BÁO CÁO TỎNG HỢP
NHIEM VU HOP TAC QUOC TE KHOA HOC
VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
TÊN NHIỆM VỤ
HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG PHAT TRIEN DICH TE HOC PHAN TU’
MỘT SÓ VIRÚT GÂY BỆNH Ở NGƯỜI
Cơ quan chủ trì: VIỆN VỆ SINH DỊCH TẾ TRUNG ƯƠNG
Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS LÊ THỊ KIM TUYẾN
8185
Trang 2SAN PHAM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUÓC TÉ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
Tên nhiệm vụ
HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC
TRONG PHAT TRIEN DICH TE HOC PHAN TU MOT SO VIRUT GAY BỆNH Ở NGƯỜI
Cơ quan cha tri: VIEN VE SINH DICH TE TRUNG UONG Chi nhiém nhiém vu: TS LE TH! KIM TUYEN
Trang 3
MỞ ĐẦU 1
Chương 1.TÔNG QUAN 3
1.1 CÔNG NGHỆ TIN SINH HỌC 3
1.1.1 Khái niệm về Tin sinh học 3
1.1.2 Lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học 4
1.1.2.1, Phân tích trình tự 4
1.1.2.2 Tim kiếm gen 5
1.1.2.8, Dò tìm đột biên 5
Sosdnh trình tự 6
Bảo tân đa dạng sinh học 6
1.1.3 Công cụ phân mềm Tin sinh học 7
mém Tin sinh hạc miễn phí 7 mém Tin sinh hoc thuong mai 8
1.1.3.3 Phan mém Tin sinh học bản quyền BioNumerics 8
1.2 UNG DUNG TIN SINH HOC TRONG NGHIEN CUU DICHTE HOC PHANTU BENH 9 Ở NGƯỜI
1.2.1 Khái niệm về Dịch tễ học phân tử 9
1.2.2 Dịch té hoc phan tlr bénh séi H
1.2.2.1 Vinit soi H
1.2.2.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân từ bệnh sôi "
1.2.3 Dịch té học phân tử bệnh Rubella 14
1.2.3.1 Vint Rubella 14
1.2.3.2, Nghiên cứu dịch 8 hoc phan sk bénh Rubella 15
1.2.4 Ứng dụng Tin sinh học trong nghiên cứu Dịch tễ học phân tử 16
Chuong 2 - PHUGNG PHAP NGHIEN CUU 19
Trang 42.1.2 Đào tạo và chuyến giao Công nghệ Tin sinh học tại Việt Nam
2.2 UNG DUNG TIN SINH HỌC TRONG NGHIÊN CỨU BAC DIEM GENOTYP CHUNG VIRUT SOI VA RUBELLA LUU HANH TAI CAC VUNG BIA LY DAN CU’
2.2.1.Phương pháp Sinh học phân tử ứng dụng trong phân tích genotyp chủng virút sởi và Rubella
2.2.1.2 Gây nhiễm chủng vindt trên nuôi cấy tễ bào
2.2.1.3 Tách chiết ARN vinit
2.2.1.4 Phương pháp nhân gen bằng RT-PCR và Nested PCR 2.2.1.5 Phương pháp RELP 2.2.1.6 Phương phdp multiplex realtime PCR 2.2.1.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotit 2.2.2 Phân tích genotyp chủng virút sỏi và Rubella bằng phản mềm Tin sinh học BioNumerics 3.2.2.1 Phân tích genopyp chủng vinit bằng phân mềm “BiaNumerics sequence”
2.2.2.2 Phan tich genotyp ching vinit bang phén mém “BioMumerics fingerprint” 2.2.2.3 Dung cây phả hệ phát sinh loài bằng phan mém “BioNumerics Tree and
Netword Inference”
Chuong 3 KET QUA VA BAN LUẬN
3.1 HOP TAC NGHIEN CUU VA CHUYEN GIAO CONG NGHE TIN SINH HOC UNG DUNG TRONG DICH TE HOC PHAN TU’
3.1.1, Kết quả nghiên cứu và chuyén giao Céng nghé Tin sinh hoc
3.1.2 Kết quả so sánh và chọn lựa các chương trình Tin sinh học phù hợp
3.2 KÉT QUÁ ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC DIEM
GENOTYP CHUNG VIRUT SOI VA RUBELLA LƯU HÀNH TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ DÂN CƯ KHÁC NHAU
Trang 53.2.2 Gidi trinh tu nucleotit doan gen glycoprotein £1 virlit Rubella 3.2.2.1 Tach chiét ARN vinit Rubella
3.2.2.2 Két qud RT-PCR khuéch đại ADN gen E1 virit Rubella
3.2.2.3, Gidi trinh tye nucleotit gen E1 vinit Rubella
3.2.3 Két qua multiplex realtime PCR xac dinh vinit séi va Rubella
3.2.3.1 Kết quả mutliplex PCR
3.2.3.2 Két qud mutliplex realtime PCR
3.24 Ứng dụng phân mém BioNumerics trong xác định genotyp chủng virút sởi & Rubella
3.2.4.1 Kết quả chọn lựa chương trình phân mêm Tìn sinh hạc phù hợp
3.2.4.2 Kết quả ứng dụng phân mễm BioNumerics trong phan tich genotyp vinit
sổi và Rubella
3.2.4.3, Ban dé dich t8 phan bé cde genotyp vinit séi va Rubella 3.2.5 Banh gia hiéu qua vé khoa học công nghệ
Trang 6Trong vài thập kỷ qua, Sinh học phân tử được đánh giá là một ngành khoa học với những bước phát triển mạnh mẽ Hàng loạt công cụ ứng dụng sinh học ra đời góp
phan thúc đẩy quá trình phân tích và giải mã các đữ liệu thông tin thu được từ các
nghiên cứu sinh học ở mức độ phân tử ADN Có thể nói chưa bao giờ thông tin sinh
học trở nên phong phú và đa dạng như hiện nay Để giải mã khối lượng thông tin đồ sộ
như vậy, Công nghệ thông tin đã được ứng dụng vào Sinh học một cách khá triệt để Tin sinh học ra đời, chính là sự kết hợp khoa học giữa Công nghệ thông tin và các thành tựu nghiên cứu sinh học ở mức độ phân tử ADN
Những thành tựu của Tin sinh học đã hỗ trợ mạnh mẽ trong việc đưa Sinh học,
Y học vào giải quyết những công việc thực tiễn, thúc đẩy nhanh quá trình chẩn đoán
bệnh, tìm ra các y được phẩm mới, vắcxin phòng địch, kít chẩn đoán Tin sinh học còn là công cụ hữu ích trong việc xử lý các dữ liệu thông tin về trình tự ADN của các
bộ gen, lập bản đề phát sinh và phân bố các genotyp của các loài vi sinh lưu hành theo vùng địa lý và theo thời gian Điều này là cần thiết trong nghiên cứu giám sát dịch tễ học phân tử nhằm ngăn chặn dịch bệnh nguy hiểm ở người
Lĩnh vực Tin sinh học vô cùng phát triển trên Thế giới Việc đưa Tin học vào
Sinh học đã và đang được quan tâm bởi hầu hết các nước phát triển Trong khu vực
Châu Á, các nước như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản đã và đang có những đột phá
trong lĩnh vực này Đối với Việt Nam, Tin sinh học là ngành khoa học non trẻ và cũng
chỉ xuất hiện ở các Viện nghiên cứu và trong một vài trường Đại học lớn và cũng chỉ
dừng lại ở trong giới nghiên cứu về Công nghệ sinh học Điều thiết yếu cần có trong
Tin sinh học là những ngân hàng dữ liệu cho phép mọi người đế dàng truy cập thông
tin Thứ hai nữa là cần có những phần mềm tin học làm công cụ để phân tích những dir liệu trong ngân hàng sinh học này Tuy nhiên, ở nước ta, việc tạo ra các sản phẩm phần mềm để đưa vào áp dụng võ cùng hiếm hoi Đội ngũ những người làm Tin sinh học
còn hạn hẹp Để có được những ngân hàng dữ liệu đặc hiệu cho hoàn cảnh Việt Nam,
Trang 7đề hiện nay của Sinh học Việc đào tạo kỹ năng nghiên cứu độc lập và khả năng cộng
tác với các đồng nghiệp trên Thế giới của đội ngũ khoa học này sẽ là điều kiện thiết yếu trong quá trình phát triển của Tin sinh học Việt Nam
Xuất phát từ những đòi hỏi cấp bách và thực tiễn của ngành Tin sinh học Việ
Nam, với định hướng phát triển và ứng dụng công nghệ Tin sinh học trong nghiên cứu
dịch tế học phân tử, nhiệm vụ hợp tác quốc tế giữa Viện Vệ sinh Dịch tế TƯ và Viện
Pasteur Paris, Pháp “Hợp tác nghiên cứu ứng dụng Tin sinh học trong dịch tễ học phân tử một số virút gây bệnh nguy hiểm ở người” đã được triển khai nhằm đạt hai mục tiêu chính:
1 Hợp tác nghiên cứa và chuyễn giao công nghệ Tin sinh hoc (Bioinformatic) ứng đụng trong Dịch tễ học phân tử một số vinút gây bệnh ở người,
2 Ứng dung Tin sinh học trong nghiên cứu đặc điểm genotyp của mét 96 ching vinit
(Rubella, sối) la hành tại cde ving dia lý dân cư khác nhau
Việc xây dựng các ứng dụng Tin sinh học hỗ trợ trong nghiên cứu và chuyển giao công nghệ Tin sinh học là vô cùng cần thiết, qua đó giúp chúng ta nhanh chóng
hoà nhập với cộng đồng ngoài nước, mở ra cơ hội hợp tác nghiên cứu khoa học với các
nước trong khu vực và trên thế giới Hơn thế, việc ứng dụng rộng rãi và thành công của Tin sinh học trong nhiều lĩnh vực Sinh học đóng góp phần thiết yếu trong việc thúc đây
Trang 81.1.2 Lĩnh vực nghiên cứu chính của Tin sinh học
Thực chất Tin sinh học gắn liền với nhiều ngành khoa học khác nhau, nghiên
cứu trên nhiều lĩnh vực khác nhau, nhằm thu thập, lưu trữ và phân tích các đữ liệu sinh
học Kết quả của những nghiên cứu này tạo ra các phần mềm giúp giải quyết một số vấn để xung quanh việc tìm hiểu về gen, protein và một số vấn đề khác liên quan đến Sinh học phân tử
1.1.2.1 Phân tích trình tực
Kể từ khi bộ gen của Phage Œ-X174 được xác định trình tự (1977) cho đến nay, trình tự ADN của rất nhiều loài sinh vật đã được lưu trữ trong các ngân hàng cơ sở dữ
liệu gen Việc so sánh các gen trong cùng một loài hay giữa các loài khác nhau có thể cho thấy sự tương đồng về chức năng của protein, hay mối quan hệ phát sinh chủng loài giữa những loài này thể hiện trên cây phát sinh chủng loài (olylagenetre tree) Với
sự tăng trưởng khổng lồ của dữ liệu loại này, việc phân tích trình tự ADN một cách thủ công trở nên không thể thực hiện nỗi
Ngày nay, các chương trình máy tính được sử dụng để giúp tìm các trình tự tương đồng trong bản đỗ gen của hàng loạt sinh vật, với số lượng nucleotit trong trình tự lên đến hàng tỷ Những chương trình này có thể tìm kiếm những trình tự ADN khơng giống nhau hồn tồn đo các đột biến nueleotit gây nên bởi sự thay thé, mat hay thêm các gốc bazơ Thuật ngữ bắt cặp trình tự (sequence alignment) duge áp dung ngay cả trong quá trình xác định trình tự ADN, là kỹ thuật xác định trình tự đoạn nhỏ (shotgun sequencing) Kg thuat này đã được công ty Celera Genomies sử dụng để xác định trình tự genom của vi khuẩn Haemophilus influenza Ky thuft x4e định trình tự
hiện nay không thể tiến hành với cả đoạn ADN lớn cỡ vài chục nghìn nueleotit trở lên nên cần phải xác định trình tự nhỏ để giải mã hàng nghìn đoạn trình tự với kích thước
khoảng 600-800 nueleotit Sau đó, những đoạn trình tự nhỏ này được sắp xếp thứ tự và
Trang 9
(genome assembly algorithms) 14 mét trong những lĩnh vực nóng của tin sinh học
[23] Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm tại các Viện nghiên cứu đầu ngành của VN cũng đang triển khai kỹ thuật lắp ráp genom trong việc xác định trình tự nucleotit hoàn
chỉnh của các genom virút (cúm H5N1, SABRS) và đã bước đầu thành công [9], [14]
1.1.2.2 Từm kiếm gen
Trong nghiên cứu bản đồ gen (genomies), thuật ngữ annotation là quá trình đánh dấu các gen và các đặc tính sinh học khác trong một chuỗi ADN Không phải tất cả các nucleotit bén trong một genom đều là gen Phần lớn các ADN bên trong genom của
sinh vật bậc cao là các đoạn ADN không phục vụ cho một nhiệm vụ cụ thể nào được
gọi là những đoạn ADN rác Tin sinh học giúp cho việc tìm kiếm tự động các gen và
những trình tự điều khiển bên trong một genom Hệ thống phần mềm làm nhiệm vụ
“genome annotation” dau tiên đã được thiết kế vào năm 1995 bởi Owen White cho giải mã vi khuẩn Haemophilus trluenza Tác giả White đã xây dựng hệ thống phần mềm này để tìm kiếm các gen nằm trong chuỗi ADN làm nhiệm vụ mã hoá các protein, ARNt van chuyén và các chức năng khác tạo nên chức năng đầu tiên của các gen đó
Hiện nay, hầu hết các hệ thống genome annotation đều hoạt động tương tự nhưng các
chương trình nhằm để phân tích lĩnh vực nghiên cứu bản đề gen ADN thường xuyên được cải tiến [3]
1.1.2.3 Do tim đột biến
Bất nhiều các nghiên cứu xác định trình tự (sequencing) hién nay là nhằm tim ra các đột biến diém (point mutation) xây ra trên các gen khác nhau Tập các dữ liệu
được tạo ra đòi hỏi các hệ thống tự động đọc những dữ liệu kiéu chudi ndy (sequence
đata) rồi so sánh trình tự kết quả với các trình tự đã biết trên genom Những hệ thống
oligonucleotit microarray cho phép nghiên cứu đồng thời hàng trăm ngàn vị trí trên
toàn bản đồ gen đang được sử dụng để xác định những đột biến thêm và mất đoạn
Trang 101.1.2.4 So sánh trình tực
Khi so sánh trình tự sinh học, có hai vấn đề được đặt ra, đó là việc so sánh đối xứng toàn cục và so sánh đối xứng cục bộ So sánh đối xứng toàn cục là quá trình so
sánh đối xứng cho toàn bộ các phân tử của hai trình tự Mỗi một phân tử của một trình
ột ký tự
tự sẽ được so sánh đối xứng với một phần tử của trình tự kia hoặc ứng với
trồng (gap) Khác với so sánh đối xứng toàn cục, so sánh đối xứng cục bộ chỉ thực hiện
việc so sánh đối xứng trên một số phân của các trình tự được so sánh So sánh đối xứng
cục bộ có ý nghĩa sinh học lớn hơn so sánh toàn cục vì thông thường không phải tắt cả các phần tử trong trình tự tham gia vào việc xác định đặc tính sinh học của trình tự Một số chương trình Tin sinh học đóng vai trò công cụ hỗ trợ cho việc so sánh trình tự Giải thuật so sánh trình tự đối xứng hiện đang được sử dụng là Needleman-Wunsch và
Smith-Waterman Chức năng so sánh này nằm trong modun ClustalX Công dụng của
chương trình cho phép nhập và so sánh các đoạn trình tự hoặc các tập tin so sánh dạng FASTA, phylip, v.v [14], [31]
1 Bảo ton du dung sinh học
Tin sinh học thường áp dụng trong lĩnh vực bảo tồn đa dang sinh học
(QGiodiversity) Tinh da dang sinh học lớn nhất của Thế giới tập trung ở các nước thuộc
vùng khí hậu nhiệt đới Thông tin quan trọng nhất được thu thập chính là tên, miêu tả,
sự phân bố, trạng thái và kích thước đân số của các chủng loài (speeizs), nhu cầu thói quen và cách mà mỗi tổ chức tương tác với các chủng loài khác Thông tin này được lưu trữ vào trong cơ sở đữ liệu các máy tính, được truy xuất bởi các chương trình phần
mềm để tìm kiếm, hiển thị, phân tích các thông tin đó một cách tự động, và quan trọng nhất, là để giao tiếp được với con người, đặc biệt qua internet Các chuỗi ADN của các loài sắp tuyệt chủng có thể được bảo quản, tên cùng miêu tả của mỗi loài được lưu lại
để có thể cho phép truy cập tối đa các thông tin cần cho việc bảo tồn đa đạng sinh học
Một ví dụ của ứng dụng này là dự án Species 2000 Đây là một dự án nghiên cứu toàn
Trang 11thông tin về bất kì chủng loài nào từ các cơ sở dữ liệu cung cấp [3], [15]
1.1.3 Công cụ phần mèm Tin sinh hoc
Tin sinh học có mục đích phải giải mã bí ẩn sinh học chứa trong vài tỷ nueleotit
Trình tự các đoạn genom được lưu trữ tại các Ngân hàng gen trên Thế giới là nguồn dữ
liệu khổng lề để tra cứu Những số liệu cần lựa chon và so sánh đòi hỏi các chương
trình tin học Công cụ phần mềm giữ vị trí thiết yếu cần có trong Tin sinh học Thống kê cho thấy, các phần mềm tin học đang được sử dụng có số lượng phong phú cùng với
tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực khoa học
1.1.3.1 Phân mềm Tân sinh học miễn phi
Hàng trăm phần mềm đã được lập trình giúp cho việc chọn lựa, so sánh và xử lý
các thông tin về trình tự ADN và protein Nhiều phẩn mém min phi hién đang được sử
dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân tích trình tự gen như FASTA, BLAST, Mega 4, Cn3D, Phylip, Peptool, Genetool, ClustalX, BioEdit, SeqVISTA, SAGA, Primer3, T-coffee, PC-Genes, Discovery Studio Gene, DNASIS, DNAMAN, VECTOR NTI,
AnnHyb, DNA Club, Plasmid Processor, Oligos v.v Trong số đó, phần mềm BLAST được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tìm kiếm những trình ty nucleic acid hoặc
protein tương đồng lưu trữ trên các cơ sở đữ liệu từ Ngân hàng gen Phần mềm ClustalW được dùng để so sánh sắp xếp các trình tự (Multiple Alignment) Cho đến nay, phần mềm MEGA4 là một trong những phần mềm miễn phí được công nhận có
tính ứng dụng cao trong tính toán và dựng cây phả hệ phân loại lồi
Các ngơn ngữ lập trình của máy tính như Perl và Python thường được dùng để
giao tiếp và ly trích dữ liệu từ các ngân hàng cơ sở dữ liệu sinh học thông qua những chương trình tin sinh học Cộng đồng những lập trình viên tin sinh học đã triển khai
nhiều dự án phần mềm mã nguồn mở (#ee/2pen source) như EMBOSS, Bioconduetor, BioPerl, BioRuby va BioJava Điều này giúp cho việc chia sẻ, phát triển và phổ biến
Trang 12nguyên lý thiết kế cũng như bước đầu tạo ra sản phẩm phần mềm mang thương hiệu
Việt Nam trong lĩnh vực Tin sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm Sản
phẩm phần mềm HiBio của Phân viện Công nghệ thông tin TP Hồ Chí Mình hợp tác
với Viện Công nghệ sinh học Việt Nam ra đời là một minh chứng cho định hướng này
Sản phẩm phần mềm HiBio là tập hợp gồm các moẩun chương trình độc lập, trong đó
mỗi mođun thực hiện một chức năng riêng như: mođun nhập và soạn thảo dữ liệu trình
tự, mođun so sánh bắt cặp trình tự, mođun tạo vectơ cất [3 1]
1.1.3.2 Phan mem Tin sinh hoc thong mui
Dù có được những lợi thế về nguồn thông tin to lớn, hữu ích và miễn phí như hiện nay, việc sử dụng những phần mềm miễn phí rõ ràng vẫn chưa đáp ứng được việc truy cập và khai thác những thông tin có giá trị và cập nhật nhất trong nguồn dữ liệu khổng lồ của các Ngân hàng gen Do tính cạnh tranh rất cao trong quá trình nghiên cứu khoa học trên toàn cầu, một số chương trình phần mềm đã được nâng cấp và thương mại hoá nhằm tạo thuận lợi lớn nhất cho việc áp dụng phương pháp nghiên cứu dùng
Tin sinh học Nhiễu chương trình phần mềm thương mại được nâng cấp và sử dụng tại
các Trung tâm nghiên cúu khoa học và bệnh viện trên Thế giới Có thể kể một số phần mền bản quyền điển hình như Paul*, BioNumerics, MacClade, Hennig86, TreeRot,
WINCLADA Các chương trình này cho phép phân loại phân tử nhanh chóng và tự
động, hỗ trợ cho việc phân tích kết quả thử nghiệm Tuy nhiên để có được những
chương trình này cần phải
những cơ sở có điều kiện kinh phí cho phép
1.1.3.3 Phan mem Tin sinh học ban quyen BioNumerics
ặt mua Do vậy các chương trình thương được trang bị ở
Một trong danh mục các phần mềm thương mại được công nhận trên toàn thế
giới và hiện được sử dụng thường nhật ở rất nhiều phòng nghiên cứu tại các trường đại
học, bệnh viện, Viện nghiên cứu, ngành thực phẩm, y dược phẩm các ngành công
Trang 13microarrays, Mal di, và phần lớn các kỹ thuật phân loại phân tử nhanh chóng và tự động ưu việt này giúp cho nó có thể đễ dàng tạo ra một lượng lớn dữ liệu từ các kỹ thuật thử
nghiệm khác nhau, hỗ trợ cho việc phân tích kết quả thử nghiệm
Phần mềm BioNumeries có 12 modun (module), bao gồm 06 mođun ứng dụng
và 06 moẩun phân tích:
e Modun ứng dụng: Kiểu vân tay (Fingerprint types) E], kiểu 2D gel (2D gel types)
au die tinh (Character types) EA, kigu trinh ty (Sequence pes) EI,
hướng đữ liệu (Trend data types) [PÌ và các kiểu ma trận (Marre types) ED,
« Modun phân tích: Modun Cây và mạng suy ludn (Tree and network inference
module) F4], Modun Nhin dang (indentification module) El, Modun kích thước và
théng ké (Dimensioning and Statistics module) [2], Modun ede céng eu chia sé cơ sở
dir ligu (Database sharing tools module), Modun Audit trails and Versioning
Modun phan tích trình tự sinh hoe phén tir (Sequence Molecular analysis module)
1.2 UNG DUNG TIN SINH HOC TRONG NGHIEN CUU DICH TE HOC PHAN TU’ BỆNH Ở NGƯỜI
1.2.1 Khái
iệm về Dich té hoc phan tử
Trong Y học, các tác nhân gây bệnh phan lớn đều là vi sinh Căn nguyên gây
nên dịch bệnh đã được biết đến Một dich bệnh bùng nỗ từ các đơn vị cơ thể (tế bào, vi
rút) nhân lên từ một cơ thể gốc được gọi là tổ tiên, lan truyền ra ngoài, lây nhiễm từ cá thể này sang cá thể khác Tại các ổ địch xảy ra không cùng một địa điểm và thời gian
sẽ xuất hiện nhiều dòng tế bào khác nhau Trong điều kiện kinh tế hội nhập và giao lưu
dễ dàng như hiện nay, mọi người có thể đi chuyển khắp Thế giới, bất kỳ lúc nào và bất
Trang 14Trong những năm gần đây, sự xuất hiện và tái xuất hiện các bệnh địch nguy
hiểm đang là vấn đề đe dọa nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng Các địch bệnh nguy hiểm lây lan một cách nhanh chóng từ vùng lãnh thổ địa lý của Quốc gia này sang
Quốc gia khác Nguy cơ bùng nỗ các đại dịch là vấn đề nỗi cộm trong Y học Xác định
tính đa dạng đi truyền của các chủng vi sinh gây bệnh nguy hiểm ở người nhằm phát
hiện và ngăn chặn kịp thời dịch bệnh là vấn đề cấp bách không chỉ ở Việt nam mà còn
được đặt ra ở nhiều Quốc gia trên Thế giới Một hướng nghiên cứu mới “Dich té hoe
phân tử” được các nhà khoa học trên toàn thế giới quan tâm Khái niệm về ngành khoa
học này đã được công nhận “Dịch tẾ học phân tử là phân tích so sánh các genom để
nghiền cứu quá trình lan truyền của một bệnh ở một quân thể” [WHO] Dịch tễ học
phân tử cho phép theo rối riêng rế từng chủng vi sinh gây bệnh Có thể xác định bao
nhiêu chủng đang lưu hành trên mỗi vùng địa lý khác nhau Việc xác định sự biến đổi
trên trình tự ADN genom của các chủng cho phép so sánh tính chất của các dịch bệnh xây ra tại các địa điểm và thời gian khác nhau [6], [10], [12], [21], [27], [28]
Dịch tế học phân tử đã trở thành một công cụ chính xác và ngày càng đóng vai
trò cần thiết bởi nó cho phép:
- Xác định nguồn gốc và đường lây truyền của mỗi tác nhân gây bệnh - Quan sát genotyp các chủng gây bệnh theo thời gian và địa điểm
- Cho thông tin về khả năng ngăn chặn sự lây truyền của chủng gây bệnh - Đánh giá hiệu quả của các chương trình tiêm chủng vắcxin
- Theo rối sự tiến hoá và biến đổi của các chủng vi sinh gây bệnh
Ở Việt nam, Dịch tế học phân tử là lĩnh vực khoa học hoàn toàn mới và bắt đầu
được triển khai trong những năm gần đây NỊ vụ đặt ra cho công tác chăm sóc sức khoẻ cộng đồng của ngành Y tế dự phòng là phải giám sát dịch tế học, phát hiện và
ngăn chặn kịp thời các địch bệnh nguy hiểm ở người Các phương pháp sinh học phân
tử phân tích đặc tính sinh học và sự biến đổi genotyp các chủng vi sinh gây bệnh ở mức độ ADN là phần thiết yếu trong nghiên cứu giám sát dịch tễ học phân tử [5][13],[22]
Trang 15genotyp các chủng hiện đang lưu hành Việc giám sát bệnh cần phải được mở rộng
trong mọi vùng lãnh thể Thế giới và tiến hành liên tục trong tất cả các giai đoạn Các dữ liệu gen có thể giúp xác nhận và ngăn chặn các nguồn lây lan của bệnh 1.2.2 L221 Virit soi h té hoc phan tir bénh soi “——— g Than it” sion protein Virút sởi thuộc gia dinh Paramyxoviridae, Membrane Max porơtein M)
chi Morbillivirus Genom virút sởi là một
sợi đơn thẳng âm tính có chiều dài khoảng
15.894 nucleotit mi hod cho 06 cấu trúc
Complexe Trnsenpee|_ protein: Nueleoprotein (N), Phosphoprotcin ‘Large protein iL)
“Auctopreten do “Prospheprote ) (Œ), Hemagglutinin (H), Membran (M), Fusion (F), va Large (L) Virat séi duge Hình 1.2.2.1a Cấu trúc phân tử virút sởi WW] Wey | biến đổi về đặc điểm di truyền đã được mô cho là só đặc tính đơn loài, tuy nhiên sự tả với các chủng hoang đã (Hình 122.1a) [27], [33] Bài zm ĐH sed
Hinh 1.2.2.1b Ban dé genom vinit si
1.2.2.2 Nghiên cứu địch tỄ học phân tử bệnh séi
+ Trên Thế giới: Bệnh sởi được biết đến từ thế kỷ tht IX, nhưng cho đến nay vẫn tồn tại và được xếp vào một trong những bệnh gây tỷ lệ tử vong cao cho trẻ em trên thế giới Theo công bố của Trung tâm Ngăn ngừa và Kiểm soát bệnh tật (CDC, Mỹ), trên thế giới, mỗi năm ước tính có khoảng 20 triệu ca mắc sởi, trong đó 164 nghìn
ca tử vong do sởi
Theo danh pháp tiêu chuẩn hoá của WHO, các genotyp virút sởi hoang đã được
tách biệt thành 08 nhánh có tên A, B, C, D, E, E, G, và H, với 22 kiểu gen [WHO,
Trang 16ADN vùng biến đổi nhất của 500 nueleotit đầu cuối -COOH của gen N hoặc toàn bộ
gen H Tuy nhiên cùng với thời gian, nhiều trình tự genom ADN virút sởi mới đã được
bổ sung thêm trong danh mục đữ liệu của GenBank thế giới Điều này cho thấy có sự
biến đổi về trình tự ADN của các chủng virút hoang đã tại các vùng địa lý Việc kiểm soát, ngăn chặn và khống chế sự lây lan nhằm tiến tới thanh toán bệnh sởi trên toàn cầu được WHO đặt lên hàng đầu Điều này cần có sự hợp lực của tất cả các quốc gia trên thế giới[10], [27] Bảng 1.2.2.2 Danh mục chủng virút sởi chuẩn đại dién cho nhóm và dưới nhóm Số đăng ký trong Genotyp Trang thai Tên chủng Genchank Gen Gen
A Hoạtđộng _ Edmonston-wL USA/54 U03669 U01987
Bl Hoạtđộng — YaoundeCAE/1283"YI4" AF079552 U01988 B2 Hoaiđồng — LibrevileGAB/94"R9G AF079551 U01994
B3 Hoaiđộng New YordUSA/94 146152 LA6753
Tbandan NIE/97/1 AJ239133 - A1232203
đi Hoạtđộng — Tokyo.IPN/84/E AY047365 AY043459
C2 — Hoạtđộng MarylandUSA/77"IM" M81898 — M89921 Erlangen DEU/90"WIF Z80808 = X84872
Di Bất hoạt Bristol UNKUNK/74 (MPV) Z80805 D01005
D2 Hoatdéng = Johannesburg SOA/88/1 AF085198 U64582
D3 Hoatdéng lHHnoisUSA/S9I"Chicagol" M8i895 U01977
D4 — Hoạtđộng MontrealCAN/89 AF079554 U01976
D5 Hoaiđộng PalauBLA/93 146157 A6158
Bangkok THA/93/1 AF009575 AF079555
D6 Hoatđộng New Tesey.USA/9/1 146757 146750
D7 Hoạtđộng VicoriaAUS/1685 AF247202 AF243450
Illinois USA/50.99 AY043416 AY037020
D8 Hoatdéng = Manchester UNK/30.94 U29285 AF280803
Trang 17+ Bắt hoạt MVs/Madrid.SPA/94 PESS Z80830 X81865
Gl Bắt hoạt Berkeley.USA/83 AF079553 U01574
G2 Hoạt động Amsterdam NET/49.97 AFI71231 AF171232
@3 Hoạt động MVs/Victoria AUS/24.99 AF353621 AF353622
HI Hoạt động Hunan.CHN/93/7 AF045201 AF045212
H2 Hoạt động Beijing CHN/94/1 AF045203 AF045217
+ Piệt Nam: Từ năm 1983, bệnh sởi được xếp là 1 trong 6 bệnh được triển khai
tiêm phòng vắcxin trong Chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia Đến năm 2005,
tỷ lệ mắc sởi chỉ còn 0,16 ea/100.000 đân (Bộ Y tế, 2005) Tuy nhiên, sự bùng nỗ của
các vụ địch sởi ở mọi lứa tuổi, xảy ra tại nhiều địa phương trong những năm gân đây là vấn đề nổi cộm trong ngành Y tế Dự phòng Điển hình là các vụ dịch sởi xẩy ra ở Nghệ
An (1998), Nha Trang (2000), Gia Lai (2002), Lao Cai (2005), Lai Châu (2006) và Thái Nguyên (2006), Ninh Bình (2008), Tp HCM (2009) Theo báo cáo của Chương
trình TCMRQG, tính đến tháng 03 năm 2009 đã có 7629 ca nghỉ mắc sởi Việc chin
đoán nhanh, chính xác căn nguyên gây dịch sởi là vấn dé cấp bách được đặt ra cho công tác giám sát dịch tế học Cho đến nay, để phục vụ cơng tác chấn đốn giám sát
dịch tế học bệnh sỏi, kỹ thuật IgM-ELISA vẫn đang được triển khai tại một số phòng thí nghiệm chuẩn thức Quốc gia
Nghiên cứu Dich t8 học phân tử bệnh sởi bắt đầu được đề cập ở Việt Nam từ
năm 2002 với mục tiêu xác định sự phân bố các genotype virút sởi và nguồn gốc các
chủng sởi du nhập từ bên ngoài Các kỹ thuật sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng
và hỗ trợ đắc lực cho việc xác định và phân biệt sởi với các căn nguyên gây sốt phát
ban khác Để triển khai định hướng nghiên cứu này, các kỹ thuật PCR, Đa dang độ dài đoạn cắt hạn chế (RFLP) va giải trình tự ADN (sequeneing) bắt đầu được thực hiện tại
một số phòng thí nghiệm chuẩn thức quốc gia của các Viện đầu ngành như Viện Vệ
sinh Dịch tế TƯ, Viện Pasteur TpHCM Bước đầu giải trình tự một đoạn gen dài 450
nueleotide ở đầu tận cùng -COOH của gen nucleocapsit (N) của một số chủng virút sởi
phân lập tại Việt Nam cho thấy các chủng virút sởi lưu hành tại miền Bắc Việt Nam
Trang 18ching Mvi/Beijing/CHN/94-1 chuan của WHO Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây nhất đã
phát hiện genotyp H1 được xác định trong vụ địch sởi ở Nha Trang vào tháng 03/2000
Genotyp nay có cấu trúc tương tự như chủng chuẩn Ä/an.CH7/93 [23] Từ 2005,
bằng kỹ thuật Giải trình tự đã xác định các chủng sởi hoang dại lưu hành tại một số
vùng địa lý Việt Nam đều thuộc genotyp H1 So với danh mục chủng virút sởi phân bố
trên toàn thế giới, genotyp H1 và H2 có tỷ lệ biến đổi tương đối xa so với chủng gốc chuẩn A (Edmonston) Các genotyp này xuất hiện và chỉ lưu hành tại một số nước châu Á như Nhật Bản, Trung quốc và Việt Nam [10], [21], [22] 1.2.3 1.2.3.1 Virit Rubella h té hoc phan tir bénh Rubella
Virút Eubella là thành viên duy nhất của chỉ
RUBELLA VIRUS Rubivims và gia đình của Toagaviridae Các
hat virion hinh cầu có đường kinh 50-70 nm,
none
icosahedral rusheeapsid được bao phi boi mét lop mang lipid Bén
trong màng lipid là một capsid có cấu trúc
ieosahedral với đường kính là 40 nm Genom
a virdt Rubella là mệt sợi don ARN đương tinh,
được bao bọc bởi capsid Trên màng tế bào
Ipidbihyer memlrane phân bố các "gai" glycoprotein E1 và E2
(Hinh 1.2.3.1)
Hình 1.2.3.1a Cấu trúc phân tử virút Rubella
Các gen ARN bên trong capsid có chiều dài
khoảng 9757 nucleotit và mã hóa cho 05 | sie pape
ne | protein bao gồm 02 protein phi cấu trúc 150
Trang 19
Nghiên cứu địch tố học phân từ bệnhRubella
+ Trên Thế giới: Rubella là loại bệnh do virut Rubella gây ra, đễ lây lan qua
đường hô hấp Bệnh Rubella rất nguy hiểm cho phụ nữ mang thai đặc biệt là trong 3 tháng đầu của thai kỳ, sẽ ảnh hưởng xấu tới thai nhỉ, gây sảy thai hoặc sinh non 90%
phụ nữ mang thai trong 3 tháng đầu của thai kỳ sẽ sinh ra em bé bị hội chứng Bubella
bẩm sinh như: điếc, đục thủy tỉnh thể, tật mắt nhỏ, tăng nhãn áp bẩm sinh, tật đầu nhỏ, viêm não, màng não, chậm phát triển tâm thần, gan to, lách to Trẻ sinh ra có thể chứng Rubella bm sinh (CRS), mắc các chứng bệnh về tim, mắt, tai hoặc thiểu năng tri tue
Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới WHO thì mỗi năm, chỉ tính riêng ở các nước đang phát triển, khoảng 100.000 trường hep CRS Théi điểm địch bùng phát năm
1964-1965 ở các nước phương Tây, hơn 20.000 trẻ em sinh ra bị khuyết tật do ảnh
hưởng của virus Tại VN, theo báo cáo tổng kết của chương trình Tiêm chủng mở rộng quốc gia, trong năm 2009 có 965 ca được chấn đoán dương tính với Rubella
Theo các công bố khoa học, trình tự gen E1 đã được sử dụng cho các kiểu gen
và phân tích phát sinh loài của chủng virút Rubella Các genotyp Rubella hiện đang lưu
hành trên Thế giới được phân bố thành 2 nhóm chính với 09 kiểu genotyp RGI (1A,
Trang 201j RVs/Miami FL USA/32.02 EF602117
2A RVi/Beijing CHN/80[24] AY 258323
2B RVi/W ash USA/16,00[2B] AY 968220
2 Rvi/Mosscow.RUS/97 (C74) DQ085340
+ Piệt Nam: Phụ nữ mang thai mắc Rubella trong 3 thing thai dau tién sé dé lại di
tật bẩm sinh cho trẻ Đây là vấn đề ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng Chương trình giám sát bệnh địch ở Việt nam cho thấy, ngày càng có nhiều các ca sốt
phát ban có biểu hiện lâm sàng tương tự sởi được xác định căn nguyên do virút
Rubella Dién hình là các vụ dich Rubella xẩy ra năm 2005 và 2006 tại nhiều địa
phương trên cả nước với hàng nghìn ca mắc Tuy vậy, các nghiên cứu về Rubella mới chỉ dừng ở mức độ xây dựng kỹ thuật chấn đoán lâm sàng và huyết thanh học Vì vậy
êm di
việc cần thiết phải tiến hành nghiên cứu địch tế học phân tử để ầm hiểu đặc
truyền, nguồn gốc và sự phân bố của virút Rubella luu hành ở Việt Nam nhằm mục tiêu phát hiện và khống chế dịch bệnh
1.2.4 Ứng dụng Tin sinh học trong nghiên cứu Dịch té hoc phan tir
+ Trên Thế giới: Từ khi trình tự ADN tế bào con người được phân tích, Tin sinh
học có mục đích phải giải mã bí Ân sinh học chứa trong vài tỷ nueleotit Tin sinh học cung cấp các công cụ tìm kiếm khai thác thông tin về hệ genome- transeriptome- proteotome của nhiều cơ thể sinh vật cũng như các công cụ phân tích thông tin sinh học ở mức độ phân tử Trình tự các đoạn genom virút được lưu trữ tại các Ngân hàng gen trên Thế giới là cơ sở cho việc so sánh kết quả phân tích và dựng cây phả hệ miêu tả nguồn gốc và sự phân bố các genotyp chủng vi sinh
Cho đến nay, nguồn cơ sở đữ liệu công cộng lớn nhất, lưu trữ tới hàng tỷ dữ liệu về trình tự gen và protein được cung cấp bởi ba Ngân hàng gen thế giới nỗi tiếng:
- NCBI Trung tâm Quốc gia về Céng nghé Sinh hoe (National Center for
Biotechnology Information) ea M¥
Trang 21~ DDB]: Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản (DNA data Bank of Japan [14], [35]
Những số liệu cần so sánh đòi hỏi các chương trình máy tính Vai trò của các
thuật toán, hệ thống xử lý dữ liệu, môi trường mạng hết sức quan trọng Kết quả của
những nghiên cứu này tạo ra các phần mềm giúp giải quyết một số vấn để xung quanh
việc tìm hiểu về gen, protein và một số vấn đẻ khác liên quan đến Sinh học Điển hình
nhw phan mém Evolutionary Biology Group (Oxford) (http://ovolve.zoo.ox.ac.uk.) 14
một trong những công cụ hữu ích trong nghiên cứu Dịch tế học phân tử các bệnh virút Các chương trình phần mềm tin học giúp cho việc xác định vị trí và sự khác biệt trên
trình tự ADN genom chính xác đến tỷ lệ dưới 1/1000 Tin sinh học đã trở nên một công cụ không thể thiếu được trong phân tích đặc điểm di truyền (genotyping) của các genom virat Nhiéu céng trình nghiên cứu của các tác giả ngoài nước đều nhấn mạnh đến vai trò của Tin sinh học trong các nghiên cứu sinh học ở mức độ phân tử [1], [10], [19], [28], [34]
+ Tại Việt Nam: Trong những năm gần đây Tin sinh học bắt đầu được triển
khai ở nước ta trong việc phân tích và xác định trình tự ADN của các tác nhân vi sinh gây bệnh Các công trình khoa học ứng dụng các chương trình Tin sinh học được thực hiện tại một số Viện nghiên cứu khoa học và trường Đại học lớn trong nước như Viện Vệ sinh Dịch tế TƯ, Viện Pasteur TP HCM, Viện Công nghệ sinh học VN, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM, Trường Đại học Ý Dược Tp HCM là những minh chứng [15], [22], [23], [30] Phòng Thí nghiệm chuẩn thức quốc gia bệnh Hô hấp Viện VSDTTƯ đã ứng dụng các chương trình phần mềm BioEdit, Mega4, MEGALIGN, DNASIS trong việc phân tích các trình tự genom ADN của virút cúm H5N1 và HIN1 Chương trình tin học BLAST, ClustalW, Phylip, pmimer3, DNAstar và Mega3 đã được các tác giả chọn lựa và sử dụng trong định nhánh (phylogenetic) virút Dengue và
Viêm não Nhật Bản phân lập tại Việt Nam Bên cạnh các phần mềm miễn phí, một số
Trang 22nghiên cứu và chấn đoán bệnh tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp HCM, Bệnh viện Lao Phạm
Ngọc Thạch Tp HCM, Viện Di truyền Nông nghiệp và Trường Đại học Cần Thơ
Các công bé cho thấy, việc xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng vi sinh ngày càng phổ biến trong các nghiên cứu về phân loại genotyp Tin sinh học đã trở thành yếu tố rất quan trọng góp phản cho sự thành công trong các nghiên
cứu thuộc lĩnh vực Sinh học nói chung và Dịch tế học phân tử nói riêng Để có cơ sở
chính xác cho các chiến lược hoạch định công tác phòng chống bệnh dịch, các nghiên
cứu địch tế học phân tử về các tác nhân gây bệnh cần phải triển khai một cách thống
nhất có hệ thống Điều này đòi hỏi phải xây dựng được bộ số liệu về đặc điểm di truyền, sự tiến hoá, phân bố theo địa dư của các tác nhân gây bệnh Những bộ số liệu di
truyền này không những chỉ được sử dụng tại Việt Nam mà còn góp phần xây dựng ngân hàng đữ liệu các tác nhân gây bệnh của thế giới Điều này cho thấy sự cần thiết
Trang 23Chương 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 CHUYEN GIAO CONG NGHE TIN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DỊCH TE HOC PHAN TU VIRUT GÂY BỆNH Ở NGƯỜI
Một trong những mục tiêu chính của hợp tác quốc tế nhằm nâng cao kiến thức và kỹ năng về Công nghệ Tin sinh học cho đội ngũ cán bộ khoa học VN Phía đối tác
Pháp giúp đào tạo, chuyển giao công nghệ mới trong lĩnh vực Tin sinh học Quy trình
chuyển giao công nghệ được thực hiện thông qua các khoá đào tạo về lý thuyết và thực
hành Tin sinh học cho đội ngũ cán bộ Việt Nam Chuyển giao công nghệ hướng
chuyên sâu về lĩnh vực ứng dung Tin sinh hoe trong phân tích đặc điểm di truyền của
chủng vỉ sinh vật gây bệnh ở người trên mô hình bệnh sởi và Rubella
2.1.1 Đào tạo và chuyên giao Công nghệ Tin sinh học tại Pháp
2.1.1.1 Đào tạo kiến thức về Công nghệ Tân sinh học
Định hướng chính của để tài là chọn lựa và ứng dụng chương trình phần mềm
phù hợp với điều kiện của VN Các phần mềm được chọn lựa và kết nối với nhau để
tạo nên các quy trình phù hợp với việc phân tích dữ liệu và trình tự ADN của mỗi virút Quy trình đào tạo lý thuyết và thực hành Tin sinh học cho 06 nghiên cứu viên Việt Nam được tiến hành tại Viện Pasteur Paris Pháp tập trung nghiên cứu các chức năng ứng dụng của các phần mềm Tin sinh học dựa trên hệ thống phần mềm đang được sử dụng của Viện Pasteur Paris: Tools at Pasteur Paris, Evoluionary Biology Group (Oxford) va mét sé phần mềm bản quyền (BioNumeries):
-_ Hiển thị cặp trình tự chính và trình tự bắt cặp
~_ Tìm vị trí của một enzym giới hạn trong một trình tự ~_ Tìm kiếm đoạn mỗi
- Phin tich, so sinh mức độ tương đồng giữa các trình tự
-_ Dựng cây phát sinh chủng loại
Trang 24
ChuyÊn giao Công nghệ Tân sinh học trong chọn lựa phân mềm phù hợp Quy trình nghiên cứu lựa chọn phần mềm phủ hợp trong phân tích xác định genotyp chủng virút Sởi và Bubella, dựa trên các chương trình phần mềm đang được
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân tích ADN genom như: Blast, D[ALIGN, Phylip, Shibase, NEBeutter, Genomatix, BLOCKS, PRODOM, T-coffee Primer3, MEGA4, ClustalX
Quy trình chuyển giao công nghệ được thực hiện qua hợp tác quốc tế trong việc
chọn lựa chương trình Tin sinh học phù hợp Danh mục hơn 300 chương trình phần
mềm đang được sử dụng tại Viện Pasteur Paris được liệt kê trên website
http://bioweb.pasteur.ft/intro-uk,html là nguồn thông tin phong phú và hữu ích cho
việc chọn lựa chương trình phần mềm phủ hợp nhất cho nghiên cứu Dịch tễ học phân
tử Chức năng chính của một số chương trình phần mềm hiện đang được sử dụng
thường nhật tại Viện Pasteur Paris được miêu tả trong Bảng 2.1.1.2
Bảng 2.1.1.2 Chức năng chính của các chương trình phần mềm Tin sinh học
Nội dung Phần mém Chức năng chính
Tin sinh hoc
1 [Timkiémcosod [BLAST - Tìm kiểm trình tự bương đồng trên cơ sở đữ liệu
liệu FASTA ~ 8o sánh trình tự
Cytoscape _ | - Phân tích và hình ảnh hoá các tương tác dữ liệu mạng
ShiBASE - Cơ sở dữ liêu tương tác cho các so sánh đặc tính di truyền của Shigella
2 | Xử lý trình tự SQUIZZ -Chuyển đổi định dạng tập tín
Trang 25DNA), EMBOSS - Tim kiém diém khacnhau gitra các trình tự đồng nhất
4 | Phát sinh chủng loại | Phylip - Gộp tập hợp phát sinh chủng loại
MEGA4 - Dựng cây phát sinh chủng loại, đendrogram, Treealign cladogram hoặc phenogram
Quicktree CS
BioNumeries | - Phần mềm hữu hiệu cho xác định phát sinh loài Evolutionary | và genotyp virút Biology Group (Oxford) 5 |Phân tích trình tự | ProtParam |-Tính tốn thơng sốvật lý và hóa lý khác nhau cho Protein protein
ProtScale - M&ta so luge trinh ty amino acid trén cfu tric
protein chon lựa SMART - Lĩnh vực Protein BLOCKS 6 | Phân tích trình tự — | Erimo - Thiết kế môi Nucleic Being Tacg - Tìm vị trí cắt của enzym hạn chế Rebase NEBontter In Silico
Rnaga - Phân tích RNA
EMBOSS — | - Dich ma trinh by Nucleic 7 |PhânHíehcấutúc | Predator - Cấu trúc bậc 2
COSA - Cấu trúc bậc 3
$ | Phân tích kế quả — [BieNumerics | -Tìm kiếm điễm khác nhau giữa các hình vạch fingerprint | bang ADN trén gel
điện di trên gel
- Dựng cây phát sinh chủng loại
2.1.2 Đào tạo và chuyền giao Công nghệ tin sinh học t:
lệt Nam
Đào tạo và chuyển giao Công nghệ Tin sinh học được triển khai tại Việt Nam
Trang 26gia Pháp Quy trình chuyển giao công nghệ thông qua khoá đào tạo lý thuyết về sự phát triển và các lĩnh vực ứng dụng của Tin sinh học Quy trình ứng dụng phần mềm
BioNumeries trong nghiên cứu dịch tế học phân tử được hoàn thiện tại Viện Vệ sinh
Dich té TU với hệ thống máy vi tính được trang bị hoàn chỉnh Tổ chức Hội thảo quốc
tế giữa các nhà khoa học Việt Nam và Pháp nhằm trao đổi thông tin trong lĩnh vực ứng
dụng Tin sinh học trong nghiên cứu địch tế học phân tử virút gây bệnh ở người
2:2 ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIÊM GENOTYP CHUNG VURUT SOI VA RUBELLA LU'U HANH TAI CAC VUNG DIA LY DAN CU’
Nhiệm vụ Hợp tác quốc tế theo Nghị định thư với CH Pháp tập trung vào
nghiên cứu xây dựng các quy trình ứng dụng Tin sinh học và Sinh học phân tử trong
Dich té hoe phan tử Các quy trình công nghệ này được ứng dụng cụ thể trên mô hình
phân tích genotyp chủng virút sởi và Rubella Các phương pháp Sinh học phân tử được
triển khai nhằm mục đích thu nhận các kết quả thực nghiệm (trình tự ADN và hình vach RFLP) lam co sở đữ liệu cần thiết cho việc chon lựa và xây dựng quy trình ứng
dụng Tin sinh học Phương pháp nghiên cứu được trình bày theo nội dung nghiên cứu
của thuyết minh đề tài
2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng trong phân tích genotyp chung soi va Rubella
2.2.1.1 Vật liệu
«_ Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn gồm một số chủng virút ARN: sởi và Rubella © Mau bệnh phẩm: dịch họng hầu thu thập từ bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bệnh
phương VN trong năm 2006-2009 Bệnh sởi/Rubella từ các vụ dich tại một số phẩm được lấy vào ngày 1-7 sau phát ban và giữ 4°C trong môi trường vận chuyến e Số lượng mẫu:
- 10 mẫu bệnh phẩm dịch họng hầu do Phòng Thí nghiệm Hô hấp, Khoa Virút, Viện VSDTTƯ thu thập tại các vụ dịch ở miền Bắc VN: Lai Châu (2/2006), Điện
Trang 27- 10 mẫu bệnh phẩm địch họng hầu do Phòng Hô hấp, Viện Pasteur Tp HCM thu thập tại các vụ địch sởi ở một số địa phương miền Nam VN năm 2008-2009
- 12 mẫu bệnh phẩm dịch họng hầu do Phòng Hô hấp Viện Pasteur Tp HCM thu
thập tại các vụ địch Rubella ở một số địa phương miền Nam VN 2007
- 04 mẫu chủng vắcxin sởi Ed-Vero, Ed-HA, AIK-C Vero, AIK-C EL do Trung tâm
Khoa hoe và sản xuất vacxin Sabin cung cấp
- 02 mẫu chủng vắcxin sởi phân lập từ vắcxin sởi W6675/Rouvax-Aventis Pasteur
(Pháp) và EME732 A/Bicken Cam (Osaka, Nhật Bản)
- 04 mẫu chủng virút sởi và Rubella chuẩn do Trung tâm chuẩn thức Quốc gia Pháp về bệnh sởi và hô hấp Paramyxovirus (CHU, Caen) cung cấp
- 40 miu ARN ching virat sởi được xác định genotyp Dã do Viện Pasteur
Phnompenh, Campuchia cung cấp
3.2.1.2 Gây nhiém ching vivit trên nuôi cấy tế bào
Ching virút sởi và Rubella được gây nhiễm và tăng sinh trên các nuôi cấy tế
bào thường trực Vero SLAM theo thường quy kỹ thuật của hai phòng thí nghiệm Hô hấp thuộc Viện Vệ sinh Dịch tế TƯ và Viện Pasteur Tp HCM Chủng virút đương tính
được chọn lựa từ các nuôi cấy tế bào gây nhiễm bị huỷ hoại Hình ảnh và kích thước điển hình của virút sởi được quan sát đưới kính hiển vi điện tử theo kỹ thuật chuẩn của phòng Hiển vi điện tử, Viện VSDTTƯ
2.2.1.3 Tisch chidt ARN virsit
ARN virat duge tach chiét tir 280 jl née néi nuôi cấy tế bào Vero Slam gay
nhiễm chủng virút sởi hoặc Rubella, sir dung Kit QLAamp Viral RNA Isolation (QlAgen, My) Quy trinh tach chiét ARN theo đúng thường quy đi kèm của bộ kít
Trong để tài, quy trình này được cải tiến ở hai công đoạn Công đoạn đầu tiên với việc nạp vào cột sắc ký thể tích mẫu thí nghiệm tăng lên 280 LÍ so với thể tích thường đặt là
14041 Bằng cách này, sin phim ARN sau tinh sạch đạt hiệu xuất tách chiết cao, cho
phép thực hiện nhiều thử nghiệm Công đoạn cuối, ABN được giữ nguyên trên cột và
Trang 28
4 Phương pháp nhân gen bang RT-PCR vis Nested PCR
© RT-PCR: Genom virat sởi và Rubella đều là một chuỗi ARN đơn Phản ứng RT-PCR gồm hai giai đoạn chính là phiên mã AEN virút thành ADN nhờ enzym phiên mã ngược và tổng hợp ADN dưới tác dụng của DNA polymerase Đoạn ADN
nucleoprotein N die hiệu virút sởi và glycoprotein E1 die higu virút Rubella được tổng
hop, str dung Kit Superscript One-step RT-PCR với enzym platinum Taq polymerase
(nvitrogen) Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành theo thường quy chuẩn của phòng Thí
nghiệm Sinh học phân tử, Trung tâm Bệnh viện Trường Đại học (Caen, Pháp)
Trình tự cặp mỗi cho RT-PCE khuếch đại đoạn ADN 387 bp đặc hiệu virút sởi:
- mỗi xuôi (n1): 5*GCT ATG CCA TGG GAG TAG GA 3°, - mỗi ngược (I2R): 3* GGC CTC TCG CÁC CTA GTC TA 3°
Trình tự cặp mỗi cho RT-PCE khuếch đại đoạn ADN 380 bp đặc hiệu Rubella:
- mỗi xuôi (Bu 1TR) : 3° CGT ATG TGG AGT CCG CÁC TT3', - mỗi ngược (Rube 1E): 3* CGT CTG GCA ACT CTC CGT3°
RT-PCE được tiến hành véi téng thé tich 25 jl dung dich: 2,511 mau ARN virat
sởi/Rubella; 6,5ul H2O; 12,501 đệm 2X Invitrogen; 1,5, mỗi xuôi 100M; 1,51 mỗi
ngược 10M; 0,30 enzyme superscript II RT / Platinum Taq Invitrogen 5U/ul Chu ky phản ứng RT-PCR: 55°C/30°; 94°C/4’; [95°C/30”, 57°C/30”, 72°/1?] x10; [95°C/30”, 57°C/30”, 72°C/1"] + 5°*/chu ky x 25; 72°C/10°; 4°C/o Sn phim RT-PCR được kiểm
tra bing dign di trén gel agarose 2%, nhuém edithium brommit
* Mested PCR: Với các chủng virút không xác định được băng ADN sau RT-
PCBE, cần tiến hành tiếp phản tmg Nested PCR Phan tng Nested PCR lam ting 46
nhạy và tính đặc hiệu của phản ng PCR thi nhat bing cach nhân lên đoạn ADN bên
trong vùng khuếch đại Với các cặp mỗi chọn lựa, đoạn ADN gen N virút sởi có kích
thước khoảng 492-576 bp bên trong vùng khuếch đại đươc nhân lên Trình tự cặp mỗi
cho phản ứng Nested PCR: méi xuéi (n3): 5 CCA TGG GAG TAG GAG TGG 3', mỗi ngược (n4R): 5' CTC TCG CAC CTA GTC TAG 3'
Phản ứng Nested PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 LÍ dung địch mẫu: 501
Trang 29MgCl: 50 mM, 1,25, mỗi xuôi 10M; 1/2541 mỗi ngược 100M; 0,154 platinum Tag
polymerase Invitrogen SU/ul Chu kỳ phản ứng Nested-PCR: 93°C/3°; [95°C/30°; $7°C/30°; 72°C/1°]x10; [93°C/30°°; 57°C/30?°; 72°C/1°]+ 3°2/chụ kỳ x 25; 72°C/10°
Sản phẩm thu được sau Nested PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
2%, nhuộm với eđithium brommit 2.2.1.5 Phương pháp RFLP
BFLP là tên gọi tắt của phương pháp Đa hình chiều đài các đoạn cắt enzym hạn chế (Restriction enzym) Phương pháp RFLP cho khả năng phát hiện các thay đổi cấu trúc ADN qua các hình vạch trên bản gel điện di Enzym cắt hạn chế là những
endonueleaza do vi khuẩn sinh ra và có khả năng nhận biết những vị trí cắt hạn chế để
cắt chuỗi ADN đài thành những phân đoạn có chiều dài khác nhau Nếu chọn được tổ
hợp ADN loại enzym han chế, có thể thiết lập được “vân tay” (FingerprinÐ đặc trưng cho cá thể có chứa loại phân tử ADN Những thay đổi trên ADN có thể nhận biết bằng
sự có mặt hoặc biến mắt các vị trí cắt của enzym hạn chế Những sự khác nhau khi so
sánh mẫu cắt hạn chế ADN toàn phần được sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền Quy trình kỹ thuật RFLP được hoàn chỉnh và ứng dụng để phân tích đoạn gen N
genotyp chủng virút sởi Đoạn gen ADN này có khoảng 350-563 bp do vậy cần phải
chọn các enzym hạn chế có khả năng cắt được 2-3 lần để tạo ra các hình có từ 3-4
vạch Dựa trên chương trình tin học NEBeutter (New England Biolabs, Mỹ) các enzym
Haelll, Mbol va ScrFI đã được chọn lựa để phân tích genotyp chủng virút sởi Dựa trên sự biến đổi của các ví trí cắt hạn chế trên trình tự ADN gen N tính đa dạng của
genotyp virút sởi được phân tích RELP được tiến hành với tổng thể tích 20 nl mẫu: 71
mẫu ADN, 1ul enzym cắt hạn chế, 24.1 đệm 10%, 10411 H20 Ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1-3
giờ Sản phẩm RFLP kiểm tra trên gel agarose 3% nhuộm với edithium brommit
2.2.1.6 Phicong phip multiplex realtime PCR + Phuong phap multiplex PCR
Virút sởi và Rubella gây sốt phát ban ở người với bệnh cảnh lâm sàng khó phân
biệt Phương pháp multiplex PCR đã được áp dụng nhằm chẩn đoán phân biệt căn nguyên gây bệnh Các cặp mỗi đặc hiệu cho khuếch đại đoạn ADN gen N virút sởi và
Trang 30tham gia phản ứng Trình tự cặp mỗi nhân đoạn ADN gen N virút séi vi dogn ADN
gen E1 virút Bubella cho phản ứng được thiết kế như sau:
Trình tự cặp mỗi nhân đoạn ADN genN virút sởi:
- Mii xuéi (Gar 1F): 5° CGG AGC TAA GAA GGT GGA TAA3° - Mỗi ngược (Sar IR): 5° CTC CCA TGG CAT AGC TCC A’
Trình tự cặp mỗi nhân đoạn ADN gen E1 virút Rubella:
- Mỗi xuôi (Ru 1TR): 3° CGT ATG TGG AGT CCG CAC TT 3? éi nguge (Rube 1F): 3* CGT CTG GCA ACT CTC CGT3'
Phan tng RT-PCR duge tiến hành với tổng thể tích 251 mau thành phần phản
ing, sir dung Kit Qiagen One-step RT-PCR Trong dé, 2,51 mau phan tich duge trộn trong đệm phản ứng có chứa các thinh phin: Sul dém 5X; 11 dNTPm 10mM; 3p Q
soluion 5X; 1,2uI mỗi xuôi (Sar 1E) 10M, 1,201 mỗi nguge (Sar 1R) 10 pM; 1,2pl mdi xuéi (Ru 1TR) 10uM; 1,201 mỗi ngược (Rube 1E) 10uM, lui Enzyme polymease
Lunit/pl; 7,7 H1 H22
Chu kỳ phản ứng multiplex PCR: 50°C/30; 94°C/15'; [94°C/30”;, 60°C /30”
72°G/1']% 40, 72°C/10' Sản phẩm thu được sau Nested PCR được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 2%, nhuộm với edithium brommit Các băng ADN với kích thước đặc hiệu của genom virút cho phép xác định sự có mặt của virút gây bệnh
+ Phương pháp multiplex realtime PCR
TH semen Quy trình multiplex PCR duge cai tién
# nem thêm để có thể định lượng ADN virút
với sự hỗ trợ của máy realime PCR
Sản phẩm khuếch đại lúc này không phải phát hiện ở bước cuối cùng mà
được phát hiện ở mỗi chu kỳ nhiệt
bằng cách dùng máy realtime PCR do
tín hiệu huỳnh quang túc thời Sản
Hình 2.2.1.6 Nguyên lý multiplex realtime PCR phẩm ADN khuếch đại được phát hiện
Trang 31Multiplex realtime PCR duge tién hanh trong mét éng phản ứng với cặp mỗi Sar
1F + Sar LE cho khuếch đại ADN gen N virút sởi và Ru 1TE + Bube 1F cho ADN gen
E1 Rubella cùng với toàn bộ các thành phần tham gia phản ứng
Probe: RV323r: 5*JOE- GAT CAC CCA GCA CTC CAC GCAA -BHQI 3°
MVTqrv: 5` FAM- TCT TGC TCG CAA AGG CGG TTA CGG- BHỌI 3°
Bing multiplex realtime PCR cho kết quả chẩn đoán xác định đồng thời bệnh phẩm nhiễm sởi và Rubella
2.2.1.7 Phương pháp xác định trink ty nucteotit
Phương pháp xác định trình tự nucleotit của ADN phê biến nhất là phương pháp Sanger Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp chuỗi ADN bổ sung cho trình tự chuỗi ADN cần xác định Đây là phương pháp enzym học tiến hành tổng hợp các phân tử
ADN với một hàm lượng nhỏ đẫn xuất dideoxy của các nucleotit (đảNTP) Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của phương tiện kỹ thuật, việc xác định trình tự ADN được
tiến hành tự động hoá bằng hệ thống máy giải trình tự Nguyên tắc hoạt động của máy
là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có 1 vạch điện di đi qua chùm tỉa laser thì vạch
điện đi sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghỉ nhận và
lưu lại thành một đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ Từ biểu đồ các đỉnh cường độ
ánh sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân
tích thành trình tự của đoạn ADN Người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau
để đánh dấu 4 loại ddN'TP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự được thực hiện chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng
Dựa trên nguyên lý chung của phương pháp sequencing, trình tự các đoạn ADN genom virút sởi và ubella được xác định Sản phẩm ADN virút sau phản ứng RT- PCE được tỉnh sạch theo phương pháp cnzyme ExoSAP-IP của phòng Thí nghiệm
Sinh học phân tử CHU Caen (Pháp) Đoạn gen ADN sau tỉnh sạch được kiểm tra trên gel agarose 2% Giải trình tự ADN gen N virút sởi được tiến hành với thể tích 1-2 jl
miu ADN tỉnh sạch, sử dụng CEQ DTCS Quiek start kít theo thường quy của Phòng
thí nghiệm Chuẩn thức Quốc gia CNR Sởi Lyon (Pháp) Các cặp mỗi
Trang 32
cho phản ứng RT-PCR được sử dụng làm khuôn mẫu cho giải trình tự Trình tự đoạn gen ADN 552 bp đặc hiệu virút sởi vi 380 bp dic higu Rubella được xác định Trình tự
đoạn gen ADN được sử dụng làm cơ sở dữ liệu cho việc phân tích genotyp chủng virút
2.2.2 Phân tích genotyp chủng virút sởi và Rubella bằng phản mẻm Tin
sinh học BioNumerics
3.2.2.1 Phân tích genotyp chiing viriit bằng phần mầm “BioNumevics sequence” + Xử lý kết quả giải trình tự
Quy trình ứng dụng phần mềm “BioNumerics sequenee” khởi đầu bằng việc nhập dữ liệu trình tự các mẫu ADN cần phân tích vào thư mục chủ (home direetory) Trinh ty nucleotit thé ban đầu là đề thị các sóng sắc ký với 4 mẫu tương ứng với từng
ddNTP (A,C,T.G) thu được từ kết quả giải trình tự Khi đề thị sắc ký được nạp vào máy, trình tự cặp mỗi xuôi và ngược hiển thị trên màn hình Chiều của các mỗi xuôi và ngược được cân chỉnh cho phù hợp Điều cần thiết quyết định cho việc xác định đúng
trình tự đoạn ADN là việc chỉnh sửa bằng tay những đỉnh sóng lỗi hoặc chồng lên nhau Công đoạn này cần sự phối hợp giữa người làm Tin học và người làm thực nghiệm Chương trình sẽ tự động chuyển các ký hiệu dạng đỉnh sóng sang trình tự nueleotit tương ứng Trình tự các nucleotit virút sởi và Rubella chỉnh sửa hoàn chỉnh được tự động nạp vào cơ sở dữ liệu của thư mục chủ
+ Nhập dữ liệu trình tự nucleotit
Dữ liệu cho việc so sánh sự tương đồng giữa các genotyp gồm các trình tự ADN
mẫu virút xét nghiệm và trình tự ADN chuẩn Các trình tự nueleotit chuẩn chọn lựa từ
Ngân hàng gen NCBI duge nhập vào thư mục chủ dưới định dạng GenBank hoặc FASTA Các bước nhập đữ liệu thực hiện theo quy trình hướng dẫn do Hãng sản xuất cung cấp với sự hỗ trợ của các công cụ phần mềm Kết thúc quy trình, toàn bộ các trình
tu ADN genom chung virat séi va Rubella cần phân tích và trình tự chuẩn được nạp tự
động vào cơ sở dữ liệu của thư mục chủ
3.2.2.2 Phân tích genotyp chủng vi bằng phần mâm “BioNumerics fingerprint” Điện di là một kỹ thuật quan trọng trong việc nghiên cứu các mối quan hệ trong
Trang 33điện cho việc phân tích kết quả điện di trên gel Nó cho phép tự động định dạng tip tin (file) 48 họa và định lượng quang học từ các tập tin hình ảnh bitmap Dữ liệu Fingerprint cho phan tích chủng virút sởi và Rubella là bản điện di trên gel agarose
Hình ảnh điện đi đổ trên gel agarose định đạng đuôi TIEE được nhập vào thư xnục chủ của phần mém “BioNumeries fingerprint” Ảnh gốc bitmap hai chiều hiển thị
ở dang nén den bing tring sẽ được đảo chiều thành nền trắng băng đen Trên màn hình
xác định trục và đường viền để điều chỉnh các dải băng dựa trên băng chuẩn Sử dụng
các công cu cla “BioNumerics fingerprint” dé tim kiếm, đánh đấu những băng chưa rõ ràng Có thể nâng cao chất lượng hình ảnh bằng cách lược bớt các băng nhiễu, điều chỉnh phan ảnh nén, loại bỏ những chấm bản trên ảnh và làm mịn đường cong Phần
mềm tự động phiên dịch hình ảnh các băng ADN thành các đường cong densitometric và định lượng kích thước các băng Dữ liệu Fingerprint sau xử lí đuợc lưu vào cơ sở đữ
liệu thư mục chủ của phần mềm BioNumerics
2.2.2.3 Dựng cây phả hệ phái sinh loài bằng phần mềm “BioiNhunerics Tree and
Netword Inference”
Cây phả hệ phát sinh loài và phân loại genotyp chủng virút sởi và Bubella được
thiết kế bằng phần mềm “BioNumeries Tree and Netword Inference” Phần mềm này
có chức năng phân tích các cơ sở dữ liệu được chọn lựa Các đữ liệu ở dạng trình tự nueleotit hoặc Fingerprint thu được từ thực nghiệm và từ cơ sở dữ liệu đăng ký trên Ngân hàng gen NCBI được sử dụng làm cơ sở dữ liệu cho phân tích, so sánh cặp nhóm và dựng cây phả hệ phát sinh loài Trung tâm của chức năng phân tích là cửa số so sánh
“Comparison window” trong phan mềm “BioNumeries Tree and Netword Inference”
+ Dựng cây phả hệ từ dữ liệu trình tự nueleotit
Chọn lựa các dữ liệu trình tự nueleodit virút sởi hoặc Rubclla xét nghiệm và
trình tự chuẩn đã được nạp sẵn trong thư mục chủ Việc phân tích genotyp các chủng virút được tiến hành trong cửa số so sánh “Comparison window” Cây phả hệ được
dựng bắt đầu từ việc sắp xếp trình tự bằng cặp nhóm Sử dụng các thuật toán để thực
hiện quá trình sắp xếp các nueleotit Toàn bộ trình tự ADN virút sởi/Rubella cần phân tích được so sánh, gióng cột thẳng hàng với các trình tự chuẩn Tỉ lệ tương đồng giữa
Trang 34trên việc sắp xếp các nhánh theo tỉ lệ đồng thuận giữa các trình tự cặp nhóm Mỗi giao điểm trong cây phả hệ đại điện cho trình tự tương ứng của nhóm đó Giao điểm gốc đại điện cho trình tự tương ứng của toàn bộ cây phả hệ Chỉnh sửa hoàn chỉnh cây phả hệ bằng các cơng cụ như hốn đổi vị trí nhánh, phóng to, thu nhỏ hình ảnh Thêm các ký hiệu hoặc tô màu cho các nhánh của cây phả hệ dé tách biệt các nhóm
+ Dựng cây phả hệ từ dữ liệu Fingerprint
Chọn các dữ liệu Fingerprint của ADN virút sởi đã nạp sẵn trong thư mục chủ
Sử dụng công cụ “Comparison” của “BioNumeries Tree and Netword Inferenee” cho việc phân tích genotyp các chủng virút sởi và Rubella Cây phả hệ được dựng dựa trên tỉ lệ tương đồng giữa kích thước các băng ADN virút bằng RFLP
(Ghi chú: Quy trình công nghệ chỉ tiết của phương pháp nghiên cứu được trình bày trong
Trang 35Chương 3 KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
3.1 HỢP TÁC NGHIÊN CỨU VÀ CHUYEN GIAO CONG NGHE TIN SINH HOC UNG DUNG TRONG DICH TE HOC PHAN TU
3.1.1 Kết quả nghiên cứu va chuyén giao Céng nghé Tin sinh hoc
Đối tác phía Pháp trong dự án gồm nhóm các nhà khoa học hiện dang làm
tại Khoa Nghiên cứu đặc
lểm di truyền của các nhân gây bệnh và Y tế cộng đồng
(PF8-LaPlate-forme Gánotypage des Pathagènes et Santé¿ Publique) thuậc Trung tâm
chuẩn thức Quốc gia Pháp (CNE) của Viện Pasteur Paris là một trong những Khoa có
năng lực cao trong lĩnh vực Công nghệ Tin sinh học Dựa trên năng lực chuyên môn và
điều kiện cơ sở vật chất hiện đại của Viện Pasteur Paris, đội ngũ cán bộ Việt Nam được
đào tạo lý thuyết và tiếp thu Công nghệ Tin sinh học tiên tiến nhất hiện nay
Năm 2008-2009, 06 nghiên cứu viên được đào tạo và trao đổi khoa học về lĩnh
vực Công nghệ Tin sinh học tại viện Pasteur Paris Pháp Đây là đội ngũ cán bộ Tin sinh học được trang bị thêm những kiến thức cơ bản và thực hành thành thạo các
chương trình phần mềm Tin sinh học, nâng cao trình độ chuyên môn và kỹ năng
nghiên cứu độc lậi
Năm 2009, khoá đào tạo “Ứng dụng phần mềm BioNumerics trong nghiên cứu
Dịch tế học phân tử” được tổ chức tại Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương (21-23/9/2009) với tham gia giảng đạy của 03 chuyên gia Pháp đã giúp nâng cao trình độ chuyên môn Tin sinh học cho đội ngũ 37 nghiên cứu viên Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương, Viện Pasteur Tp HCM, Poliovac Hợp tác đào tạo và chuyển giao công nghệ Tin sinh học
từ phía đối tác Pháp nhằm giúp đội ngũ nghiên cứu viên Việt Nam nắm vững và sử
dụng thành thạo chương trình Tin sinh học trong phân tích, khai thác và quản lý thông tin dữ liệu khoa học, đáp ứng nhiệm vụ triển khai Công nghệ Tin sinh học trong nghiên
cứu Dịch tế học phân tử
3.1.2 Kết quả so sánh và chọn lựa các chương trình phần mém Tin sinh
học phù hợp
Tính năng ưu việt của các phần mềm Tin sinh học được so sánh dựa trên chức
Trang 36Ngen | Hình 3.1.2a Cây phát sinh chủng loại virút sởi Việt Nam (BioNumerics Version 6.0) MR08_09 Mien Nam VN Ninh Binh.VN.2 (18/5/08) Ninh BInhAVN.3 (6/8/08) Ninh BinhAIN4 (16/6/08) M193 Mien Nam VN Ninh BinhA/N 4 (16/6/18) MR119 Mien Nam VN MFE161 lan Nam VN Lai Chau VN.6 (11/02/86) ‘Thai Nguyen VN (134/08) Dien Blan VN (24/02/06) Dien kien VN.7 (24/02/16) ‘Thai Nguyen VN.10 (13/08) Thai Nguyan VN.8 (13/4/16) EdVern VAGUAIKUero L MRICH Mien Nam TÀI Ninh Bink PWS 18.05.08 Wink Bink VI 18.95.08 -MR119 Miện, Nam, VAT AI Nam Nam VN Mink Bink Vie
Trang 37MEI8- Mien Han VM ME183 Mien Ham VM ME118 Mien Ham VM ME09 C9 Mien Nam VH NinF Einh 4 (13.05.06 ink ah VN3 (13.0508) NinF Einh VN' (J3.0508) ink Fi NDF NR Bị Din Fier VR 22.70 7A) Dien Hier VN (22.02.25) ha Rguye3 VN (104 062 ha Rguye VN (13.04 06) |— Lai Chas YN (11.02.06) ha Rquyen V0 (12.04.06) VAGAKVera EdVeo cam Hình 3.1.2e Cây phát sinh chủng loại virút sởi V iệt Nam (Mega 4) Trong nghiên cứu này, các phần mềm: BioNumeries (version 6.0), ClustalW và MEGA4 duge chọn lựa từ danh mục các phần mềm hiện có và sử dụng trong
cây phát sinh chủng loại virút sởi lưu hành tại Việt Nam (2006-2009)
biểu diễn trên các Hình 3.1.2.a, b,c
dựng
ết quả được S§o sánh các phần mềm đã được ứng dụng, kết quả đã chọn lựa được 03 phần
mềm Tin sinh học BioNumeries phù hợp điều kiện và kỹ năng nghiên cứu của cán bộ
Tin sinh học Việt Nam Đó là:
1 BioNumerics Kiểu trình tự (BioNumeries Sequence types) 2 BioNumeries Kiểu vân tay (BioNumeries Fingerprint types)
3 BioNumeries Cây và mạng suy luận (BioNumeries Tree and Netword Inferenee)
Phần mềm BioNumeries có các chức năng cơ bản đáp ứng được đòi hỏi trong
trong nghiên cứ
- Tính ứng dụng cao, cho phép nhập 20.000 dữ liệu và thực hiện so sánh với các hệ
tương đồng và khoảng cách khác nhau cho nhiều đạng số liệu
Trang 38liệu gel 1D,2D từ các phương pháp đa hình (RFLP, AFLP, RAPI định tỷ lệ sai khác giữa các genotyp < 0,01%
Khả năng xác
- Môi trường cơ sở dữ liệu rộng cho phép kết nối nhiều phòng thí nghiệm lưu trữ và
xây dựng lại thử nghiệm
-_ Truy vấn, thăm dò và khai thác dữ liệu, phân tích, so sánh trực quan
ối Internet cao
- Tich hợp mạng, trao đổi dữ liệu với khả năng kết
Các phần mềm chọn lựa được ứng dụng trong phân tích genotyp và dựng cây
phả hệ phát sinh loài và phân loại genotyp chủng sởi và Rubella lưu hành tại các vùng địa lý khác nhau
Kết quả chọn lựa và xây dựng một chương trình Tin sinh học đơn giản, có thể
thực hiện tại các phòng thí nghiệm của nước ta sẽ mở ra hướng phát triển ứng dụng trong nhiều nghiên cứu không chỉ thuộc lĩnh vực Y tế dự phòng và Sinh Y học mà còn
nhiều lĩnh vực khác như Di truyền học, Nông nghiệp, Đa dạng sinh học và bảo tồn
nguồn gen quý hiếm Đặc biệt trong các công trình khoa học phân tích tính đa dạng
của trình tự và cấu trúc phân tử ở mức độ ADN
3.2 KET QUA UNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỄM GENOTYP CHUNG VIRUT SOI VA RUBELLA LUU HANH TAI CAC VUNG DiA LY DAN CU’ KHAC NHAU
3.2.1
3.2.1.1 Tách chiếtLRN viyát sôi
rình tự nucleotit đoạn gen quan trọng của virút sởi
Chủng virút sởi có nguồn gốc từ mẫu bệnh phẩm dịch họng hầu được gây nhiễm và tăng sinh trên nuôi cấy tế bào thường trực Vero SLAM Virút sởi thông thường được phân lập từ bệnh phẩm ngay giai đoạn tiên phát đến vài ngày sau khi phát ban Sự
nhân lên của virút trên tế bào gây nhiễm với việc tạo các đám tế bào liên hợp được
quan sát dưới kính hiển vi quang học Hình ảnh các virút sởi giải phóng từ tế bào được
kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử cho thấy, các hạt virút có cấu trúc hình cầu kích
thước 200-250 nm điển hình của virút sởi (Hình 3.2.1.1) Các mẫu tế bào dương tính
Trang 39nhiễm và tăng sinh virút đóng vai trò quan trọng vì kết quả của các công đoạn tiếp theo
của nghiên cứu phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của vật liệu virút ban đầu
Hình 3.2.1.1 Hạt v rút sởi tách tử tế bào Vero SLAML
(Phòng Kinh hiển vĩ điện tử Viện VRDTTƯ-2028)
Toàn bộ ARN virút sởi được tách chiết từ 280 pil dich té bao Vero SLAM gay nhiễm cho hiệu xuất tỉnh sạch cao Quy trình tách chiết ARN của chúng tôi có bước cải
tiến mới Ở giai đoạn cuối cùng, ARN được giữ nguyên trên cột và bảo quản ở -201C
cho đến khi thực hiệ
các kỹ thuật tiếp theo Cách bảo quản ARN trên cột giữ cho sin
phẩm không bị biến tính và an toàn cho việc vận chuyển mẫu ARN
Theo khuyến cáo của WHO cũng như các công bố khoa học của các tác giả
trong và ngồi nước, ni cấy tế bào thường trực Vero SLAM được lựa chọn là dòng tế
bào thích hợp nhất cho việc gây nhiễm và phân lập chủng virút sởi [11], [27], [28] Kết quả thu nhận của chúng tôi cũng cho thấy, so với dòng tế bào B95a, tế bào Vero SLAM
tỏ ra thuận tiện và đặc hiệu hơn cho việc gây nhiễm và tăng sinh chủng virút sỏi 3.2.4.2 Hết quả RT-PCR và Neseä PCR nhân dogn gen Nucleocapsit N vistit sot
+ Két qua RT-PCR
RT-PCR là một trong các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng rộng rãi
trong chẩn đoán bệnh sởi Các nghiên cứu đều tập trung phân tích đoạn ADN đài
khoảng 500 mueleotit đầu tận cùng -COOH của genom Nueleoeapsit N virút sỏi Trong
nghiên cứu này, 30 mẫu ARN virút sởi tỉnh sạch từ các nuôi cấy tế bào Vero SLAM
gây nhiễm chủng sởi được sử dụng cho phản ứng RT-PCR Doan ADN die higu
Trang 401 BT và các thành phần của bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR San phim ADN khuéch
dai sau RT- PCR duge kiểm tra trên gel agarose 2% nhuộm với cdithium bromit Kết
quả điện di trên Hình 3.2.1.2a thu nhận một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng
387 bp, phù hợp với cặp mỗi đặc hiệu đã thiết kế 1234 65 678910111213 ttt! Bele Me | 08700
Hình 3.2.1.2a Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi sau RT-PCR
1.2.3.4.5.6.7.8.10,11, Mẫu ADN vintt sối 12 ChuẪn âm tính
9 Thang ADM chuẩn 100bp 13 Chuẩn dương tính
Cho đến nay, RT-PCR đã trở thành kỹ thuật thường nhật được thực hiện tại hau
hết các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh sởi trong và ngoài nước Tuy nhiên, tuỳ theo
mục đích nghiên cứu của từng công trình thực nghiệm, trình tự các cặp mỗi đặc hiệu
cho khuếch đại đoạn gen N virút sởi có thể được thiết kế khác nhau Chu kỳ phản ứng RT-PCR ciing được thiết kế phù hợp với từng nghiên cứu Điểm chung nhất là các đoạn ADN được khuếch đại đều tập trung trong vùng 500- 590 bp [1], [10], [13], [17]
So véi các công trình khoa học đã công bố, quy trình thực hiện phản ứng RT-
PCE của chúng tôi có điểm khác biệt Giai đoạn thực hiện phản ứng nhiệt gồm 35 chu
kỳ, được lập trình với 2 công đoạn Công đoạn thứ nhất gồm 10 chu kỳ [95°C/30 giây,
37°C/30 giây, 72°C/1 phút], công đoạn tiếp theo kéo đài 25 chu kỳ [93°C/30 giây, 57°C/30 gidy, 72°C/1 phut] + 5 giây cho mỗi chu kỳ Với việc bổ sung thêm thời gian
như trên, quá trình khuếch đại đoạn ADN đạt hiệu xuất cao hơn Điểm mới này giúp
cho việc tối ưu hoá quy trình kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu + Két qua Nested PCR
Với các chủng virút không xác định được băng ADN sau RT-PCR, cần tiến