bộ khoa học công nghệ Bộ y tế chơng trình khoa học công nghệ phục vụ chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng báo cáo tóm tắt dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm m số KC.10-DA12 5972 10/8/2006 Hà nội 2004 dự án sản xt thư nghiƯm cÊp nhµ n−íc kc.10 – da12 hoµn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm Chủ nhiệm dự ¸n : GS.TSKH Ngun Thu V©n C¸c c¸n bé tham gia TS.Nguyễn Tuyết Nga CNSH.Vũ Hồng Nga CN.Lê Hoàng Long TS.Đỗ Tuấn Đạt TS.Đỗ Thủy Ngân TS.Nguyễn Quế Anh PGS.TS.Đoàn Huy Hậu PGS.TS.Hồ Bá Do BS.Đinh Hồng Dơng Các quan tham gia Công ty vắc xin sinh phẩm số - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắc xin chế phẩm sinh học Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin Sabin Bộ môn Dịch tễ - Học viện Quân y chữ viết tắt ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axÝt ribonucleic) ALT Alanin transferaza AST Asparagin Transferaza CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật dự phòng- Mỹ) cADN Complementary ADN (ADN bổ sung) ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ED50 Effective dose 50 (Liều gây miễn dịch 50%) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) ELU ELISA Unit (Đơn vị ELISA) GMT Geometric mean titer (hiệu giá trung bình nhân) HAV Hepatitis A Virus (Virút viêm gan A) HLA kháng nguyên bạch cầu ngời HT Huyết IFNβ interferon-β IFNγ interferon-γ IFNα interferon-α kD kilodalton (kil«dalton) LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle mIU mili International unit (mili đơn vị quốc tế) àg mcg M Mol MSV Master seed virus (Chñng gèc gièng) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử ) nm nanomet NCR Non coding region (Vïng kh«ng m· hãa) ORF Open reading frame (khung ®äc më) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza) PFU Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMMK Primary Monkey Kidney Cell (Tế bào thận khỉ tiên phát) rpm round per minute (Vòng/phút) SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di gel polyacrylamid) TCYTTG Tỉ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào) VABIOTECH Công ty vắcxin sinh phẩm số VSDTTƯ Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương VX Vắcxin WSV Working seed virus ( Chủng sản xuất) mục lục Đặt vấn đề CHƯƠNG : Vật liệu phơng pháp 1.1 Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt 1.2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 2.1 An toàn chung 2.2 KiĨm tra v« khn 1.2.3 KiĨm tra chÊt g©y sèt 1.2.4 KiĨm tra chÊt hÊp phơ Al(OH)3 1.2.5 KiĨm tra hµm l−ỵng Formaldehyt 1.2.6 Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 1.2.7 KiĨm tra c«ng hiƯu 1.3 Ph−¬ng pháp đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch vắcxin viêm gan A bất hoạt thực địa lâm sàng 1.3.1 Đối tợng nghiên cứu 1.3.2 Vật liệu nghiên cứu 1.3.3 Phơng pháp nghiên cứu CHƯƠNG 2: Kết bàn luận 2.1 Hoàn thiện qui trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt 2.1.1 Hiệu giá vi rút viêm gan A trình nuôi cấy8 2.1.2 Hiệu giá vi rút viêm gan A trình tinh khiết virút 2.1.3 Hàm lợng Protein toàn phần …………… 2.1.4 Thư nghiƯm bất hoạt9 2.1.5 Pha chế vắc xin đóng ống 2.2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 10 2.1 Xây dựng tiêu chuẩn thành phần hoá học 10 2.2.2 Xây dùng vỊ c¸c chØ sè sinh häc………………………………… 11 2.3 KÕt đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch vắcxin viêm gan A bất hoạt thực địa lâm sàng 13 2.3.1 Kết đánh giá tính an toàn vắc xin viêm gan A đối tợng 13 2.3.2 Kết đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX nhóm đối tợng có anti-HAV (-) 14 2.3.3 Kết đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX nhóm đối tợng có anti-HAV (+) 18 Kết luận 20 Kiến nghị 22 Tài liệu tham khảo 23 đặt vấn đề Virút viêm gan A (HAV) phổ biến tất nớc khu vực Tây Thái Bình Dơng Đông Nam Điều kiện vệ sinh đà làm lây lan HAV vùng dịch lu hành cao Mức độ lu hành HAV cộng đồng cao Các nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học Bangladesh, Bhutan, India, Maldive Nepal chøng minh r»ng 85-95% trỴ em ë 10 ti ®· cã miƠn dÞch víi HAV ChØ cã mét sè trẻ bị nhiễm phát triển thành trờng hợp nhiễm trùng có triệu chứng Nghiên cứu nguyên trờng hợp viêm gan rải rác nớc chứng minh nhiễm HAV chịu trách nhiệm tới khoảng 10-25% tất trờng hợp viêm gan trẻ em, nhiƠm ë ng−êi lín th−êng chØ lµ 1-5% Dịch viêm gan A thờng xẩy thành phố có liên quan đến việc sử dụng nguồn nớc uống thực phẩm không an toàn Kết nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học Indonesia Thái Lan cho thấy huyết dơng tính trẻ em giảm xuống năm 19941995 (30-35%) so với kết nghiên cứu đà tiến hành vào năm 1977-1978 (85-90%) trẻ em tuổi từ 7-12 tuổi Đây kết cải thiện tiêu chuẩn vệ sinh, làm môi trờng, thiết bị nớc uống giảm mạnh lu hành HAV Việt nam nhiều nghiên cứu HAV đà đợc tiến hành cho thấy HAV nguyên nhân chủ yếu trờng hợp viêm gan cấp tính (29%), 59% số có độ tuổi > 20 tuổi Những nghiên cứu khác cho thấy 90% dân nông thôn có anti-HAV (IgG) thuộc tuổi niên Tình hình dịch tễ học HAV thay đổi nhiều nớc Với việc tăng cờng tiªu chn vƯ sinh ë nhiỊu n−íc tû lƯ nhiƠm HAV trẻ nhỏ đà giảm nhiều, trí nớc vùng có dịch lu hành cao, song ổ dịch thấp xuất Do nhiều nớc chuẩn bị phải đón nhận trờng hợp viêm gan A lâm sàng ngày tăng trẻ lớn ngời lớn Mặc dù đà có vắcxin tốt, song giá thành đắt khả tiêm đại trà đợc Các sinh phẩm chẩn đoán viêm gan A đắt hạn chế việc sử dụng để thử nghiệm trớc tiêm phòng Đề tài KHCN 11-10 đà nghiệm thu xuất sắc, nghiên cứu xây dựng đợc công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ PMMK, đảm bảo yêu cầu tối thiểu TCYTTG loại vắcxin Hiện nay, tiêu chuẩn Việt nam đề cho loại vắcxin cha đợc dự thảo Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát PMMK có nguồn cung cấp dồi nớc nhằm giảm giá thành vắcxin yêu cầu cấp thiết đợc đặt Mặt khác liều tiêm lịch tiêm khác vắcxin viêm gan A đợc sử dụng nh cần thiết liều tiêm nhắc lại vấn đề cần nghiên cứu Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết đó, dự án Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt quy mô 100.000 liều/năm có mục tiêu nh sau: Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm đạt tiêu chuẩn quốc tế Xây dựng tiêu chuẩn Việt nam cho vắcxin viêm gan A bất hoạt Đánh giá hiệu lực vắcxin thực địa lâm sàng, xác định lịch tiêm liều tiêm phù hợp Với mục tiêu đó, Dự án có nội dung nh sau : 1.Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta : bổ sung trang thiết bị cần thiết để mở rộng sản xuất; nghiên cứu xây dựng đợc thông sè hãa, lý, sinh häc tèi −u; c¶i tiÕn mét số công đoạn quy trình sản xuất để nâng cao công suất Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia thích hợp cho vắcxin viêm gan A bất hoạt thành phần hoá học (protein, formaldehyt, hydroxyt nhôm, pH), an toàn, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố Nghiên cứu tính ổn định chất lợng thành phần loạt vắcxin viêm gan A Việt nam sản xuất so sánh với tiêu chuẩn TTYTTG Đánh giá hiệu lực vắcxin viêm gan A thực địa lâm sàng giai đoạn III, theo dõi tính an toàn, phản ứng phụ, đáp ứng miễn dịch nhóm ngời tình nguyện, đánh giá hiệu lực vắcxin viêm gan A với cỡ mẫu n = 300 Xác định liều tiêm lịch tiêm phù hợp cho đối tợng khác Bảng 8: Kết theo dõi biểu toàn thân chỗ sau tiêm vắcxin nhóm đối tợng Tại chỗ tiêm Toàn thân Đau Dị ứng Đối tợng Biểu khác (*) Sè l−ỵng Tû lƯ (%) Sè l−ỵng Tû lƯ (%) Ng−êi lín 56 18,42 0,33 Kh«ng 40 13,07 0 Kh«ng 96 15,73 0,16 Kh«ng (n = 304) TrỴ em (n = 306) Céng (n = 610) (*): biểu khác: sng, nóng, đỏ, áp xe (tại chỗ tiêm); sốt, nhức đầu, chóng mặt, nôn/buồn nôn, khó thở, đau cơ, khớp (xem mẫu theo dõi phụ lục) 2.3.2 Kết đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX nhóm đối tợng có anti-HAV (-) 2.3.2.1 Nhóm trẻ em Bảng 9: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch(%) sau tiêm VX theo lịch 0-1-6 Liều 50àg LiỊu 75µg HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 LiỊu 25µg HT4 HT2 HT3 HT4 9/26 22/25 25/25 4/30 19/30 28/28 1/24 6/23 20/22 (34,6%) (88%) (100%) (13,3%) (63,3%) (100%) (4,2%) (26,1%) (90,9%) Bảng 10: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch(%) sau tiêm VX theo lịch 0-1-2 Liều 75àg Liều 50àg Liều 25µg HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 17/51 45/51 51/51 10/47 29/47 39/46 3/52 19/52 44/48 (33,3%) (88,2%) (100%) (21,3%) (61,7%) (84,8%) (5,8%) (36,5%) (91,7%) 14 Sù tăng tỷ lệ đối tợng đạt mức hiệu giá kháng thể bảo vệ nhóm tiêm liều 75àg lịch tiêm khác ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tơng tự nh vậy, tỷ lệ đối tợng đạt mức hiệu giá kháng thể bảo vệ tăng dần có ý nghĩa thống kê sau mũi tiêm VX nhóm tiêm liều thấp (50àg 25àg) lịch (p0,05) Nh− vËy, sau tiªm mịi VX, có liều 75àg 100% đối tợng đạt mức hiệu giá kháng thể bảo vệ 50 àg theo lịch 0-1-6 Kết rằng, tiêm theo lịch 0-1-6 0-1-2 tháng (tức tiêm mũi VX) dùng liều 75àg cho cộng đồng Bảng 11: Biến động GMT (mIU/ml) anti-HAV liều tiêm khác lịch 0-1-6 tháng Huyết LiỊu 75µg LiỊu 50µg LiỊu 25 µg p GMT n GMT n GMT n HT2 152,3 116,1 30,3