Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp xác định một số carotenoids quan trọng trong thực phẩm

BỘ Y TẾ VIEN DINH DUGNG -= 00 -< Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP XÁC ĐỊNH MOT SO CAROTENOIDS QUAN TRONG TRONG THỰC PHẨM Cấp quản lý: Cấp sở Chủ nhiệm dé tài: Ths Lê Hồng Dũng Nời thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP Thời gian thực hiện: 9/2003 đến 9/2004 Hà Nội, tháng 12 - 2004 Báo cáo nghiêm thu đề tài nghin cứu khoa hoc cấp Viên ÁP DỤNG PHƯƠNG PHAP SÁC KÝ LỎNG CAO ÁP XÁC ĐỊNH MỘT SO CAROTENOIDS QUAN TRỌNG TRONG THUC PHAM ĐẶT VẤN ĐỀ Carorenoid nhóm sắc tố tổng hợp thực vật số loại vi sinh vật Các carotenoid chia thành hai nhóm chính: carotenoid nhóm hydrocarbon (carotene) carotenoid chứa oxy (còn gọi oxocarotenoid hay xanthophyll), Cae xanthophyll c6 nhóm hydroxyl (OH) co thể kết hợp với acid béo thành carorenol ester [1] Tới có 700 loại carotenoid biết đến tự nhiên, khoảng 40 loại thường có mặt chế độ ăn khoảng 20 loại có lượng đáng kể huyết mơ thể người Trong số đó, loại carotenoid có mặt huyết tương mơ Œ-carorene, -carorene, lycopene (các carorenoid nhóm hydrocarbon), f-cryptoxanthin, lutein va zeaxanthin (các carorenoid nhóm xanthophyll) [2] Trong thể người, carorenoid đóng nhiều vai trị quan trọng Ngồi hoạt tính tiển vitamin A, nhiều nghiên cứu cho thấy carotenoid có khả tăng cường hệ thống miễn dịch làm giảm nguy mắc bệnh hiểm nghèo ung thư, bệnh tim mạch, thối hóa võng mac tuổi tác bệnh cườm [3,4,5, 12] Những tác dụng sinh học carotenoid độc lập với hoạt tính tiên vitamin A đặc tính chống oxy hóa carorenoid, thơng qua rác dụng làm hoạt rính gốc tu va don dep oxy ngun tử [13, 14, 15] Vai trị tích cực carotenoid chế độ ăn sức khòe người mối quan tâm nhiều nhà khoa học, địi hồi phải có số liệu thành phần loại carotenoid Hiện nay, phương pháp phân tích carotenoid thực phẩm phát triển, bao gồm sắc ký lớp mòng sắc ký lòng cao áp, để thay bổ sung cho phương pháp phân tích cổ điển (sắc ký cột mở - OCC) [16] Đề định tính đánh giá cấu trúc carotenoid, phương pháp phổ biến quang phổ UV-VIS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) khối phổ [17,18,19] Ngoài ra, phương pháp xác định điện hóa (ECD) cơng cụ hữu ích, thay cho phương pháp HPLC (UV-VIS) thơng thường, trường hợp địi hịi độ nhạy cao (cỡ 10) cỡ mẫu nhỏ phân tích lượng vết Phương pháp đo quang phổ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS) thường dùng để ước lượng tổng số carorenoids, nhiên, phương pháp sắc ký lòng cao áp (pha thường pha ngược, C18 C30) dùng phổ biến để xác định carorenoid riêng biệt Tuy chưa có phương pháp chuẩn để xác định tất carotenoid rhực phẩm phương pháp Harr %ott [22], thiết bị sắc ký lòng cao áp sử dụng rộng rãi nhiều nghiên cứu thành phần carorenoid số thử nghiệm liên phòng [28] 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1 Áp dụng phương pháp sắc ký lòng cao áp khảo sát điều kiện phân tích carotenoid 2.2 Xác định hàm lượng Œ-carorene, -carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin Trong số rau giàu carotenoid PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Hóa chất, thuốc thử Tat loại hóa chất sử dụng thuộc loại hóa chất tỉnh khiết phân tích Methanol, ethanol, aceronitrile, petroleum erher, kali hydroxyt, natri sulfate khan hãng Merek (Đức), n-hexane hãng Prolabo (Pháp), dichlomethane từ hãng BHD (Anh) Các chất chuẩn -carotene, lycopene duge mua tit hang Sigma (My) œ-carorene, lurein, zeaxanrhin, 3.2 Hệ thống sắc ký lơng Hai hệ thống sắc ký lịng sử dụng nghiên cứu hệ thống sắc ký ion với dereror UV-VIS 2487, huỳnh quang 2475, bơm mẫu ray hệ thống sắc ký axit amin với detetor PDA 2996, huỳnh quang 2475 bơm mẫu tự động hãng Water (Mỹ) Cột sắc ký sử dụng Symmetry C18 (150mmx 4.6mmx 5um) va Symmerry Shield RP18 (150mm x 4.6mmx 5m) hãng Water Thành phân pha động gồm acetonitrile : methanol (chứa 50mM ammonium acetate) : dichlormethane với ty lệ tương ứng 75:15:10 (v/v/v) Tốc độ dòng ml/phút nhiệt độ cột 40°C Các carotenoid định lượng bước sóng 450nm lutein, zeaxanthin, œ-carotene, -carorene 476nm lycopene 3.3,Chuẩn bị dung địch chuẩn Lutein, c-carotene, -carotene hòa tan chloroform va thém hexane (tỷ lệ 1:9) đến vạch định mức Zeaxanthin lyeopene hoa tan wong chloroform Trit lycopene, rat ca dung dịch chuẩn bảo quản lọ kín sắm màu -20°C Để tránh phân hủy, lyeopene chia vào lọ nhỏ lọ 1ml, thổi khô nitơ đóng kín, bảo quản -20°C Khi dùng, hòa tan lại chloroform Trước đo lại độ hấp thụ, lọ chuẩn để nhiệt độ phòng lượng dung dịch chất thổi khơ nitơ hịa tan lại dung mơi thích hợp đo máy quang phổ hấp thụ Specord 40 có phận quét bước sóng Nồng độ dung dịch chuẩn tính tốn lại dựa vào hệ số hấp thụ riêng, thể hiệnở bảng Bảng L Hệ số hấp thụ riêng céc carotenoid Luteia Zeaxamhin Lycopene đ-carotene Ê-earotene Dung môi ‘A (am) Be Be Ethanol Hexane Hexane Hexane Hexane 45 451 472 444 450 2550 2480 3450 2800 2560 145.1 141.4 185.3 130.3 1374 Phân từ lượng 369 569 537 537 337 Các dung dịch chuẩn làm việc có nơng độ từ 0.01Jig/ml pha từ dung dịch gốc cách thổi khơ nitơ pha lỗng pha động Hốn hợp chuẩn carorenoid chuẩn bị pha động từ chuẩn don carotenoid 3.4.Chuẩn bị mẫu rau, Các mẫu rau g6m rau muống, rau ngót, cà chua, cà rốt, ớt vàng mẫu cam, quýt, mận, đu đủ dưa hấu rửa sạch, lấy phần ăn xay máy xay mẫu ướt Mẫu polyethylene -20°C đến phân tích đồng bảo quản lọ 3.5 Phương pháp chiết xuất carotenoid Hai phương pháp chiết xuất carotenoid áp dụng phương pháp Hart Scort (22) phương pháp tiêu chuẩn theo AOAC (24) Phương pháp chiết xuất định lượng cdc carotenoid theo Hart Scott tóm tắt hình Phương pháp chiết xuất phân theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC tóm tắt hình Nhiều nghiên cứu trước (29) khuyến cáo khơng nên dùng phương pháp thủy phân phân carotenoid để tránh phân hủy thay đổi cấu trúc carotenoid Trong đẻ tài này, để so sánh khác trước sau giai đoạn thủy phân, mẫu mẫu ớt thủy phân theo phương pháp Han Scort để xác định carotenoid nhóm xanthophyll, hình 3.6 Phương pháp định tính định lượng carotenoid Sau chiết xuất, mẫu dịch chiết phân tích hệ thống sắc ký lòng với detector PDA UV-VIS Các carotenoid xác định cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn tương ứng, đồng thời dựa vào phổ tử ngoại chiều chất detector PDA Hàm lượng loại carotenoid tính tốn dựa vào diện tích peak đường chuẩn tương ứng Hình 1: Quy trình chiết xuất carotenoids theo phương pháp Hart Scoft ‘Mau cau, qua (10g) + 1g Mgco, V 50m! THF: MeOH (1:1) Chiết phút máy nghiền tốc độ cao Lọc chân không Ba # Gộp ¥ dịch ”” Dịch chiết THEMeOH |@”” “ chiết (bình gạn) ‘Trang rửa chiết lại lầnx 50ml ]Tmrweom + 50ml ether đầu hỏa chứa 1% BHT + 50ml NaCl 10% Ỷ Tắc kỹ Lép ether Lớp THF:MeOH Gép dịchcl ¥ Co quay châu khơng đến khô Y Hồa tan điều chỉnh dichlormethan tới 10ml Ỷ Pha loãng pha động với tỷ lệ thích hợp bơrn vio HPLC Chiết lại lầnx 30ml etker Hình 2: Quy trình chiết xuất carotenoid theo AOAC Mẫu rau, (2g) + 005 g MgCO, + 35 mlethanoliether dau hỏa (4:3) Chiết máy xay tốc độ cao phút Lạc chân không Chiết lại2 lầnx 35 ml etharol:ether dầu hỏa Lọc —PB — — Rửa bã lầnx 12.5 mlethanoL Lọc Rita ba lanx 12.5 mlether Loe Gop dich chiet — _ | Bổ bã Rửa lấnz 50 rnÍ NaCl 10%, Hinx 50m1H,O Dịch chiết carotenoid Cô quay chân không 640°C Tòa tan cận wong ml chloroform va dink mite vừa đủ 1Oml với dung môi pha động Loc qua màng lọc 0.45|tm Bơm 50ul vào HPLC lớp nước Hình Giai đoạn thủy phân dịch chiết (đối với mẫu ớt) 4ml địch chiết dichlormethane + mÌKOH 10%/ methanol Thùy phân Lhtrong chỗ tốiở nhiệt độ phòng ‘Them 20ml NaCl 10% va chiét bing 20ml ether dầu hỏa —— Chiết lại2 lầnx 20ml ether đầu hỏa Gop dich chiet ether Rita nước đến trung tinh Dịch chiết earotenoid Bé lớp nước Cô quay chân không 35°C Ha tan cặn ml dichlomethane định xmức vừa đủ 1Oml với dung môi pha động, Loc qua mang loc 0.45 Pha loãng với tỷ lạ thích hợp bơm vào HPLC 3.7 Tính tốn kết Ham lugng cdc carotenoids rau, tính tốn theo cơng thức sau: X(g/100g)= đó: máu X Ca XD —————————x100 A„xm A„., diện tích peak carotenoid trén sắc đồ phân tích A„„ diện tích peak chuẩn carotenoid sắc đồ mẫu chuẩn Cạ„ nồng độ chuẩn carotenoid DÌà hệ số pha loãng mm lượng mẫu cân chiết xuất KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Khảo sát điều kiện phân tích 4.1.1 Các điều kiện chiết xuất carotenoid Hai phương pháp chiết xuất carotenoid áp dụng mẫu rau, Cả phương pháp Harr Seorr (hình 1) phương pháp theo AOAC (hình 2) có khả chiết hồn tồn carotenoid sau lần chiết xuất hỗn hợp dung môi tương ứng Việc thêm MpgCO; giúp cho dung mơi chiết xuất thấm sâu vào mẫu hịa ran carotenoid Tuy nhiên, độc tính cao dung môi terahydrofuran nên phương pháp chiết xuất theo AOAC, sử dụng hỗn hợp ethanol:ether dâu hỏa chọn áp dụng để phân tích mẫu rau 4.12 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lòng Nhiễu carotenoid loại pha động sử dụng để khảo sát khả tách methanol:THF (50:50); methanol: THF (95:5); acetonitrile:methanol (chứa S0mM ammonium acetate):dichlormethane:H,O (70:15:10:5); kết khảo sát cho thấy pha động aceronitrile:merhanol (chứa 50mM ammonium acerate):dichlormethane (75:20:5) (theo Hart va Scott) có khả tách tốt carotenoid cột sắc ký có, khả tách tốt œ-carotene, -carotene đồng phân 9-cis -carorene Hai loại cột Symmetry C18 Symmetry Shield RP-18 dùng để khảo sát khả tách carotenoid Kết cho thấy cột Symmetry C18 có khả tách tốt cho peak bị dỗng Tuy nhiên, loại cột khơng tách lutein khỏi zeaxanthin (hình 5) Đây hai carotenoid nhóm xanthophyll eó cấu trúc giống Điều phù hợp với nghiên cứu trước cột moaome C18 sử dụng pha động tương tự aceronitrile:merhanol:dichlormethane (70:20:10) [1] Để rách tốt cdc carotenoid có cấu trúc giống đồng phân, giới thường sử dụng loại cột polyme C18 (chẳng hạn cột Vydac 0.008 000% —Lutizea 201TP34 [22]) loại cột tốt cột polyme C30 [1] Hình Sắc đổ hốn hợp chuda carotenoids: Lutein/zeaxanthin (3.008), lycopene (11.171), c-carotene (18.488) va B-carotene (19.801) Pha động: acetoaitrilc:rnethanoL (chia 50mM ammonium acetate):dichlormethane (75:20:5) Tée 46 ddng Lml/phit, UV 450am 0003 “i aga 8§ 3$ ụi & {A Ệ a 004 0000 cnet s Naat nec 1800 | 18.00 Hình Sắc đồ chuẩn luteia (5a), t,=2.980 zeaxanthin (5b), t,=3.009 Pha động: acetonitrile:methanol (chita 50mM ddog Lml/phit, UV 450am ammonium acetate):dichlormethane (75:20:5) Toc Ảnh hường nhiệt độ trình phân tích khảo sát Ở nhiệt độ 25-30°C, phân giải peak cải thiện phần, nhiên không đáng kể loại cột sắc ký có Mặt khác, theo nghiên cứu trước [1], cột C18 thông thường phải hạ nhiệt độ buồng cột xuống nhiệt độ phòng (chẳng hạn 13°C) có khả tách lutein zeaxanrhin khỏi Tuy nhiên điều khó áp dụng hệ thống sắc ký có Tai 40°C, phan giải Œ-carotene -carorene tương đương so với 2ã5°C Do nhiệt độ buồng cột phân tích carotenoid chọn 40°C nhằm rút ngắn thời gian phân tích 4.2 Đánh giá phương pháp phân tích 4.2.1 Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính phương pháp phân tích khoảng nồng độ carotenoid cho phép tính tốn kết dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính y =ax + b (rong y diện tích chiều cao pic, x nồng độ carotenoid) Kết khảo sát koảng tuyến tính carorenoid thể bảng 4.2.2 Độ thu hồi độ lặp lại phương pháp Các chuẩn carorenoid nạp vào mẫu cà rốt độ thu hồi trung bình tính tốn thể bảng Do Lutein va zeaxanthin chưa tách khỏi phương pháp sắc ký lòng khảo sát nên nghiên cứu chưa đánh giá độ thu hôi carotenoid Các chuẩn lycopene, œ-carorene - carotene duge nap vào mẫu cà rốt với nồng độ tương ứng 0.235 g/ml, 0.317 Hg/ml 0.634 ng/ml Kết độ thu hồi giá trị trung bình phép phân tích song song (n=3) Bảng Kết khảo sát giới hạn phát hiện, khoảng tuyến tính, độ lặp lại độ thu hổi cde carotenoid Lutein GiẾU, ban, phat: BIẾN (ug/ml) Khoảng tuyến Zeaxanthin | Lycopene | a-carotene | B-carotene ;oggs 0005 0016 0.007 001 tính (ugiml), - =0.995-| 0.02-3.0 | 00230 | 00320 | 0023.5 | 00240 0.999 Độ thu hồi B12 89.5 913 (%), 0=3 (0.235 6317 (0.634 i a=5 jig/ml) g/ml) jig/ml) 7.8 68 57 LENN, 4.3, Két phân tích mẫu rau, Bang thé hàm lượng trung bình carotenoid mẫu trước giai đoạn thủy phân (n=6) Trong 10 loại rau, phân tích, hàm lượng Lutein cao rau ngót, lycopene có nhiều cà chua dưa hấu, Œ-carotene có nhiều cà rốt ớt vàng, -carotene có hàm lượng cao rau ngót cà rốt Hình Sắc đỏ carotenoid mẫu rau ngót Pha động: acetonitrile:methanoL (chứa 50mM ammonium acetate):dichlormethane (75:20:35) Tốc độ dòng Iml/phút, UV 450nam 0080 ed 9.00 food 1200 1400 1600) = b-carotene >a-carotene 0.280 Bảng Hàm lượng trung bình (n=6) carotenoid rau va trước thủy phân (tig/100g mẫu tươi) Rau muống Raungi Cachu Cà mốt Gt vang Du dit Dưa hấu Cam Quýt _ 86,8 | i SH93 24 98 | 40 | 1205 | 13.0 | | Man Tuteia | 30.2 Ì Tycopene | œ-caroene Ì | | -carotene | T89 3060 7800 05 2000.5 i 7T | | | 68101 eas 688m1 732706 | 153.0 | 3606.7 4813652 402.7 BO 214 281 | 628 430 | 16331 Hioh Sic dé céc carotenoid miu maa Pha dong: acetonitrile:methanol (chia 50mM ammonium acetate):dichlormethane (75:20:5) Tốc độ dòng Lml/phit, UV 450am cae ozo \ : (|R LÍ \ §2 ge | |) | 6000ˆ- -~ cung mm { pc ' Be ate E| Ri soe | \ he i tot Trong loai qua, cée xanthophyll abu lutein va zeaxanthin & dang ester với acid béo (carotenol ester) Thủy phân cách hiệu để loại bò ehlorophyll chất béo không mong muốn chất ảnh hường đến q trình phân tích làm giảm tuổi thọ cột sắc ký lịng [1] Việc thủy phân carotenol ester đơn giản hóa q trình phân tách, định tính định lượng cde carotenoid cde ester khó rách khỏi khó tách khỏi chất béo mẫu Trong nghiên cứu này, trình thủy phân rút ngắn (rong giờ) để hạn chế phân hủy carotenoid Hàm lượng carotenoid ớt vàng loại thể bảng So sánh hàm lượng carotenoid mẫu thủy phân không thủy phân (bảng 5) thấy hàm lượng lutein tăng lên dưa hấu mận So sánh diện tich peak lutein/zeaxanthin & cée mau ớt vàng, đu đủ, cam quýt thấy đáp ứng cao hẳn so với mẫu không thủy phân tương ứng (hình 7,8) Điều cho thấy để định lượng số xanthophyll lutein zeaxanrhin cần thiết phải thực biện giai đoạn thủy phân, đồng thời điều kiện tủy phân cần khảo sát thêm nhằm đạt độ thu hồi cao Tuy nhiên lutein va zeaxanthin bị lẫn vào nên việc định lượng không thực loại có chứa hai loại carotenoid Trong hàm lượng carotenoid nhóm hydrocarbon lycopene, œ-carotene, J-carotene lại giảm Mặc dù số lượng mẫu thủy phân khảo sát chưa nhiều thấy q trình thủy phân đồng thời làm phân hủy earorenoid nhóm chúng dễ bị oxy hóa tác động mơi trường kiểm, ánh sáng khơng khí Đặc biệt hàm lượng lycopene giảm tới gần 60% mẫu dưa hấu sau thủy phân So sánh với số nghiên cứu trước Hart Scort thấy hàm lượng hâu hết carotenoid tăng lên sau giai đoạn thủy phân Điều cho thấy q trình phân tích giai đoạn thủy phân cần tiến hành điều kiện nghiêm ngặt sục khí nitơ vào mẫu, thêm chất chống oxy hớa để hạn chế phân hủy earotenoid Bảng Hầm lượng trung bình (n=6) carotenoid rau va qua sau thủy phân (ug/100g mẫu tươi) | Tateia [Lycopene 'œ-eatmtene 2804.6 @-carotene Gr vang 32198 Du dit 69 2092 Dưa hấu 276 463.0 322.7 Cam 15.5 304 Quyt 12.9 30.3 Man 327.4 353 1403.9 Bảng So sánh hàm lượng carotenoid ớt loại trước sau thủy phân (0g/100g mẫu tươi) [— TwRia Lycopene o-GAroIEnE ÿ-eamolene Tawge Sau TP | Tarée TP | Sau TP Gt vang | Dud Dim | Nu + Cam Quá Mạn - t 10 | 276 | 2000.5 | : : + + 392) 3271 i Tans © | sau TP “3270.6; 6875) 2804.6, | : G8) Tạ 0Ì 155j 129) 353) Sau TP 3606.7; | + 32198 2652 402.7| 281) 430 16331) 2092 322.7 304 303 14039 Hình Sắc đỏ carotenoid mẫu mận sau thủy phân Pha động: acetoniirile:metha nol (chứa 50mM Lutein độ dòng Lml/phút, UV 450am armmmonium acetate):dic hlomnethane (75:20:35) Tốc Ô 4409 ` 607 1800 2006 KẾT LUẬN 5.1 Kết nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp để định lượng carotenoid rau, sau: - Quy trình chiết carorenoid AOAC 43.014 (1984) sử dụng hỗn hợp ethanol/petroleum ether theo - Cot sic ky: Symmetry C18 hoac Symmetry Shield RP18 150mmx 4,6mm - Pha động: Acetonitrile:Methanol Dichlormethane (75:20:5) (chứa 5O0mM ammonium acetate): - Tée dòng: 1ml/ phút; nhiệt độ buồng cột 40°C - Detector: UV rai 476am d6i véi Lycopene, va 450nm d6i voi cde carotenoid lại, hoac detector PDA 450am ø Để định lượng carotenoid nhóm hydrocarbon (lycopene, œ-carorene, carorene) dùng cột sắc ký pha ngược (C18) thông thường không áp dụng giai đoạn thủy phân o Dé tach định lượng xanthophyll lurein, zeaxanthin cần sử dụng loại cột tách đặc hiệu loại cột polyme C18 C30 va cần thiết phải thủy phân mẫu để chuyển carotenol ester thành dạng tự 5.2 Hàm lượng carotenoid rau, Hàm lượng carorenoid số rau, xác định sau: - Lutein ¢6 nhiều loại rau rau ngốt (5419,3 Hg%), rau muống -_ Lycopene có nhiều rong ca chua (2750,0 Iig%) dưa hấu (2000,5 (867,9 Ig%), có số loại mận (327,1 Iig%) dưa hấu (27,6 Hg%) Hg%) - _ Œ-earotene có hàm lượng cao ớt vàng (3270,6 Hg%), cà rốt (3036,0 ng%) rau ngót (572,9 Ig%) -_ -earorene có nhiều rau cà rốt (6597,1 Hg%), rau ngót (6810,1 Ig%), ớt vàng (3606,7 Ig%), rau muống (1531,0 Iig%) cà chua (647,8 Hg%), có mận (1633,1 Hg%) dưa hấu (402,7 Hg%) Các kết phân tích tập hợp theo dõi đánh giá nghiên cứu nhằm xây dựng thành sở liệu để cập nhật vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam KHUYẾN NGHỊ Để xây dựng sở liệu carorenoid thực phẩm Việt Nam, cần thiết phải mở rộng nghiên cứu nhiều đối tượng rau, thực phẩm thông dụng Bên cạnh cập nhật số liệu phát triển Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm, sờ liệu đáp ứng nhu cầu sử dụng người tiêu dùng nhà khoa học dinh dưỡng Hà Nội ngày — CƠ QUAN CHỦ QUẢN (Ký tên đồng đấu) DON VICHU TRI thắng năm 2004 CHU NHIEM DE TAI TÀI LIỆU THAM KHẢO Della B Rodriguez-Amaya (2001) A guide to carotenoid analysis in foods ILSI Press International Life Sciences Institute One Thomas Circle, N.W Washington, D.C ISBN I57881-072-8 Dale A Cooper, PhD., Alison L Eldridge, PhD., RD., and Joha C Peter, PhD (1999) Dietary carotenoids and lung cancer: A ceview of recent research Nutrition Review, Vol 57, No (1): 133-145 Mathews-Roth, M.M (1995) Carotenoid and cancec prevention experiment and epidemiological studies Puce Appl Chem 57:717-722 Mathews-Roth, M.M (1991) Recent progress in the medical applications of carotenoids Pure Appl Chem 63:147-156 Bendich, A and JA Olson (1989) Biological actions of carotenoids FASEB J 3:19271932, Bendich, A (1990) “Caroteaoids and immune system In Carotenoids: Chemistry and Biology Eds N.L Krinsky, M.M Mathew-Roth and RF Taylor New York: Pienum Press, 323-335, Bendich, A (1994) Recent advances in clinical research involving carotenoids Pure Appl Chem 66:1017-1024 Keinsky, N.L (1990) “Carotenoids in medicine” In Carotenoids: Chemistry and Biology Eds NL Keinsky, M.M Mathew-Roth and RF Taylor New York Plenum Press, 279291 Krinsky, NL (1994) The biological properties of carotenoids Pure Appl Chem 66:10031010 10.Ziegler, R.G (1991) Vegeables, fcuits, and carotenoids and the tisk of cancer Am J Clio Nute, 53: 2518-2598 Li Gerstec, H (1991) Potential cole of beta-carotene in the prevention of cardiovascular disease Int J Vit Nutr Res, 61:277-291 12 Byer, T and G Perry (1992) Dietary carotene, vitamin C, and vitamin E as protectives antioxidants ia human cancers Ann Rey Nute 12:139-159, 13 Burton, G.W (1989) Antioxidants action of carotenoids J Nute 11.9:109-L11 14, Krinsky, NI (1989) Antioxidant function of carotenoids Free Radical Biol Med, 7:617635 15 Palozza, P and N.L Krinsky (1992) Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro: An overview Methods Enymol 213:403-420 16 Teodor Hodisan, Carmen Socaciu, Ioana Ropaa, Gaveil Neamm (1997) Carotenoid composition of Rosa canina fruits detecmined by thin-layer chromatogeaphy and highperformance liquid chromatography J Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 16: 521528 17.G Britton, S Liaaen-Jensen, H Pfander (Eds.) (1995) Carotenoids, Vol LA-LB, Biekhauser Verlag, Basel 18 G Britton (1983) The Biochemistry of Natural Pigments Cambridge University Press, Cambridge 19 H Pfander (1987) Key to carotenoids, 2“ ed., Birkhauser Verlag, Basel 20 AM Pupin, MJ Dennis, M.C.F Toledo (199) HPLC analysis of carotenoids in orange juice Food Chemistry 64:269-275 21 Abdulnabi A Abushita, Emhemed A Hebshi, Hussein G Daood & Pdter A Biacs (1997) Determination of antioxidant vitamins in tomatoes Food Chenusiry Vol 60, No 2:207- 212 22 David J Hart & K John Scott (1995) Development and evaluation of an HPLC method foc the analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid coateat of vegetables and fuits commonly consumed in the UK Food Chemistry 54:101-LLL 23 Anocha Kajadphai Tauagbodhitham, Gwya P Jones, Mack L Wahlqvist & David R Briggs (1998) Evaluation of exteaction method forthe analysis of carotenoids in fruits and 24 vegetables Food Chenustry Vol 63, No 4:577-584 Association of Official Analytical Chemists (1984) Official Methods of Analysis of the Association of Analytical Chemists Section 43.014-43.017: Catotenes in Fresh Plaot Materials and Silages, Spectrophotomettic Method, Final Action, 14* eda The Association of Official Analytical Chemist, Inc., Aclington, VA 25 Ami Bea-Amotz & Rachel Fishler (1998) Analysis of carotenoids with emphasis on 9-cis beta-carotene in vegetables and fruits commonly consumed in Iscael Food Chemistry Vol 62, No 4: 515-520 26 Pongtora Suagpuag, Sommai Tangchitpianvit, Umipora Chittchang, Emon Wasanrwisut (1999) Retinol and beta-carotene content of indigenous caw and home-prepared foods in Northeast Thailand Food Chemistry 64:163-167 21 Tee E-Siong, God Ah-Heng & Khor Swan-Choo (1995) Carotenoid composition and 28 content of legumes, tubers and starchy coots by HPLC Mal J Nutr L: 63-74 K John Scot, Paul M Finglas, Rob Seale, David J Hatt & Isabelle de Eroidmonr-Gortz (1996) Inieclaboratory studies of HPLC proceduces for the analysis of carotenoids in foods Food Chemistry Vol 57, No 1: 85-90 29 US Depactment of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service, 2001 USDA Nutrient Database for Standard Refer ence, Release 14 Web version