Tối ưu hóa các điều nuôi cấy dòng vi khuẩn bacillus amyloliquefacciencs b39 sinh iturin a nồng độ trong dịch chiết

N QU N L KHU N NG NGHI P Ứ NG NGH O TP HCM Ể BÁO CÁO NGHI M THU TỐ Ƣ Ĩ Đ ỀU KI N NI CẤY DÒNG VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciencs B39 SINH ITURIN A NỒ ĐỘ CAO TRONG DỊCH CHIẾT ThS Nguyễn Phạm Trúc Phương Th nh ph h inh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) TỐ Ƣ Ĩ Đ ỀU KI N NI CẤY DỊNG VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciencs B39 SINH ITURIN A NỒ ĐỘ CAO TRONG DỊCH CHIẾT ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) h Minh, h ng 01/2017 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Nghiên cứu nhằm chọn lọc môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu điều kiện nuôi cấy để vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh tổng hợp Iturin A cao dịch chiết Thử nghiệm với loại môi trƣờng khác giúp phát môi trƣờng ni cấy thích hợp để Bacillus amyloliquefaciencs sinh tổng hợp Iturin A với hàm lƣợng cao Vì vậy, loại môi trƣờng khác gồm M1, M2, M3, M4, M5, M6 đƣợc bổ sung 1% dịch khuẩn sau tăng sinh đem ủ 37ᴏC 48h, lắc 150 vòng đƣợc đƣa vào thử nghiệm khả sinh tổng hợp Iturin A Bacillus amyloliquefaciencs B39 Kết thí nghiệm 1, xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy M2 (6g/l NaH2PO4; 3g/l KH2PO4; 1g/l NH4Cl; 0,5g/l NaCl; 20g Glucose; 0,25g MgSO4.7H2O; 0,01g/l Thiamin.HCl; 0,015g/l CaCl2) mơi trƣờng thích hợp để vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh tổng hợp Iturin A với hàm lƣợng cao (23,63 mg/L) Đồng thời xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu (nhiệt độ nuôi cấy 31ᴏC; thời gian nuôi cấy 120 giờ; pH môi trƣờng 7) để chủng khuẩn sinh Iturin A cao (36,71 mg/L) Ngồi cịn xác định đƣợc phƣơng pháp thu nhận Iturin A màng lọc cho nồng độ ức chế tối thiểu nấm Fusarium oxysporum (MIC) mg/L hiệu suất thu nhận cao (63,80%) nhƣng giữ đƣợc hoạt tính làm tiền đề sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại trồng Fusarium oxysporrum gây MỤC LỤC Trang phụ bìa Tóm tắt đề tài Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình TH NG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU hƣơng TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Nguồn gốc đặc tính hóa học iturin A 1.2 Khả ứng dụng Iturin A 1.3 ác nguyên liệu để sản xuất iturin Trang i ii iv vii viii ix 4 1.4 Nguyên nhân sử dụng 1.5 Sơ lƣợc nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng 1.6 Kết nghiên cứu 2015 10 11 13 13 13 13 13 13 13 1.7 Tình hình nghiên cứu Iturin A hƣơng II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Phƣơng tiện thí nghiệm 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.2 Nội dung 1: Tối ƣu môi trƣờng điều kiện ni cấy dịng vi 13 khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs sinh Iturin A cao 2.3.1.1 Mục tiêu 13 2.3.1.2 Bố trí – Phƣơng pháp thí nghiệm 13 a Phục hồi, tăng sinh khối dòng vi khuẩn B amyloliquefacienc 13 b họn lọc môi trƣờng lên men 15 c Khảo sát mối tƣơng quan nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi 16 cấy, pH môi trƣờng nuôi cấy 2.3.3 Nội dung 2: Khảo sát phƣơng pháp thu nhận Iturin A thô từ dịch lên men 2.3.3.1 Mục tiêu 2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm a Phƣơng pháp thu nhận Iturin cồn 18 18 18 18 b Phƣơng pháp thu nhận Iturin điểm đẳng điện 19 c Phƣơng pháp thu nhận Iturin sunphate amon 19 d Phƣơng pháp lọc 19 e Đánh giá hiệu kháng nấm Fusarium oxysporum Iturin A sau thu nhận điều kiện in vitro 19 hƣơng 3: KẾT QU VÀ TH O LUẬN 21 3.1 Nội dung 1: Tối ƣu môi trƣờng điều kiện ni cấy dịng vi 21 khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh Iturin A cao 3.1.1 Phục hồi, tăng sinh khối chủng khuẩn Bacillus 21 amyloliquefaciencs B39 3.1.2 Chọn lọc môi trƣờng nuôi cấy (lên men) Bacillus amyloliquefaciencs cho khả sinh tổng hợp Iturin A cao 3.1.3 Khảo sát mối tƣơng quan nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trƣờng nuôi cấy 3.2 Nội dung 2: Khảo sát phƣơng pháp thu nhận Iturin A thô từ dịch lên men hƣơng IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LI U THAM KH O PHỤ LỤC 21 24 28 31 31 31 32 35 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VI T Fusarium oxysporum F.oxysporum Bacillus amyloliquefaciencs B amyloliquefaciencs LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry BA Bacillus Agar BB Bacillus Broth MIC Minium Inhibitory Concentration PDA Potatoe Dextrose Agar DANH SÁCH BẢNG Số Tên bảng số liệu Trang 2.1 Thành phần môi trƣờng BA BB 14 2.2 Thành phần môi trƣờng lên men thu Iturin A 15 2.3 Khoảng giá trị thích hợp cho yếu tố khảo sát 16 2.4 Ma trận nghiệm thức thí nghiệm 17 3.1 Kết ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấyđến mật độ tế 22 bào vi khuẩn hàm lƣợng Iturin A 3.2 Mã hóa ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm lƣợng Iturin 24 thu đƣợc 3.3 Hệ số ảnh hƣởng yếu tố thí nghiệm mơ hình 25 hồi qui đến hàm lƣợng Iturin A 3.4 Kết hàm lƣợng Iturin A B amyloliquefaciencs B39 27 sinh tổng hợp điều kiện dự đốn 3.5 Kết bán kính vịng kháng nấm (mm) nồng độ ức chế tối thiểu MIC Iturin A thô thu nhận từ dịch lên men 28 phƣơng pháp khác 3.6 Hiệu suất thu nhận Iturin A thô (%) từ dịch lên men 30 phƣơng pháp khác DANH SÁCH HÌNH Số Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hóa học Iturin A 3.1 Khuẩn lạc Bacillus amyloliquefaciencs 39 môi trƣờng 21 BA 3.2 Hiệu ức chế nấm Fusarium oxysporum Iturin A thô 30 thu nhận phƣơng pháp khác THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài: Tối ƣu hóa điều kiện ni cấy dịng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh Iturin A nồng độ cao dịch chiết Chủ nhiệm nội dung nghiên cứu: Nguyễn Phạm Trúc Phƣơng quan chủ trì: Trung Tâm Nghiên Cứu Và Phát Triển Nơng Nghiệp Công Nghệ Cao TP.HCM Thời gian thực hiện: Từ 5/2016 – 2/2017 Kinh phí đƣợc duyệt: 217.676.040 đồng Mục tiêu: - Xác định môi trƣờng nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trƣờng nuôi cấy để vi dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs sinh Iturin A có nồng độ cao - Xác định phƣơng pháp thu nhận Iturin thu nhận hoạt tính kháng nấm cao thơ để Iturin thu đƣợc có hiệu suất Sản phẩm nội dung nghiên cứu khoa học: Chọn lọc đƣợc mơi trƣờng M2 mơi trƣờng thích hợp để vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh tổng hợp Iturin cao Đồng thời xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu (nhiệt độ nuôi cấy 31ᴏC; thời gian nuôi cấy 120 giờ; pH môi trƣờng 7) để chủng khuẩn sinh Iturin A cao Ngồi cịn xác định đƣợc phƣơng pháp thu nhận Iturin A màng lọc cho MIC mg/L hiệu suất thu nhận cao (63,8%) nhƣng giữ đƣợc hoạt tính làm tiền đề sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại trồng Fusarium oxysporrum gây Báo cáo khoa học MỞ ĐẦU Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho phát triển nhiều lồi nấm mốc gây hại cho nơng nghiệp nƣớc ta có Fusarium Phytopthora Sử dụng thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học cách khơng kiểm sốt để phịng trị bệnh làm ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe môi trƣờng sống Thêm vào đó, tính hiệu loại thuốc hóa học ngày giảm khả thích nghi kháng lại mầm bệnh Các nhà khoa học nhiều nơi giới nỗ lực nghiên cứu tìm kiếm sản phẩm thay bao gồm vi sinh vật có lợi chất tiết có hoạt tính kháng sinh từ chúng Trong số dòng vi khuẩn phân lập đƣợc từ khu vực suối nƣớc nóng Bình Châu, dịch chiết ni cấy dịng Bacillus amyloliquefaciens B39 cho khả kháng Fusarium oxysporum Phytopthora palmivora điều kiện in vitro mạnh Thêm vào đó, kết phân tích khối phổ kỹ thuật L /MS xác định dịch chiết ni cấy dịng vi khuẩn tiết iturin A, chất có khả kháng nấm mạnh diện rộng (Từ kết đề tài N TX 2015: “Đánh giá khả kháng Fusarium oxysporum Phytopthora palmivora từ dịch chiết nuôi cấy số dòng vi khuẩn Bacillus phân lập từ khu vực suối nƣớc nóng ình hâu”) Kháng sinh dạng lipopeptde Iturin đƣợc xem loại thuốc trừ nấm sinh học có tiềm thay cho loại thuốc trừ nấm hóa học để kiểm sốt tác nhân gây bệnh hại trồng Tuy nhiên, việc lên men quy mô công nghiệp chƣa đƣợc thực giá thành sản xuất cao nồng độ thu đƣợc lại thấp Thêm vào đó, việc sử dụng vi sinh vật dạng bào tử vi khuẩn Bacillus cách trực tiếp thƣờng không mang lại hiệu nhƣ mong muốn điều kiện thực tế khả tổng hợp nên hợp chất thứ cấp nhƣ Iturin liên quan chặt chẽ đến nguồn dinh dƣỡng vi sinh vật Iturin đƣợc sản xuất sau pha sinh trƣởng mà nguồn dinh dƣỡng bắt đầu khan Tuy nhiên, thiếu hoàn toàn một vài chất dinh dƣỡng thiết yếu thƣờng dẫn đến hình thành nên bào tử lƣợng Iturin sinh ngừng lại Trong khả đối kháng ngăn ngừa nấm bệnh nhờ khả tiết kháng sinh chúng Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Tối ƣu hóa điều kiện ni cấy dịng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciencs B39 sinh Iturin A nồng độ cao dịch chiết” Means Nghiệm thức N Mean StDev 95% CI M1 8.5140 0.0637 (8.4324, 8.5955) M2 7.7807 0.0419 (7.6992, 7.8622) M3 8.5429 0.1065 (8.4614, 8.6244) M4 8.6063 0.0520 (8.5248, 8.6878) M5 7.6896 0.0919 (7.6080, 7.7711) M6 8.4332 0.0885 (8.3517, 8.5147) Pooled StDev = 0.0776049 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping M4 8.6063 A M3 8.5429 A M1 8.5140 A M6 8.4332 A M2 7.7807 B M5 7.6896 B Means that not share a letter are significantly different 42 One-way ANOVA: Hàm lượng Iturin A (mg/L) versus Nghiệm thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis At least one mean is different Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Nghiệm thức Values M1, M2, M3, M4, M5, M6 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 969.92 193.984 74.13 0.000 Error 18 47.10 2.617 Total 23 1017.02 Nghiệm thức Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1.61764 95.37% 94.08% 91.77% Means 43 Nghiệm thức N Mean StDev 95% CI M1 14.410 1.233 (12.711, 16.109) M2 23.625 1.949 (21.926, 25.324) M3 7.430 1.270 ( 5.731, 9.129) M4 3.750 0.500 ( 2.051, 5.449) M5 8.760 0.409 ( 7.061, 10.459) M6 13.46 2.89 ( 11.76, 15.16) Pooled StDev = 1.61764 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping M2 23.625 M1 14.410 B M6 13.46 B M5 8.760 C M3 7.430 C M4 3.750 A D Means that not share a letter are significantly different Phụ lục 3.2 Khảo sát mối tƣơng quan nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trƣờng nuôi cấy 44 45 46 47 Phụ lục 3.3 : Khảo sát phƣơng pháp thu nhận Iturin A thô từ dịch lên men - Dịch chiết One-way ANOVA: Bán kính vòng kháng nấm (mm versus Nồng độ Iturin A (mg/l) Method Null hypothesis Alternative hypothesis Significance level All means are equal At least one mean is different α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Nồng độ Iturin A (mg/l) Levels Values mg/l, 18mg/l, 27mg/l, 36mg/l, 9mg/l Analysis of Variance Source Nồng độ Iturin A (mg/l) Error Total DF 25 29 Adj SS 1533.08 10.58 1543.67 Adj MS 383.271 0.423 F-Value 905.36 P-Value 0.000 Model Summary S 0.650641 R-sq 99.31% R-sq(adj) 99.20% R-sq(pred) 99.01% Means Nồng độ Iturin A (mg/l) mg/l 18mg/l 27mg/l 36mg/l 9mg/l N 6 6 Mean 0.000000 15.667 17.833 20.417 11.917 StDev 0.000000 0.408 0.516 1.021 0.801 95% CI (-0.547061, 0.547061) ( 15.120, 16.214) ( 17.286, 18.380) ( 19.870, 20.964) ( 11.370, 12.464) Pooled StDev = 0.650641 Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence Nồng độ Iturin A(mg/l) 36mg/l N 27mg/l 18mg/l 9mg/l 0mg/l 6 6 Mean Grouping 20.417 A 17.833 15.667 11.917 0.000000 48 B C D E Means that not share a letter are significantly different hƣơng háp thu nhận cồn - One-way ANOVA: Bán kính vịng kháng nấm (mm versus Nồng độ Iturin A (mg/l) Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis At least one mean is different Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Nồng độ Iturin A (mg/l) Values mg/l, 18mg/l, 27mg/l, 36mg/l, 9mg/l Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 214.300 53.5750 135.63 0.000 Error 25 9.875 0.3950 Total 29 224.175 Nồng độ Iturin A (mg/l) Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.628490 95.59% 94.89% 93.66% 49 Means Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean StDev 95% CI mg/l 0.000000 0.000000 18mg/l 5.833 0.516 ( 5.305, 6.362) 27mg/l 6.333 0.753 ( 5.805, 6.862) 36mg/l 7.250 0.758 ( 6.722, 7.778) 9mg/l 2.833 0.753 ( 2.305, 3.362) (-0.528437, 0.528437) Pooled StDev = 0.628490 Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean Grouping 36mg/l 7.250 27mg/l 6.333 B 18mg/l 5.833 B 9mg/l 2.833 mg/l 0.000000 A C D Means that not share a letter are significantly different - hƣơng pháp thu nhận điểm đẳng điện 50 One-way ANOVA: Bán kính vịng kháng nấm (mm versus Nồng độ Iturin A (mg/l) Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis At least one mean is different Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Nồng độ Iturin A (mg/l) Values mg/l, 18mg/l, 27mg/l, 36mg/l, 9mg/l Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 214.867 53.7167 275.47 0.000 Error 25 4.875 0.1950 Total 29 219.742 Nồng độ Iturin A (mg/l) Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.441588 97.78% 97.43% 96.81% Means 51 Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean StDev 95% CI mg/l 0.000000 0.000000 18mg/l 5.083 0.665 ( 4.712, 5.455) 27mg/l 6.500 0.447 ( 6.129, 6.871) 36mg/l 7.333 0.408 ( 6.962, 7.705) 9mg/l 2.667 0.408 ( 2.295, 3.038) (-0.371289, 0.371289) Pooled StDev = 0.441588 Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean 36mg/l 7.333 27mg/l 6.500 18mg/l 5.083 9mg/l 2.667 mg/l Grouping A B 0.000000 C D E Means that not share a letter are significantly different - hƣơng pháp thu nhận sunphate amon One-way ANOVA: Đường kính vòng kháng nấm (mm versus Nồng độ Iturin A (mg/l) Method 52 Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis At least one mean is different Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Nồng độ Iturin A (mg/l) Values mg/l, 18mg/l, 27mg/l, 36mg/l, 9mg/l Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 380.083 95.0208 335.37 0.000 Error 25 7.083 0.2833 Total 29 387.167 Nồng độ Iturin A (mg/l) Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.532291 98.17% 97.88% 97.37% Means Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean StDev 95% CI 53 mg/l 0.000000 0.000000 (-0.447552, 0.447552) 18mg/l 6.250 0.612 ( 5.802, 6.698) 27mg/l 8.000 0.707 ( 7.552, 8.448) 36mg/l 10.333 0.606 ( 9.886, 10.781) 9mg/l 3.750 0.418 ( 3.302, 4.198) Pooled StDev = 0.532291 Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean 36mg/l 10.333 27mg/l 8.000 18mg/l 6.250 9mg/l 3.750 mg/l Grouping A B C D 0.000000 E Means that not share a letter are significantly different - hƣơng pháp thu nhận màng lọc One-way ANOVA: Bán kính vịng kháng nấm (mm versus Nồng độ Iturin A (mg/l) Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis At least one mean is different 54 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Nồng độ Iturin A (mg/l) Values mg/l, 18mg/l, 27mg/l, 36mg/l, 9mg/l Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 1008.33 252.083 245.54 0.000 Error 25 25.67 1.027 Total 29 1034.00 Nồng độ Iturin A (mg/l) Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1.01325 97.52% 97.12% 96.43% Means Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean StDev 95% CI mg/l 0.000000 0.000000 18mg/l 11.500 1.049 ( 10.648, 12.352) 27mg/l 14.500 1.049 ( 13.648, 15.352) 36mg/l 16.333 0.816 ( 15.481, 17.185) 9mg/l 7.667 1.506 ( 6.815, 8.519) (-0.851940, 0.851940) 55 Pooled StDev = 1.01325 Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence Nồng độ Iturin A (mg/l) N Mean 36mg/l 16.333 27mg/l 14.500 18mg/l 11.500 9mg/l 7.667 mg/l 0.000000 Grouping A B C D E Means that not share a letter are significantly different 56