Xây dựng quy trình nhân giống thu sinh khối in vitro và bước đầu kiểm tra hàm lượng một số hoạt chất sinh học của cây sâm cau curculigo orchioides gaertn

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG, THU SINH KHỐI IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KIỂM TRA HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CÂY SÂM CAU (CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN.) Mã số: TV03/15 – 16 Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Thực vật Chủ nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thị Thanh Thảo Cán tham gia: ThS Đinh Thị Sáu CN Nguyễn Văn Long Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .iii DANH SÁCH B ẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v TÓM TẮT vi I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II ĐẶT VẤN ĐỀ III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Giới thiệu Sâm cau 3.1.1 Phân loại 3.1.2 Đặc điểm hình thái 3.1.3 Phân bố đa dạng sinh học 3.2 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp Sâm cau 3.2.1 Sơ lược hợp chất thứ cấp thực vật 3.2.2 Thành phần hóa học Sâm cau .6 3.2.3 Hoạt tính sinh học giá trị dược liệu Sâm cau 3.3 Sự phát sinh hình thái thực vật 11 3.3.1 Sự phát sinh quan q trình ni cấy 12 3.3.2 Sự phát sinh phôi sinh dưỡng 13 3.4 Giới thiệu hệ thống ngập chìm tạm thời TIS 15 3.4.1 Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 3.4.2 Đặc điểm cấu tạo hệ thống ngập chìm tạm thời - TIS 16 3.5 Một số nghiên cứu Sâm cau 18 IV NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 V VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 5.1 Vật liệu 21 5.2 Phương pháp nghiên c ứu 21 5.2.1 Khử trùng thân rễ tạo nguồn mẫu nuôi cấy in vitro 21 5.2.2 Tăng trưởng chồi ngủ từ thân rễ 21 5.2.3 Tạo cụm chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng 22 i 5.2.4 Cảm ứng tạo rễ tạo hoàn chỉnh 22 5.2.5 Cảm ứng tạo phôi từ mô in vitro 22 5.2.6 Cảm ứng tạo mô sẹo từ mô in vitro 23 5.2.7 Cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo 23 5.2.8 Tăng trưởng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 23 5.2.9 Xác định diện đo hàm lượng số hoạt chất Sâm cau 24 5.2.10 Xử lý thống kê 26 VI KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27 6.1 Khử trùng thân rễ tạo nguồn mẫu nuôi cấy in vitro 27 6.2 Tăng trưởng chồi ngủ từ thân rễ 29 6.3 Tạo cụm chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng 31 6.4 Cảm ứng tạo rễ tạo hoàn chỉnh 32 6.5 Cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng từ mô in vitro 34 6.6 Cảm ứng tạo mô sẹo từ mô in vitro 36 6.7 Cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo 39 6.8 Tăng trưởng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời 41 6.9 Xác định diện đo hàm lượng số hoạt chất Sâm cau 43 6.9.1 Xác định diện Curculigoside 43 6.9.2 Định lượng phenol tổng số phương pháp đo quang 45 6.9.3 Định lượng flavonoid tổng số phương pháp đo quang 47 VII KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 48 7.1 Kết luận 48 7.2 Kiến nghị 49 VIII SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 50 IX TÀI LIỆU HAM KHẢO 51 9.1 Tài liệu tiếng Việt 51 9.2 Tài liệu tiếng Anh 52 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid MS Murashige & Skoog NAA Naphathalene acetic acid BA Benzyladenine IAA 3-Indoleacetic acid IBA 3-Indolebutyric acid Kine Kinetine TIS Temporary Immersion System (Hệ thống ngập chìm tạm thời) iii DANH SÁCH BẢNG Bảng Thành phần hóa chất sử dụng xây dựng đường chuẩn phenol tổng 25 Bảng Thành phần hóa chất sử dụng xây dựng đường chuẩn Flavonoid 26 Bảng Tỉ lệ mẫu sống vô trùng xử lý CuSO4 kết hợp với NaOCl 27 Bảng Tỉ lệ mẫu sống vô trùng xử lý HgCl2 27 Bảng Ảnh hưởng nồng độ BA đến tăng trưởng chồi từ thân rễ Sâm cau 29 Bảng Ảnh hưởng nồng độ BA đến nhân nhanh chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng 31 Bảng Ảnh hưởng NAA tới tạo rễ Sâm cau 32 Bảng Ảnh hưởng nồng độ BA 2,4-D đến khả tái sinh chồi từ mẫu in vitro 35 Bảng Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng tới khả tạo mô sẹo từ mẫu in vitro 37 Bảng 10 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng tới tăng sinh khối mơ sẹo từ Sâm cau in vitro 38 Bảng 11 Ảnh hưởng BA 2,4-D tới tái sinh chồi từ mô sẹo 40 Bảng 12 Khả tăng trưởng Sâm cau môi trường bán rắn hệ thống TIS 42 Bảng 13 Giá trị Rf phản ứng tạo màu với thuốc thử FeCl : K3 [Fe(CN)6] 43 Bảng 14 Hàm lượng phenol tổng số mẫu Sâm cau 46 Bảng 15 Hàm lượng flavonoid tổng số mẫu Sâm cau 47 iv DANH SÁCH HÌNH Hình Cây Sâm cau ngồi tự nhiên Hình Cấu trúc curculigoside phân lập từ Sâm cau Hình Cấu trúc Phenolic glucosides phân lập từ Sâm cau Hình Cấu tạo hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời - TIS 17 Hình Cây Sâm cau tự nhiên sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 21 Hình Mẫu Sâm cau vô trùng 28 Hình Sự phát sinh chồi từ thân rễ Sâm cau sau tuần cấy 30 Hình Nhân chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng 31 Hình Sự hình thành rễ Sâm cau mơi trường khác 33 Hình 10 Sự phát sinh hình thái rễ Sâm cau mơi trường MS 33 Hình 11 Các giai đoạn phát triển phôi sinh dưỡng Sâm cau 35 Hình 12 Chồi phát triển từ phôi mô Sâm cau mơi trường khác 36 Hình 13 Sự hình thành mơ sẹo từ mơ Sâm cau mơi trường 38 Hình 14 Phát sinh hình thái mơ sẹo từ Sâm cau quan sát KHV 39 Hình 15 Sự hình thành phơi từ mơ sẹo môi trường khác 40 Hình 16 Cây Sâm cau ni cấy điều kiện mơi trường khác 42 Hình 17 Bản sắc ký lớp mỏng curculigoside từ mẫu sinh khối Sâm cau 44 v TÓM TẮT Sâm cau biết đến loại dược liệu quý, đặc biệt thân rễ (rhizome) có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học q curculigoside, flavonone glycoside, phenyl glucoside, aliphatic chất thuộc nhóm cycloartan triterpenic Cây Sâm cau sử dụng nhiều đông y y học đại Tuy nhiên, khả sinh trưởng tự nhiên Sâm cau chậm, với khai thác triệt để người khiến Sâm cau rơi vào tình trạng có nguy tuyệt chủng Phương pháp ni cấy mơ thực vật tiến công nghệ sinh học thực vật có bước phát triển mạnh việc bảo tồn nguồn giống dược liệu quý Trong nghiên cứu này, quy trình nhân giống in vitro Sâm cau xây dựng với nguồn vật liệu ban đầu đoạn thân rễ Sâm cau Đoạn thân rễ Sâm cau khử trùng HgCl2 0,1% 13 phút với NaOCl 6% kết hợp với CuSO4 5% Mẫu thân rễ Sâm cau vô trùng cấy vào môi trường MS bổ sung BA mg/l nhằm thúc đẩy tạo chồi Các chồi hủy đỉnh sinh trưởng cho hệ số nhân chồi cao môi trường MS không bổ sung chất điều hòa Các mẫu in vitro đặt môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D nhằm cảm ứng tạo mô sẹo Lá Sâm cau in vitro có khả tạo chồi thơng qua đường phát sinh phôi sinh dưỡng trực tiếp từ hay gián tiếp qua đường tạo mô sẹo Mơi trường MS khơng bổ sung chất điều hịa thích hợp cho việc tạo rễ từ chồi trưởng thành Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời với môi trường MS lỏng bổ sung 2,0 mg/l BA giúp tăng trưởng Sâm cau với số cao 5,27 cây/mẫu Trong điều kiện in vitro, hợp chất curculigoside xuất cao quan rễ (Rf = 0,74 – 0,76), hàm lượng phenol tổng số diện cao rễ Sâm cau nhân nhanh hệ thống TIS (90,52 mg/g) hàm lượng flavonoid tổng số cao mẫu Sâm cau nhân nhanh hệ thống TIS (13,65 mg/g) vi I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống, thu sinh khối in vitro bước đầu kiểm tra hàm lượng số hoạt chất sinh học Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn)” (Mã số: TV03/15-16) Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2374 QL1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 028-37153792 Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Thực Vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2374 QL1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 028-37157631 Chủ nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thị Thanh Thảo Nhóm thực hiện: ThS Đinh Thị Sáu CN Nguyễn Văn Long Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ 1/2015- 12/2016) Kinh phí: - Tổng kinh phí: 300 triệu VNĐ - Kinh phí sử dụng: 300 triệu VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: - Xây dựng quy trình nhân giống Sâm cau in vitro - Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời nhân nhanh sinh khối Sâm cau - Kiểm tra hàm lượng số hoạt chất sinh học Sâm cau in vitro so với tự nhiên Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký STT Nội dung đăng ký Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết thực - Đã sưu tập 275 từ vườn dược liệu An Giang 360 từ Đăk Lăk Xây dựng quy trình Đã xây dựng quy nhân giống in vitro trình nhân giống Sâm 4/2015 - 6/2016 Sâm cau: cau in vitro: - Khảo sát điều kiện - Mẫu thân củ khử Sưu tập nguồn mẫu 1/2015 - 4/2015 Sâm cau Đánh giá Đạt Đạt khử trùng mẫu - Khảo sát môi trường tạo chồi nhân nhanh chồi - Khảo sát trường tạo rễ môi - Khảo sát môi trường cảm ứng mô sẹo từ mô in vitro - Khảo sát môi trường tạo phôi sinh dưỡng Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời TIS việc tăng trưởng Sâm cau trùng phương pháp NaOCl 6% kết hợp với CuSO4 5% HgCl2 0,1% 13 phút - Mơi trường 2.0 mg/l BA thích hợp tạo chồi từ mẫu thân củ Sâm cau; môi trường MS thích hợp cho tạo cụm chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng - Môi trường MS không bổ sung chất điều hịa thích hợp tạo rễ từ chồi - Môi trường MS + 0.5 mg/l BA + 1.0 mg/l 2,4D thích hợp tạo mơ sẹo - Mơi trường MS + 0.5 mg/l 2,4–D + 2.0 mg/l BA thích hợp cho tạo phôi từ mô - Môi trường MS + 2,0 mg/l BA thích hợp cho 6/2016 - 9/2016 tăng trưởng Sâm cau từ phôi hệ thống ngập chìm tạm thời Bước đầu khảo sát số hợp chất thứ cấp mẫu sinh khối in vitro 9/2016 - 12/2016 (Curculigoside, hàm lượng phenol tổng số, hàm lượng flavonoid tổng số) Đã xác định diện hợp chất Curculigoside, hàm lượng phenol tổng flavonoid tổng Sâm cau in vitro Đạt Đạt II ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm cau (Curculigo orchiodes Gaertn) loài dược liệu sống lâu năm, quan thân rễ chứa hợp chất sinh học có tính dược lý cao flavono id glycoside, curculigoside, chất thuộc nhóm cycloartan triterpenic,… Theo Đơng y, Sâm cau có cơng dụng việc giúp tăng cường sinh lực phái mạnh Ngoài ra, Sâm cau có tác dụng trừ phong thấp, băng lậu, ung nhọt, hạ sốt giảm đau, chống loãng xương (Lei cs, 2009), giảm thiểu biến chứng bệnh đái tháo đường Bên cạnh đó, hợp chất tự nhiên thu nhận từ Sâm cau cịn có khả chống oxy hóa ức chế phát triển tế bào ung thư (Đỗ Huy Bích cs, 2004) Sâm cau loài dược liệu quý khả sinh trưởng phát triển chậm với khai thác mạnh mẽ người khiến cho lồi rơi vào tình trạng có nguy tuyệt chủng Hiện nay, Sâm cau đưa vào sách đỏ Viêt Nam, phân loại vào nhóm thực vật có nguy tuyệt chủng cao (Nguyễn Tiến Bân cs, 2007) Việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống tiếp cận tiến kỹ thuật công nghệ sinh học thực vật công nghệ tạo phôi soma, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời - TIS,… tạo tiềm việc nhân nhanh sinh khối thu nhận hợp chất thứ cấp từ dược liệu q Chính vậy, đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống, thu sinh khối in vitro bước đầu kiểm tra hàm lượng số hoạt chất sinh học Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn)” thực nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Giới thiệu Sâm cau 3.1.1 Phân loại Cây Sâm cau cịn có tên gọi khác: Ngải cau, tiên mao, cồ nốc lan Tên tiếng Anh: Black musale, thuộc họ Sâm cau (Hypoxidaceae) Theo trang “Đa dạng sinh học Ấn Độ”, Sâm cau phân loại theo hệ thống sau: Giới: Plantae Ngành: Tracheophyta 3 Nhân nhanh chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range L1 60.0 0.0 0.0 0.0 L2 60.0 20.0 11.547 40.0 L3 60.0 20.0 11.547 40.0 L4 66.6667 11.547 6.66667 20.0 L5 76.6667 5.7735 3.33333 10.0 L6 73.3333 11.547 6.66667 20.0 L7 53.3333 11.547 6.66667 20.0 L8 33.3333 11.547 6.66667 20.0 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3762.5 537.5 3.15 0.0273 Within groups 2733.33 16 170.833 Total (Corr.) 6495.83 23 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups L8 33.3333 X L7 53.3333 XX L3 60.0 XX L2 60.0 XX L1 60.0 XX L4 66.6667 XX L6 73.3333 XX L5 76.6667 X Số chồi S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range L1 2.31333 0.301717 0.174197 0.55 L2 1.69333 0.338575 0.195477 0.67 L3 1.52667 0.411866 0.237791 0.75 L4 1.64 0.375899 0.217025 0.75 L5 2.13667 0.231805 0.133832 0.42 L6 2.33333 0.381881 0.220479 0.75 L7 1.44333 0.0981495 0.0566667 0.17 L8 1.0 0.0 0.0 0.0 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4.58378 0.654826 7.22 0.0005 Within groups 1.4516 16 0.090725 Total (Corr.) 6.03538 23 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups L8 1.0 X L7 1.44333 XX L3 1.52667 X L4 1.64 XX L2 1.69333 XX L5 2.13667 XX L1 2.31333 X L6 2.33333 X Chiều cao chồi cao S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range L1 6.26333 0.22942 0.132455 0.42 L2 5.77333 0.0702377 0.0405518 0.14 L3 5.66 0.173205 0.1 0.3 L4 5.26667 0.100664 0.0581187 0.2 L5 4.88667 0.425245 0.245515 0.8 L6 4.40667 0.136137 0.0785988 0.26 L7 4.18 0.08 0.046188 0.16 L8 3.99333 0.170098 0.0982061 0.32 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14.185 2.02642 48.77 0.0000 Within groups 0.6648 16 0.04155 Total (Corr.) 14.8498 23 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups L8 3.99333 X L7 4.18 XX L6 4.40667 L5 4.88667 L4 5.26667 X X X L3 5.66 X L2 5.77333 X L1 6.26333 X Số chồi cao Summary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range L1 5.76667 0.152753 0.0881917 0.3 L2 5.8 0.0 0.0 0.0 L3 5.6 0.34641 0.2 0.6 L4 5.53333 0.11547 0.0666667 0.2 L5 5.26667 0.057735 0.0333333 0.1 L6 5.33333 0.11547 0.0666667 0.2 L7 4.93333 0.305505 0.176383 0.6 L8 4.86667 0.416333 0.24037 0.8 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.62625 0.375179 6.82 0.0007 Within groups 0.88 16 0.055 Total (Corr.) 3.50625 23 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups L8 4.86667 X L7 4.93333 XX L5 5.26667 XXX L6 5.33333 XX L4 5.53333 XX L3 5.6 XX L1 5.76667 X L2 5.8 X Tạo chồi phương pháp hủy đỉnh Số chồi tạo S ummary S tatistics Count Average L1 4.8 L2 4.6 L3 4.46667 L4 3.6 L5 3.2 Standard deviation 0.4 0.4 0.503322 1.249 0.2 Standard error 0.23094 0.23094 0.290593 0.72111 0.11547 Range 0.8 0.8 1.0 2.4 0.4 ANOVA Table Source Sum of Squares Between groups 5.78667 Within groups 4.34667 Total (Corr.) 10.1333 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean L5 3.2 L4 3.6 L3 4.46667 L2 4.6 L1 4.8 Df 10 14 Mean Square 1.44667 0.434667 F-Ratio 3.33 P-Value 0.0560 Homogeneous Groups X XX XX XX X Chiều cao chồi S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error L1 1.44667 0.117189 0.0676593 L2 1.3 0.2 0.11547 L3 1.26667 0.152753 0.0881917 L4 1.14333 0.0981495 0.0566667 L5 1.03333 0.057735 0.0333333 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0.297173 0.0742933 4.13 Within groups 0.180067 10 0.0180067 Total (Corr.) 0.47724 14 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups L5 1.03333 X L4 1.14333 XX L3 1.26667 XXX L2 1.3 XX L1 1.44667 X Range 0.22 0.4 0.3 0.17 0.1 P-Value 0.0315 Tạo rễ Tỷ lệ mẫu tạo rễ S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range N1 100.0 0.0 0.0 0.0 N2 100.0 0.0 0.0 0.0 N3 100.0 0.0 0.0 0.0 N4 93.3333 11.547 6.66667 20.0 N5 66.6667 11.547 6.66667 20.0 N6 46.6667 11.547 6.66667 20.0 N7 30.0 10.0 5.7735 20.0 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 15266.7 2544.44 35.62 0.0000 Within groups 1000.0 14 71.4286 Total (Corr.) 16266.7 20 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups N7 30.0 X N6 46.6667 N5 66.6667 N4 93.3333 X N3 100.0 X N2 100.0 X N1 100.0 X X X Số rễ S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range N1 7.29 0.343948 0.198578 0.67 N2 15.8667 2.04287 1.17945 3.8 N3 16.29 1.34101 0.774231 2.6 N4 9.97333 0.710375 0.410135 1.42 N5 9.77667 3.23568 1.86812 6.33 N6 6.16667 0.57735 0.333333 1.0 N7 3.66667 1.1547 0.666667 2.0 Total 21 9.86143 4.7202 1.03003 15.2 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 408.143 68.0239 25.42 0.0096 Within groups 37.4617 14 2.67584 Total (Corr.) 445.605 20 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups N7 3.66667 X N6 6.16667 XX N1 7.29 N5 9.77667 X N4 9.97333 X XX N2 15.8667 X N3 16.29 X Chiều dài rễ S ummary S tatistics Count Average Standard deviation Standard error Range N1 9.29 0.343948 0.198578 0.67 N2 0.586667 0.080829 0.0466667 0.16 N3 0.49 0.0264575 0.0152753 0.05 N4 0.38 0.02 0.011547 0.04 N5 0.303333 0.064291 0.0371184 0.12 N6 0.25 0.05 0.0288675 0.1 N7 0.116667 0.0288675 0.0166667 0.05 Total 21 1.63095 3.20943 0.700356 9.57 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 205.743 34.2904 1799.35 0.0000 Within groups 0.2668 14 0.0190571 Total (Corr.) 206.009 20 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups N7 0.116667 X N6 0.25 XX N5 0.303333 XX N4 0.38 XX N3 0.49 XX N2 0.586667 N1 9.29 X X Tạo chồi từ Số chồi S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 Average 1.667 1.067 1.8 1.733 3.867 0.533 Variance 0.0133 0.1733 0.16 0.0133 1.2933 0.0933 Standard deviation 0.115 0.416 0.4 0.115 1.137 0.305 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 19.2978 3.85956 13.26 0.0002 Within groups 3.49333 12 0.291111 Total (Corr.) 22.7911 17 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0.533333 X 1.06667 XX 1.66667 X 1.73333 X 3 1.8 X 3.86667 X Số phôi S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 Average 4.4 7.73 10.13 9.467 10.6 4.86667 Variance 0.52 0.813 0.253 0.093 0.16 1.65333 Standard deviation 0.72111 0.90185 0.503322 0.305505 0.4 1.28582 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 108.613 21.7227 37.31 0.0000 Within groups 6.98667 12 0.582222 Total (Corr.) 115.6 17 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 4.4 X 4.86667 X 7.73333 9.46667 X 3 10.1333 X 10.6 X X Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo Trọng lượng tươi mô sẹo S ummary S tatistics Nghiem thuc Count Average 0.154333 Variance 0.000576333 10 Standard deviation 0.0240069 ANOVA Table 3 3 3 3 0.182 0.226 0.295333 0.152667 0.258333 0.494667 0.330333 0.189 0.001521 0.002089 0.000842333 0.000977333 0.000937333 0.00469633 0.00180833 0.001701 0.039 0.0457056 0.029023 0.0312623 0.0306159 0.0685298 0.0425245 0.0412432 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.287604 0.0359505 21.36 0.0000 Within groups 0.030298 18 0.00168322 Total (Corr.) 0.317902 26 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0.152667 X 0.154333 X 0.182 XX 0.189 XXX 3 0.226 0.258333 0.295333 XX 0.330333 X 0.494667 XXX XX X Trọng lượng khô S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 3 Average 0.0153333 0.0283333 0.026 0.068 0.017 0.041 0.128667 0.0786667 0.0163333 Variance 0.0000243333 0.0000493333 0.000009 0.000061 0.000013 0.000016 0.0000743333 0.000256333 0.00000933333 Standard deviation 0.00493288 0.00702377 0.003 0.00781025 0.00360555 0.004 0.00862168 0.0160104 0.00305505 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0353412 0.00441765 77.55 0.0000 Within groups 0.00102533 18 0.000056963 Total (Corr.) 0.0363665 26 11 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0.0153333 X 0.0163333 XX 0.017 XX 0.026 XX 3 0.0283333 0.041 0.068 X 0.0786667 X 0.128667 XX X X Tái sinh chồi từ mô sẹo Số phôi S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 Average 10.8 15.2667 23.8667 35.9333 32.5333 25.0667 Variance 3.72 11.5733 5.29333 3.57333 6.09333 4.05333 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1400.52 280.105 48.99 0.0000 Within groups 68.6133 12 5.71778 Total (Corr.) 1469.14 17 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0.0153333 X 0.0163333 3 0.017 X 0.026 X 0.0283333 X 0.041 X X 12 Standard deviation 1.92873 3.40196 2.30072 1.89033 2.46847 2.01329 Số chồi S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 Average 1.333 2.533 3.333 5.867 7.667 3.0 Variance 0.333 0.013 0.213 0.373 0.813 0.16 Standard deviation 0.577 0.115 0.462 0.612 0.902 0.4 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 82.8711 16.5742 52.16 0.0000 Within groups 3.81333 12 0.317778 Total (Corr.) 86.6844 17 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1.13333 X 2.53333 X 3.0 X 3 3.333 X 5.867 7.667 X X Thí nghiệm nhân chồi hệ thống TIS Số chồi S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 3 Average 1.53333 1.6 1.06667 3.13333 2.86667 1.6 2.13333 5.26667 Variance 0.0933333 0.16 0.213333 0.173333 0.0933333 0.12 0.0933333 0.493333 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 38.56 5.50857 30.60 0.0000 Within groups 2.88 16 0.18 Total (Corr.) 41.44 23 13 Standard deviation 0.305505 0.4 0.46188 0.416333 0.305505 0.34641 0.305505 0.702377 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 3 1.06667 X 1.53333 XX 1.6 XX 1.6 XX 2.13333 2.86667 XX 3.13333 X 5.26667 XX X Số rễ S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 3 Average 4.93333 3.33333 2.8 4.73333 6.13333 2.73333 3.13333 4.8 Variance 0.173333 0.0533333 0.0 0.0933333 0.0933333 0.0933333 0.0133333 0.16 Standard deviation 0.416333 0.23094 0.0 0.305505 0.305505 0.305505 0.11547 0.4 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 32.385 4.62643 54.43 0.0000 Within groups 1.36 16 0.085 Total (Corr.) 33.745 23 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count 3 3 3 3 Mean 2.73333 2.8 3.13333 3.33333 4.73333 4.8 4.93333 6.13333 Homogeneous Groups X X XX X X X X X 10 Hàm lượng phenol tổng số S ummary S tatistics Nghiem thuc Count 3 3 3 Average 156.75 81.08 12.66 31.9767 85.56 42.59 90.52 Variance 15.6771 17.1223 8.1292 12.2774 7.2637 29.3281 33.0619 14 Standard deviation 3.95943 4.13791 2.85118 3.50392 2.69513 5.41554 5.74995 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean quare F-Ratio P-Value Between groups 41336.3 6889.38 392.53 0.0000 Within groups 245.719 14 17.5514 Total (Corr.) 41582.0 20 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count 3 3 3 Mean 12.66 31.9767 42.59 81.08 85.56 90.52 156.75 Homogeneous Groups X X X X XX X X 11 Hàm lượng flavonoid tổng số S ummary S tatistics Nghiem thuc ANOVA Table Count 3 3 3 Average 34.4713 16.0947 1.70233 10.27 12.475 13.647 12.162 Variance 3.98092 1.48485 0.144292 0.750501 1.10647 0.708537 0.143971 Standard deviation 1.99522 1.21855 0.379858 0.866315 1.05189 0.841746 0.379435 Source Sum of Squares Df Mean quare F-Ratio P-Value Between groups 1779.9 296.65 249.60 0.0000 Within groups 16.6391 14 1.18851 Total (Corr.) 1796.54 20 Multiple Range Tests M ethod: 95.0 percent LSD Count 3 3 3 Mean 1.70233 10.27 12.162 12.475 13.647 16.0947 34.4713 Homogeneous Groups X X XX X X X X 12 Quy trình nhân giống Sâm cau Vật liệu: Thân rễ Sâm cau thu thập tự nhiên Quy trình nhân giống Sâm cau thực theo bước sau: + Công đoạn 1: Khử trùng mẫu thân rễ để tạo nguồn vật liệu nuôi cấy in vitro:  Chọn lọc Sâm cau khỏe mạnh, đường kính thân rễ khoảng 1cm, loại bỏ lá, rễ * Xử lý tủ cấy gồm bước: 15  Bước 1: Rửa mẫu thân rễ với xà phịng lỗng  Bước 2: Cắt mẫu thành đoạn nhỏ khoảng cm, lắc với dung dịch xà phịng lỗng 30 phút  Bước 3: Rửa mẫu với nước từ 3-5 lần * Xử lý tủ cấy gồm bước:  Bước 1: Chuyển mẫu sang bình tam giác hấp khử trùng  Bước 2: Xử lý mẫu với NaOCl 6% 50 phút, rửa với nước cất vô trùng lần  Bước 3: Xử lý mẫu với CuSO4 5% 20 phút, rửa với nước cất vô trùng lần  Bước 4: Loại bỏ phần hoại tử, cấy mẫu vào môi trường MS  Bước 5: Đặt ống nghiệm chứa mẫu điều kiện phịng ni 14 ngày để thu nhận mẫu sống vô trùng * Thời gian thực hiện: tuần + Công đoạn 2: Tạo nguồn mẫu in vitro gồm bước:  Bước 1: Các chồi ngủ trưởng thành (có – lá), tách bỏ bẹ  Bước 2: Dùng dao cấy hủy đỉnh sinh trưởng cấy môi trường MS *Thời gian thực hiện: tuần * Hệ số nhân chồi: 2,08 chồi + Công đoạn 3: Tạo cụm chồi phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng gồm bước:  Bước 1: Sử dụng Sâm cau in vitro (có 5-6 lá)  Bước 2: Tách bỏ bẹ từ vào vùng đỉnh sinh trưởng  Bước 3: Dùng dao cấy cắt ngang vùng đỉnh sinh trưởng  Bước 4: Cấy mẫu môi trường MS * Thời gian thực hiện: tuần * Hệ số nhân chồi: 4,8 chồi + Công đoạn 4: Cảm ứng tạo rễ tạo hoàn chỉnh  Bước 1: Sử dụng chồi in vitro đạt chiều cao từ – cm với –  Bước 2: Cấy môi trường MS * Thời gian thực hiện: tuần + Công đoạn 5: Tạo mô sẹo từ in vitro gồm bước:  Bước 1: Sử dụng Sâm cau in vitro (cao khoảng 10 cm, có – lá)  Bước 2: Lá tách khỏi thân, cắt bỏ cuống đầu  Bước 3: Cắt thành mảnh nhỏ (kích thước khoảng 1×1 cm)  Bước 4: Cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L 2,4 – D 16  Đặt mẫu điều kiện khơng có ánh sáng * Thời gian thực hiện: 10 tuần + Công đoạn 6: Tạo cụm phôi soma từ mô sẹo gồm bước:  Bước 1: Tách mô sẹo thành cụm nhỏ (đường kính cm)  Bước 2: Cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L 2,4 - D kết hợp 2,0 mg/L BA * Thời gian thực hiện: 10 tuần * Hệ số nhân chồi: 7,67 chồi + Công đoạn 7: Tăng trưởng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời - TIS, bao gồm bước:  Bước 1: Chọn khối mô sẹo tạo phôi tuần tuổi  Bước 2: Cấy vào hộp TIS có chứa 250 ml mơi trường MS bổ sung mg/l BA  Bước 3: Cài đặt hệ thống TIS với thông số sau: chu kỳ bơm giờ/lần thời gian ngập chìm phút/lần bơm chu kỳ ngập chìm * Thời gian thực hiện: 10 tuần * Hệ số nhân chồi: 5,27 chồi * Điều kiện phịng ni: Chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2.500  500 lux, nhiệt độ 25  2oC, ẩm độ 55  5% + Cơng đoạn 7: Quy trình trồng vườn ươm:  Bước 1: Sử dụng in vitro có chiều cao 15 cm, đầy đủ rễ  Bước 2: Rửa môi trường bám nước có bổ sung vài giọt Iot  Bước 3: Trồng giá thể gồm đất sạch, tro, vụn xơ dừa theo tỉ lệ 8:1:1 Bước 4: Chế độ tưới lần/ngày, phân bón NPK (30-10-10) phun lên lần/tuần 13 Các đề tài hướng dẫn Người thực STT Tên đề tài Cán hướng dẫn Ghi Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực TS Dương Hoa Xô Nguyễn Văn Luận văn vật lên tạo phơi vơ tính ThS Nguyễn Xuân Long Thạc sĩ Sâm cau (Curculigo Dũng orchioides Gaertn.) Xây dựng quy trình nhân ThS Đinh Thị Sáu Nguyễn Thị giống in vitro Sâm cau Luận văn KS Nguyễn Thị Bích Như (Curculigo orchioides Cử nhân Thanh Thảo Gaertn.) 14 Cơng trình cơng bố khoa học 17 18