Khai thác và phát triển nguồn gen quý hiếm cây thuốc lá cty tnhh một thành viên ktkt thuốc lá

Trang 1

CƠNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN VIEN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ

BAO CÁO TONG KET NHIEM VU

KHAI THAC VA PHAT TRIEN NGUON GEN

QUY HIEM CÂY THUOC LA

Chủ trì nhiệm vụ: KS Trần Thị Thanh Hảo

7722 26/02/2010

Trang 2

CƠNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN VIEN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ

BAO CÁO TONG KET NHIEM VU

KHAI THAC VA PHAT TRIEN NGUON GEN

QUÝ HIÊM CÂY THUOC LA

Thực hiện theo Hợp đơng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ F nghiệp cơng nghiên cứu khoa học và phát triển cơng nghệ số

04B/HDD-KHCN ngày 28 tháng 5 năm 2009 giữa Bộ Cơng Thương

và Cơng ty TNHH một thành viên Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá

Chủ trì nhiệm vụ: KS Tran Thj Thanh Hao

Những người thực hiện chính: TS Chu Hồng Hà

CN Phạm Thị Vân

KS Nguyễn Hồng Thái KTV Nguyễn Hồng Việt KTV Nguyễn Thị Mai Hoa

Trang 3

MODAU

Việt Nam được đánh giá là một trong 15

ĩc cĩ nguơn tài nguyên di

truyền thực vật phong phú Sự đa đạng, giàu cĩ về tài nguyên di truyền thực vật

là tiền đề để nước ta phát triển nơng nghiệp bền vững Tuy nhiên do sức ép gia tăng đân số và sự thâm canh nơng nghiệp khơng hợp lý, nguồn gen cây nơng nghiệp đã và đang bị xĩi mịn, mắt mát với tốc độ rất nhanh Từ một nước thiếu lương thực, Việt Nam đã đảm bảo được an ninh lương thực, trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới Bên cạnh những thành cơng to lớn đạt được, mặt trái của nĩ là sự mắt dân đi nhiều giống lúa địa phương, những giống lúa cĩ chất lượng cao do áp dụng các giống cải tiến cĩ năng suất cao Điều này cũng xảy ra với hầu hết các hoạt động sắn với tài nguyên nơng nghiệp và lương thực, thuỷ sản, lâm nghiệp Theo PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trung tâm Tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam thì cĩ đến 80% nguồn gen tại các địa phương đã khơng cịn tồn tại ngồi sản xuất

Trước thực trạng tài nguyên đi truyền thực vật suy giảm, các nhà khoa học khẳng định đã đến lúc cần chú trọng cơng tác bảo tơn, phát triển nguồn gen tại cộng đồng bên cạnh bảo quản tại ngân hàng gen

Tuy nhiên, do nhu cầu cuộc sống, người nơng dân chỉ trồng những loại cây mang lại lợi ích kinh tế hoặc cĩ giá trị sử dụng Vì thế, mà những nguồn sen địa phương cĩ chất lượng cao, thích nghỉ với điều kiện thổ nhưỡng, cĩ khả năng chống chịu tốt, nhưng giá trị kinh tế thấp nên đã khơng được gieo trồng, cĩ nguy cơ biến mắt Bảo tồn thơng qua sử dụng được coi là giải pháp tối ưu để thúc đây sử dụng bên vững nguồn tài nguyên dĩ truyền

Khai thác, thương mại hĩa các sản phẩm bản địa chính là tạo điều kiện cho người dân bảo tổn, song muốn bảo tồn bền vững phải gắn với phát triển

"Theo GS Nguyễn Ngọc Kính- Phĩ chủ tịch Hội giống cây trồng Việt Nam thì

chúng ta khơng chỉ khai thác mà cịn phải nhân tức là giữ lại cái giống đĩ, tìm cách phục tráng, chọn lọc lại để nhân lên sản xuất cĩ quy mơ

Cây thuốc lá là một trong những cây cơng nghiệp ngắn ngày cĩ hiệu quả kinh tế cao Cũng như các cây trồng khác, hiện tượng xĩi mịn nguồn gen thuốc lá cũng đang điển ra, chính vì vậy cơng tác thu thập và lưu giữ các giống thuốc

lá được nhiều nước tiến hành như Trung Quốc (hiện cĩ trên 1000 mẫu giống

thuốc lá), Zimbabue

Cũng như các loại cây trồng khác, những giống thuốc lá mới ở Việt Nam với những ưu thế nổi trội về năng suất, chất lượng cao đang dần din thay thé các giống thuốc lá cũ và các giống địa phương Chính vì vậy việc khai thác và phát triển nguồn gen quý hiểm thuốc lá là một trong những việc cần tiến hành thường xuyên nhằm hạn chế sự xới mịn và mắt mát nguồn gen thuốc lá đồng thời để cĩ nguồn vật liệu khởi đầu phong phú phục vụ cho cơng tác chọn tạo giống thuốc lá mới

Trang 4

MUCLUC

TOM TAT NHIEM VU

Chuong 1 TONG QUAN TÀI LIỆU

Chương 2 THỰC NGHIỆM 1 Mục tiêu 2009

2 Nội đung nghiên cứu 3 Phương pháp nghiên cứu 4 Vật liệt

Chuong 3 KET QUA VÀ BÌNH LUẬN

1 Nhân nhanh 04 giéng thuốc lá (SG8, SG9, B54, ChinKB) mang các đặc

tính chống chịu bệnh hại đễ sản xuất hạt giống

1.1 Chọn lọc những địng/giống cĩ đặc tính quý về tính chồng chịu bệnh hại 9 1.2 Một số Hic điểm chính của các dịng/giống thuốc lá 1.2.1 Thời gian sinh trưởng của các dịng/i Ống 1.2.2 Một số chỉ tiêu sinh học của các dong/gidng 1.2.3 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính 1

1.2.5 Một số chỉ tiêu hố học chính thuốc lá nguyên liệu

1.2.6 Chất lượng giống dựa vào tính chat hn 1.3 Kết quả sản xuất hạt của các dịng/giồng Một số yếu tổ cấu thành năng suất và năng suất của các dịng/gi 2 Ứng dụng cơng nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu

2.1 Tạo địch huyền phù vi khuẩn để biến nap

2.2 Chọn lọc invitro sau biến nạp

2.3 Giai đoạn ra cây vào giá thể 2.4 Giai đoạn trồng ra bầu đá

2.5 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen

Trang 5

TOM TAT NHIEM VU

Mục tiêu chính của nhiệm vụ là khai thác và phát triển những giống thuốc 1á mang nguồn gen quý hiếm

Hàng năm, Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá đều tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá các giống thuốc lá mới được bổ sung từ nhiều nguồn khác nhau Các giống được sắp xếp và phân loại theo một số tiêu chí như theo mục đích sử dụng (thuốc lá vàng sấy, thuốc lá nâu phoi ), theo năng suất, phẩm cấp, hàm lượng nicotin, đường khử hoặc đặc tính chống chịu sâu bệnh hại chính

Trang 6

Chương 1 TONG QUAN TAI LIEU

Thuốc lá là cây cơng nghiệp ngắn ngày cĩ giá trị kinh tế cao Cũng như các cây trồng nơng nghiệp khác bệnh và sâu hại luơn là mối đe dọa đến năng suất và chất lượng nguyên liệu thuốc lá Mức độ thiệt hại hàng năm tuỳ thuộc vào từng vùng, từng bệnh mà biến động từ 0-100%, trung bình từ 20-30%, Theo tổng kết của Shew và Luca, 1991 thiệt hại do sâu bệnh hại thuốc lá tại Mỹ lên tới 20%

Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan

tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe Chọn tạo giống

theo hướng chống chịu sâu bệnh là một trong những hướng chọn tạo giống thuốc lá, chính vì vậy những nguồn vật liệu khởi đầu mang những đặc tính chống chịu sâu bệnh cần được bảo tổn, khai thác và phát triển

Biện pháp chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh truyền thống gặp một số khĩ khăn nhất định do tính trạng qui định đặc tính chống chịu sâu bệnh thường

do nhiều gen qui định hoặc gắn với một số tính trạng khơng tốt Để nâng cao

hiệu quả trong chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh, việc ứng dụng cơng nghệ biến đổi đi truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính đã và đang được quan tâm nghiên cứu [1] Gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vi? (vegetative insecticidal protein-protein sinh dưỡng diệt cơn trùng) mã hĩa cho

các protein Vip trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Z, cĩ

hoạt lực và phổ tác dụng điệt cơn trùng cao Gen vi? mã hố các protein hoạt động trong ruột giữa của cơn trùng (gắn với chất nhận đặc hiệu, tạo thành các kênh trao đổi ion gây nên sự mắt cân bằng trao đổi chất, làm tê liệt bộ máy tiêu hĩa của cơn trùng), cĩ hoạt tính kháng sâu xám cao gắp 260 lần so với protein cry 14 và cĩ phổ hoạt động rộng như điệt được sâu xanh hại ngơ, sâu xanh hại thudc 14 [4], [5], [6]-

Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây cơng nghiệp ngắn ngày

cĩ giá trị kinh tế cao Vấn đề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu Căn cứ vào chiến lược phát triển ngành thuốc lá từ nay đến năm 2020 ngành thuốc lá tăng, cường tạo giống trong nước, tạo giống cĩ khả năng kháng sâu bệnh cao và cho

chất lượng tốt phục vụ sản xuất nguyên liệu trong nước và xuất khẩu [3] Để đáp

ứng được chiến lược của ngành thuốc lá, việc khai thác và phát triển những giống thuốc lá cĩ những nguồn gen quý hiếm để phục vụ ngành thuốc lá nĩi tiêng và ngành cơng nghiệp nĩi chung là rất cần thiết

Ứng dụng cơng nghệ biến đổi di truyền để biến nạp gen kháng sâu bệnh

hại quan tâm vào cây trồng cũng là một trong những hướng đi được quan tâm để

Trang 7

giải quyết vấn đề đĩ Trong những năm gần đây, Viện Cơng nghệ sinh học Việt

Nam đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập các gen mã hố cho các protein gây độc với cơn trùng và bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp vào một số đối tượng cây trồng như ngơ, bơng, thuốc lá |[2] Gen vip3⁄4 được các nhà khoa học phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học phân lập, đánh

giá hoạt tính, phổ tác dụng và cơng bĩ trình tự gen tại ngân hàng gen quốc tế (mã số A.1971413 - phụ lục 3) là một trong những kết quả nghiên cứu mới nhất

về gen kháng sâu thế hệ mới cĩ tác dụng diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy (trong đĩ cĩ sâu xanh, sâu xám, sâu khoang hại thuốc lá)

Trang 8

Chong 2 THUC NGHIEM 1 Mục tiêu 2009

- Sản xuất hạt của một số dịng/giống thuốc lá mang đặc tính chống chịu bệnh hại

- Ứng dụng kĩ nghệ di truyền (cơng nghệ sinh học) để tạo giống mang gen chống chịu sâu (iz3A) trên cây thuốc lá

- Bảo tồn an tồn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm

2 Nội đung nghiên cứu

2.1 Nhân nhanh 04 địng/gi ống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang

các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt đầu dịng

2.2 Ứng dụng cơng nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu:

- Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vao cay thuốc lá (giống K326) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Atumerfaciens )

- Bước đầu kiểm tra sự cĩ mặt của gen chuyển vào thơng qua phản ứng PCR với cặp mỗi đặc hiệu

2.3 Bảo tổn an tồn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm

3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nuơi cấy cây trong ống nghiệm theo Murashige & Skoog

1962

- Bồ trí thí nghiệm ngồi đồng ruộng theo phương pháp khối ngẫu nhiên hồn chỉnh, nhắc lại 3 lần

- Số liệu được xử lý theo TRRISTART 5.0, phần mềm excel

- Phương pháp đánh giá chất lượng giống qua phân tích thành phản hố

học nguyên liệu thuốc lá: đường khử (TCVN 7102:2002), đạm tổng số (TCVN

7252:2003), nicotin (TCVN 6679:2000), đlo (TCVN 7251:2003)

- Đánh giá chất lượng giống qua bình hút cảm quan nguyên liệu theo TC 01-2000

- Phân cấp thuốc lá nguyên liệu vàng sấy theo tiêu chuẫn TCN 26 -1 -02 - Kỹ thuật trồng và hái sấy thuốc lá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 618-

2005

Trang 9

giéng duoc dinh gid theo 10 TCN 426-2000 “Quy pham khdo nghiém gidng

thuốc lá ”, phần khảo nghiệm cơ bản

- Chuyển gen vào mảnh lá thơng qua vi khuẩn ⁄L#zmer/ociens (Topping 1998 - phụ lục 4)

-_ Gen sàng lọc cây sau biến nạp là gen kháng kháng sinh Kanamycine

- Kiểm tra sự cĩ mặt của gen chuyển vào trong cây bằng phương pháp PCR với cặp mỗi 35S Fs/Fr (promotor 35S cé trong cau tric gen chuyển vào cây)

4 Vật liệu

- Vật liệu thực vật:

+ Dịng/ giống thuốc lá: 3 dịng SG8, SG9 và B54, giống ChinKB được

chọn lọc để đánh giá và sản xuất hạt đầu dịng, giống K326 được dùng làm giống đối chứng và để chuyển gen kháng sâu viz3A

- Vật liệu vi sinh: Vi khuan 4 fumerfaciens ching C58 mang vector

pBII21 chứa gen vip3A (phy lực 2, 3)

- Hố chất thang marker chudn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine va các hố chất thơng dụng khác

- Thiết bị máy méc, dung cy: BO kit tinh sach DNA, pipetman, may soi Gel (Bio - Rađ), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy đo pH, bộ điện di, máy PCR, bé ổn nhiệt, máy cấy vơ trùng, tủ lạnh sâu

Trang 10

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

1 Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống

1.1 Chọn lọc những địng/giống cĩ đặc tính quý vỆ tính chồng chậu bệnh hại

Hang nim Viện KTKT Thuốc lá đều tiến hành thu thập bổ sung các giống thuốc lá vào trong tập đồn quỹ gen Trong quá trình th khảo sát và đánh giá bước đầu thu được một số đặc tính quý của một số giống Trên cơ sở những đặc tính mơ tả ban đầu chúng tối sắp xếp theo nhĩm giống, lựa chọn một số

giống cĩ những đặc tính tốt để tiếp tục đánh giá vào vụ sau

Năm 2009, chúng tơi chợn lọc và đánh giá một số dịng, giống mang một số

đặc tính quý về tính chồng chịu bệnh hại chính là địng SG8, SG9, BS4 và giống ChinKB Bang 1 Một số đặc điểm quý của các dịng/giĩng thuốc lá

TT | Dịng giống | Địa điểm /năm thu thập Đặc tính quý

1 | Gwngp | Trng Quốc -2006 Kháng bệnh đen thân, năng suất

2 sag | St Gin- 2007 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) 3 sơo - |SàiGịn-2007 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) 4 B84 Bắc Giang - 2007 Kháng bệnh khảm lá (TMV và CMV)

Hai dịng SG8 và SG 9 được thu thập ở phía Nam trong năm 2007, với mơ tả ban đầu của cán bộ thu thập về cho thay trên đỏng ruộng nhiễm tồn bộ bệnh virus

xoăn đọt (héo đĩm cà chua - TSWV) nhưng cĩ một số cây vẫn sinh trưởng rất tốt

Năm 2008 đề tài đã khảo sát, đánh giá và bước đầu cho thấy giống cĩ tỷ lệ nhiễm

bệnh virus thấp (<5%) và cho năng suất trung bình Do vậy năm 2009 chúng tơi

tiễn hành nhân nhanh và khảo sát lại tính chống chịu bệnh vius tại miền Bắc

Dịng B%4 là dịng thuốc lá được chọn lọc trong nước, qua nhiều năm khảo sát đã cho thấy khả năng kháng cao với bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV) và khẩm lá đưa chuột (CMV)

Giống ChinKB là giống thuốc lá do cán bộ Viện sưu tập trong khi đi cơng

tác tại Vân Nam - Trung Quốc với đặc điểm mơ tả ban đầu cho thấy cĩ năng suất cao và khả năng kháng bệnh đen thân tốt, năm 2008 chúng tơi nhân nhanh và khảo

At dic tính của giống trong điều kiện Việt Nam và cĩ những kết quả bước đầu cho thấy giống cĩ tiếm năng năng suất cao (năng suất thực thu trên 22 tạ/ha), kháng bệnh đen thân và nhiễm bệnh virus nhẹ Tuy nhiên khả năng đậu quả khơng tốt

Từ những mẫu cây invitro, chúng tối tiến hành nhân cây của các dịng/giống để khảo sát trong vụ Xuân 2009

Trang 11

Sơ đỗ 1 Sơ đồ nhân invitro cic dong/giéng

1á của cây invitro Cắt các mảnh lá cĩ kích thước 0,5 - 1cm? |

Mơi trường khởi động (3 - 5tuần)

Chọn các mảnh lá phân hĩa mạnh, sạch |

cắt thành các cụm cĩ kích thước 0,5 - 1em4

Mơi trường nhân đa chổi (3- 4 tuần)

Chọn các chỗi phân hĩa rõ rằng, |

cĩ chiều đài 1 - 2cm, cĩ 1 - 2 lá thật

Mơi trường ra rễ @ - 4 tuần)

Chọn những cây cĩ bộ rễ phát triển đầy đủ cĩ 3 - 5 lá thật, cao khoảng 3- 5 cm |

Ra cay va vào bầu (3- 4 tuần) "Trồng ra ruộng

Nam 2009 các dịng/giống được nhân invitro đề đánh giá lại một số đặc tính quý và chọn cá thể tốt để thu hạt Một số đặc điểm chính của các dịng/giống được thu thập thể hiện trong các bảng biểu dưới đây

1.2 Một số đặc điểm chính của các đồng/giơng thuốc lá 1.2.1 Thời gian sinh trưởng của các đồng/giống

_ Thời gian sinh trưởng của các giống giúp người sản xuất chủ động bồ trí sắp xếp thời gian trồng và bĩ trí thời vụ hợp lý Bang 2 Thời gian sinh trưởng của các dịng/giống, ĐVT:ngày

TT Tên dịng | Từ trơng - | Từ trơng - | Từ trồng

Trang 12

Kết quả cho thấy đa số các địng/giống cĩ thời gian sinh trưởng xuất hiện

10% số cây ra nụ từ 54-58 ngày, thời gian ra nụ 90% khoảng 58 đến 60 ngày "Tất cả các giống khảo sát đều cĩ thời gian sinh trưởng đao động trên đưới 110

ngày, phù hợp với cơ cấu cây trồng

1.2.2 Một số chỉ tiêu sinh học của các đồng/giống

Chiều cao cây, đường kính thân và độ dài lĩng liên quan tới khả năng chống chịu vớ kiện ngoại cảnh như mưa, giĩ Những giống cĩ chiều cao trung bình và đường kính thân lớn cĩ khả năng chống chịu khá tốt với điều kiện thời tiết bất lợi như giĩ mạnh, mưa lớn và thường những cây khoẻ sẽ cĩ tiềm năng về năng suất và phẩm chất tốt Độ đài lĩng cịn liên quan đến sự phân bố của lá trên cây cũng như độ thơng thống của tán cây trên đồng ruộng

Số lá và kích thước lá là những yếu tổ liên quan chặt chế đến tiềm năng năng suất của các giống Những giống cĩ số lá sinh học cao (SLSH), kích thước lá lớn sẽ cho tiềm nẵng năng suất cao

Bang 3 Một số chỉ tiêu sinh học về thân và lá của các dịng/giống, xr|„ Tên | CCSH | ¿thẩm* — Tổng SLKT | KTL (cm) dồnggiếeg| em | em | ¿„y | do | “2 | nà [nạ 1 |ChnKB | 1456 | 29 32 | 25 | 173 | 65a | 283 2 | sca 1493 | 29 49 | 222 | 169 |ĩ34|234 3 |5G9 1501 | 2⁄8 49 | 232 | 176 |657|245 4 |BS4 1503 | 27 47 | 242 | 194 [021 | 23,8 5 |K326đc | 1407 | 28 56 | 237 | 184 | 02,5 | 260 ISD sx 402 0.84 Ghi chi: CCSH: chiéu cao sink hoc; ds duémg kinh than cach géc 20 em; SLKT: sé lá kính 8; KTL: lách thước lá

Kết quả cho thấy các giĩng/ dịng đều cĩ chiều cao sinh học cao hơn gi ống, đối chứng K326, đường kính thân và độ dài lĩng tương đương nhau

Dịng SG9 và BS4 cĩ tổng số lá tương đương giống đíc, dịng SG 8 va giống Chin KB cĩ tổng số lá thấp hơn đíc Số lá kinh tế đạt từ 17 - 19 lá Kích

thước lá của giống Chin KB lớn hơn các giống cịn lại, thể hiện tiềm năng năng suất tốt

1.2.3 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính:

Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dịng/giống được thể trong bảng 4 Giống Chin KB, dịng SG 8 và SG 9 bị nhiễm bệnh khảm lá nhẹ giai đoạn sau trồng, địng B54 hầu như khơng bị nhiễm các bệnh hại phổ biến trên

Trang 13

đồng ruộng, thể hiện sức chống chịu khá tốt Như vậy các dịng/giống đều thể hiện được những ưu thế về đặc tính chống chịu bệnh hại chính theo mơ tả ban đầu Bảng 4 Mức độ nhiễm bệnh hại chính của các dịng/ giống Tên Một số bệnh hại chính TT | dịng giống Héo rũ vi khuẩn Denthan | TMV +CMV 1 | ChinKB He â ad 2 |ĐG8 = he 3 |SG9 2 nh 4 | BS4 " z z 5 | K326 We + + cos Gửi chủ: - Khơng bị bệnh - +: Nhiễm bệnh nhẹ (TLB<109)

++: Nhiễm bệnh trung bình (TEB: 10- 209) ; +++:_ Mmẫm bénh nang (TLB >20% )

1.2.4 Một số yếu tơ câu thành năng suất và năng suất cũa các đồng/giơng Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống được thể hiện trong bảng 5 Bang 5 Năng suất và phẩm cắp của các dịng/giống S38 ÿlệ Ad dànggng ise wor thế de " cme “on @ c (%2 (tha) 1 | ChinKB 627 83 23,7 32,0 201 2 |SG8 54,0 79 17,6 33,5 159 3 |SG9 56,3 8,0 25,5 30,5 16,8 4 |Bs4 50,4 9.0 11.8 38.0 178 5 |K326 de 56,9 7,8 30,0 36,5 209 ESD sx 176

Giải chú: KLTĐP: Khối lượng trung bình; NĐ: năng suất

Giống Chin KB cĩ khối lượng lá tươi cao, cĩ tỷ lệ tươi/khơ trung bình,

năng suất tương đương giống đối chứng Dịng SG8 và SG9 cĩ năng suất thực

thu tương đương nhau và tháp hơn giống đối chứng Riêng dịng B$%4 cĩ tỷ lệ tươi/khơ cao, tỷ lệ cấp 132 tháp, cĩ tỷ lệ cọng cao và năng suất thấp hơn so với de

Trang 14

1.2.5 Một số chỉ tiêu hod học chú: thuốc lá nguyên liệu

Chất lượng nguyên liệu của các giống được chúng tơi đánh giá thơng qua một số chỉ tiêu hố học chính Kết quả thu được thể hiện trong bảng 6

Dịng BS4 cĩ hàm lượng đường khử khá thấp (11,8%), các dịng/giống

cịn lại cĩ hàm lượng đường khử trung bình (từ 16-219)

Tắt cả các giống đều cĩ hàm lượng clo dao động xung quanh giá trị 0,5 khơng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng thuốc lá nguyên liệu

1.2.6 Chất lượng giống đựa vào tính chất hút

Kết quả đánh giá chất lượng dịng/giống đựa vào tính chất hút được thể hiện trong bảng 7 Bang 7 Chất hrợng các địng/giống qua bình hút cảm quan ĐVT: Điểm z 5 5 + TT ding ates Huong! Vi me cháy “ae điên 1 |ChinKB 93 | 92 70 6,0 6,0 37,5 2 |SG8 96 | 96 65 6,0 6,0 37,7 3 | sco 92 | 9A 64 6,0 6,0 37,0 4 |BS4 95 | 96 6,9 6,0 6,0 38,0 3 |K326 đíc 95 | 95 65 6,0 6,0 37,5

Các địng/giống đều cĩ hương và vị khá (9,2 - 9,6 điểm), độ nặng vừa phải (6,4 - 7 điểm), độ cháy khá (6 điểm), màu sắc từ vàng cam tới vàng sáng,

tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm), đáp ứng chất lượng nguyên liệu trong

nước

Trang 15

1.3 Kết quả sản xuất hạt của các địng/giống

Tiến hành chọn những cá thể cĩ kiểu hình tương đối đồng đều trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngồi đồng ruộng, bao hoa và thu hạt giống của các dịng/gi ĩng Kết quả được thể hiện trong bảng 8

Bang 8 Kết quả chọn lọc và lượng hạt của các địng/giống

Số cây Téngkhéi | Khốilượng | Tỷ lệ nảy

Hat thu được của các dịng/giống cĩ khối lượng 1000 hạt từ 0,083g đến

0,087g, tỷ lệ nảy mầm đạt 85 đến 879%, đáp ứng chất lượng hạt giống thuốc lá

nguyên chủng (chỉ tiêu chất lượng hạt giống thuốc lá nguyên chủng theo 10TCN

619 - 2005: khối lượng 1000 hạt trên 0,08 g và tỷ lệ nảy mầm trên 85%) Lượng hạt thu được từ 100 - 150g/giĩng, đủ để cung cấp cho 5 -7 ha trồng trong những

năm tiếp theo

2 Ứng dụng cơng nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu

Gen vip thuộc nhĩm gen mã hố protein Vip (vegetative insecticidal protein) Protein cĩ trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa, xuất hiện trong pha sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Z‡, gây độc với hầu hết cơn trùng bộ cánh vảy (7epi4opíea), ngồi ra cịn gây độc đối với một số cơn trùng bộ cánh cứng (Coleopfera) và hai cánh (7Xpfera)

Trong nhĩm gen vip thì gen »ip3A được đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì sen mã hố cho protein 7ip3A cĩ hoạt lực điệt sâu mạnh, phổ hoạt động rộng

Protein /ip3A c6 thé khang cả một số cơn trùng thuộc bộ cánh vay (Lepidoptea)

như sâu xanh hại thuốc lá, sâu khoang, sâu xám mà protein C?y hẳu như khơng cĩ tác đụng

Gen vip3A sit dung trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhĩm nghiên cứu thuộc Phịng cơng nghệ tế bào thực vật - Viện cơng nghệ sinh học Gen được chèn vào vector chuyển gen thực vật pBI121 dưới sự điều khiển của

promotor 35S va dugc biến nạp vào vi khuan A.twnerfaciens ching C58

Trang 16

Sơ đỗ2 Quá trình biến nạp gen vip3A vao thuéc la va sang lọc cây sau biến nạp Chủng khuẩn trên Dịch huyền phù

mơi trường LB đặc vị khuẩn

Biến nap ảnh lá ngâm trong dung

dịch huyền phủ vi khuẩn — Tái sinh đa chỗi

MMảnh lá tiền nuơi cấy

Trồng cây trong bầu đất Ra cây bầu trấu : cát

2.1 Tạo địch huyén phù vi khuẩn đỄ biến nap

Dịng khuan lac A.tumerjaciens ching C58 mang gen vip3A được nuơi hổi

phục trên mơi trường LB đặc cĩ chứa kháng sinh chọn lọc Sau đĩ chọn một dịng,

khuẩn lạc trịn, độc lập trên LB đặc cấy chuyển sang mồi trường LB lỏng cĩ chứa

kháng sinh chọn lọc để để thu địch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyên gen Dịch huyền phù vi khuẩn đươc đo bằng phương pháp đo giá tị mật độ quang,

(Optical Density- OD) ở bước sĩng 600 nm, cĩ giá trị đạt 0,75, đủ điều kiện để

biến nạp vào mảnh lá thuốc lá theo phương pháp đĩa lá

2.2 Chon toc invitro sau bién nap

Sau biến nạp, các mảnh lá được đồng nuối cấy hai ngày trên mơi trường tái sinh chỗi (GM), sau đĩ chuyển sang mơi trường tái sinh chứa kháng sinh chọn lọc

Kanamycine néng d6 30 mg/l (GM Kan 30) Sau 3 tuần các cụm chổi được tách và cấy chuyển sang mơi trường chon loc Kanamycine néng dé 50 mg/l (GM Kan 50) Nhiing chéi phát triển tốt sẽ được tách ra và cấy chuyển sang mơi trường GM Kan 30 lần 2 Sau đĩ chỗi được cấy chuyển sang mơi trường ra rễ tạo cây hồn chỉnh cĩ chứa Kanamycine nồng độ 50 mg/1 (RM Kan 50)

Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các địng qua các giai đoạn khác nhau

thể hiện trong bảng 9

Trang 17

Bảng 9 Tỷ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn chọn lọc invitro DVT:(%) Giai đoạn Cơng thức — — Manhia | Cụmchồ | Raréq@an1) | Raré gần 2) CTTN 77,7 823 733 81,8 BICL 00 00 00 0,0 Đ/C2 93,3 96,7 96,7 96,6 18D», 6,9 34 46 49

Gửi chú: CTTN: cơng thức thí nghiệm; ĐVCI: mẫu khơng chuyẪn gen trên mơi tường, cĩ chứa kháng sinh chọn lọc Kan; ÐVC2: mẫu khơng chuyễn gen trên mơi trường khơng chúa kháng sink chon pe Kan

Giai đoạn chọn lọc mành lá tải sinh da chéi

Ở CTTN, số mảnh lá tái sinh đa chỗi trên mơi trường chọn loc GM Kan 30 khá cao (77,7%) Theo lý thuyết những dịng tái sinh được trên mơi trường cĩ kháng sinh Kan là do trong genom của chúng cĩ mang gen kháng Kan nên cĩ thể kết luận đây là những mẫu đã biến nạp thành cơng, trong khi ở Đ/C1 các mảnh lá khơng tái sinh đa chỏi, vàng dần và chết chứng tỏ trong tế bào của các mảnh lá khơng biến nạp khơng chứa gen kháng Kan nên chúng khơng thể tái sinh trên mơi trường cĩ kháng sinh này Đ/C 2 cĩ tỷ lệ mẫu phân hĩa thành cụm chổi trên mỗi trường GM là 93,3%

Giai đoạn chọn lọc cụm chỗi sau biến nạp:

Những cụm chổi ở CTTN được cắt nhỏ và chuyển sang mơi trường tái

sinh đa chồi GM Kan 50 để tiếp tục chợn lọc, những cụm chỗồi ở Đ/C2 được ding lam vat ligu cho D/C 1 va D/C 2 6 giai đoạn chọn lọc cụm chổi

86 cum chdi tiép tuc phan hod trén mơi trường chon loc (GM Kan 50) dat 82,3%, các cụm chổi cịn lại phân hố chậm và vàng dân, trong khi Ð/C1 100% các cụm chổi phân hĩa chậm hoặc ngừng phân hố ,vàng dân và chết, Đ/C2 cĩ tỷ lệ mẫu tái sinh trên mơi trường là 96,7%

Giai đoạn chọn lọc cây tải sinh hồn chỉnh:

Những chỗi khỏe sẽ được tách ra và chuyển đang mơi trường ra rễ (RM

Kan 50) để tạo cây hồn chỉnh

Số chi tái sinh thành cây hồn chỉnh và sinh trưởng tốt trên mơi trường, RM chon lọc lần 1 (Kan 50) đạt 73,39%, trên mối trường RM chọn lọc lần 2 (Kan 30) đạt 81,8%, phần cịn lại khơng ra rễ, sinh trưởng chậm hoặc ngừng sinh

trưởng trong khi Đ/C1 cĩ 100% chổi khơng ra rễ, vàng dần và chết cịn D/C2 cd

96,559 chỗi tái sinh thành cây hồn chỉnh

Trang 18

Như vậy cĩ thể quá trình chuyển gen và sàng lọc cây sau chuyển gen invitro đã được hồn thành

2.3 Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cất (fÿ lệ 1:1)

Từ những dịng chọn lọc trên mơi trường RM (Kan 50), chọn 16 dịng thuốc lá chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt nhất và đủ điều kiện (cĩ 4-5 lá

thật, cĩ bộ rễ phát triển đầy đủ, cao từ 4-6cm ) để ra cây vào giá thể trấu : cát

(lệ 1: 1)

Đây là bước chuyển cây từ giai đoạn cung cấp các điều kiện sống tối ưu trong phịng sang giai đoạn cây tự tổng hợp, đồng hĩa và dị hĩa các chất từ điều kiện tự nhiên để phục vụ cho các hoạt động sống của mình Bước chuyển cây ra giá thể được coi như bước trung gian để cây cây thích nghỉ từ từ với điều kiện ngoại cảnh và ra rễ mới.Với đặc điểm hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, cĩ thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dịng khi vào giá thể khá cao (91,3%), hệ rễ mới phát triển mạnh, chứng tỏ sự thích nghỉ của cây với điều kiện ngoại cảnh khá tốt, là tiền đề để cĩ những cây khỏe mạnh khi cây sống trong điều kiện ngoại cảnh mới

2.4 Giai đoạn trằng ra bầu đắt

Giai đoạn trồng ra bầu đất là giai đoạn cây được chuyển sang điều kiện tự

dưỡng Sau 14 ngày chuyển các dịng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đặt

trong nhà lưới Tỷ lệ sống của các dịng khi trồng ra chậu vại đất đạt 90 % (tương đương với Đ/C) chứng tỏ cây thích nghỉ tốt với điều kiện ngoại cảnh

'Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hồn chỉnh trên mơi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hồn thành

2.5 Kiểm tra và theo đối kết quả chuyỄn gen

Vào giai đoạn 30 ngày sau trồng, khi cây đã mọc ra lá mới và phát triển

bình thường thì tiến hành thu mẫu lá non của 16 dịng thuốc lá chuyển gen để tách chiết DNA tổng số Các mẫu DNA được kiểm tra với cặp mỗi 35S Fs/Rs để xác định xem gen được chuyển vào cĩ tiếp tục phiên mã và hoạt động trong cây hay khơng bằng phản ứng PCR PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn Đây là phương pháp thường được đùng trong phân tích dịng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao Theo lý thuyết nếu ta cung cấp cặp mỗi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen

nằm giữa hai mỗi đĩ Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển

sen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mỗi đĩ thì ta cĩ thể kết luận rằng cây đĩ đã mang đoạn gen cần chuyển [1], [2]

Promotor 35S được thiết kế trong cấu trúc vector pBI121, nằm trong phần

bờ trái và bờ phải của cấu trúc chứa đoạn gen chuyển vào cây, cĩ tác dụng tăng

cường quá trình phiên mã của gen được chuyển vào Cặp mỗi 35S Fs/Rs được

Trang 19

thiết kế để nhân đoạn gen cĩ kích thước 314 bp Kết quả điện di sin phim PCR của 16 dong thuốc lá chuyển gen được thể hiện trong hình 1

M1234 3 678 9 lđ1112 1314 1516 +

Feel eee eet et

Hình 1: Kết quả điện đi sản phẩm PCE của 16 dịng thuốc lá với cặp mồi 338 Fs/Rs

AW: marhar; 1-16: các dịng thuắc lá chuyén gen đức () : mẫu lá cây khơng chuyén gen

aie (4): plasmit tach từ vị khuẩn A.tumerfactens C58 mang vector pBII21 chita gon vip3A

Toan b6 16 dong thuốc lá chuyển gen (được ký hiệu K326 - v1 đến K326

- v16) đều cho một băng đuy nhất ở vị trí khoảng 300 bp, phù hợp với kích thước tính tốn ban đầu chứng tỏ trong các dịng thuốc lá chuyển gen thế hệ To

đều cĩ sự cĩ mặt của promotor 35S cĩ trong cấu trúc vector pBI121/i73A được

thiết kế trong nghiên cứu

Việc đánh giá sự sinh trưởng, phát triển cũng như đặc tính kháng sâu qua

phản ứng Biotest sẽ được tiếp tục tiền hành trong thời gian tiếp theo 3 Bảo tồn an tồn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm

20 dịng/giống mang các nguồn gen quí được bảo tồn trong ống ngị

thường xuyên cấy chuyển sang mơi trường mới đảm bảo các giống sinh trưởng

phát triển tốt Nguồn hạt giống được bảo quản trong kho lạnh, định kỳ 3

tháng/lần kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của hạt

Trang 20

Bang 10 Danh sách các dịng/giống được bảo tồn

TT dănggống Đặc tính quý Ghi chú

1 |ChinKB | Kháng bệnh đen thân Cây invitro và hạt

2 |SG8 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) | Cây invitro và hạt 3 |SG9 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) | Cây invitro và hạt 4 |BS1 Kháng bệnh khảm lá (TMV và CMV) _ | Cây invitro và hạt 3 |K326-vi | Mang genkháng sâu (vi234) Cây invitro thế hệ T, 6 |K326-v2 |Mang genkháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, 7 |K326-v3 | Mang genkháng sâu (9i23⁄4) Cây invitro thế hệ T, 8 |K326-v4 |Mang gen kháng sâu (vip3.4) Cây invitro thé hé T, 9 |K326-v5 | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, 10 |K326-v6 | Mang gen kháng sâu (vip 3.4) Cây invitro thé hé T, 11 |K326-v7 | Mang gen khang sau (vip 3.4) Cây invitro thé hé T, 12 |K326-v8 | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, 13 |K326-v9 | Mang gen kháng sâu (vip 3.4) Cây invitro thé hé T, 14 |K326 -v10_ | Mang gen kháng sâu (viz3⁄4) Cây invitro thế hệ T, 15 |K326 -v1l | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, 16 |K326 -v12 | Mang gen kháng sâu (vip3⁄4) Cây invitro thế hệ T, 17 |K326 -v13_ | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, 18 |K326 -v14 | Mang gen kháng sâu (vi23⁄) Cây invitro thé hé T, 19 |K326 -v15 | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thế hệ T, 20 |K326-v16 | Mang gen kháng sâu (vi23⁄4) Cây invitro thé hé T, KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 1.1 Nhân nhanh 04 giống thuốc lá mang các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống

Nhân invitro, đánh giá lại đặc tính quý của 4 dịng/gi ống thuốc lá về tính chống chịu bệnh hại (03 dịng: SG8, SG9, BS4 và giống ChinKB) Kết quả cho thấy

Trang 21

dong SG8, SG9 va giéng Chin KB hau như khơng xuất hiện bệnh đen thân và

héo rũ vi khuẩn, bị nhiễm bệnh khảm lá nhẹ giai đoạn sau trồng, dịng B%1 khơng bị nhiễm b: i, thể hiện sức chống chịu tốt với bệnh hại chính trên

đồng ruộng trong đi phía Bắc Giống Chin KB cĩ tỷ lệ tươi/khơ trung bình, năng suất tương đương giĩng đối chứng K326 Dịng SG 8 và SG9 cĩ hàm

lượng nicofin cao hơn đối chứng, năng suất thực thu tương đương nhau và thấp hơn giống đối chứng Riêng dịng B%4 cĩ tỷ lệ tươi/khơ cao, tỷ lệ cấp 1+2 tháp, cĩ tỷ lệ cọng cao, năng suất và hàm lượng đường khử thấp so với đíc Các địng/giống đều cĩ hương và vị khá, độ nặng vừa phải, độ cháy khá, màu sắc từ

vàng cam tới vàng sáng, tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm)

Chọn lọc những cá thể sinh trưởng phát triển tĩt, đồng đều để thu hạt giống Lượng hạt giống thu được từ 100 -150g địng/giĩng, đạt yêu cầu về chất lượng hạt nguyên chủng (khối lượng 1000 hạt trên 80 mg, tỷ lệ nảy mầm trên 859)

1.2 Ứng dụng cơng nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu

Chuyển thành cơng gen kháng sâu vip3A đưới sự điều khiển của promotor 35%

vào 16 địng thuốc lá K326 thơng qua vi khuan A.twnerfaciens ching C58

Kết quả kiểm tra sự cĩ mặt của gen vip3A trong 16 dong thuốc lá chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mơi đặc hiệu là 355 Fs/Rs cho thấy tồn bộ 16 dịng

thuốc lá chuyển gen (100%) đều cho một băng cĩ kích thước khoảng 300 bp, chứng tỏ sự cĩ mặt của gen được chuyển vào 16 dịng thuốc lá chuyển gen

1.3 Bảo tổn an tồn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm

20 địng/giống mang nguồn gen quí được thường xuyên cấy chuyển sang mơi trường mới, Nguồn hại giống được bảo quản trong kho lạnh đảm bảo các

địng/giống sinh trưởng phát triển tốt

2 Kiến nghị

- Đề nghị Hội đồng KHKT Bộ CN nghiệm thu nhiệm vụ năm 2009 và cho phép tiếp tục thực hiện nhiệm vụ trong những năm tiếp theo

Hà Nội, ngày thang nam

Xác nhận của đơn vị chủ trì Chủ nhiệm dé tai

Trần Thị Thanh Hảo

Trang 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội Cơng nghệ sinh học thực vật trong

cải tiền giống cây trơng NXB Nơng Nghiệp - 1997

Lê Trần Bình, Phan Văn Chỉ, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang

Huan Ap dung cde kĩ thuật phân từ trong nghiên cứu tài nguyên sinh

vật Việt Nam NXB Khoa học và kĩ thuật - 2003

Hồng Tự Lập và cs Giáo frình thí nâng ngạch viên chức Tơng cơng ty Thuốc lá Việt Nam năm 2008- 2009

Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương

Thảo Giáo £rinh cơng nghệ sinh học nơng nghiệp NXB NN - Hà Nội - 2005

Crickmore, N., Ziegler, D.R., Fietelson, J., Schnepf, E.,Van Bie, J., Lereclus, D., Baum, J and Dean, DH Revision of the nomenclature for Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiology and Molecular Biology Review 62:807-813; 1998

Yu, C-G., M A Mullins, G W Warren, M G Koziel, and J J Estruch ‘The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein ip34 Iyses midgut epithelium cells of susceptible insects Applied and Environmental Microbiology 63:532-536; 1997

Trang 23

PHY LUC

Phụ lục 1: Thành phần mơi trxdng MS (Murashige va Skoog, 1962) Phụ lục 2: Cầu trúc vector pBI121 Phụ lục 3: Trình tự gen viz3A Phụ lục 4: Phương pháp chuyển gen quan tâm vào cây thuốc lá (cải tiến) (Topping, 1998) Phụ lục 5a: Kết quả xử lý số liệu ngồi đồng ruộng

Phụ lục 5b: Kết quả xử lý số liệu trong phịng thí nghiệm Phụ lục 6: Các hỗ sơ liên quan đến nhiệm vụ

Quyết định giao nhiệm vụ Hợp đồng

Thuyết minh

Biên bản nghiệm thu cấp cơ sở

Bài phản biện của Hội đồng cấp cơ sở

Trang 24

Phụ lục 1 Thành phần mơi trường MS (Maurashige và Skoog, 1962) Nhĩm Hĩa chất Hàm lượng (mg) ENO; 1900 NHANOs 1650 Đa lượng MgSO, 180,54 KPO 170 CaCl 332,02 H;BO; 62 MSO, 22,3 ZnSO, 8,6 KI 0,83

Trung va Vilwong NayMoOs Rie 0.25

Trang 25

Phy lục 3 TRÌNH TỰ GEN vip3A

Locus AJ971413p DNA linear BCT L9-MAY-2005

DEFINITION Bacillus thuringiensis vip3A gene for vegetative insecticidal protein

ACCESSION AJ971413

VEBSTON AJ971413.1 GL:66351675

ORGANISM Bacillus thuvingiensis

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;

Bacillus cereus group REFERENCE 1

AUTHORS Pham,N.B., Le,N.H., Pham,T.T., Chu,H.H, and Le,B.T

TITLE Cloning and sequence analysis gene encoding the vegetative

insecticidal protein (VIPSA] of some Vietnamese -B

thuringiensis strains JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 2370) AUTHORS —Pham,N.B

TITLE —Diect submission

Trang 26

eps /gene~"vip3Rn 1 2370 /gene—"vip3Rn /eodon_ start~L /tranel_table-LL /product-"vegetative insecticidal protein" /protein_id-"CAL96522.1" /db_xvef-"GL: 66351676" (/ae_xve £-"GOR:QaveTo" /db_xvef-" InterPro: 122003305" /de_xvef-"IoterPro:IPR008927" /db_xvef-"IotexPro:1PR008979"

(/db_xve f-"UniProtkB/TYEMBL :QavYTO"

/txans Lat Lon—"MNKNNTKLSTRALP SF LDYPNGLYGPATGIEDIMNMIPETDTGG DLTLDELLENQQLLNDL $GKLOGVNGSLNOLIAQGNENTELSKEILRIANEQNQVLND VUNKLDAINTMLAVYLP KI TSMLSDVMKQNYBLSLLEYLSKQLOBISDELDLINYNY LINSTLTELTPAY QRIK YVNEKFEELTPATETSSKVKKDGSPADILDELTELTELAKS \VIKNDVDGP EP YLNTPH DVMVGNNLEGRSALKTASELLTRENVRTSGSEVGNVENELE VLTALQBKBPLTLTTCRKLLGLAD LDYTSIMNEHLNKEKEBPRVNLLPTLSNTPSNEN YARVKGSDEDAKMIVEA KP GHALIGPELSNDSLTVLRVYEAKLRQNY QVDRDSLSEVI YGDMDKLLCPDQSHQIY YTNNIVEPNEYVITELDPTREMKTLAYEVTANPYDSST GEL GLNKKRVESSERBYRTL SANDDGVYMPLGVISETELTPINGEGLQADENSRLITLTCK SY¥LRELLLATDLSNKET KLIVEP SGP LSNLVENGS LBEDNLESWKANNENAYVDHTGG

Trang 27

VNGTKRLYVHEDGGESQPTGDKT.KPKTBYVTQYTVRGEPSTHLKDENTGY THYED TNN NLEDYQTINKRPTTGTDLEGVYLILKSQNGDBANGONE LILBISPSEKLLSPELINTN NUTSTGSTNESGNTLTL YQGCRGILRQNLQLOSESTYRVYPSVSGORNVRIENSREVE PEKRYMSGAKOVSEMETTRPERONEYLELSQGNNLYGGPLVEPYOVS LK" GRTGTN

1 atgaaCaaga ataatactaa attaagcaca agAgCCttac caagttttat tợattatttt 6L aatggeattt atggatttge cactggtate aaagacatta tợaacatgat ttttaaaacg 121 gatacaggtg gegatctaac cctagacgaa attttaaaga atcageagtt actaaatgat Lal aterctggta aattggatgg ggtgaatgga agettaaatg atettatcgc acagggaaac 241 traaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgeaa atgaacaaaa teaagettta 301 aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatge ttcgggtata tetacctaaa 361 attaccteta tgttgagtga tợtaatgaaa caaaattatg cgctaagtet gcaaatagaa 421 tacttaagta aacaattgea agagattter gataagttgg atattateaa tgtaaatgta 481 cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgegtate aaaggattaa atatgrgaac 541 gaaaaatttg aggaattaac teetgctaca gaaactagtt caaaagtaaa aaaggatgge 601 tctectgcag atattertga tgagttaact gagttaactg aactagcgaa aagtgtaaca S61 aaaaatgatg tợợatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 721 aataatttat tegggegtte agctttaaaa actgcategg aattaattac taaagaaaat Tal gtgaaaacaa geggeagtga ggtcggaaat gtttataact tcttaategt attaacagct 241 ctgeaageaa aagettttct tactttaaca acatgcegaa aattattagg ctragcagat 901 attgattata ctEctattat gaatgaacat teaaataagg aaaaagagga atttagagta 961 aacateetee ctacacttte taatactttt tetaatccta attatgcaaa agttaaagga 1021 agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgeatt gattgggtte 1081 gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1141 tateaagteg ataaggatte cttateggaa gttattratg gtgatatgga taaattatrg 1201 tgeceagate aatctgaaca aatctattat acaaataaca tagtarttce aaatgaatat 1261 geaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacageg 1221 aarttttatg artettctac aggagaaatt ggcttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1381 gaageggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg tgtatatgee gttaggtgte

1441 atcagtgaaa catttttgac tecgattaat gggtttggee tecaagetga tgaaaattca

Trang 29

Phụ lục 4 Phương pháp chuyển gen quan tâm vào cây thuốc lá (cãi tiến)

(Topping, 1998)

TT các bước Hội dụng thực hiện

1 Cây ria vạch khuẩn lạc ra đĩa cĩ chứa LB đặc cĩ bổ sung kháng sinh chọn

lọc U trong 28°C trong 2 ngày

£ Chuẩn bị mảnh cấy thuốc lá bằng cách cất các mảnh lá thành các mẫu cĩ

kích thước khoảng 1 cm”, đặc trên mơi trường GM trong 2 ngày

3 Một ngày trước khi biến nạp, nuơi một khuẩn lạc vào 2ml LB lỏng cĩ bổ

sung kháng sinh chọn lọc, nuơi lắc 2000/p trong 7-8 giờ, sau dé hit Imi dịch khuẩn tren cấy chuyển sang 50 mÌ LB lỏng cĩ bổ sung kháng sinh, nuơi qua đêm (16 -20 giờ)

4 Điển nạp:

- Khuẩn sau khi nuơi qua đêm được đem đo ODàp= 0,5 - 1 thì sử dụng để biến nạp

- Các mảnh lá sau 2 ngày nuơi cằm ứng trên mơi trường GM được chuyển sang dia petri cĩ chứa 5 ml dung dịch MS lỏng

- Đỗ dịch khuẩn vào đĩa petri cĩ chứa mảnh lá ở trên

4 Sau 10 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khơ và cấy lên mơi trường GM khơng cĩ kháng sinh, đồng nuơi cấy 02 ngày

6 Sau 02 ngày, cấy chuyển các mảnh lá sang mơi trường GM cĩ bễ sung

Cefotaxim 400 mg/l +Kanamycine 30 mg/l

7 Sau 2-31 các chỗi hình thành được cắt và cấy chuyển sang mơi trường

GM cé b3 sung khang sinh Cefotaxim 400 mg/l +Kanamycine 50 mngil

8 Các chồi đài 2-3 cm thì được cắt và cấy chuyển sang mơi trường ra rễ RM

cĩ bỗ sung khang sinh Cefotaxim 400 mg/l + Kanamycine 50 mg/l

9 Các cây con cao 5 ~7 cm thì được cét va chuyén sang mi trong raré RM

cĩ bỗ sung kháng sinh Cefotaxim 400 mgfl + Kanamycine 50 mg/l méi

10 Cây con ra rễ nhiều , cao 5 “7 cm thì được đưa ra bầu chứa giá thể trấu : cát

(it)

11 Sau 7 -14 ngày trồng cây ra bầu đất trong nhà kính 12 Tiền hành các nội dung kiểm tra cây sau chuyển gen

13 Thu hạt để phân tích các thể hệ san

Chú ý: Tắt cả các bước đều cĩ kèm cơng thức đối chứng Ghỉ chủ: thành phân các loại mơi trường

Trang 30

Mơi trường Thành phần

GM (TA sinh) MS+BÁP Imgfl + Sucrose 30 g/l + agar 9 g/l, pH=5,8 RM (Ra rỗ) MS +IBA 0,1mg/l + Sucrose 30 gil + agar 9 g/l, pH = 5,8 LBléng Bacto pepton 10 gil +Nacl 10 g/l + Yeast Extract 5 g/l, pH =7 1B đặc TP lễng + agar 16g/1

Phụ lục 5a KẾT QUẢ XỬ LÝ SĨ LIỆU NGOAI DONG RUONG

Trang 33

VARIATE GRAND MEAW STANDARD DEVIATION cor v [ets [ew '

om 1st soytean | I Il

wo BASED oy BASEDOM | H i

ons TOTAL $3 RESID ss 1 1 i set 1s 23.1407 Geedad — 0.4468 1.9 0.0033 0.8688 cose "`" ae aes 0.0027 0.4358 us as 18.309 2.1517 0.0366 ¬ 0.2302 Phụ lục 5b KẾT QUẢ XỬ LÝ SĨ LIỆU TRONG PTN BALANCED ANOVA FOR VARIATE © TIML FILE BAOLY 16/ 9/ 9 10:33 PAGE 1 Thi nghiem bo eri hoan toan ngau ohien THẾ: cy Le nanh 1a TLce: ey Le cum choi

Trang 34

* TOTAL (CORRECTED) 3/15082.0 1882.75 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCC FILE BAOLY 16/ 9/ 8 10:33 PAGE 2 Thi nghiem bo eri hoan toan ngau nhien THẾ cy Le manh 1a TLce: ey Le cum choi

TIRRL: ey le ra re chon lec lan 1 TIRR2: cy le ra re chon lec lan 2 VARIATE voo4 TLCC LM SOURCE OF VARIATION DE SUMS OF — MEAN — E RATTD PROB ER SQUARES SQUARES LW 1iere 216328.7 8184.353 *****+ 0.000 2 * RESIDUAL 617.3320 2.88867 * TOTAL (CORRECTED) 8 16346.0 2043.25 BALANCED ANOVA FOR VARIATE © TLRRL FILE BAOLY 16/ 9/ 9 10:33 PAGE 3 Thi nghiem bọ trí hoạn toan ngau nhiền THẾ cy Le manh 1a TLce: ey Le cum choi

TIRRL: cy le ra re chon lec lan 1 TIRR2: ty le ra re chon lec lan 2

Trang 35

VARTATE V005 TLRRI LM SOURCE OF VARIATION DE SUMS OF MEAN © F RATIO PROR ER SQUARES SQUARES LW ers 21s266.7 7633.33 **xx*+ 0.000 2 * RESIDUAL 631.3339 922231 * TOTAL (CORRECTED) 8 1sz98.0 1912.25 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TUER2 FILE BAOLY 16/ 9/ 9 10:35 PAGE 4 Thi nghiem bọ eri hoan toan ngau nhien Tuer cy le manh 1a TLce: ey Le cum choi

Trang 36

MEANS FOR EFFECT CTS

Thi nghiem bọ trí hoạn toan ngau nhiên THẾ cy le nanh 1a

TLce: ey Le cum choi

TIRRL: ey le ra re chon lec lan 1 TIRR2: ey le ra re chon lec lan 2 PAGE 5 crs crm pen pe 3) DE oo SaLED 0 wos Ta mice TLRRL 77.6667 82.3333 73.3333 0.000000 0.000000 0.000000 93.3333 96 6867 96.6667 2.01844 0.981270 1.31938 6.00000 6.00000 6.00000 5.8821 3.39437 4.56395, TLRR2 e1-e000 0.000000 96.9687 1-41414 6.00000 4.00382 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARV TABLE FILE HAOLV 16/ 9/ 9 10:33 Thi nghiem bo tri hoan toan ngav nhien THẾ: cy Le nanh 1a THCC: ey Le cum choi

TIRRL: cy le ra re chon lec lan 1 TIRR2: ty le ra re chon lec lan 2

35

Định dạng
Số trang	37
Dung lượng	4,44 MB