Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kít để chuẩn đoán các loài ký sinh trùng chủ yếu ở việt nam

BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên đề tài: SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ XÂY DỰNG KIT ĐỂ CHẨN ĐỐN CÁC LỒI KÝ SINH TRÙNG CHỦ YẾU Ở VIỆT NAM Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài PGS.TS LÊ THANH HÒA BỘ Y TẾ 9574 Hà Nội - 2012 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới, đặc biệt sinh học phân tử có định hướng phát triển vượt bậc Một thành tựu lớn phát triển kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ tiến hố sinh vật, có ký sinh trùng (Blair et al., 2005; Chandler, Colitz, 2006) PCR trở nên công cụ thiếu công tác giám định, phát hiên sinh vật, kể ký sinh trùng gây bệnh kỹ thuật cao Dễ làm, có tính nhạy đặc hiệu cao, đồng thời cần lượng khn ADN đối tượng sinh vật giai đoạn sinh trưởng nào, PCR cho sản phẩm với độ xác cao loại sinh vật nghiên cứu Do đó, với lợi vậy, PCR ứng dụng rộng rãi lĩnh vực, trước hết chẩn đốn lồi gây bệnh (Ishmael, Stellato, 2008) Thành phần loài ký sinh trùng (KST) Việt Nam phong phú gồm ký sinh trùng đường ruột, đường hô hấp, thường gây bệnh cộng đồng nghèo (bao gồm: sán gan lớn, nhỏ; sán phổi; sán dây ấu trùng sán lợn) phân bố đa nhiễm thể, đặc biệt đường ruột, tồn dạng trưởng thành hoặc/và dạng phát triển khác Một số loại KST nói cịn có giai đoạn tồn phát triển vật chủ trung gian (cá, ốc, cua, tơm) trì nguồn gen ký sinh Nếu sử dụng phương pháp truyền thống hình thái học hoặc/và huyết học để chẩn đốn xác định, có nhiều lúc chưa xác, đặc biệt có số KST gây bệnh có biểu bệnh lý tương tự nhau, có hình thái gần giống vật chủ trung gian dạng ấu trùng (metacercaria) khó phân biệt Bất kỳ đâu, đơn hay đa nhiễm, dạng trứng, ấu trùng hay trưởng thành, riêng rẻ hay lẫn lộn (ví dụ: đường ruột gồm trứng/con trưởng thành nhiều loại khác nhau; hay tập hợp metacercaria cá/cua/tơm), KST cung cấp nguồn gen đích làm khn cho phản ứng phát gen đặc hiệu lồi Multiplex-PCR, loại hình chẩn đốn phân tử đa gen đa mồi, ứng dụng phát lúc gen đặc hiệu nhiều loài, cho kết xác lồi KST gây bệnh để có hướng chẩn đoán nhanh nhất, tiết kiệm nhất, điều trị phòng chống đắn Đề tài cấp Bộ: “Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kit để chẩn đốn lồi ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam”, Bộ Y tế phê duyệt, cấp kinh phí, cho thực giai đoạn 2010 – 2011, với số chủ đích sau: Mục tiêu chung đề tài: Có kit chẩn đoán đa gen số ký sinh trùng thường gặp Cụ thể: Xây dựng kit sinh học phân tử chẩn đoán phân biệt ký sinh trùng thường gặp người Việt Nam sán gan lớn (fascioliasis), sán gan nhỏ (clonorchiasis), sán ruột nhỏ (haplorchiasis), sán phổi (paragonimiasis), sán dây ấu trùng sán lợn (taeniasis) Trên sở chuẩn hố kit, tiến hành ứng dụng chẩn đoán số bệnh nhân Việt Nam diện hẹp trước phát triển ứng dụng qui mô lớn Từ mục tiêu vậy, đề tài đưa số luận giải cho trình thực thiết kế phương pháp xây dựng kit multiplex-PCR, sau: i) Phải có mồi đặc hiệu nhạy cho vùng gen đối tượng, vậy, phải có trình tự nucleotide vùng gen đó; ii) Phải khoanh nhóm đối tượng chẩn đốn, trước hết nhóm xuất đường ruột (trứng/KST trưởng thành loài sán sán dây), đường hơ hấp (sán phổi), metacercaria cá/cua, chí ấu trùng ốc/vật chủ trung gian; iii) Kit phải có độ đặc hiệu độ nhạy cao cần thử nghiệm đánh giá; iv) Mẫu bệnh phẩm sử dụng phải loại lấy từ vật chất thu thập dễ dàng đối tượng (ví dụ: sán trưởng thành, trứng, phân, đờm, metacercaria cá, cua; cercaria vật chủ trung gian); v) Kit phải kiểm nghiệm phương pháp giả nghiệm từ nguồn khuôn xác định trộn lẫn với (in vitro) thử nghiệm thực tế (in vivo), có điều kiện; vi) Xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng đáp ứng yêu cầu; vii) Triển khai ứng dụng chẩn đoán bệnh phẩm bệnh nhân qui mô hẹp, có điều kiện thực Trong điều kiện thực tế thực đề tài (2010-2011), xây dựng kit multiplex-PCR chẩn đoán ký sinh trùng đăng ký đề tài: loài sán gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), loài sán gan lớn (Fasciola gigantica; F hepatica), loài sán phổi (Paragonimus heterotremus; P ohirai), loài sán ruột nhỏ (Haplorchis taichui; H pumilio), loài sán dây/ấu trùng sán lợn (Taenia solium; T saginata; T asiatica) Gen đích chủ yếu tập trung vào thị phân tử hệ gen ty thể, dựa vào liệu nucleotide toàn hệ gen ty thể sán gan nhỏ (Clonorchis; Opisthorchis); sán gan lớn Fasciola spp; sán ruột nhỏ Haplorchis spp; sán phổi Paragonimus spp Cơ sở liệu gen/hệ gen ty thể tìm thấy GOBASE (xem: http://gobase.bcm.umontreal.ca/) (O’Brien et al., 2009), bao gồm nhiều liệu đồng nghiệp xây dựng (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006) Mặt khác, nhiều liệu gen/hệ gen ty thể cập nhật trình thực đề tài sán ruột nhỏ Haplorchis spp (Le et al., chưa công bố; De and Le, 2011) Sử dụng thị phân tử ty thể từ nguồn liệu này, kit nghiên cứu thực Tám kit xây dựng, là: i) Bộ kit số 1, ký hiệu kit A(Cs+Ov), loài: Giữa sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini; ii) Bộ kit số 2, ký hiệu kit B(Fg+Fh), loài: Giữa sán gan lớn Fasciola hepatica F gigantica; iii) Bộ kit số 3, ký hiệu kit C(Ht+Hp), loài: Giữa sán ruột nhỏ Haplorchis taichui H pumilio; iv) Bộ kit số 4, ký hiệu kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg), loài: Giữa sán gan nhỏ C sinensis O viverrini sán gan lớn F gigantica F hepatica; v) Bộ kit số 5, ký hiệu kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht), loài: Giữa sán gan nhỏ C sinensis O viverrini sán ruột nhỏ H pumilio H taichui; vi) Bộ kit số 6, ký hiệu kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp), loài: Giữa sán gan lớn F hepatica F gigantica sán ruột nhỏ H pumilio H taichui; vii) Bộ kit số 7, ký hiệu kit D(Tso+Tsa +Tas), loài: Giữa sán dây T solium T saginata T asiatica; viii) Bộ kit số 8, ký hiệu kit E(Ph+Po), loài: Giữa sán phổi P heterotremus P ohirai Mỗi kit, bao gồm 100 phản ứng sản xuất trình bày bao gói theo u cầu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐÁNH GIÁ VỀ BỆNH KÍ SINH TRÙNG THƯỜNG GẶP THUỘC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.1.1 Đánh giá tình hình chung bệnh kí sinh trùng Hiện nay, có hàng trăm loại bệnh KST, trước hết bệnh sán (trematode), sán dây (cestode), giun tròn (nematode) KST đơn bào (protozoa) người truyền từ động vật sang người gây bệnh (zoonotic infection), nghiên cứu sâu sắc góc độ ngun nhân, sinh thái học, hình thái học, đặc tính truyền lây, chế sinh bệnh, vòng đời, điều trị, phịng chống, chẩn đốn ký sinh trùng học, huyết học, gen học mối quan hệ phả hệ thành phần loài (McCarthya, Moore, 2000; Macpherson, 2005; Graczyk, Fried, 2007; Littlewood, 2008; De Lellis et al., 2008) Nhiều loại bệnh KST xuất tái xuất ((re)-emerging parasitic infections) nhiều quốc gia, có nhiều loại nguy hiểm, kháng thuốc nhanh mức độ kháng thuốc cao trở thành mối quan tâm hàng đầu y tế giới Sự bùng nổ/tái xuất/đa nhiễm/kháng thuốc/đột biến nhiều loài KST gây bệnh đặt u cầu cần có nhiều phương pháp chẩn đốn nhanh, nhạy, xác, kinh tế tiết kiệm thời gian (Hotez et al., 2008; King, Bertino, 2008) Một số đối tượng KST thường gặp gây bệnh Việt Nam gồm loài truyền lây từ động vật sang người qua thức ăn (foodborne trematodes/cestodes), đối tượng để xây dựng kit chẩn đoán multiplex-PCR thuộc phạm vi đề tài Hơn nữa, đối tượng nghiên cứu thuộc loại tồn thức ăn (cá, cua, tôm) có nhiều dạng sinh trưởng tồn ruột (trứng, sán trưởng thành), thuận lợi cho việc phát phân tử kit PCR đa mồi 1.1.2 Một số bệnh thường gặp đối tượng nghiên cứu đề tài 1.1.2.1 Sán gan nhỏ bệnh sán gan nhỏ Sán gan nhỏ làm đối tượng nghiên cứu đề tài gồm loài Clonorchis sinensis phân bố Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam phía Đơng nước Nga Opisthorchis viverrini phân bố Đông Nam Châu Á, gặp người Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia Trung Quốc Bệnh thường gặp có vai trị dịch tễ học quan châu Á giới bệnh sán gan nhỏ (clonorchiasis/opisthorchiasis) C.sinensis Opisthorchis viverrini gây Một điều đặc biệt lưu ý O viverrini C sinensis coi yếu tố tham gia tích cực chế tiến triển gây ung thư biểu mô túi mật (cholangiocarcinoma) với gần 100% tử vong người (Sripa, 2007) Xu hướng phân bố hai loài châu Á, C sinensis vùng Đông – Bắc O viverrini vùng Đông – Nam châu Á Việt Nam vùng địa lý có tồn hai lồi, nay, C sinensis phát tỉnh phía Bắc đến Nghệ An; O viverrini phát tỉnh miền trung phía Nam từ Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế đến Phú Yên, Đắc Lắc (Le et al., 2006; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2006) Vùng giao tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, việc cần xác định thêm cho xác (Le et al., 2006), điều có ý nghĩa sử dụng kit multiplex-PCR để sàng lọc nguồn bệnh đối tượng người cá địa bàn có giao loài (Lê Thanh Hoà cs, 2006) A B Hình 1.1 Sán gan nhỏ C sinensis trưởng thành (A) trứng sán C sinensis tiêu thu nhận phương pháp Kato-Katz (B) B A Hình 1.2 Sán gan nhỏ O viverrini trưởng thành (A) trứng sán O viverrini tiêu thu nhận phương pháp Kato-Katz (B) Sán gan nhỏ C sinensis có dạng hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt, dài từ 10 – 20 mm, chiều ngang từ – mm, có hai mồm hút Mồm hút phía trước có đường kính khoảng 600 µm, đường kính mồm hút phía sau khoảng 500 µm Ống tiêu hoá chạy dọc hai bên thân Lỗ sinh dục gần mồm hút vùng Tinh hoàn chia nhánh gần chiếm hết phía thân sau Buồng trứng khoảng thân, tử cung ống ngoằn nghèo gấp khúc (Hình 1.1A) Trứng sán C sinensis thường có hình bầu dục hình bóng đèn điện, màu vàng nâu, kích thước trung bình khoảng (27 x 15) µm (Hình 1.1B) Số lượng trứng C sinensis đẻ hàng ngày phụ thuộc vào vật chủ thời gian nhiễm Sán gan nhỏ O viverrni trưởng thành sống màu suốt có màu hồng màu đỏ, đầu phía trước nhỏ có hấp miệng nằm gần tận cùng, hấp bụng hình chén nằm mặt bụng, khoảng 1/5 phía trước thể Kích thước trung bình sán trưởng thành dài 7,4 mm (5,5 – 9,55 mm) rộng 1,47 mm (0,77 – 1,65 mm) (Hình 1.2A) Trứng sán gan nhỏ O viverrini C sinensis giống nhau, khó phân biệt hình thái Trứng hình oval hay bóng đèn, màu vàng nhạt, có nắp nhơ lên, kích thước trung bình (27 – 15 µm) ( Hình 1.2B) 1.1.2.2 Sán gan lớn bệnh sán gan lớn Bệnh sán gan lớn bệnh chung người gia súc chủ yếu hai loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 Fasciola gigantica Cobbold, 1856 (thuộc họ Fasciolidae) gây nên Fasciola spp gây bệnh chủ yếu động vật ăn cỏ trâu, bị, cừu, dê… nhiên Fasciola spp thích ứng gây bệnh cho người (Kumar, 2001; Lofty et al., 2008; Nguyen et al., 2009) Sự phân bố hai loài F hepatica F gigantica khác giới, lồi F hepatica gây bệnh vùng có nhiệt độ ơn đới F gigantica có mặt rộng rãi châu lục, đặc biệt vùng có khí hậu nhiệt đới (Mas-Coma et al., 2005; 2009) Sự phân bố theo vùng tuyệt đối, hai lồi F hepatica F gigantica tồn số nước thuộc vùng Trung Đông Nam Á như: Pakistan, Iran, Nhật Bản Trung Quốc (Kumar, 2001; Ashrafi et al., 2006; Mas-Coma et al., 2009) Những nghiên cứu gần Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, Iran khẳng định sán gan lớn thuộc loài lưỡng bội, tam bội đa bội (diploid, triploid “mixoploid”), nhiều tồn dạng hình thái học trung gian (intermediate form) thuộc loại khuyết sản (Itagaki et al., 2005; Xuan et al., 2005; Le et al., 2007; 2008; Nguyen et al., 2009; Choe et al., 2011) Tại Việt Nam, trường hợp người bị nhiễm sán gan lớn ghi nhận ngày nhiều phương pháp chẩn đốn hình thái học, huyết học sinh học phân tử (Tran et al., 2001), có số trường hợp có di chuyển đặc biệt chúng người (Xuan et al., 2005; Le et al., 2007) Nghiên cứu di truyền học hệ gen ty thể hệ gen nhân cho thấy có lẫn tạp di truyền lai tự nhiên F hepatica F gigantica quần thể sán gan lớn Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc Việt Nam (Agatsuma et al., 2000; Itagaki et al., 2011; Le et al., 2008) Do vậy, việc thẩm định loài F hepatica F gigantica, đặc biệt mẫu sán có hình dạng trung gian thiết cần sử dụng phương pháp sinh học phân tử (Huang et al., 2004; Itagaki et al., 2005; Le et al., 2008; Mas-Coma et al., 2009) Toàn hệ gen ty thể F hepatica F gigantica giải mã (Le et al., 2001; 2002) nhiều chuỗi ITS-2 Ngân hàng gen cung cấp liệu quan trọng xác để thẩm định loài quần thể Fasciola spp (xem Le et al., 2008) A B C Hình 1.3 Sán gan lớn F hepatica trưởng thành (A), F gigantica trưởng thành (B) trứng sán Fasciola spp tiêu thu nhận phương pháp Kato-Katz (B) Sán gan lớn trưởng thành hình lá, thân dẹt, bờ mỏng, kích thước 20-30 x 10-12 mm, màu trắng hồng xám đỏ; người, sán ký sinh đường mật, bất thường ký sinh lạc chỗ bắp, da, phúc mạc (Le et al., 2007; 2008) (Hình 1.3A,B) Sán gan trưởng thành tồn thể: nhị bội (diploid) tam bội (triloid), đẻ trứng theo đường mật xuống ruột theo phân Trứng có dạng hình oval thường chụm lại với (Hình 1.3C) Trứng xuống nước, nở ấu trùng lông (miracidium), nhiệt độ thích hợp (15 - 25°C), vịng - 21 ngày Miracidium tiếp tục ký sinh ốc thuộc giống Lymnaea phát triển thành ấu trùng (cercaria), sau cercaria rời khỏi ốc bám vào thực vật thủy sinh để tạo nang trùng (metacercaria) bơi tự nước (khoảng giờ) Người trâu bò ăn phải thực vật thủy sinh uống nước lã có ấu trùng bị nhiễm sán gan lớn (Mas-Coma et al., 2005; 2009; Ashrafi et al., 2006) Metacercaria vào vật chủ qua đường miệng, thoát kén, xuyên thành ruột, xuất ổ bụng, tiếp tục xuyên vào gan, đến gan vào ngày thứ sau kén, sau chúng di hành đến ký sinh đường mật, trưởng thành đẻ trứng tiếp tục vòng đời Tuổi thọ sán gan lớn người từ - 13,5 năm (Kumar, 2001) Do vòng đời với nhiều giai đoạn phát triển nhiều vật chủ khác nhau, việc chẩn đoán sinh học phân tử phát phân biệt Fasciola spp thuận lợi (Mas-Coma et al., 2005; 2009) 1.1.2.3 Sán ruột nhỏ bệnh sán ruột nhỏ Sán ruột nhỏ phần lớn truyền qua cá phổ biến nhiều nước giới, bao gồm 69 loài sán ruột nhỏ biết ký sinh người, đáng ý sán ruột truyền qua cá chủ yếu thuộc họ Heterophyidae Echinostomatidae (WHO/WR, 2002) Trong họ Heterophyidae loài giống Haplorchis đặc biệt quan tâm Đối với Haplorchis spp, năm gần đây, dịch tễ học nước châu Á có số lượng người nhiễm ngày tăng, phân bố rộng giới phương thức truyền lây qua cá nước ngọt, nguồn protein chủ yếu nước phát triển Có lồi thuộc giống Haplorchis thơng báo gây bệnh người, bao gồm H taichui, H pumilio, H yokogawai, H pleurolophocerca, and H vanissimus Haplorchis pumilio Loss, 1986 phát ký sinh người Đài Loan, Trung Quốc, Philippines, Ai Cập, Thái Lan, Australia, Việt Nam (De, Le, 2011) (Hình 1.4A) Haplorchis taichui Nishigori, 1924 phát ký sinh người Philippines, Thái Lan, Lào, Đài Loan, Bangladesh, Việt Nam (Dung et al., 2007) (De, Le, 2011) (Hình 1.4B) Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932 phát ký sinh người Philippines, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan A B Hình 1.4 Sán ruột nhỏ trưởng thành trứng H pumilio (A); Sán trưởng thành trứng H taichui (B) Haplochis spp loài sán ruột nhỏ để hồn thành vịng đời chúng phải trải qua nhiều lồi vật chủ phức tạp (vật chủ chính, vật chủ trung gian) nên thường quan tâm (kể y tế, thú y thủy sản) Sán trưởng thành ký sinh ruột, đẻ trứng trứng theo phân ngồi, rơi vào mơi trường nước, trứng nở ấu trùng lông chui vào ốc để phát triển thành ấu trùng đuôi Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi phát triển thành nang trùng ký sinh thịt mang cá (mắt thường khó nhìn thấy) Người động vật ăn phải cá có ấu trùng nang chưa nấu chín, ấu trùng chui vào dày, đến ruột phát triển thành sán trưởng thành ký sinh 1.1.2.4 Sán dây ấu trùng sán lợn Dịch tễ, bệnh học, chẩn đoán điều trị sán dây ấu trùng sán lợn toàn giới nghiên cứu đầy đủ (Hoberg, 2006) Họ sán dây Taeniidae Ludwig, 1886 có nhiều loại, gồm lồi thuộc giống Taenia; giống Multiceps; giống Echinococcus Trong đó, quan trọng giống Taenia với sán dây lợn T solium ấu trùng sán dây lợn (cysticercosis), sán dây bò T saginata sán dây người T asiatica (Willingham, Engels, 2006; Eom, 2006) Taenia có người vật chủ vật chủ trung gian trâu bò (T saginata) lợn (T solium T asiatica) bệnh ký sinh trùng từ động vật truyền sang người (parasitic zoonosis) Hiện loài T solium gây bệnh ấu trùng sán lợn người, gọi bệnh ấu trùng sán lợn (cysticercosis) coi bệnh nguy hiểm sán dây gây (Willingham, Engels, 2006; Willms, 2008) Trong thời gian lâu, loài T saginata T asiatica chưa phân biệt thành hai loài riêng biệt T asiatica coi loài T saginata với tên gọi T saginata asiatica (Eom, 2006) Trong năm trở lại đây, loài sán dây T asiatica thức phân loại sán dây gây bệnh người, nhiên vòng đời số đặc tính sinh học lồi nghiên cứu (Eom, 2006) Các phương pháp SHPT áp dụng việc giải mã hệ gen ty thể nhiều hệ gen nhân tế bào thị phân tử có giá trị chẩn đoán, phân loại nghiên cứu di truyền quần thể thẩm định lồi có loài phát (Le et al., 2002; Yamasaki et al., 2006) a) Sán dây bò Taenia saginata: T saginata dài khoảng – 12 m, gồm 1000 – 2000 đốt, đầu khơng có chùy khơng có vịng móc, có giác bám, tử cung chia 12 – 32 nhánh Nang ấu trùng sán dây bị hình bầu dục, màu hồng, kích thước 0,6 – 0,8 x 0,3 – 0,5 cm chứa dịch màu đỏ đầu sán với giác bám khơng có vịng móc (Hình 1.5) Nang ấu trùng sán dây không ký sinh người (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010) b) Sán dây lợn Taenia solium: Sán dây lợn T solium dài khoảng – m, có khoảng 900 đốt gồm phần (phần đầu, phần cổ nơi sinh đốt non, phần thân chứa 336 Opisthorchis viverrini strain OvBD1 NADH dehydrogenase subunit (nad4) gene, partial cds; tRNA-Gln (trnQ), tRNA-Phe (trnF), and tRNA-Met (trnM) genes, complete sequence; ATPase (atp6) and NADH dehydrogenase subunit (nad2) genes, complete cds; tRNA-Val (trnV), tRNA-Ala (trnA), and tRNA-Asp (trnD) genes, complete sequence; NADH dehydrogenase subunit (nad1) gene, complete cds; tRNA-Asn (trnN), tRNAPro (trnP), tRNA-Ile (trnI), and tRNA-Lys (trnK) genes, complete sequence; NADH dehydrogenase subunit (nad3) gene, complete cds; and tRNA-Ser (trnS1) gene, complete sequence; mitochondrial 4,253 bp linear DNA EU443831.1 GI:170716262 337 Opisthorchis viverrini strain QN NADH dehydrogenase subunit (nad4) gene, partial cds; tRNA-Gln (trnQ), tRNA-Phe (trnF), and tRNA-Met (trnM) genes, complete sequence; ATPase (atp6) and NADH dehydrogenase subunit (nad2) genes, complete cds; tRNA-Val (trnV), tRNA-Ala (trnA), and tRNA-Asp (trnD) genes, complete sequence; NADH dehydrogenase subunit (nad1) gene, complete cds; tRNA-Asn (trnN), tRNA-Pro (trnP), tRNA-Ile (trnI), and tRNA-Lys (trnK) genes, complete sequence; NADH dehydrogenase subunit (nad3) gene, complete cds; and tRNA-Ser (trnS1) gene, complete sequence; mitochondrial 4,252 bp linear DNA EU443832.1 GI:170716268 341 Opisthorchis viverrini NADH dehydrogenase subunit gene, partial cds; tRNA-Asn, tRNA-Pro, tRNA-Ile, and tRNA-Lys genes, complete sequence; and NADH dehydrogenase subunit gene, complete cds; mitochondrial 1,357 bp linear DNA DQ119551.1 GI:73476922 =================== 122 Fasciola gigantica isolate FgGxB10 internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260079.1 GI:163311191 123 Fasciola gigantica isolate FspX internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260077.1 GI:163311189 124 Fasciola gigantica isolate FspT4 internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260075.1 GI:163311187 125 Fasciola gigantica isolate FspN internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260073.1 GI:163311185 126 Fasciola gigantica isolate FspNA internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260071.1 GI:163311183 127 Fasciola gigantica isolate FspH2 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260069.1 GI:163311181 128 Fasciola gigantica isolate FspFG2 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260067.1 GI:163311179 129 Fasciola gigantica isolate FspCB2 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260065.1 GI:163311177 130 Fasciola gigantica isolate FspBD internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260063.1 GI:163311175 131 Fasciola gigantica isolate FspB3 internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA 87 EU260061.1 GI:163311173 132 Fasciola gigantica isolate Fsp1 internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260059.1 GI:163311171 133 Fasciola gigantica isolate FgBDB internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260057.1 GI:163311169 135 Fasciola gigantica isolate FspQB internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260078.1 GI:163311190 136 Fasciola gigantica isolate FspTH internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260076.1 GI:163311188 137 Fasciola gigantica isolate FspPY internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260074.1 GI:163311186 138 Fasciola gigantica isolate FspNB internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260072.1 GI:163311184 139 Fasciola gigantica isolate FspM internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260070.1 GI:163311182 140 Fasciola gigantica isolate FspH1 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260068.1 GI:163311180 141 Fasciola gigantica isolate FspFG1 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260066.1 GI:163311178 142 Fasciola gigantica isolate FspCB1 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260064.1 GI:163311176 143 Fasciola gigantica isolate FspBD1 internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260062.1 GI:163311174 144 Fasciola gigantica isolate Fsp2 internal transcribed spacer 2, complete sequence 361 bp linear DNA EU260060.1 GI:163311172 145 Fasciola hepatica isolate FhAU internal transcribed spacer 2, complete sequence 362 bp linear DNA EU260058.1 GI:163311170 ====================== 104 Haplorchis taichui isolate HtaCcl3 internal transcribed spacer 2, partial sequence 358 bp linear DNA GQ176379.1 GI:240266059 105 Haplorchis taichui isolate HtaCcl1 internal transcribed spacer 2, partial sequence 358 bp linear DNA GQ176377.1 GI:240266057 106 Haplorchis taichui isolate HtaTL internal transcribed spacer 2, partial sequence 88 445 bp linear DNA GQ176375.1 GI:240266055 107 Haplorchis pumilio isolate HpuM4 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176373.1 GI:240266053 108 Haplorchis pumilio isolate HpuMTL internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176371.1 GI:240266051 109 Haplorchis pumilio isolate HpuD1a internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176369.1 GI:240266049 110 Haplorchis pumilio isolate HpuCeS1 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176367.1 GI:240266047 111 Haplorchis pumilio isolate HpuC2cl3 internal transcribed spacer 2, partial sequence 289 bp linear DNA GQ176365.1 GI:240266045 112 Haplorchis pumilio isolate HpuC2cl1 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176363.1 GI:240266043 113 Haplorchis taichui isolate HtaMND2 internal transcribed spacer 2, partial sequence 446 bp linear DNA GQ176380.1 GI:240266060 114 Haplorchis taichui isolate HtaCcl2 internal transcribed spacer 2, partial sequence 441 bp linear DNA GQ176378.1 GI:240266058 16 Haplorchis pumilio isolate HpuMND internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176374.1 GI:240266054 117 Haplorchis pumilio isolate HpuM1 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176372.1 GI:240266052 118 Haplorchis pumilio isolate HpuD2 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176370.1 GI:240266050 119 Haplorchis pumilio isolate HpuCeS3 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176368.1 GI:240266048 120 Haplorchis pumilio isolate HpuCeB1 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176366.1 GI:240266046 121 Haplorchis pumilio isolate HpuC2cl2 internal transcribed spacer 2, partial sequence 290 bp linear DNA GQ176364.1 GI:240266044 ============ Taenia solium cytochrome b gene, complete cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 1,068 bp linear DNA AY280805.1 GI:30841822 89 280 Taenia saginata cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 652 bp linear DNA AY280803.1 GI:30841818 285 Taenia solium cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 726 bp linear DNA AY280806.1 GI:30841824 286 Taenia saginata cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 652 bp linear DNA AY280804.1 GI:30841820 287 Taenia saginata cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 652 bp linear DNA AY280802.1 GI:30841816 293 Taenia asiatica cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 652 bp linear DNA AF429313.1 GI:16519046 297 Taenia asiatica cytochrome c oxidase subunit (cox1) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 800 bp linear DNA AF429314.1 GI:16519048 =================== 288 Paragonimus ohirai NADH dehydrogenase subunit (nad2) gene, complete cds; mitochondrial gene for mitochondrial product 867 bp linear DNA AY264852.1 GI:30349386 342 Paragonimus heterotremus strain DB cytochrome oxidase subunit I (cox1) gene, partial cds; mitochondrial 441 bp linear DNA DQ234301.1 GI:78128516 ============================================================= 90 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kit để chẩn đốn lồi ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam Thuộc: Đề tài cấp Bộ Y tế - Chương trình (tên, mã số chương trình): Chủ nhiệm đề tài: Họ tên: LÊ THANH HÒA Ngày, tháng, năm sinh: 02/02/1954 - Nam Học hàm, học vị: Phó giáo sư Y học, Tiến sĩ Y – sinh học phân tử Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp Chức vụ: Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học Điện thoại: Cơ quan: 04-37567297 Nhà riêng: 04-38525566 Mobile: 0912336855 Fax: 04-38363144 - E-mail: imibtvn@gmail.com Tên tổ chức công tác:Viện Công nghệ sinh học Địa tổ chức: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Địa nhà riêng: B4-P207- Tập thể Trung Tự - Đống Đa – Hà Nội Tổ chức chủ trì đề tài: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Điện thoại: 04-37567297 - Fax: 04-38363144 E-mail: tnhai@ibt.ac.vn Website: www.ibt.ac.vn Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Trương Nam Hải Số tài khoản: 931.01.064 Tại Kho bạc nhà nước Ba Đình Hà Nội Tên quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học công nghệ Việt Nam II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực đề tài: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 01/01/2010 đến 31/12/2011 - Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 12 năm 2011 - Ngày nghiệm thu cấp sở: 18/01/2012 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 495 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 495 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tr.đ) 2010 200 2011 295 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tr.đ) 2010 200 2011 295 Ghi (Số đề nghị toán) 214 tr.đ 281 tr.đ c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng SNKH 184.0 Thực tế đạt Tổng SNKH 184.0 Nguồn khác 184.0 184.0 Nguồn khác 165.0 165.0 165.0 165.0 146 495 146 495 146 495 146 495 Các văn hành q trình thực đề tài: Số Số, thời gian ban TT hành văn 4839/QĐ-BYT ký ngày 08/12/2009 01/2010/HĐ-ĐTCB ký ngày 29/01/2010 Quyết tốn kinh phí giai đoạn I năm 2010, ký ngày 24/12/2010 Tên văn Ghi Về việc phê duyệt đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ lĩnh vực Y học sở, đào tào bắt đầu thực năm 2009 Hợp đồng nghiên cứu khoa học cơng nghệ cấp Bộ Quyết tốn kinh phí giai đoạn I năm 2010 01/BBNT ký ngày 12/05/2011 Giấy xác nhận chi tiêu tài đề tài NCKH, ký ngày 29/012/2011 Bảng kê chứng từ toán, ký ngày 30/12/2011 17/QĐ-CNSH ký ngày 12/01/2012 1425/QĐ-BYT ký ngày 02/5/2012 27680/QĐ-SHTT ký ngày 31/5/2012 4600/QĐ-BYT ký ngày 22/11/2012 10 Biên nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ giai đoạn I (năm 2010) Giấy xác nhận chi tiêu tài đề tài NCKH Bảng kê chứng từ toán Về việc thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp sở đề tài thuộc chương trình cấp Bộ Y Tế Về việc thành lập Hội đồng Khoa học công nghệ nghiệm thu đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Về việc chấp nhận đơn hợp lệ đăng ký giải pháp hữu ích Về việc công nhận kết thực đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Tổ chức phối hợp thực đề tài: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Viện Công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học Trường Đại học Y Hà Nội Trường Đại học Y Hà Nội Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt - Tổ chức thực đề tài - Xây dựng kit, chọn đoạn gen đặc hiệu, thiết kế mồi PCR, kiểm tra, kiểm nghiệm - Xử lý số liệu tin-sinh học - Hồn thiện qui trình - Thu thập mẫu, xử lý mẫu, nuôi cấy mẫu (nếu cần) - Phối hợp xác định lồi hình thái học, thẩm định SHPT - Ứng dụng thực tế diện hẹp (nếu có) - Xây dựng kit, chọn đoạn gen đặc hiệu, thiết kế mồi PCR, kiểm tra, kiểm nghiệm - Xử lý số liệu tin-sinh học - Hồn thiện qui trình - Thu thập mẫu, xử lý mẫu, nuôi cấy mẫu - Phối hợp xác định lồi hình thái học, thẩm định SHPT Ghi chú* Cá nhân tham gia thực đề tài: Tên cá nhân Tên cá nhân Nội dung tham Số đăng ký theo tham gia gia TT Thuyết minh thực PGS.TS Lê PGS.TS Lê Chủ nhiệm đề tài Thanh Hòa Thanh Hoà Soạn thảo đề cương, bảo vệ hội đồng hồn thiện Xây dựng kit để chẩn đốn loài ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam PGS.TS Nguyễn Văn Đề ThS(NCS) Nguyễn Thị Bích Nga Sản phẩm chủ yếu đạt Xây dựng kit để chẩn đốn lồi ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam Thiết kế mồi: Có cặp mồi đặc hiệu Xử lý số liệu xác Có kết thẩm định rõ ràng Chỉ đạo tốt thực đề tài Thu thập mẫu, xử Đã thu thập mẫu PGS.TS sán gan lớn, sán Nguyễn Văn lý mẫu: sán gan lớn, sán lá gan nhỏ ký sinh Đề gan nhỏ Thẩm người Việt định loài Nam Thẩm định phương pháp loài phương hình thái học pháp hình thái học Tách chiết DNA Có kết PCR ThS(NCS) thẩm định phân biệt Nguyễn Thị tổng số (hệ gen loài phương nhân gen ty Bích Nga pháp SHPT Có chu thể) lồi trình nhiệt tối ưu sán gan lớn, đánh giá kết sán gan nhỏ Xây dựng quy phản ứng PCR trình PCR đa mồi với mồi chung phân biệt sán gan mồi đặc hiệu lớn, sán gan nhỏ (kí Ghi chú* Chỉ đạo thực đề tài tiến độ báo cáo kết nghiệm thu Bàn giao đủ mẫu tham gia hoạt động đề tài Thực tốt công việc giao hiệu kit A, B, AB) ThS Vũ Thị Tiến TS Lê Thị Kim Xuyến BSTY Nguyễn Thị Khuê BSTY Nguyễn Thị Khuê Xử lý mẫu KST hình thái học thẩm định loài SHPT với loài sán ruột nhỏ: tách chiết DNA thực multiplex-PCR; Dịng hố giải trình tự; Tách chiết DNA tổng số (hệ gen nhân gen ty thể) loài sán phổi Thực Có mẫu chuẩn DNA tinh khiết, quy trình Xây dựng qui trình PCR đa mồi lồi sán ruột nhỏ (Kí hiệu kit: C, AC) Thực tốt cơng việc giao Có cặp mồi đặc hiệu Có kết PCR thẩm định Có chu trình nhiệt tối ưu đánh giá Thực tốt cơng việc ThS(NCS) Đồn Thị Thanh Hương TS Nguyễn Thị Giang Thanh ThS Hồng Thị Minh Châu TS Ngơ Thị Hương CN Đỗ Thị Roan TS Đoàn Thị Thanh Hương phản ứng PCR với mồi chung mồi đặc hiệu Giả nghiệm kiểm nghiệm kit phân biệt hai loài sán phổi kết Xây dựng giao quy trình PCR đa mồi phân biệt sán phổi (kí hiệu kit E) Tách chiết DNA thực multiplex-PCR với loài sán dây ấu trùng sán lợn; Dịng hố giải trình tự; - So sánh mẫu chuẩn quốc tế Thực xây dựng phương pháp multipexPCR: + Thiết kế mồi kiểm nghiệm mồi + Phân nhóm đối tượng (nhóm kit: gen; gen) thử nghiệm với cặp mồi thiết kế + Giả nghiệm kiểm nghiệm kit + Kiểm tra sản phẩm giải trình tự Có mẫu chuẩn DNA tinh khiết Có chu trình nhiệt tối ưu đánh giá kết Xây dựng qui trình PCR đa mồi phân biệt sán dây âu trùng sán lợn (Kí hiệu kit: D) Thực tốt cơng việc giao Có chu trình nhiệt tối ưu đánh giá kết Giả nghiệm kiểm nghiệm kit loài CFF(Cs+Fh+Fg), phân biệt loài C sinensis; F hepatica F gigantica; OFF(Ov+Fh+Fg), phân biệt loài O viverrini; F hepatica F gigantica; CHH(Cs+Ht+Hp), phân biệt loài C sinensis; H taichui H pumilio; OHH(Ov+Ht+Hp), phân biệt loài O viverrini; H taichui H pumilio Thực tốt công việc giao Dịng hố giải trình tự Kiểm tra độ nhạy độ đặc hiệu kit thiết kế Dịng hố giải trình tự Kiểm tra độ nhạy độ đặc hiệu kit thiết kế Thực tốt công việc giao - Lý thay đổi: Mục 4: TS Lê Thị Kim Xuyến thay ThS Vũ Thị Tiến nghỉ sản phụ; Mục 7: ThS Hoàng Thị Minh Châu thay ThS(NCS) Nguyễn Thị Giang Thanh làm nghiên cứu sinh nước ngoài; Mục 8: CN Đỗ Thị Roan thay TS Ngô Thị Hương công tác miền Nam (Viện SR-KST-CT Quy Nhơn) Tình hình hợp tác quốc tế: Thực tế đạt Theo kế hoạch Số TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* Dự kiến hợp tác Trường Đại học Đã tham gia Hội thảo quốc tế Seoul (Hàn Quốc): Trao đổi mẫu, Osong (Hàn Quốc), chuyên đề: kit thử nghiệm kit “Định hướng nghiên cứu sán dây Châu Á” (24-26/10/2011) Dự kiến hợp tác Trường Đại học Thời gian ngắn không thực hiện; Mahidol/Khon Kaen (Thái Lan): kinh phí đồn khơng Trao đổi mẫu, kit thử nghiệm kit duyệt; có mẫu thu Việt Nam thực Việt Nam - Lý thay đổi (nếu có): Mục 2: Khơng có kinh phí đồn để thực khơng duyệt; có mẫu thu Việt Nam thực Việt Nam đáp ứng yêu cầu hợp đồng Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Trao đổi thu nhận mẫu từ đối tác quốc tế (đã xác định chuẩn) Chọn gen đặc hiệu loài thiết kế mồi (kit multiplex-PCR) Thu thập mẫu ký sinh trùng thường gặp người Việt Nam bao gồm sán gan lớn, sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ, sán phổi, sán dây ấu trùng sán lợn Hoạt động phịng thí nghiệm: - Xử lý mẫu KST hình thái học thẩm định loài Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Thực tế đạt Có mẫu chuẩn Có mẫu chuẩn Quốc tế Có Quốc tế Có cặp mồi đặc cặp mồi đặc hiệu Có hiệu Có kết kết PCR PCR thẩm định loài thẩm định loài bằng phương pháp SHPT Có phương pháp chu trình nhiệt SHPT Có chu trình nhiệt tối tối ưu đánh ưu đánh giá giá kết kết Có mẫu Có mẫu quy cách quy cách - Có mẫu chuẩn DNA tinh khiết Đúng quy trình Có mẫu chuẩn DNA tinh khiết, quy trình Xây Người, quan thực PGS.TS Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Nguyễn Văn Đề - Đại học Y Hà Nội - ThS(NCS) Nguyễn Thị Bích Nga, TS Lê Thị Kim SHPT: tách chiết DNA thực phản ứng PCR - Dịng hố giải trình tự; - Xây dựng qui trình chẩn đốn lồi ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam - Báo cáo khoa học Đánh giá độ nhạy độ đặc Yêu cầu cần hiệu kit kiểm tra báo cáo khoa học Làm phản ứng PCR với mồi chung mồi đặc hiệu Dịng hố, giải trình tự nucleotide phân tích chuỗi gen So sánh với chuỗi mẫu Ngân hàng gen giới để xác định thành phần loài Chọn gen đặc hiệu lồi thiết kế mồi (kit multiplex-PCR) Có cặp mồi đặc hiệu Có kết PCR đặc hiệu Quy trình chẩn đốn multiplex-PCR dựng qui trình chẩn đốn lồi ký sinh trùng chủ yếu Việt Nam - Báo cáo khoa học Đã thực kiểm tra kit sở mẫu chuẩn avf mẫu thu trường Xuyến,– Viện Công nghệ sinh học - PGS.TS Nguyễn Văn Đề - Đại học Y Hà Nội - BSTY Nguyễn Thị Khuê, TS Đoàn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học - ThS Hồng Quy trình multiplex-PCR Thị Minh chẩn đốn Châu, CN Đỗ Thị Roan – lồi ký sinh Viện Cơng trùng Có nghệ sinh học cặp mồi đặc hiệu Có kết PCR đặc hiệu III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN SXTN Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Sản phẩm: Bộ Kit MultiplexPCR loại Đăng ký chuỗi gen Đơn vị đo Chuỗi Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt kit, 100 phản ứng/bộ; có dẫn bảo quản, sử dụng đánh giá kết – 10 chuỗi gen kit, 100 phản ứng/bộ; có dẫn bảo quản, sử dụng đánh giá kết – 10 chuỗi gen 14 kit, 100 phản ứng/bộ; có dẫn bảo quản, sử dụng đánh giá kết 61 chuỗi gen - Lý thay đổi: Do có điều kiện, bên cạnh kit theo kế hoạch, thực thêm kit phát 2-3 lồi, có giá trị ứng dụng thực tế kit phát loài Bộ kit sán b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi c) Sản phẩm Dạng III: Số TT I II III Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt 02 02 Bài báo khoa học nước Bài báo “Xây dựng kit PCR đa mồi phát hai loài (multiplex-PCR) sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini Việt Nam“ Bài báo “Thiết kế thử nghiệm kit Triplex-PCR phân biệt ba loài sán dây (Taenia asiatica; T saginata T solium) gây nhiễm người Việt Nam“ Bài báo khoa học quốc tế 01 Development and evaluation of a single step multiplex PCR for simultaneous detection of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica (Fasciolidae; Trematoda; Platyhelminthes) Chương sách: Multiplex-PCR chương sách Chương 12: “Multiplex-PCR, nguyên lí ứng dụng“ (pp 238-263); Sách chuyên khảo: “Sán dây/ấu trùng sán lợn sinh học phân tử ứng dụng” Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà biên soạn Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Tạp chí Y học thực hành, 783(9): 30-32 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 10(1): 1-6 01 Journal of Clinical Microbiology, 50(8): 2720-2726 chương sách Nhà xuất Y học, Hà Nội 2010 (326 trang) d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sĩ Tiến sĩ BS Nội trú BS CKI; CKII Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 01 01 Ghi (Thời gian kết thúc) 2010 đ) Tình hình đăng ký bảo giải pháp hữu ích: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Quy trình PCR đa mồi để nhận biết có mặt lồi sán gan F gigantica F hepatica Kết Theo Thực tế kế hoạch đạt 01 Ghi (Thời gian kết thúc) Được Cục Sở hữu trí tuệ chấp nhận đơn hợp lệ, định số 27680/QĐSHTT, ngày 31 tháng năm 2012 01 e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Địa điểm Thời gian (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu đề tài mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Giải pháp multiplex PCR ln phát triển để lúc chẩn đốn phát nhiều lồi quan tâm từ khn DNA hỗn hợp Lợi multiplex PCR tiết kiệm khn, phát đa lồi, tiết kiệm thời gian công sức, đặc biệt đối tượng KST mà đề tài lựa chọn Đến lúc này, đề tài có điểm giải pháp KH CN: i) Lần multiplex PCR dựa thị hệ gen ty thể xây dựng cho sán dẹt thuộc loài Haplorchis spp; sán phổi Paragonimus spp; Fasciola spp nhiều loài khác; ii) Một số loài có châu Á, trước chưa có phương pháp chẩn đốn đa mồi, đa lồi; iii) Một số lồi tồn giao tranh có Việt Nam (sán gan nhỏ Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini), kit chẩn đoán phân biệt cần thiết Từ kết đề tài, có hiệu trên, biên tập để công bố số báo tạp chí quốc tế SCI/SCIE b) Hiệu kinh tế xã hội: - Multiplex-PCR chẩn đốn phân biệt số lồi sán lá, sán dây gây bệnh từ động vật sang người, nghiên cứu thành công, áp dụng đối tượng kí sinh trùng phân bố đường ruột thường gặp chủ yếu truyền lây qua thực phẩm - Các kit qua thử nghiệm phịng thí nghiệm kiểm nghiệm số mẫu thu thập trường, cho độ nhạy đặc hiệu cao, dễ sử dụng - Các kit thao tác dễ dàng, tiết kiệm khn DNA kiểm tra chung nhiều loại kí sinh trùng thu từ nguồn đường ruột, đường hơ hấp (kể có trứng loại đó) - Đề tài có khả đưa vào ứng dụng thực tế (với số kit); công bố có khả cơng bố quốc tế cơng trình thực Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra đề tài: Số TT I II Nội dung Báo cáo định kỳ Lần Kiểm tra định kỳ Lần Thời gian thực Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) 01/201012/2010 Xây dựng thử nghiệm kit: - Bộ kit số 1, ký hiệu kit A: phân biệt loài Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini - Bộ kit số 3, ký hiệu kit C: phân biệt loài Haplorchis taichui Haplorchis pumilio - Bộ kit 7, ký hiệu kit AC: phân biệt loài: Clonorchis sinensis Haplorchis spp 12/05/2011 Xây dựng thử nghiệm kit - Bộ kit số 1, ký hiệu kit A: phân biệt loài Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini - Bộ kit số 3, ký hiệu kit C: phân biệt loài Haplorchis taichui Haplorchis pumilio - Bộ kit 7, ký hiệu kit AC: phân biệt loài: Clonorchis sinensis Haplorchis spp Bên cạnh xây dựng kit trên, đề tài 10 III Nghiệm thu sở 18/01/2012 Chủ nhiệm đề tài, Dự án SXTN (Họ tên, chữ ký) xây dựng thử nghiệm thêm phản ứng triplex-PCR (hoàn thành vượt tiêu đăng ký đề tài): kit số 5B, ký hiệu CHH(Cs+Ht+Hp), phân biệt loài C sinensis; H taichui H Pumilio; kit số 5C, ký hiệu OHH(Ov+Ht+Hp), phân biệt loài O viverrini; H taichui H pumilio - Phương pháp nghiên cứu sử dụng đề tài phương pháp chuẩn, thường qui, phù hợp với nội dung nghiên cứu - Đề tài hoàn thành tiêu đề - Các sản phẩm đề tài đạt yêu cầu - Báo cáo viết tôt, có lỗi in ấn - Các báo đăng tạp chí có chất lượng - Đào tạo thạc sĩ Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) PGS.TS Lê Thanh Hòa 11