BỘ Y TẾ
DE TAIKY 01-04
DE TAI NHANH CUA KY 61-04 NGHIEN CUU SAN XUAT
BO SINH PHAM MAC-ELISA DUNG CHO CHAN DOAN VIEM NAO NHAT BAN
CHU NHIEM DE TAI NHANH KY 01-04 TS PHAN THI NGA
6612 2711012007
Trang 2MUCB
NGHIEN CUU sAN XUAT BO SINH PHAM MAC-ELISA
DUNG CHO CHAN DOAN VIEM NAO NHAT BAN (VNNB) DAT VAN DE:
Thử nghiệm miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB, (IgM antibody Capture ELISA goi tét là MAC-ELISA) được Buado, K và Igarashi, A nghiên cứu và đưa vào áp dụng trong chẩn đoán nhanh, sớm và đặc
bic
nhiều ưu điểm nổi bật như: bệnh VNNB Đây là một phương pháp chẩn đoán huyết thanh học mới có
- Huyết thanh sử dụng cho thử nghiệm không phải xử lý mà vẫn tránh được dương tính giả với yếu tố thấp khớp
- Chẩn đoán sớm bệnh ngay sau khi mắc 2 - 4 ngày đầu Chẩn đoán bệnh
bằng một mẫu huyết thanh đơn
~ Chẩn đoán đặc hiệu, có độ nhạy và chính xác cao
Chính vì vậy mà phương pháp chẩn đoán huyết thanh này nhanh chóng được áp dụng ở nhiều nước có lưu hành bệnh VNNB để xác định căn nguyên
Để áp dụng thử nghiệm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh 'VNNB, thì việc sử dụng sinh phẩm dưới dạng những bộ sinh phẩm là rất thuận tiện cho việc áp dụng thử nghiệm này Do vậy mục đích nghiên cứu của chúng tôi là: Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán nhanh bệnh VNNB IL VAT LIEU: 1 Vật liệu để chế tạo sinh phẩm: 1.1 Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhất trắng giống Swiss loại 2 - 3 ngày tuổi - Chuột nhất trắng giống Swiss L1 - 13 gam
Do trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm Viện Vệ Sinh
Trang 31.2 Cac hoa chat: - Suctoza - Axeton - Axit Boric - Albumin bồ - Tá dược Freund - Horse - Raddish - Peroxidaza ~ Sephacryl $200 - O-Phenylene Diamine (OPD) - Các muối: + Axit citric + Axit H,SO, +KCL +NaH,PO, +H,O, +Na,CO; + NaHCO, + Na;HPO, I2H,O +O-Phenylene diamine + Twcen 20 1.3 Dựng cụt - Bơm tiêm 1 ml, 2ml, 5ml - Pipet 1 mÍ, 2ml, 5ml, 10ml
- Tấm nhựa làm ELISA đáy bằng 96 giếng,
- Pipet man loại 20 pl, 100 pil, 1000 pl - Pipet maa 8 kénh 50-250 pl
- Dau típ cho các loại pipet man trên
- Các dụng cụ thuỷ tỉnh trung tính và các đỏ dùng phòng thí nghiệm cần
Trang 41.4 Thiét bị phòng thí nghiệm ~ Buồng vô trùng - Máy nghiền não - Máy li tâm lạnh 4°C (10.000 vịp) - Tủ lạnh 4C, - 20°C, - 70% - Tủ ấm 37% - Tủ xấy - Máy đo pH - Cân chính xác
- Máy hút chân không - Máy quay điện từ - Máy doc ELISA
- Máy đông khô sinh phẩm 2 Sinh phẩm
2.1 Các sinh phẩm chuẩn
- Kháng nguyên VNNB chủng Nak Biken Nhật Bản
- IgG chuột kháng virut VNNB chủng Nak gắn Peroxydaza của Viện Biken, Nhat Ban
- Khéng IgM ogubi dac biéu chuéi jicia cappel USA sia xuat
2.2 Cae sinh phdm tạo bộ sinh phẩm MAC-ELISA
- Kháng nguyên VNNB do phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất
- Huyết thanh mẫu chứng dương và chứng âm do phòng thí nghiệm Viêm não cung cấp
-IgG chuột kháng virut VNNB gắn Peroxydaza do phòng thí nghiệm Hoá sinh và phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất
- Kháng IgM người đặc hiệu chuối JL của Cappel USA 3 Mẫu bệnh phẩm cho kiểm tra bộ sinh phẩm:
- Các mẫu bệnh phẩm được lấy từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp chưa rõ căn nguyên ở mọi lứa tuổi (bệnh nhân
các ở dịch và nghỉ là VNNB)
Trang 5
- Thời gian lấy mẫu: Sau khi mắc bệnh 1 -2 ngày cho đến 60 ngày sau - Bệnh phẩm: Huyết thanh bệnh nhân lay 0,1 ml - Iml
IIL PHUONG PHAP
1 Quy trình sản xuất khang nguyén VNNB Nakayama theo phương pháp
SUCROZA-AXETON:
- Não chuét 6 ohiém virut VNNB được nghiền đồng nhất 20% trong
sucroza 8,5% bằng máy nghiền Nissei - Nhat Ban 2000 v/p trong 5 phút
- Cho một thể tích hốn dịch virut này vào 20 thể tích Axêton lạnh
- Ly tam 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ nước nổi
- Lầm tan cặn này bằng một thể tích Axeton lạnh như trên để 4°C/60 phút
- Ly tâm 1.800 víp trong 15 phút loại bỏ nước nổi Hoà cặn này bằng
Axeton lạnh cho vào trong tube ly tam 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ
nước nổi
~ Trải rộng cặn trong tube và làm khô bằng máy hút chân không từ 1 -2 giờ ~ Làm tan cặn bằng đệm Borat pH.9 có 0,4% Albumin bò để 4°C qua đêm - Ly tam 10.000 v/p trong 60 phút ở 4°C lấy nước nổi kiểm tra hiệu giá
bằng phản ứng ngưng kết hỏng cầu (kháng nguyên dùng cho thử nghiệm
MAC-BLISA hiệu giá phải đạt >1/256)
- Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA - Đông khô kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá sau đông khô 2 Quy trình sản xuất khang thé virut VNNB gin HRPO:
2.1 Quy trình sẵn xuất kháng thé khdng virut VNNB (Nak):
- Cách gây miễn dịch cho chuột 8wiss 11- 13 gam:
+ Số lần gây miễn dịch: 5 lần, mi lần cách nhau 7 ngày
+ Liêu gây miễn dịch: 0,2 mÍ hồn dịch virut (văcxin VNNP) với tí dược Freund theo ty lé 1/1
+ Đường tiêm: Tiêm vào phúc mạc
- Lấy mầu tìm để kiểm tra hiệu giá kháng thể (ít nhất là 3 con chuột) sau
mũi tiêm thứ 4
Trang 6thuật truag hoà trên tế baồ nếu kết quả đạt:
+ Phản ứng ngăn ngưng kết hỏng cầu hiệu giá > 1/1.000
+ Kỹ thuật trung hoà trên tế bào hiệu giá > 10°
~ Lấy máu tách huyết thanh: Lấy máu cho vào tube để nghiêng ở nhiệt độ phòng cho đông, đề vào 37%/60p Rồi để ở 4%C qua đêm để tách lấy huyết
thanh
2.2 Quy trình sản xuất kháng thể IgG khang virut VNNB gin HRPO:
2.2.1 Tỉnh chế IG kháng vừut VNNB
a Pha loãng kháng thể virut VNNP trong PBStheo tỷ lệ 1/2
b Cho 1 thể tích loãng dung dịch (NH,);SO, bão hoà vào 1 thể tích kháng
thể đã pha loãng trên
c Quay điện từ ở phòng thí nghiệm 20 phút
d Ly tâm 10.000 vịp trong 20 phút loại bỏ nước nổi
e Lầm taa cặn bằng PBS và thêm dung dịch (NH,);SO, bão hoà để có nồng độ cuối cùng là 39% † Quay điện từ ở phòng thí nghiệm ít nhất 20 phút g Ly tam 10.000 v/p trong 20 phút h Loại bỏ nước nổi và làm tan cặn với PBS (làm nhắc lại như các bước e, f, g, thém 2 lần nữa
i Hoa tan cặn với một lượng PBS nhỏ nhất, thẩm tích trong PBS loại bỏ
Trang 7k Cho qua cột trao đổi loa Sephacryl: S200) để chọn các mẫu có chứa IgŒ kháng virut VNN
L Hộn các mẫu có chứa IgG, cô đặc bằng áp lực chân không Kháng thể tỉnh chế này dùng để làm cộng hợp Eazym
2.2.2 Gắn IgG kháng virut VNNG tình khiết với HRPO:
Tham tich IgG 30 mg HRPO pha trong 12,3 ml
(100mg) trong dung nước cất cho 2,5ml 0,1M NalO dich 0,01M Carbonat quay điện từ20 phút ở phòng thí
pH9,ố ở 4C qua đêm nghiệm | Thẩm tích trong dung dịch IM Ácetat pH 4,5 ở phồng thí nghiệm qua đêm | Điều chỉnh pH tới 9,5 bằng dung dich IM Cacbomat pH 9,6 + —Ì
Quay điện từ ở phòng thí nghiệm trong 2 giờ (tránh ánh sáng) Để ở 4°C t rong 2 giờ không quay điện từ: Cho qua cột trao đổi Ion (Sephacryl: $200) Thu các mẫu và đo ở bước sóng 280”, 403”,
Tính tỷ số mật độ quang học (OD) của bước sóng 403/280
Hon céc miu 6 ty số trong khoảng 0,3 - 0,6 Them 0,1% Albumin b3 (chất làm bền vững)
Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thừ nghiệm MAC-ELISA Đông khô
3 Chọn mẫu huyết thanh chứng dương và chứng âm:
3.1 Chọn mẫu huyết thanh dương tính:
- Huyết thanh bệnh nhâo có hội chứng não cấp nghỉ VNNB được làm xét
Trang 8nghiệm bằng kỹ thuật HI chọn mẫu xác định dương tính có hiệu giá >1/80
ằng thử nghiệm MAC-ELISA từng mẫu huyết thanh riêng
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu dương chuẩn của Viện Nagasaki Nhật Ban) - Những mẫu huyết thanh thoả mãn hai điều kiện: - Hiệu giá HI > 1/80 - MÁC - ELISA dương tính (OD mẫu thừ/OD chứng âm >2) Kiểm tra
3.2 Chọn mẫu huyết thanh âm tính:
- Huyết thanh người lành ở vùng không có lưu hành địch VN được làm xét nghiệm kiểm tra bằng kỹ thuật HI và MAC-ELISA xác định âm tính
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu âm chuẩn của Viện Nagasaki)
4 Pha các dung dịch đệm cho bộ sinh phẩm
4.1, Dung dịch phú bản pH, 9/6:
Na,CO, 139g
NaHCO, 293g
NaN, 028
Nuc cat vita di: 100 ml
4.2 Dung dich 0,05M Citrat phopat pH 5,0 déc 10 lén:
Acxit Citric 304g
Na,HPO,12H,o 17,90g
Trang 94.5 PBS tinh thé: NaCL 30g KCL 02g Na,HPO, 115 g KHPO, 02g
(Khi dùng pha trong 1.000 mÍ nước cất)
* Các dung dịch đệm và hoá chất được đóng lọ đủ dùng cho từng bộ sinh phẩm 96 thử nghiệm
5 Cố định kháng thé IgG khang IgM ngudi đặc hiệu chuỗi pp trén phiến
nhựa 96 ghiếng:
- Chuẩn độ hiệu giá kháng thể kháng IgM người theo phương pháp của Bundo, K và Igarashi, A để xác định hiệu giá thích hợp
- Pha kháng thể kháng TgM người trong dung địch phủ bản pH 9,6 - Cho vào các giếng của bản nhựa mối ghiếng 100 HÍ, để 4°C qua đêm
- Rửa bản nhựa bằng dung dịch PBS-T 5 lần
- Các bản nhựa đã cố định kháng thể IgŒ được bọc kía bằng giấy bạc bảo
quản ở 4°C hoặc -20°C
6 Nguyên lý thứ nghiệm MAC-ELISA:
Nguyên lý: Thừ nghiệm Miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut
viêm não Nhật Bin (IgM Antibody Capture ELISA gọi tắt là MAC-ELISA) là
một thử nghiệm miễn dịch gián tiếp để xác định sự có mặt của kháng thể IgM
Trang 10Tóm tắt sơ đỏ: NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT MAC-ELISA ll ‹ e mo “a 1 3 5
1.1gG thỏ kháng IgM người đặc hiệu chuối p
2 Kháng thể IgM có trong máu hoặc dịch não tuý 3 Khang nguyén VNNB (Nak)
4 IgŒ chuột kháng vi rút VNNB gắn Peroxydaza 5 Cơ chất hiện màu OPD
Tiêu chuẩn nhận định dương tính đọc bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 42 am OD chứng dương
IV KET QUA
Bảng I So sánh hiệu giá các sinh phẩm sản xuất:
SINH PHẨM VIÊN BIKEN VIÊN VSDT
Hiệu giá - kháng nguyên > 1/2000 > 1/2000 Hiệu giá - Cộng hợp enzym > 1/2000 > 1/2000
Trang 11Bang 2 Theo doi điều kiện và thời gian bảo quần sinh phẩm: Sinh phẩm Hình thức Thời gian bảo quần 40°C - 20% 1 Tấm nhựa 96 giếng 2 Kháng nguyên VNNB
3 Huyết thanh âm 4 Huyếnt thanh dương
Trang 15V.NHAN XET VA BAN LUAN
1 Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao, tỉnh khiết để sử dụng cho thử aghiém MAC - ELISA hiệu giá kháng nguyên (kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu - HA) >1/2000, hiệu giá công hợp enzyrm >1/2000 (Bảng 1)
2 Qua theo đối điều kiện bảo quản sinh phẩm đã xác định thời gian bảo quảu sinh phẩm
~-Ở 4PC trong 3 tháng -Ở -20°C trong 3 năm
3 Ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh
VNNB thấy có những ưu điểm nổi bật như:
- Chẩn đoán bệnh với một mnấu huyết thanh, huyết thanh không phải xử Lý, tránh được dương tính giả, chẩn đoán sớm bệnh Trong 173 mẫu máu đơn (lấy sau khi mmắc 1 - 3 ngày) thử nghiệm MAC-ELISA Xác định dương tính là 108/173 (62,42%) trong khi đó thử nghiệm HI chỉ xác định được 42/172 (24,27%) mẫu có kháng thể
- Điều tra tình trạng nhiễm ẩn virut Dengue và virut VNNB trong 252 mẫu
máu lấy ở người bình thường tại Hải Hưng 6/1992 Bằng thử nghiệm MAC- ELISA có 245 mẫu âm tính với cả kháng nguyên Dengue và VNNE Nhưng có 4 mẫu dương tính với kháng nguyên VNNB và âm tính với kháng nguyên Dengue, có 3 mãu dương tính với kháng nguyên Dengue và âm tính với kháng
nguyên VNNB
(Bảng 4) ứng dụng thừ nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán xác định bệnh
cũng cho kết quả tương tự, không có sự chếo giữa kháng nguyên viêm não và
khẩng nguyên Dengue
Như vậy MAC-ELISA là một thử nghiệm đặc hiệu, không chéo với kháng
nguyên cùng nhóm Flavi virut, nó rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, giám sắt bệnh ở những nơi có lưu hành cả vitut Dengue và virut VNNB như ở nước ta 4 Từ những kết quả chẩn đoán bệnh bằng thử nghiệm MAC-ELISA đã xác định một số đặc điểm dịch tế vẻ VNNB
Trang 16- Dịch thường xảy ra về mùa h diah cao cita dich thutng [A thing 6, ty le xác định dương tính vào thời điểm này là 2 16/295 (hình 1)
- Tỷ lệ mắc VNNB cao nhất ở nhóm tuổi 0 - 9 (85,53%) bảng 5
- Kết quả xác định VNNB tại các tỉnh và thành phố không phản ánh được thực chất tình hình bệnh VNNB tại các avi đó, nhưng nó có ý nghĩa trong việc xác định sự có mặt của virut VNNB tại các địa phương đó (bảng ố và bảng 7)
VI KẾT LUẬN:
Qua các kết quả đạt được chúng tôi nhận thấy:
1 Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao và độ tỉnh khiết dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA
- Kháng nguyên VNNE hiệu giá <2000 (phản ứng HA) - Cộng hợp cnzym hiệu giá >2000 (ELISA)
2 Thời gian và điều kiện bảo quản sinh phẩm
kiện 4°C bộ sinh phẩm có hạn dùng trong 3 tháng éu kiện - 20°C bộ sinh phẩm có bạn dùng 12 tháng
3 Bộ sinh phẩm MAC - ELISA được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh VNNB
cho kết quả nhanh, sớm chính xác