghiên cứu các điều kiện giữ chủng chuẩn liên cầu nhóm A: C2038
2-Nghiên cứu cụ thể hoá vẻ mặt kỹ thuật của từng bước trọng quy trình sản xuất
Trang 11
2.TONG QUAN
2.1.Liên cầu nhóm A:
2.1.1.Khả năng gây bệnh:
Liên cầu có khả năng gây ra nhiều bệnh ở người, đặc biệt là liền câu nhóm
A Khả năng gây bệnh phụ thuộc vào đường xâm nhập, tình trạng của cơ thể và
các nhóm liên cầu khác nhau, thạm chí phụ thuộc vào các typ huyết thanh khác
nhau trong nhóm Liên cầu nhóm A gây ra các thể bệnh sau:
*Nhiễm khuẩn tại chỗ : Viêm họng, chốc lở, mụn nhọt ngoài da, viêm quảng ở người lớn, nhiễm khuẩn các vết thương, viêm tai giữa, viêm hạch, viêm phối,
nhiễm trùng tử cung sau đề, vwv
Cơ chế gây bệnh của các thể bệnh này đã được hiểu một cách rõ ràng Những
yếu tố giúp cho quá tình lan toả của liên cầu và yếu tố kháng đại thực bào giữ vai trò quan trọng trong bệnh lý Một trong các yếu tố chủ yếu đó là acid hyaluronic
của vỗ và protein M,
*Ñhiễm khuẩn thứ phát: từ những ổ nhiễm khuẩn tại chỗ, bệnh nhân có thể bị
nhiễm khuẩn huyết, viêm măng trong tìm cấp
*Bệnh tình hồng nhiệt:bệnh thường gấp ở trẻ cm trên hai tuổi ở các nước ôn đới
*Bệnh viêm cầu thân cấp san nhiễm liên cầu nhóm A:
Hiện nay liên câu nhóm A có tới trên 130 typ huyết thanh, nhưng căn nguyên
gây viêm cầu thận cấp ở trẻ em thường gap typ 4, 2, 12, 55, 57, 59, 60, 61[29]
Bệnh thường xuất hiện sau khi nhiễm liên cầu nhóm A ở họng hoặc ở da hai đến ba tuần
*Bệnh thấp tim:
Thường gặp typ 1,3,5,6,14,18,19,24, [29] Bệnh thường xuất hiện sau nhiễm
liên cầu nhóm A ở họng hai đến ba tuần
Trang 12các tác giả đều giải thích là cơ chế tự miễn Các tác giả đẻu cho rằng: có sự phản ứng chéo giữa các kháng thể chống các kháng nguyên của liên cầu nhóm A
(kháng thể chống kháng nguyên protein M của liên câu nhóm A) với kháng
nguyên tổ chức của cơ tim và một số tổ chức liên kết khác[7] Giữa kháng thể
chống kháng nguyên vách của liên cầu nhóm A(carbohydrate) với thành phần glycoprotein cha van tim[6,8,9[ như bảng sau:
Bảng2.1: phản ứng chéo giữa các kháng thể chống các kháng nguyên của
liên cầu nhóm A với các tổ chức của ngươi
| Ị
[Kháng thể chống các thành ` 'Tổ chức của người | Tàiliệu
phần kháng nguyên của bị phản ứng chéo tham khảo liên cầu nhóm A | Chống KN polinM ˆ ˆˆ lCgum (6,7,16,19,35) Ị | bào Chong KN glycoprotein cia ma Glycoprotein ola mang day cau | (6] ‘Than polysaccharide | Chống KN của màng tế bào KN tổ chức † 161
Chong KN polysaccharide Glycoprotein cla van tim (68.9, 22]
Í Chống KĐ lyaluonie ¡ iuiyNilfoik pein, (él
Vì vậy, xá
định hiệu giá kháng thể kháng streptolysin O, là một trong những
bằng chứng khẳng định nhiễm liên cầu nhóm A trước đồ trong tiêu chuẩn chẩn
đoán thấp tìm và viêm cầu thận c:
2.1.2.Độc tố streptolysin Ơ :
ấp ở trẻ em
Streptolysin O là một trong số các ngoại độc tố của liên cầu nhóm A Độc tố
này là một kháng nguyên mạnh, có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể( anttreptolysin O) Ngoài ra, độc tố còn mang tất cả các tính chất của một
Trang 13và khi tiêm vào tĩnh mạch động vật thực nghiệm đã xác định được sự lắng đọng
dưới nội tâm mạc và đay cũng là một trong những giả thuyết giải thích về cơ chế
gây bệnh thấp tim
Streplolysin O có khả năng làm tan máu mạnh, nhưng lại
ất hoạt bởi oxy, vì vậy trên môi trường thạch máu, streptolysin Q gây tan máu sâu trong thạch
Đây là một khó khăn khi sản xuất Kháng nguyên streptolysin O, trong quá trình
sản xuất và bảo quản phải chống được sự oxy hoá để giữ én định hiệu giá kháng nguyên Đông thời cũng là một lưu ý khi tiến bành phản ứng ASLO, phải chú ý phân phối kháng nguyên streptolysin O vào phản ứng ngay sau khi pha, nếu
không, kháng nguyên sẽ bị mất hiệu giá do bị oxy hoá
Nguyên lý của phản ứng ASLO được dựa trên tính chất gây tan máu mạnh của độc tố streptolysin O, phản ứng được sử dụng trong chẩn đoán bệnh thấp tìm và
viêm cẩu thận cấp ở trẻ em Tính chất gây tan mầu có thể bị bất hoạt bởi
cholesterol, song mức cholesterol trong máu không ảnh hưởng tới tính chất
này Tuy nhiên, khi tiến hành phản ứng ASLO cần lưu ý: nếu mẫu huyết thanh bệnh nhân trong quá trình bảo quản để tiến hành phản ứng không dam bio vô
khuẩn, vi khuẩn nhiễm trong mẫu huyết thanh sẽ sản xuất ra enzym esteraza
Enzym này có tác đụng este hoá cholesterol ester trong huyết thanh trở thành
cholesterol tự do và gắn với kháng nguyên sữeptoiysin O sử dụng trong phản ứng, ASLO, lam biến đổi tính kháng nguyên của streptolysin O ngăn cản quá trình
làm ly giải hồng cầu của kháng nguyên sreptolysin O, dẫn đến dương tính giả
Điều này cũng lý giải phần nào nhiễm liên cầu nhóm A ở da thường có hiệu giá kháng thể kháng streptolysin O thấp hơn nhiễm liên cầu nhóm A ở họng, do độc
tổ streptolysin bị ức chế bởi tipid ở đa [25]
2.2.Phản ứng ASLO :
Mục đích: Phát hiện kháng thể chống kháng nguyên streptolysin O (ASLO:
Trang 14nhiễm liên cầu nhóm A trước đó, trong chẩn đoán bệnh thấp tìm và viêm cầu than cấp ở trẻ em
Đây là phản ứng huyết thanh học được sử dụng đầu tiên trong xác định kháng
thể của liên cầu nhóm A [25,30,31].Kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng
streptolysin O bằng phản ứng ASLO là kỹ thuật đơn giản và được sử dụng phổ
biến nhất hiện nay ở Việt Nam cững như trên thế giới để khẳng định bằng chứng
nhiễm liên cầu nhóm A trong tiêu chuẩn chẩn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em[6,29,32]
Phương pháp này được triển khai theo nhiều quy trình khác nhau rất phù hợp
với trang thiết bị của từng phòng xét nghiệm như:
-Quy trình Humatex ASO của Đức: sử dụng hạt latex gấn kháng nguyên
streptolysin O trên lam kính để định tính và bán định lượng kháng thể kháng
strcptolysin O trong huyết thanh khơng pha lỗng Phản ứng đương tính khi nhìn
thấy rõ rằng hạt ngưng kết tương đương với nồng độ kháng thể kháng streptolysin © trong huyết thanh không pha loãng là 200 đơn vị trong Lml huyết thanh
-Quy trình Macrotiter đo bằng quang phổ kế và Macrotiter không sử đụng quang
phổ kế của Tổ chức Y tế Thế giới
-Quy trình Macrotiter của Tổ chức Y tế Thế giới đã được Rautz và Randall cải
tiến
-Quy trình Microtiter của Tổ chức Y tế Thế giới
Tất cả các quy trình khuyến cáo của Tổ chức Y Tế Thế giới đều dựa trên
nguyên lý sau:
Nguyên lý: Kháng thể kháng streptolysin O có kha nang trung hồ độc tố
streptolysin ©, lam cho độc tố này không còn khả năng làm tan hồng cầu trong
phản ứng,
Các quy trình này đều định lượng dược nỗng độ kháng thể kháng streptolysin
© trong huyết thanh {21,25,29,32]
Trang 15Đánh giá kết quả phản ứng ASLO: Do có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu giá
kháng thể kháng streptolysin O: như lứa tuổi, mật độ dân cư, vị trí nơi nhiễm
khuẩn vv vì vậy kết quả phản ứng ASLO ở mức giới hạn bình thường hay giới hạn bất thường ở mỗi vùng địa lý, ở các nước, có sự khác nhau Theo Rautz và
Randall hiệu giá kháng thể kháng streptolysin Õ từ 200 đơn vị Todd trở lên là bất thường{32] Theo Hội tm mạch Mỹ (1992) hiệu giá kháng thé kháng streptolysin
O ở trẻ em từ 333 đơn vị Todd trở lên và ở người lớn từ 250 todd trở lên là bất
thường [28,32]
Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đưa ra hiệu giá kháng thể kháng streptolysin
Oở giới hạn bình thường va bất thường đại diện cho cả nước, mà chỉ có giới hạn
bất thường của trẻ em 5-15 tuổi ở Hà Nội là từ 240 đơn vị Tođd trở lên [2]
2.3:Tinh hình sản xuất kháng nguyên sfrepfolysin Ở trên thế giới và Việt
Nam
2.3.1.Tình hình sản xuất kháng nguyên strepfolysin O trên thế giới:
Phân ứng ASLO trong chẩn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em được
sử dụng phổ biến ở tất cả các nước trên thế giới Vì vậy nhu câu sử dụng kháng nguyên streptolysin O là rất lớn, do đó một số nước trên thế giới đã nghiên cứu
sẵn xuất thành công kháng nguyên streptolysin O
Các nước sẵn xuất kháng nguyên streptolysin Ò theo quy trình khuyến cáo của “Tổ chức Y tế Thế giới (quy trình chúng tôi sử đựng trong nghiên cứu này) như: Mỹ, Pháp, Thuy Điển Sản phẩm kháng nguyên streptolysin O được bảo quản
đưới đạng đông khô Hiện nay chương trình phòng chống thấp tim và một số
bệnh viện tuyến trung ương ở nước ta vẫn phải mua kháng nguyên dưới dạng
đông khô này với giá thành tương đối cao để sử dụng trong chẩn đoán
Tại Trung tâm Kiểm định liên cầu Quốc gia Thái Lan cũng đã nghiên cứu sản
xuất kháng nguyên streptolysin O theo quy trình khuyến cáo của Tổ chức Y tế
Thế giới dưới dạng lỏng tương tự như sản phẩm chúng tôi nghiên cứu sản xuất trong để tài này
Trang 16Kháng nguyên streptolysin O của các nước này sản xuất đều tổn tại ở trạng
thái phân tử, vì vậy bán chất của phản ứng ASLO khi sử dụng các sản phẩm trên
là phản ứng trung hoà độc tố, Ưu điểm của phản ứng ASLO khí sử dụng các sản
phẩm trên là định lượng được hiệu giá kháng thể Kháng streptolysin Ó trong
huyết thanh bệnh nhân
Hãng Human của Đức sản xuất bộ kid có tên Humatex ASO: mục đích của
sản phẩm này cũng sử đụng trong phái hiện kháng thể kháng streptolysinO trong
huyết thanh bệnh nhân Bản chất của phản ứng ASLO khi sử dụng sản phẩm này
là phân ứng ngưng kết gián tiếp Kháng nguyên streptolysin O ở dạng phân từ
được gắn trên nên mượn là hạt latex, vì vậy khi kháng nguyên strepIolysin O kết hợp với kháng thể kháng streptolysin O trong huyết thanh bệnh nhân „ kết quả sẽ
tạo nên các hạt ngưng kết mắt thường có thể quan sát được Hạn chế của phản
ứng ASLO khi sử dụng sản phẩm này là: bộ kid đã được tiêu chuẩn hoá để chỉ
phát hiện được nổng độ kháng thể kháng steptolysin O bằng 200 đơn vị trong 1
ml huyết thanh bệnh nhân, không định lượng được nồng độ kháng thể nhỏ hơn
hoặc lớn hơn 200 don vi trong 1ml huyết thanh
Sản phẩm này hiện nay cũng đã được một số bênh viện đa Khoa ở nước ta sử
dụng
2.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước:
Ở nước ta, phản ứng ASLO vẫn được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các phòng xét
nghiệm ở các bệnh viện tuyến trung ương và mội số bệnh viện tuyến tỉnh đặc biệt
sử dụng trong chương trình phòng chống thấp tìm Vì vậy nhu cầu sử dụng kháng
nguyên streptolysin Q là rất lớn Song cho tới nay ở Việt Nam vẫn chưa có cơ
quan nào nghiên cứu sản xuất thành công kháng nguyên streptolysin O Xuất
phát từ nhu câu thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm cụ thể hoá từng
bước trong quy trình khuyến cáo của TCYT Thế giới năm 1983 và khuyến cáo lại
năm 1996, với hy vọng sẽ áp đụng được quy trình để sản xuất kháng nguyên
Trang 17streptolysin O đưới dạng lỏng với giá thành rẻ hơn nhiều những sản phẩm hiện
đang sử dụng
Trang 183 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PH
NGHIÊN CỨU
3.1.Đối tượng nghiên cứu:
-Quy trình giữ chúng liên cầu nhóm A
-Quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O
3.2.Vật liệu:
3.2.1.Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
-Thạch máu cơ sở (blood agar base) sản phẩm của hãng Dijco laboratories
Detroir Michigan U.S.A
-Môi truéng BHI (Brain Heart Infusion broth)
-Môi trường Todd- Hewith broth
cita hng: Sanofi diagnostics Pasteur
-Mỗi trường Kalbak broth tự sản xuất theo công thức và quy trình của Tổ chức Y
tế thế giới khuyến cáo năm 1983
3.2 Các sinh phẩm và hoá chất khác:
-Kháng thể kháng streptolysin O (ASO) đông khô của Mỹ( Difco laboratories
Detroir Michigan U.S.A) °
-Hoá chất pha dém PBS ( phosphate buffer salin):
+Sodium dihydrogen phosphate
Trang 193.2.3.Chủng chuẩn quốc tế sắn xuất kháng nguyên streptolysin O:
-Chủng liên cầu nhóm A : C2035 Do Trung tam Kiểm định liên cầu Quốc gia
"Thái Lan cung cấp
3.2.4.Dụng cụ nghiên cứu:
-Ong nghiệm
-Pipet
~Tủ ấm 37°C
-Nồi cách thuỷ(Water- baths) 37 °C - 56°C
-Ly tâm thường, ly tâm lạnh
-Phếu lọc seitz và máy hút chân không, giấy lọc seitz đều của hãng( Pall Gelman
Laboratory) của Mỹ
-Các dụng cụ khác
3.3.Phương pháp nghiên cứu:
3.3.1.Phương pháp giữ chủng mẫu liên cầu nhóm A C203S:
Phương pháp chúng tôi thử nghiệm trên môi trường BHI huyết thanh ngựa so sánh với các phương pháp hiện đang lưu gi như:
*Giữ trên môi trường thạch máu:{32]
+Liên cầu nhóm A C2038 được cấy trên môi trường thạch máu
+ Ủ ấm ở 37°C 18-24 giờ
+Bảo quản ở 4°C
#Giữ trên môi trường BHI glycerol 20%(quy trình giữ chủng của TCYT Thế giới [25], hiện nay để án lưu giữ nguồn gen Vì sinh vật Y học, Bộ môn Vì Sinh Y học, Trường đai học Y Hà Nội đang áp dụng)
+Nuôi cấy chủng chuẩn C203S trên môi trường thạch máu
+ Ủ ấm ở 37°C 18-24 giờ
+Gật vi khuẩn từ môi trường thạch máu chuyển sang môi trường BHI va glycerol
Trang 20
+Bao quan ở -20 °C và ở -70°C
*Giữ dưới dạng đông khô.(quy trình đông khô chủng của để án lưu giữ nguồn
gen Ví sinh vật Y học, Bộ môn Vì sinh Y học, Trường đai học Ý Hà Nội) +Nuôi cấy chủng chuẩn C203 trên môi trường thạch máu
+ Ủ ấm ở 37°C /18-24 giờ
+Gặt vì khuẩn từ môi trường thạch máu chuyển sang môi trường BHI
+Đông khô
3.3.2.Phương pháp tách chiết kháng nguyên sfreptolysin O
3.3.2.1.Quy trình sản xuất kháng nguyên sireptolysin O của TCYT Thế giới
nam 1983, 1996.[25, 32].(nguyên bản trong phần phụ lục)
-Ủ1 lít môi trường Kalbak hoặc Todd-Hewith với 5ml môi trường nuôi cấy chủng liên cầu nhóm A C203S được Š giờ
-Ủ ấm ở 37°C /18-24giờ
Kiểm tra sơ bộ hiệu giá tan hồng cầu của sản phẩm streptolysin O theo quy trình
sau:
+Lấy 5ml sản phẩm, ly tâm 1500 vòng/L phút trong 30 phút
+Hút 1ml địch phía trên cộng với 0,014g NazS:0: lắc trôn đều
+Lấy 0,5 mi hỗn dịch trên pha loãng bậc 2 với đêm PBS + albumin tới độ pha loang 1:64 +Bổ sung thêm 1ml đệm PBS+albumin vào các ống phản ứng tương ứng với các nồng độ pha loãng +Bổ sung 0,5ml hồng cầu cừu hoặc hồng câu thỏ 5% vào mỗi ống của phản ứng, +Lắc trộn nhẹ phản ứng, ủ 37°C/1 giờ, đọc kết quả
+Hiệu giá kháng nguyên SO được đọc ở hiệu giá có độ pha loãng kháng nguyên
cao nhất mà vẫn còn gây tan hồng cầu hoàn toàn
+Trong quy trình khuyến cáo, sản phẩm tách chiết kháng nguyên streptolysin O
đạt yêu cầu khi gây tan hồng cầu hoàn toàn ở độ pha loãng ít nhất 1:8
Trang 21- Lọc vô trùng bằng lọc seitz
- Dịch lọc được bổ sung thêm methiolate với tỷ lệ 1/10.000 hoặc sodium azide 0,02%, bảo quản ở 49C, sau 1 tháng chuẩn độ kháng nguyên streptolysin O (Streptolysin S nếu có mặt sẽ bị bất hoạt trong thời gian này) SIreptolysin O giữ được hiệu giá nhiều năm khi bảo quản đúng ở 4°C
3.3.2.2.Phương pháp sản xuất kháng nguyên strepfolysin © theo quy trình
của TCYT Thế giới 1983, 1996 nhưng đã được chúng tôi nghiên cứu cụ thể
hoá từng bước:
*Bước 1: Ú 1 lít môi trường Kalbak hoặc Todd-Hewith với 5ml môi trường nuôi cấy chủng liên cầu nhóm A C203S được 8 giờ Được nghiên cứu cụ thể hoá như
sau:
-Nghiên cứu các điêu kiện tối ưu khi chuyển chủng từ môi trường bảo quản sang
môi trường thạch máu
-Nghiên cứu các hình thức cấy chuyển chủng từ môi trường thạch máu sang môi
trường tách chiết kháng nguyên streptolysin O
-So sánh kết quả tách chiết kháng nguyên streptoly sin O trên các môi trường khác
nhau nhằm dựa ra môi trường tách chiết hiệu quả và rẻ nhất
*Bước 2: -Kiểm tra sơ bộ hiệu giá tan hồng cầu của sản phẩm streptolysin
sản xuất:
“Theo đúng quy trình khuyến cáo
*Bước 3: Lọc vò trùng bằng lọc seitz đã được cụ thể hoá như sau:
-Ly tam trước khi lọc: Số vòng/ 1 phút, thời gian ly tâm
-Loc scitz: kích thước giấy lọc, kỹ thuật lọc
*Bước 4: Dịch lọc được bổ sưng thêm methiolate với tỷ lệ 1/10.000 hoặc
sodium azide 0,02% Bảo quản ở 4°C, sau 1 tháng chuẩn độ kháng nguyên
streptolysin O (Streptolysin S nếu có mặt sẽ bị bất hoạt trong thời gian này)
~Theo đúng quy trình của TCYT Thế gị
Trang 22
*Bước 5: Kỹ thuật chuẩn độ kháng nguyên streptolysin O.( theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới 1996).32]
-Chuẩn bị các thành phản: +Đệm PBS pH 6,3-6,5
+Antistreptolysin O chuẩn pha với PBS để được nồng độ 1 đơn vị trong ml Ngay trước khí dùng bổ sung thêm soởium đitbionite với tỷ lệ 0,07%
+Hồng cầu thỏ hoặc cừu sau khi đã rửa 3 lần với dung địch đệm PBS, được pha trong đệm PBS với tỷ lệ 59 -Quy trình chuẩn độ Bảng 3.1: quy trình chuẩn độ kháng nguyên streptolysin O Sổốn Ji ]2 |3 ]4 [5S [6 [7 Js T9 Ho SOM) 105 [05 [05 [05 [05 T0 l6 OS TOS 15 PBS (mi) | 2,25 | 2,50 } 2,75 | 3.00; 3,25 | 3,50) 3,75 | 4,00 | 4,25 | 4,50) SOđã phai lofngiml) 0,5 10,5 |0,5 |9,5 |0,5 [0,5 |0 |0,5 |0,5 |9,5 [AsoO(mj[1 ee DƯ HP jỊ IHC5% [05 [0,5 los Jos Tos jos jos Tos los Tos (mal) | Độ pha 25,5 | 1:6,0} 1:6,5] 1:7,0) 1:7,5) 1:8,0) 1:8,5] 1:9,0] 1:9,5) 1:10 loãng | |
-Sau khi phân phối xong SỐ và A$O lắc trộn đều , ù ấm15 phút ở 37°C
-Cộng thêm 0,5 mÌ hồng cầu vào các ống phản ứng, lắc đều và ủ phản ứng ở 37°C trong | gid
-Ly tam 1500vòng/1 phút trong vòng 15 phút và đọc kết quả -Đọc kết quả:
Trang 23+Hiện giá kháng nguyên streptolysin Ó được xá
định ở nồng độ kháng
nguyên pha lỗng nhất mà khơng tan hồng cảu(bị trung hoà hoàn toàn bởi 1
đơn vị kháng thể ASO — ống đầu tiên không tan hồng cầu )
*Bước 6: Bảo quản kháng nguyên streptolysin Ở ở 4°C
-Đã được dé tài nghiên cứu thêm các nhiệt độ bảo quản khác để tìm ra điều
kiện bảo quản tối uu nhất
Trang 244.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1.Kết quả nghiên cứu các điều kiện giữ chủng liên cầu nhém A C2038
4.1.1.NEhiên cứu thử nghiệm giữ chủng liên cầu nhóm A C2038 trong môi
trường BHI và tỷ lệ huyết thanh ngựa khác nhau:(Nội dung này chúng tôi
nghiên cứu từ khi đăng ký để cương vì vậy đã theo đối được 4 nam),
-Cấy chủng liên cầu nhóm A C2035 trên môi trường thạch máu
-Ủ ấm ở 37°C / 18-24 giờ, (hoặc ủ ấm 37°C /18-24 giờ với 5% COz vi khuẩn
moc càng tốt hơn)
-Gật ví khuẩn: Sử dung que cấy gặt chủng liên cầu C203§ vào mơi trường
BHI + huyết thanh ngựa với nồng độ ví khuẩn khoảng ỨT vĩ khuẩn/ml môi
trường
-Phân phối huyển địch vi khuẩn vào ống giữ chủng (ống giữ chủng phải là ống
nhựa và có nút kín: có thể sử đụng ống acryotyp hoặc ống eppendobt) mỗi ống
0,5ml
~Trộn đều vi khuẩn trên máy lắc, 10 đến 15 giây
-Đật ngay môi trường vào tù lạnh sâu ~20°C và ở -70°C
-Mỗi lần cần sử dụng, lấy ra một ống, để tan bang và cấy chuyển vào mới
trường thạch máu ngay Ống chùng sau khi sử dụng, phải bỏ đi (không sử dụng lại cho lần sau)
Kết quả thử nghiệm giữ trên môi trường BHI với tỷ lệ huyết thanh ngựa
khác nhau đã thu được kết quả như sau:
Trang 25
Bảng 4.1.Kết quả nghiên cứu giữ chủng liên cầu nhớm A C203§ ở môi trường BHI với tỷ lệ huyết thanh ngựa khác nhau:
{Mơi trường BĐI và tỷi
lệ huyết thanh ngựa | Thời gian vi khuẩn quản khác nhau các điều kiện bảo { Bao quan 6 -20°C Bao quan 6 -70°C 10% HT ngua 1-2 tuần Ï2 tuân =¡ Tháng 20% HT ngựa 6 tháng 6 tháng- Ì năm
30% HT ngựa 6 tháng-] năm ` 1-2 năm |
40% HT ngựa 1-2 năm 3-4 năm ị
50% HT ngựa *Nhận xét: -Môi trường BHI với 50% huyết thanh ngua & -70°C, đã giữ được | 1-2 năm > 4 năm vẫn đang sống
chủng liên cầu nhóm A C203S từ tháng 4 năm 2000 đến thang 6 nam 2004 vi
khuẩn vẫn sống và không có sự thay đổi vẻ đặc điểm sinh vật học
4.1.2.So sánh phương pháp giữ chủng liên cầu nhóm Á C203S trên môi
trường BHI huyết thanh ngựa với các phương pháp giữ chủng khác:
Trang 26Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S ở các
môi trường và các điều kiện bảo quan khác nhau
[Ténmeitruong | ÏTĐiểumkin |Thdigianvi |
| bảo quân | khuẩn sống i tae oe oC [BHI v3 glycerol 20% — —ˆ | BEI va glyccrol 20% -TứC | Z trấn =1 thắng BHI va huyết thanh ngựa 50% Ï-20°C 1-2 năm | [eee eee Ồ xử
j BHI và huyết ụ { -70°C >4nam van đang sống
Đông khô ~ ac >4nam vẫn đang sống *Nhận xét: ~
-Trong số các môi trường giữ chủng liên cầu nhóm A C2038, méi trường BH
va 50% huyết thanh ngựa là môi trường tốt nhất
-Điều kiện bảo quản chủng tốt nhất là ở -70°C
-Vi khuẩn giữ theo phương pháp đồng khô trên 4 năm vì khuẩn vẫn sống và
không có sự thay đổi về đặc điểm sinh vật học
Tuy nhiên phương pháp bảo quản chủng chuẩn dưới dạng đông khô đòi hỏi
phải có máy đông khó, điều kiện tiến hành tốn kém hơn, vì vậy trong đề tài
này chúng tôi chỉ khuyến cáo quy trình chỉ tiết của phương pháp giữ chủng trên môi trường BHI và huyết thanh ngựa với điều kiện bảo quản ở -70°C
4.2.Kết quả sân xuất kháng nguyên streptolysin O
4.2.1.Kỹ thuật nuôi cấy chủng mắu C203$ để tách chiết kháng nguyên
streptolysin O
*Bước 1: Cấy chuyển chủng mẫu sang môi trường thạch mầu :
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã tìm ra được các điều kiện tối ưu
của bước này nhưữ sáu:
Trang 27-Khi lấy ống chủng mẫu từ tủ lạnh sâu -20°C hoặc ở -70°C, để tan băng hoàn
toàn,
-Dùng que cấy lấy vì khuẩn cấy chuyển sang môi trường thạch máu, ủ ấm ở 37
®C/18-24 giờ (nếu ở điều kiện 5% CO› vi khuẩn mọc tốt hơn)
-Nếu vi khuẩn kiểm tra thấy đã thuần nhất, cấy chuyển sang môi trường Todd- Hewith để tách kháng nguyên streptolysinO
Qua nghiên cứu chúng tôi thấy rằng: nếu từ chủng rnấu lấy ra từ điều kiện giữ chủng mà chỉ cấy ¡ kản trên môi trường thạch máu , sau đấy cấy ngay vào môi
trường nuôi cấy để tách chiết kháng nguyên thì hiệu giá kháng nguyên thu được
sẽ thấp hơn khi chúng ta cấy chuyển lần 2 vào môi trường thạch màu rồi mới
chuyển sang môi trường tách chiết kháng nguyên(môi trường bảo quản „ thạch máu —* thạch máu —* Todd-Hewith ) kết quả được minh hoa trong bang sau:
Bang 4.3.Mối liên quan giữa số lần cấy chuyển chủng trên môi trường thạch
mau với hiệu giá kháng nguyên SO
ân cỹ|[Môi [|Nhiệtđộ|Thờigan|CỔ: | Higugia KN?
chuyển | trường (chuẩn độ sơ bộ)
tant TIM 37C |I824giờ [Không [1:4
dân? [TM 3PC |1824giờ [không LI6 [lant TTM PC TSB aS [5% L4L§ lấn? |TM 32C TI2lgÐ |5% 116-132 I Ị *Bước 2: Cay chuyển chủng từ môi trường thạch máu sang môi trường Todd-Hewith:
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi đã cụ thể hoá bước này với các điều
kiện như sau:
Nếu chúng ta cấy chuyển vi khuẩn chỉ một lần từ môi trường thạch máu sang
môi trường Todd-Hewith thì hiệu giá kháng nguyên SO sẽ thấp hơn so với cấy
chuyển vào một lượng nhỏ môi trường Todd- Hewith(số lượng môi trường cấy
Trang 28chuyển lần đầu bằng khoảng xấp xỉ l/10 sơ với toàn bộ lượng môi trường cân đẻ
nuôi cấy), sau 6-8 giờ mới cấy chuyển vào toàn bộ lượng môi trường cần nuôi cấy
để tách chiết kháng nguyên
Quá trình thử nghiệm đã thu được kết quả sau:
Bảng 4.4.Mối liên quan giữa hiện giá kháng nguyên SƠ với các hình thức
cấy chuyển khác nhau: Hình thức cấy chuyển Thiệu giá kháng nguyên SƠ TM ——# “MTtrunggian —* MT cần tách chiết 1:16- 1:32 KNSO TM —— MT cẩn tách chiết KN SO 1:8 *Nhận xét: l
-Để tách chiết được một lượng lớn kháng nguyên SO, chúng ta cân cấy chuyển vị khuẩn từ môi trường thạch máu qua một lượng nhỏ môi trường(1/10 tổng môi trường tách chiết kháng nguyên) để tăng sinh vi khuẩn , sau 6-8 giờ mới cấy chuyển vào môi trường cần tách chiết kháng nguyên, sẽ thu được lượng kháng nguyên SO cao
Qua nghiên cứu chúng tôi Áã tìm ra sơ đỗ cấy chuyển tốt nhất về thoi gian
cấy chuyển cũng như lượng môi trường cẩn cấy chuyển nhu sau:
Trang 29Sơ đồ 4.1.Sơ đồ cấy chuyển chủng mẫu với lượng mi trường cần tách chiết
kháng nguyên là 250m1
Vi khuẩn đã được nuôi cấy trên môi trường thạch máu, ủ ấm ở 37°C/ (18-24 giờ)
|
Cấy chuyển vào 2 ống môi trường Todỏ-Hewith ( mỗi ống 10ml) với
nồng độ vi khuẩn tương đương LỞ vị khuẩn/Iml, ủ ấm ở 375C /6 giờ
{
Cay chuyển cả 2 ống môi trường sang bình môi trường Todd-Hewith 250ml ủ ấm môi trường ở 37°C/18-24 giờ
+
Tach khang nguyén streptolysin 0
-Néu sản xuất kháng nguyên trên một lượng môi trường lớn (1000m)), quy trình
Trang 30Sơ đồ 4.2.Sơ đồ cấy chuyển chủng mâu với lượng môi trường cần tách chiết
kháng nguyên là 1000ml
Vi khuẩn đã được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ủ ấm ở37°C /(18-24 giờ)
|
Cấy chuyển vào 2 ống môi trường Todd-Hewith ( mỗi ống 10mÌ) với nông độ vị khuẩn tương đương LƠ” vì khuẩn/Imi, ñ ấm ở 375C /6 giờ
Ỳ
Trang 31*Bước 3: Ly tâm lạnh để tách kháng nguyên strepfoiysin O:
-Bước này ly tâm nhằm mục đích để vì khuẩn lắng xuống đáy ống , còn kháng
nguyên streptolysin O nằm trong phần nước nổi phía trên Vì nếu không ly
tâm để loại ví khuẩn và cặn môi trường mà tiến hành lọc ngay, dịch lọc sẽ không chây được hoặc chảy rất chậm và như vậy sẽ làm giảm hiệu giá kháng
nguyên streptolysin O Nhung ly tam với số vòng là bao nhiêu? và trong thời
gian bao nhiêu ? để kháng nguyên streptolysin Q không bị lắng xuống đáy ống
cùng vì khaẩn?Qua nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả nhự sau:
Bảng 4.5 Hiệu giá tan hông cầu của hỗn dịch sau khi ly tâm với số vòng khác nhau:
Số vàng ly tân/1 phút Hiệu giá tan hồng cầu
>2000 hiệu giá giảm I nia sau ly tâm
2000 hiệu giá Không thay đổi "
1500 hiệu giá không thay đổi nhưng vì khuẩn lắng không tốt -Như vậy số vòng ly tâm/ 1 phút phù hợp nhất để tách chiết kháng nguyên streptolysin O là 2000 vòng/ 1 phút
*Qua thử nghiệm chúng tôi thấy thời gian ly tâm như sau:
~Nếu ly tâm cỡ lớn( mỗi ống ly tâm có thể chứa được số lượng 100 -200ml môi
trường) , như vậy một lần ly tâm chúng ta có thể ly tâm được khoảng 1 lít môi
trường, thì số vòng là 2000 vòng/1 phút, trong thời gian là 30 phút
Nhưng nếu ly tâm loại nhỏ( mỗi ống ly tâm chỉ chứa được 15-20 mÌ mơi
trường, thì số vòng 2000 vòng/ 1 phút, trong vòng 10-15 phút
Nếu chúng ta ly tâm với thời gian ngắn hơn (lắng sẽ không chắc) khi chất
nước nổi sẽ bị vấn đục, ảnh hưởng tới quá trình lọc Nhưng nếu chúng ta ly tâm
Trang 32Cần lưu ý: khi ly tâm cản sử dụng ống ly tâm có nút kín và khi ly tâm xong,
chất phần nước nổi (kháng nguyên streptolysin O) cần thao tác nhanh để hạn chế
sự 0xy hoá kháng nguyên streptolysin
*Bước 4: Theo đúng quy trình khuyến cáo của TCYTTthế giới:
-Phẩn nước nổi chất được(kháng nguyên streptolysin O) sau ly tâm được bé sung
thêm methiolate với tỷ lệ 1% (methiolate1/10000) hoặc sođium azid với nỗng độ 0,02% *Bước 5: Theo quy trình khuyến cáo của TCYT Thế giới là lọc võ trùng bằng lọc seitz Bảng 4.6.Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên streptolysin Q với kích thước giấy lạc
Kích thước giấy lọc Ì Hiệu giá kháng nguyên sau lọc
>045 pm 11 tháng sau chuẩn độ giảm hiệu giá
0.45 pm 3 tháng sau chuẩn độ giảm hiệu giá
£0.22 pm hiéu gid dn dinh trong 2 nam }
<20 pm, | Không côn hiệu giá sau kh lọc
- Như vậy, qua kết quả thử nghiệm chúng tôi thấy sử dụng giấy lọc có kích thước
nhỏ nhất là 0,22m là phù hợp nhất Nếu chúng ta sử dụng giấy lọc có kích thước
nhỏ hơn 0,20 tim thì rất tốt để lọc vi khuẩn, nhưng đồng thời cũng giữ lại trên
màng lọc kháng nguyên streptolysin O Trong những trường hợp nay địch lọc không còn kháng nguyên, vì vậy khi kiểm tra dịch lọc hồn tồn khơng gây tan
hồng cầu
"Trong trường hợp nếu chúng ta sử dụng giấy lọc có kích thước lớn hơn 0,22
tim, không ảnh hướng tới quá trình qua lọc của kháng nguyên, nhưng có thể một
số vi khuẩn vẫn qua lọc được mà methiolate không tiêu điệt hết, thì cũng ảnh
hưởng tới hiệu giá kháng nguyên streptolysin O Trong trường hợp này ngay sau
Trang 33
khi lọc xong kiểm tra sơ bộ hiệu giá kháng nguyên sẽ không thấy có sự ảnh
hưởng, nhưng sẽ ảnh hưởng tới kháng nguyên streptolysin O trong quá trình bảo
quản, Hiệu giá kháng nguyên sẽ bị giảm đi rất nhiều trong quá trình bảo quản, vì
khi chúng ta lọc không hết vi khuẩn, quá tành chuyển hoá và nhân lên của vì khuẩn sẽ làm pH môi trường trở nên acid dẫn đến kháng nguyên streptolysin O bị
phân huỷ trong môi trường này
"Tuy nhiên trong quá trình thử nghiệm chúng tôi thấy rằng: nếu ngay từ đầu
chúng ta lọc hỗn dịch kháng nguyên qua màng lọc 0,22um, thì địch lọc sẽ chảy
rất chậm và như vậy sẽ kéo dài thời gian lọc và kháng nguyên streptolysin O sẽ bị
oxy hoá, mat kha nang gay tan hồng cầu Qua thử nghiệm nhiều lần chúng tôi thấy để đảm bảo vừa lọc hết vì khuẩn nhưng quá trình thao tác trong thời gian ngắn để tránh kháng nguyên bị oxy hoá, nên tiến hành như sau:
+Trước tiên lọc qua giấy lọc có kích thước 0,45um, lọc được một lượng dịch
khoảng 100ml thì phải thay giấy lọc 1 lần( để dịch lọc chảy nhanh không kéo dài
quá trình lọc)
+Dich loc được lọc lại lần 2 qua giấy lọc có kích thước 0,22 pum
*Bước 6: Đóng gói và bảo quản loại bỏ kháng nguyên sfreptolysin S(theo
quy trình của TCYT thế giới bảo quản dịch lọc ở 4°C trong vòng I tháng để
loại bỏ kháng nguyên streptolysin S}
-Khi hoàn thành quá trình tách chiết kháng nguyên, chúng ta chuẩn độ sơ bộ để
xác định hiệu giá kháng nguyên gây tan hồng cầu, hiệu giá này bao gồm cả
kháng nguyên streptolysin O và kháng nguyên streptolysin S, vì vậy muốn loại
trừ kháng nguyên streptolysin S chúng ta phải để hỗn dich kháng nguyên ở 4°C
hoặc ở -20°C sau 1 tháng (trong vòng 1 thang đủ thời gian để kháng nguyên
streptolysinS bị bất hoạt hoàn toàn),
Trang 34
Một tính chất rất quan trọng của kháng nguyên streptolysin © là bị oxy hoá, vì vậy khi bảo quản để sử dụng dần trong chẩn đoán hàng ngày, nên dựa vào hiệu giá kháng nguyên cao hay thấp để đồng vào các lọ vừa đủ cho một lần tiến hành
phan ứng Vì nếu đóng vào lọ to với số lượng lớn kháng nguyên, mỗi lần tiến
hành phản ứng số kháng nguyên sử dụng không hết lại bảo quân cất giữ để sử
dụng cho lần sau và nhiều lần như vậy kháng nguyên sẽ bị giảm hiệu giá
*#Bước 7: Chuẩn độ chính xác hiệu giá kháng nguyên streptolysin O bằng kháng thể mẫu ASO:
-Chuẩn độ đúng theo quy trình của Tổ chức Y tế Thế giới, (trong phần phương pháp)
*Bước 8:Bão quan kháng nguyên streptolysin O:
Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới: kháng nguyên sau khi sẵn
xuất có thể bảo quản ở 4% sử dụng được trong vòng nhiêu năm Qua nghiên cứu thử nghiệm ở một số điều kiện nhiệt độ bảo quản khác như:4%, -20 %,
ngăn đá tủ lạnh , kết quả theo dõi trong vòng 2 năm như sau:
Bảng 4.7 Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên SO với nhiệt độ bảo quản khác nhau
Nhiệt độ † Hiệu giá Hiệu giá |Hiệugiá |Hiệugiá | Hiệu giá
bảo quản KNSO KNSO sau| KNSO sau| KNSO sau} KNSO sau! sau sản xuất|6tháng |l2tháng |‡8tháng | 24 thang
4C 1:32 1:32 1:32 1:16 1:16
j Ngan da [1:32 1:32 1:32 116 116
20°C} 1:32 132 1:32 | 132 1:32 |
*Nhận xét:
Trang 35thử nghiệm, thì nhiệt độ tối ưu để bảo quản kháng nguyên SO là -20°C(trong vòng 2 năm hiệu giá không thay đổi)
-Kết quả bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh và ở 4 °C(ngăn lạnh của tử lạnh), trong vòng
1 năm hiệu giá kháng nguyên ổn định không thay đổi, nhưng sau 1 năm bị giảm
hiệu giá
Như vậy qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã cụ thể hoá và tìm ra được các
điều kiện tối ưu trong từng bước của quy trình sẵn xuất kháng nguyên ma TCYT
thế giới đã khuyến cáo năm 1983 và năm1996
#Ngoài ra để kháng nguyên SO không bị oxy hoá khi tiến hành phản ứng
ASLO can lu ý:
-Kháng nguyên streptolysin © bị oxy hoá khi có mặt của oxy, vì vậy khi tiến hành phản ứng phải pha loãng huyết thanh xong , mới pha kháng nguyên và phân phối ngay vào phản ứng, khi pha kháng nguyên phân phân phối vào phản ứng, bổ sung thêm NazS;Os với tỷ lệ 0,07%( để chống kháng nguyên bị oxy hoá)
4.3 Nghiên cứu hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin Ơ trên các môi
trường khác nhau
“Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới năm 1983 và năm 1996: sử dụng môi trường Todd-Hewith để nuôi cấy chủng liên cầu nhóm A mẫu C2035 trong tách chiết kháng nguyên sIreptolysin O Nhưng xuất phát từ tình hình thực „ môi
trường Todd-Hewith không lưu hành phố biến ở Việt Nam, trong khi đó môi
trường brain hard infusion (BHI) được sử dụng rất phổ biến ở Việt Nam và giá
thành rẻ hơn, đo đó chúng tôi đã sử dụng môi trường BHI song song với môi
trường todd-Hewith để so sánh kết quả sản xuất kháng nguyên của liên cầu nhóm
A, với hy vọng thay thế một môi trường để mua hơn nhưng kết quả tách chiết
kháng nguyên streptolysin Ơ không thay đổi Ngoài ra trong khuyến cáo của 'Tổ
chức Y tế thế giới nam 1983 và năm 1996 còn khuyến cáo sử đụng môi trường Kalbak broth(tự điều chế từ nguyên liệu thô) trong nuôi cấy liên cầu nhóm A dé
Trang 36tách chiết kháng nguyên streptolysin O, kết quả tách chiết kháng nguyên trên 3
môi trường như sau:
Bảng 4.8 Hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O trên các môi trường khác nhau: Môitrường ” |HIiệugiáKNSO [Giá lHt môi trườngđổng | Todd-Hewith “6-132 315.600 BHI [45.000 [Kalbakqy điều chế) [25.000 *Nhan xét: as -Kết quả tách chiết kháng nguyên sfreptolysin O trén 3 loại môi trường tương tự nhau
-Giá thành của môi trường ka[bak là rẻ nhất vì điều chế từ nguyên liệu thô sẵn có
trong nước (tìm bò), nhưng mất thời gian điều chế hơn
Bảng 4.9 Giá thành sản phẩm tự sản xuất so với các kháng nguyên SO nhập
ngoại hiện đang lưu hành.(không tính khấu hao máy móc)
xuất xứ của khẳng nguyên Ï giá thành một mẫu thử (đồng VN)|
KN SO sản xuất trên môi trường 3000
Todd- Hewith
KN SỐ sản xuất trên môi trường BHI | 1000 ~
KN SƠ sản xuất trên môi trường 300
| Kalbak
[KN SỐ đông Khô của Pháp 42.500 7
IRĐ SỐ đồng khơ của Mỹ 4.500
Kid Humatex ASO của Đức 10.000
Trang 37
*Nhận xét:
-Kháng nguyên streptolysin O tự sản xuất kể cả trên các môi trường tổng hợp cha
nước ngồi như: mơi trường Todd-Hewith và môi trường BHI giá thành vấn rẻ
hơn nhiều lân so với kháng nguyên SO nhập ngoại, đặc biệt rẻ nhất là sản xuất
trên môi trường Kalbak
-Kid Humatex ASO giá thành cũng rẻ hơn kháng nguyên đông khô của Pháp và
Mỹ, nhưng hạn chế trong chẩn đoán vì chỉ xác định được 1 nồng độ 200 đơn vị
kháng thể ASO trong huyết thanh bệnh nhân mà không định lượng được các nồng
độ khác
-Tuy nhiên kháng nguyên tự sản xuất có nhược điểm; khó khan trong quá trình
bảo quản và vận chuyển (vì ở dạng lỏng) Do đó để đảm bảo kháng nguyên
không bị giảm hiệu giá cần phải tuân thủ tất cả các điều kiện bảo quản mà ching
tôi đã trình bây ở phần trên
Trang 38
5.BAN LUAN
5.LBàn luận về các điều kiện giữ chủng liên cdu nhom A
Liên cầu nhóm A cũng như một số vì khuẩn gây bệnh đường hô hấp khác: phế
cAu, H.influenzae wv là những vi khuẩn hiện nay vấn gặp khó khăn trong quá
trình bảo quân và tưu giữ chủng Ngay cả đề án lưu giữ nguồn gen Vi sinh Y học
vẫn chưa tìm ra các phương pháp bảo quản tối ưu đối với các vi khuẩn nay Vi vậy để phục vụ quá trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O việc nghiên cứu
một phương pháp giữ chủng tối wu nhất cả về thời gian giữ chủng và kinh tế là rất
cần thiết
Mục đích đầu tiên của giữ các chủng vì khuẩn là làm sao cho chúng sống
được lâu dài, không bị nhiễm bẩn và không thay đổi các đặc tính di truyền, Có rất
nhiều phương pháp giữ chủng ví khuẩn, song không phải tất cả các loài vi khuẩn
đêu đấp ứng như nhau đối với các phương pháp này Cần phải nhấn mạnh rằng:
thành công hay thất bại của bảo quản chủng vì khuẩn phụ thuộc trước hết vào
việc chọn môi trường nuôi cấy, quy trình bảo quần và tuổi của vi khuẩn lúc giữ
chủng
Có nhiều cách phân chia các phương pháp bảo quản vi khuẩn, nhưng trong để
tài này chúng tôi dựa vào cách phân chia thành hai nhóm chính: nhóm gồm các
phương pháp bảo quân ngắn hạn và nhóm gồm các phương pháp bảo quản dài
hạn
Š.1.1.Các phương pháp bảo quân chủng liên cầu nhóm A C2038
*Cấy chuyển: là một phương pháp bảo quản vi khuẩn ngắn hạn, kình điển nhất
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng các môi trường mới để cấy chuyển
thường xuyên chủng vi khuẩn cần giữ Đối với liên cầu nhóm A môi trường thạch
máu là môi trường phù hợp nhất trong quá trình cấy chuyển Vi khuẩn được cấy
vào môi trường thạch máu, ủ ấm 37°C /18-24 giờ, sau đó có thể bảo quản được
Trang 39trong vòng 48 giờ ở 4°C Phương pháp này không phù hợp trong việc lưu giữ
chủng liên cầu nhóm A C2035 để phục vụ quá trình sản xuất kháng nguyên
streptolysin O vì:
-Phương pháp cấy chuyển khả năng bội nhiễm cao
-Dễ xuất hiện chọn lọc các biến thể
*Phương pháp giữ chủng liên cầu nhóm A C203S trong mời trường BHI glyxero! 20%:
Môi trường BHI là môi trường giàu chất dinh dưỡng và được sử đụng trong lưu giữ nhiều chủng vi khuẩn khó mọc trên các mói trường nuôi eấy thông thường Phương pháp giữ chủng này hiện nay vẫn được để án lưu giữ nguồn gen Vĩ sinh
Y học trường Đại học Y Hà Nội áp dụng Ngồi sử dụng mơi trường BHI, phương
pháp này da sit dung glyxerol la chat chống tinh thể hoá để hạn chế tổn thương tế
bào vi khuẩn trong giai đoạn đông băng Tuy nhiên phương pháp cũng chỉ lưu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S trong vòng một tháng Vì thế phương pháp này
cũng không tránh khỏi được các nhược điểm của phương pháp cấy chuyển đã nêu
ở trên Vì vậy chúng tôi đã thử nghiệm giữ chủng liên cầu nhóm A C2035 trong
một số điều kiện bảo quản khác nhau và thu được kết quả trong môi trường BHT
huyết thanh ngựa 50% là tối ưu (bảng 4.1)
*Phương pháp giữ chủng liên cầu nhóm A C203S trong môi trường BHI
huyết thanh ngựa 50%:
“rong phương pháp này chúng tôi đã thay thế glyxerol bằng huyết thanh ngựa
là chất chống tỉnh thể hoá và kết quả thu được đã loại trừ được những nhược điểm
của các phương pháp trên và kinh tế hơn Phương pháp này giữ được chủng nhiều
năm mới phải cấy chuyển( trong đẻ tài chúng tôi mới chỉ theo dối được 4 năm
nhưng vi khuẩn vẫn sống ), chúng tôi sẽ tiếp tục theo đối để đưa ra thời gian cấy
chuyển chính xác của phương pháp này Đay là phương pháp phù hợp nhất trong
quá trình giữ chủng phục vụ cho quá trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O
Ngoài ra với kết quả nghiên cứu có thể giúp đề án lưu giữ nguôn gen vi sinh Y
Trang 40học trường Đại học Y Hà Nội giữ chủng liên câu nhóm A tốt hơn và có thể là
nghiên cứu gợi mở cho việc giữ một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp
mà hiện nay vẫn cồn gặp khó khán trong quá trình giữ chủng
*Phuong pháp giữ chủng bằng đông khô:
Là phương pháp bảo quản đài hạn và cũng là một trong những phương pháp bảo quản vì khuẩn hiệu quả hiện nay Tuy nhiên kỹ thuật đông khô khá phức tạp
Mặt khác phương pháp này sử dụng để lưu giữ chủng vì khuẩn lâu dài là rất tốt, nhưng để phục vụ sản xuất kháng nguyên streptolysin Ở thì giá thành sẽ đất hơn
các phương pháp giữ chủng khác Ngồi ra khơng phải cơ sở nào cũng có máy đông khô để phục vụ quá trình giữ chủng phục vụ sản xuất kháng nguyên Vì vậy
một lần nữa khang định phương pháp giữ chủng trong môi trường BHI và huyết
thanh ngựa 50%( phương pháp chúng tôi thử nghiệm) ở lạnh sâu là phương pháp
kha thi, đơn giản và kinh tế hơn để phục vụ sản xuất kháng nguyên streptolysin oO
§.1.2.Ban luan về nhiệt độ bảo quản chủng:
Nhiệt độ bảo quản chủng từ ~12 đến -20°C trong các ngăn đá tủ lạnh hiệu quả
thường thay đổi vì quá trình xả đá tự động làm nhiệt độ của các khoang này
không ổn định và điều đó làm tổn hại tới tế bào vì khuẩn Vì vậy giữ vi khuẩn ở
lạnh sâu-70 °C trong quay lạnh chuyên dụng sẽ tốt hơn ngăn đá tủ lạnh rất nhiều
Quá trình lạnh sâu liên quan đến việc đông băng hồn dịch vi khuẩn có chứa các
chất chống tỉnh thể hoá như: glyxerol, huyết thanh ngựa để ngăn ngừa tổn hại tế
bảo trong quá trình đông lạnh
§.2.Bàn luận về kỹ thuật tách chiết kháng nguyên streptolysin O:
Quá trình tách chiết kháng nguyên streptolysin O phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhưng có hai yếu tố quyết định đó là: sự phát triển tốt của chủng vi khuẩn liên cầu nhóm A mẫu và chống được quá trình oxy hoá kháng nguyên streptolysin O
trong quá trình tách chiết