Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm mðc elisa dùng cho chẩn đoán viêm não nhật bản

BỘ Y TẾ DE TAIKY 01-04 DE TAI NHANH CUA KY 61-04 NGHIEN CUU SAN XUAT BO SINH PHAM MAC-ELISA DUNG CHO CHAN DOAN VIEM NAO NHAT BAN CHU NHIEM DE TAI NHANH KY 01-04 TS PHAN THI NGA 6612 2711012007 HÀ NỘI 1991 - 1993 MUCB NGHIEN CUU sAN XUAT BO SINH PHAM MAC-ELISA DUNG CHO CHAN DOAN VIEM NAO NHAT BAN (VNNB) DAT VAN DE: Thử nghiệm miễn dịch enzym phát kháng thể IgM kháng virut VNNB, (IgM antibody Capture ELISA goi tét MAC-ELISA) Buado, K Igarashi, A nghiên cứu đưa vào áp dụng chẩn đoán nhanh, sớm đặc bic bệnh VNNB Đây phương pháp chẩn đoán huyết học có nhiều ưu điểm bật như: - Huyết sử dụng cho thử nghiệm xử lý mà tránh dương tính giả với yếu tố thấp khớp - Chẩn đoán sớm bệnh sau mắc - ngày đầu Chẩn đoán bệnh mẫu huyết đơn ~ Chẩn đoán đặc hiệu, có độ nhạy xác cao Chính mà phương pháp chẩn đoán huyết nhanh chóng áp dụng nhiều nước có lưu hành bệnh VNNB để xác định nguyên Để áp dụng thử nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán nhanh sớm bệnh 'VNNB, việc sử dụng sinh phẩm dạng sinh phẩm thuận tiện cho việc áp dụng thử nghiệm Do mục đích nghiên cứu là: Nghiên cứu sản xuất sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán nhanh bệnh VNNB IL VAT LIEU: Vật liệu để chế tạo sinh phẩm: 1.1 Động vật thí nghiệm: - Chuột trắng giống Swiss loại - ngày tuổi - Chuột trắng giống Swiss L1 - 13 gam Do trung tâm nghiên cứu sản xuất động vật thí nghiệm Viện Vệ Sinh Dịch Tế Học Hà Nội cung cấp 1.2 Cac hoa chat: - Suctoza - Axeton - Axit Boric - Albumin bồ - Tá dược Freund - Horse - Raddish - Peroxidaza ~ Sephacryl $200 - O-Phenylene Diamine (OPD) - Các muối: + Axit citric + Axit H,SO, +KCL +NaH,PO, +H,O, +Na,CO; + NaHCO, + Na;HPO, I2H,O +O-Phenylene diamine + Twcen 20 1.3 Dựng cụt - Bơm tiêm ml, 2ml, 5ml - Pipet mÍ, 2ml, 5ml, 10ml - Tấm nhựa làm ELISA đáy 96 giếng, - Pipet man loại 20 pl, 100 pil, 1000 pl - Pipet maa kénh 50-250 pl - Dau típ cho loại pipet man - Các dụng cụ thuỷ tỉnh trung tính đỏ dùng phịng thí nghiệm cần thiết khác 1.4 Thiét bị phịng thí nghiệm ~ Buồng vô trùng - Máy nghiền não - Máy li tâm lạnh 4°C (10.000 vịp) - Tủ lạnh 4C, - 20°C, - 70% - Tủ ấm 37% - Tủ xấy - Máy đo pH - Cân xác - Máy hút chân không - Máy quay điện từ - Máy doc ELISA - Máy đông khô sinh phẩm Sinh phẩm 2.1 Các sinh phẩm chuẩn Biken, - Kháng nguyên VNNB chủng Nak Biken Nhật Bản IgG chuột kháng virut VNNB chủng Nak gắn Peroxydaza Viện Nhat Ban Khéng IgM ogubi dac biéu chuéi jicia cappel USA sia xuat 2.2 Cae sinh phdm tạo sinh phẩm MAC-ELISA - Kháng ngun VNNB phịng thí nghiệm Viêm não sản xuất - Huyết mẫu chứng dương chứng âm phịng thí nghiệm Viêm não cung cấp -IgG chuột kháng virut VNNB gắn Peroxydaza phịng thí nghiệm Hố sinh phịng thí nghiệm Viêm não sản xuất - Kháng IgM người đặc hiệu chuối JL Cappel USA Mẫu bệnh phẩm cho kiểm tra sinh phẩm: - Các mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân có hội chứng não cấp chưa rõ nguyên lứa tuổi (bệnh nhân ại bệnh viện dịch nghỉ VNNB) - Thời gian lấy mẫu: Sau mắc bệnh -2 ngày 60 ngày sau - Bệnh phẩm: Huyết bệnh nhân lay 0,1 ml - Iml IIL PHUONG PHAP Quy trình sản xuất khang nguyén VNNB Nakayama theo phương pháp SUCROZA-AXETON: - Não chuét ohiém virut VNNB nghiền đồng 20% sucroza 8,5% máy nghiền Nissei - Nhat Ban 2000 v/p phút - Cho thể tích hốn dịch virut vào 20 thể tích Axêton lạnh - Ly tam 1.800 v/p 15 phút loại bỏ nước - Lầm tan cặn thể tích Axeton lạnh để 4°C/60 phút - Ly tâm 1.800 víp 15 phút loại bỏ nước Hoà cặn Axeton lạnh cho vào tube ly tam 1.800 v/p 15 phút loại bỏ nước ~ Trải rộng cặn tube làm khô máy hút chân không từ -2 ~ Làm tan cặn đệm Borat pH.9 có 0,4% Albumin bị để 4°C qua đêm - Ly tam 10.000 v/p 60 phút 4°C lấy nước kiểm tra hiệu giá phản ứng ngưng kết hỏng cầu (kháng nguyên dùng cho thử nghiệm MAC-BLISA hiệu giá phải đạt >1/256) - Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA - Đơng khô kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá sau đông khơ Quy trình sản xuất khang thé virut VNNB gin HRPO: 2.1 Quy trình sẵn xuất kháng thé khdng virut VNNB (Nak): - Cách gây miễn dịch cho chuột 8wiss 11- 13 gam: + Số lần gây miễn dịch: lần, mi lần cách ngày + Liêu gây miễn dịch: 0,2 mÍ hồn dịch virut (văcxin VNNP) với tí dược Freund theo ty lé 1/1 + Đường tiêm: Tiêm vào phúc mạc - Lấy mầu tìm để kiểm tra hiệu giá kháng thể (ít chuột) sau mũi tiêm thứ - Kiểm tra hiệu giá phản ứng ngăn ngưng kết hỏng cầu kỹ thuật truag hoà tế baồ kết đạt: + Phản ứng ngăn ngưng kết hỏng cầu hiệu giá > 1/1.000 + Kỹ thuật trung hoà tế bào hiệu giá > 10° ~ Lấy máu tách huyết thanh: Lấy máu cho vào tube để nghiêng nhiệt độ phịng cho đơng, đề vào 37%/60p Rồi để 4%C qua đêm để tách lấy huyết 2.2 Quy trình sản xuất kháng thể IgG khang virut VNNB gin HRPO: 2.2.1 Tỉnh chế IG kháng vừut VNNB a Pha loãng kháng thể virut VNNP PBStheo tỷ lệ 1/2 b Cho thể tích lỗng dung dịch (NH,);SO, bão hồ vào thể tích kháng thể pha lỗng c Quay điện từ phịng thí nghiệm 20 phút d Ly tâm 10.000 vịp 20 phút loại bỏ nước e Lầm taa cặn PBS thêm dung dịch (NH,);SO, bão hoà để có nồng độ cuối 39% † Quay điện từ phịng thí nghiệm 20 phút g Ly tam 10.000 v/p 20 phút h Loại bỏ nước làm tan cặn với PBS (làm nhắc lại bước e, f, g, thém2 lần i Hoa tan cặn với lượng PBS nhỏ nhất, thẩm tích PBS loại bỏ (NH,);SO, 4°C qua đêm k Cho qua cột trao đổi loa Sephacryl: S200) để chọn mẫu có chứa IgŒ kháng virut VNN L Hộn mẫu có chứa IgG, đặc áp lực chân không Kháng thể tỉnh chế dùng để làm cộng hợp Eazym 2.2.2 Gắn IgG kháng virut VNNG tình khiết với HRPO: Tham tich IgG (100mg) dung dich 0,01M Carbonat 30 mg HRPO pha 12,3 ml nước cất cho 2,5ml 0,1M NalO quay điện từ20 phút phịng thí pH9,ố 4C qua đêm nghiệm | Thẩm tích dung dịch IM Ácetat pH 4,5 phồng thí nghiệm qua đêm | Điều chỉnh pH tới 9,5 dung dich IM Cacbomat pH 9,6 + —Ì Quay điện từ phịng thí nghiệm (tránh ánh sáng) Để 4°C t rong không quay điện từ: Cho qua cột trao đổi Ion (Sephacryl: $200) Thu mẫu đo bước sóng 280”, 403”, Tính tỷ số mật độ quang học (OD) bước sóng 403/280 Hon céc miu ty số khoảng 0,3 - 0,6 Them 0,1% Albumin b3 (chất làm bền vững) Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thừ nghiệm MAC-ELISA Đông khô Chọn mẫu huyết chứng dương chứng âm: 3.1 Chọn mẫu huyết dương tính: - Huyết bệnh nhâo có hội chứng não cấp nghỉ VNNB làm xét nghiệm kỹ thuật HI chọn mẫu xác định dương tính có hiệu giá >1/80 Kiểm tra ằng thử nghiệm MAC-ELISA mẫu huyết riêng (có đối chiếu với huyết mẫu dương chuẩn Viện Nagasaki Nhật Ban) - Những mẫu huyết thoả mãn hai điều kiện: - Hiệu giá HI > 1/80 - MÁC - ELISA dương tính (OD mẫu thừ/OD chứng âm >2) 3.2 Chọn mẫu huyết âm tính: - Huyết người lànhở vùng khơng có lưu hành địch VN làm xét nghiệm kiểm tra kỹ thuật HI MAC-ELISA xác định âm tính (có đối chiếu với huyết mẫu âm chuẩn Viện Nagasaki) Pha dung dịch đệm cho sinh phẩm 4.1, Dung dịch phú pH, 9/6: Na,CO, NaHCO, NaN, 139g 293g 028 Nuc cat vita di: 100 ml 4.2 Dung dich 0,05M Citrat phopat pH 5,0 déc 10 lén: Acxit Citric 304g Na,HPO,12H,o 17,90g 4.3 Pha dụng dịch 005M Citrat phophat pH.5,0 đặc 10 lân có H,O;: ml dung địch Citrat phophat pH.5,0 dic 10 lia 0,003 ml H,0, 4.4 Pha dung dich axit dừng phản ứng: HH,SO, đậm đặc 10,6 mí (Chú ý cho từtừaxit đậm đặc vào nước) 4.5 PBS tinh thé: NaCL KCL Na,HPO, KHPO, 30g 02g 115 g 02g (Khi dùng pha 1.000 mÍ nước cất) * Các dung dịch đệm hố chất đóng lọ đủ dùng cho sinh phẩm 96 thử nghiệm Cố định kháng thé IgG khang IgM ngudi đặc hiệu chuỗi pp trén phiến nhựa 96 ghiếng: - Chuẩn độ hiệu giá kháng thể kháng IgM người theo phương pháp Bundo, K Igarashi, A để xác định hiệu giá thích hợp - Pha kháng thể kháng TgM người dung địch phủ pH 9,6 - Cho vào giếng nhựa mối ghiếng 100 HÍ, để 4°C qua đêm - Rửa nhựa dung dịch PBS-T lần - Các nhựa cố định kháng thể IgŒ bọc kía giấy bạc bảo quảnở 4°C -20°C Nguyên lý thứ nghiệm MAC-ELISA: Nguyên lý: Thừ nghiệm Miễn dịch enzym phát kháng thể IgM kháng virut viêm não Nhật Bin (IgM Antibody Capture ELISA gọi tắt MAC-ELISA) thử nghiệm miễn dịch gián tiếp để xác định có mặt kháng thể IgM kháng virut VNNB huyết nước não tuỷ bệnh nhân Tóm tắt sơ đỏ: NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT MAC-ELISA ll ‹ e mo “a 1.1gG thỏ kháng IgM người đặc hiệu chuối p Kháng thể IgM có máu dịch não tuý Khang nguyén VNNB (Nak) IgŒ chuột kháng vi rút VNNB gắn Peroxydaza Cơ chất màu OPD Tiêu chuẩn nhận định dương tính đọc máy đọc ELISA bước sóng 42 am OD chứng dương IV KET QUA Bảng I So sánh hiệu giá sinh phẩm sản xuất: SINH PHẨM VIÊN BIKEN VIÊN VSDT Hiệu giá - kháng nguyên Hiệu giá - Cộng hợp enzym > 1/2000 > 1/2000 > 1/2000 > 1/2000 Bang Theo doi điều kiện thời gian bảo quần sinh phẩm: Sinh phẩm Thời gian bảo quần Hình thức 40°C 'Đã gắn kháng IgM người Đơng khơ Đông khô Đông khô Đông khô Tấm nhựa 96 giếng Kháng nguyên VNNB Huyết âm Huyếnt dương IgG chuột kháng virut VNNB gin HRPO O-Phenylene diamine Đệm pha chất có H;O; (đặc 10 lần) PBS (pha Lit) Tween 20 10 H,SO,4N 11 Nước cất2 lầu - 20% 3tháng | năm 3tháng |3 năm 3tháng |3 năm 3tháng |3 năm 3tháng | năm Tỉnh thể 3tháng | năm Dung dịch thang Tỉnh thể Dung địch Dung địch 12 thang 12 tháng 12 tháng 12 tháng Bảng So sánh độ nhây thử nghiệm HT MAC-ELISA 173 mẫu máu sớm (lấy sau mắc bệnh - ngày, vụ dich 1988) SỐ MẪU 37 71 60 Tổng số MAC-ELISA KẾT QUÁ HT œ Có kháng thể Oo 108/173 (62,42%) Có kháng thé 42/173 24.27%) Ww Oo 10 Oo Oo Bảng 4: Kết ứng dụng sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán giám sát bệnh Dengue VNNB Loại mẫu bệnh phẩm Mau người lành 1992 Kết Số mẫu | Kháng nguyên | Kháng nguyên VNNB Mau bệnh nhân - Có chẩn đốn lâm sàng nghỉ VNNB - Sốt cao không rõ nguyên 245 (NaK) | Dengue (D2) œ oO Oo Oo w O 40 w @ © w Bảng 5: Sự phân bố VNNB xác định MAC-ELISA theo lứa tuổi (1989 - 1991) Nhóm tuổi Xác định VNNB % ]|0-4 174 [5-9 [169 [10-14 38 4339 8553 [4214 |948 948 [15-19 0,50 4,99 11 ]>19 18 Tổng số 401 4.49 100 100 Bảng 6: Những địa phương có bệnh nhân VNNB xác định MAC-ELISA (1989 - 1991) Hà Nội Dia phuong Nội thành Ngoại thành Hà Bắc Hà Sơn Bình Hai Hung Ha Nam Định Thái Bình Vĩnh Phú Thanh Hố Lang Sơn Bắc Thái Quảng Ninh Khơng xác định Tổng số Chẩn đốn lâm sàng | Xác định VNNB 20 138 77 118 68 17 104 66 30 19 28 14 12 213 67 793 401 12 Bảng 7: Những địa phương có bệnh nhân VNNB xác định MAC - ELISA 1992 Tỉnh/ thành phố Ha Noi Nội thành Ngoại thành Thái Bình Ninh Bình Thanh Hố Nam Hà Hà Bắc Vĩnh Phú Hải Hưng Bắc Thái Quảng Ninh Ha Tây Hồ Bình Nghệ An Hà Tính Lai Châu Lang Soo Tuyên Quang Yên Bái Sơn La Quảng Trị Huế Không tố địa Tổng số Số mẫu xét nghiệm 29 52 28 69 30 60 38 1 1 28 138 330 13 MAC - ELISA (4) 24 25 25 64 25 31 30 1 11 39 339 V.NHAN XET VA BAN LUAN Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao, aghiém MAC - ELISA hiệu giá kháng nguyên kết hồng cầu - HA) >1/2000, hiệu giá công hợp Qua theo đối điều kiện bảo quản sinh phẩm sinh phẩm tỉnh khiết để sử dụng cho thử (kiểm tra phản ứng ngưng enzyrm >1/2000 (Bảng 1) xác định thời gian bảo quảu ~-Ở 4PC tháng -Ở -20°C năm Ứng dụng sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán nhanh sớm bệnh VNNB thấy có ưu điểm bật như: - Chẩn đoán bệnh với mnấu huyết thanh, huyết xử Lý, tránh dương tính giả, chẩn đốn sớm bệnh Trong 173 mẫu máu đơn (lấy sau mmắc - ngày) thử nghiệm MAC-ELISA Xác định dương tính 108/173 (62,42%) thử nghiệm HI xác định 42/172 (24,27%) mẫu có kháng thể - Điều tra tình trạng nhiễm ẩn virut Dengue virut VNNB 252 mẫu máu lấy người bình thường Hải Hưng 6/1992 Bằng thử nghiệm MACELISA có 245 mẫu âm tính với kháng nguyên Dengue VNNE Nhưng có mẫu dương tính với kháng nguyên VNNB âm tính với kháng ngun Dengue, có mãu dương tính với kháng nguyên Dengue âm tính với kháng nguyên VNNB (Bảng 4) ứng dụng thừ nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán xác định bệnh cho kết tương tự, khơng có chếo kháng nguyên viêm não khẩng nguyên Dengue Như MAC-ELISA thử nghiệm đặc hiệu, không chéo với kháng nguyên nhóm Flavi virut, có ý nghĩa chẩn đốn, giám sắt bệnhở nơi có lưu hành vitut Dengue virut VNNB nước ta Từ kết chẩn đoán bệnh thử nghiệm MAC-ELISA xác định số đặc điểm dịchtế vẻ VNNB - Dịch thường xảy mùa h diah cao cita dich thutng [A thing 6, ty le xác định dương tính vào thời điểm 16/295 (hình 1) - Tỷ lệ mắc VNNB cao nhóm tuổi - (85,53%) bảng - Kết xác định VNNB tỉnh thành phố không phản ánh thực chất tình hình bệnh VNNB avi đó, có ý nghĩa việc xác định có mặt virut VNNB địa phương (bảng ố bảng 7) VI KẾT LUẬN: Qua kết đạt nhận thấy: Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao độ tỉnh khiết dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA - Kháng nguyên VNNE hiệu giá 2000 (ELISA) Thời gian điều kiện bảo quản sinh phẩm kiện 4°C sinh phẩm có hạn dùng tháng éu kiện - 20°C sinh phẩm có bạn dùng 12 tháng Bộ sinh phẩm MAC - ELISA ứng dụng chẩn đốn bệnh VNNB cho kết nhanh, sớm xác lỗ