Thiết lập và tối ưu hóa điều kiện nuôi vi tảo haematococcus pluvialis để sản xuất astaxanthin bằng công nghệ nuôi cấy cố định trên hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang

`` ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Thiết lập tối ưu hóa điều kiện ni vi tảo Haematococcus pluvialis để sản xuất astaxanthin công nghệ nuôi cấy cố định hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Đỗ Thành Trí Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Thiết lập tối ưu hóa điều kiện ni vi tảo Haematococcus pluvialis để sản xuất astaxanthin công nghệ nuôi cấy cố định hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 25/01/2018) Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Chủ nhiệm nhiệm vụ: (ký tên) (Ký ghi rõ họ tên) Đỗ Thành Trí Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh- 2018 THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Tp HCM, ngày 29 tháng 12 năm 2017 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Thiết lập tối ưu hóa điều kiện ni vi tảo Haematococcus pluvialis để sản xuất astaxanthin công nghệ nuôi cấy cố định hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang Thuộc: Chương trình Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: - Họ tên: ĐỖ THÀNH TRÍ - Ngày tháng năm sinh: 18/02/1987 - Học hàm, Học vị: Thạc sĩ Giới tính: Nam Chuyên ngành: Di truyền học Năm đạt học vị: 2013 - Chức danh khoa học: Năm phong chức danh: - Tên quan công tác: Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh - Chức vụ: Giảng viên - Địa quan: 280 An Dương Vương, Quận 5, Tp HCM - Điện thoại quan: (08) 38352020 Fax: - Địa nhà riêng: 325/5/11 Lê Văn Quới, Bình Tân, Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại nhà riêng: - Điện thoại di động: 0962 720 643 - E-mail: dothanhtri1802@gmail.com Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: - Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ - Điện thoại: (08) 38 233 363 - (08) 38 230 780 Fax: - E-mail: vuonuomtst@gmail.com - Website: http://www.khoahoctre.com.vn/ - Địa chỉ: Số 1, Phạm Ngọc Thạch, P.Bến Nghé, Quận 1, TP.Hồ Chí Minh - Họ tên thủ trưởng tổ chức: - Số tài khoản: - Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 80 triệu đồng, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 80 triệu đồng + Kinh phí từ nguồn khác: đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 7/2017 40 9/2017 24 12/2017 16 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 8/2017 40 10/2017 24 12/2017 16 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi văn phịng phẩm, thơng tin liên lạc, in ấn Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 33,516 33,516 33,516 33,516 43,980 43,980 43,980 43,980 2,504 2,504 2,504 2,504 80 80 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: Số Số, thời gian ban Tên văn TT hành văn 30/6/2017 Hợp đồng thuê khoán 80 80 Ghi Nguồn khác Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực ThS Đỗ Thành Trí ThS Đỗ Thành Trí - Thu thập vật liệu thơng tin - Tham gia trực trực tiếp nội dung 1, 2, 3, đề tài - Phân tích số liệu, viết báo cáo ThS Tôn Nữ Thùy An ThS Tôn Nữ Thùy An Thư kí đề tài, tham gia nội dung 1, 2, đề tài CN Nguyễn Thành Công CN Nguyễn Thành Công Tham gia nội dung 3, đề tài Prof Dr Melkonian Prof Dr Melkonian Cố vấn, tham gia nội dung 1, 2, Số TT Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt -Thuyết minh chi tiết -Sản phẩm nội dung 1,2,3 -Báo cáo tổng kết -Thuyết minh chi tiết -Báo cáo tổng kết Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: Số TT Thời gian (Bắt đầu, kết thúc Các nội dung, công việc - tháng … năm) chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế Thực tế đạt hoạch Nội dung 1: Thiết kế, chế tạo mơ 6/2017 – Hồn thành hình thiết bị ni trồng vi tảo H 7/2017 pluvialis hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ theo phương ngang Nội dung 2: Tuyển chọn chủng vi 8/2017 – Hoàn thành tảo H pluvialis có suất tạo 9/2017 astaxanthin cao hệ thống nhỏ theo phương ngang Nội dung 3: Thiết kế, chế tạo, tối 9/2017 – ưu hóa hệ thống ni trồng vi tảo 12/2017 H pluvialis hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn (1m2 x 3) theo phương ngang để sản xuất sinh khối khô Người, quan thực ThS Đỗ Thành Tr ThS Tôn Nữ Thùy An í ThS Đỗ Thành Trí ThS Tơn Nữ Thùy An Hồn thành ThS Đỗ Thành Trí ThS Tôn Nữ Thùy An CN Nguyễn Thành Công III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a Dạng I: Mức chất lượng TT Tên sản phẩm cụ thể tiêu chất lượng chủ yếu sản phẩm Chủng vi tảo H pluvialis cho suất astaxanthin cao, có trình tự vùng ITS đăng kí GenBank Đơn vị đo Cần đạt Chủng Tốc độ sinh trưởng đạt 3-7 g sinh khối khơ/m2/ngày); tích lũy astaxanthin cao (đạt 1,5% - 2,5% sinh khối khơ) phịng thí nghiệm Mẫu tương tự (theo tiêu chuẩn nhất) Trong Thế giới nước Chưa có Chủng vi tảo H pluvialis sinh trưởng điều kiện ôn đới tốc độ sinh trưởng g sinh khối khơ/m2/ngày); tích lũy astaxanthin đạt 3% Số lượng/quy mô sản phẩm tạo chủng: H pluvialis CCAP 34/13 ni giữ sử dụng phịng thí nghiệm trường ĐH Nguyễn Thành Hệ thống quang Module sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ theo phương ngang nuôi vi tảo Hệ thống quang Module sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang nuôi vi tảo Hệ thống thiết bị (3 ngăn module; ngăn chứa hai lớp màng có kích thước 0,1 m x 0,5 m phù hợp cho việc chọn lựa chủng vi tảo tối ưu hóa quy trình ni Hệ thống thiết bị (hai lớp màng module, hai lớp màng có kích thước m x m) phù hợp quy mơ phịng thí nghiệm Chưa có Chưa có module giữ sử dụng phịng thí nghiệm trường ĐH Nguyễn Thành Chưa có Chưa có module với diện tích bề mặt lớp hai lớp màng 0,5 m2 giữ sử dụng phịng thí nghiệm trường ĐH Nguyễn Thành b Dạng II: TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Số lượng Bản vẽ thiết kế hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ theo phương ngang Đầy đủ thông số, đơn giản, dễ thực 01 Bản thiết kế hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang Đầy đủ thông số, đơn giản, dễ thực 01 Quy trình sản xuất sinh khối vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang Đầy đủ thông số, đơn giản, dễ thực 01 c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Chưa - Lý thay đổi (nếu có): Gia hạn sản phẩm báo đến tháng 03/2018 Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Tiến sĩ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 01 Ghi (Thời gian kết thúc) Góp 30% thực đề tài NCS Đỗ Thành Trí, trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp HCM 01 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Danh mục công nghệ Mức độ nắm vững, làm chủ Quy trình sản xuất sinh khối Đã làm chủ toàn quy vi tảo hệ thống quang trình từ thiết kế, lắp đặt, vận sinh học hai lớp màng quy hành, theo dõi thu hoạch mô lớn theo phương ngang So sánh với trình độ cơng nghệ giới Tương đương với công nghệ nuôi tảo cố định hệ thống Twin-layer Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I III Thời gian thực Nội dung Báo cáo tiến độ Lần Báo cáo nghiệm thu 27/10/2017 25/01/2018 Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Đảm bảo tiến độ Đạt Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) ĐỖ THÀNH TRÍ ĐỒN KIM THÀNH MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt 11 Danh mục bảng 12 Danh mục hình vẽ, đồ thị 13 MỞ ĐẦU 16 Mục tiêu nhiệm vụ 17 Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 18 1.1 Astaxanthin 18 1.2 Vi tảo Haematococcus pluvialis mơ hình ni vi tảo dạng dịch treo 18 1.3 Công nghệ nuôi vi tảo cố định hệ thống phản ứng quang sinh học hai lớp màng phương thẳng đứng 20 1.4 Sản xuất astaxanthin từ H pluvialis nuôi cố định hệ thống phản ứng quang sinh học hai lớp màng 22 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất astaxanthin vi tảo H pluvialis Việt Nam 23 1.6 Dự báo khả đề tài 23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị 25 2.2 Các phương pháp 25 2.2.1 Xác định hình thái, kích thước tế bào 25 2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25 2.2.3 Phương pháp giữ chủng 25 2.2.4 Phương pháp nhân nuôi sinh khối để chuyển lên hai lớp màng 25 2.2.5 Phương pháp nuôi hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ 25 2.2.6 Phương pháp nuôi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng qui mô lớn 25 2.2.7 Phương pháp thu nhận sinh khối khô 26 2.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng Astaxanthin sinh khối tảo 26 2.2.9 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 27 2.2.10 Phương pháp PCR 28 2.2.11 Giải trình tự hiệu chỉnh trình tự 28 2.2.12 Xử lý phân tích kết 29 2.2.13 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 30 2.2.14 Bố trí thí nghiệm phương pháp chuẩn tham khảo 30 2.2.15 Phân tích liệu 32 Chương KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 33 3.1 Nội dung 1: Thiết kế, chế tạo mơ hình thiết bị ni trồng vi tảo H pluvialis 33 3.1.1 Tính tốn thiết kế, chế tạo mơ hình thiết bị nuôi vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ theo phương ngang (hệ thống nhỏ) từ nguyên vật liệu có sẵn nước 33 3.1.2 Chọn lựa vật liệu twin-layer phù hợp với điều kiện Việt Nam 37 3.1.3 Quy trình vận hành hệ thống nhỏ để ni vi tảo 39 3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn chủng vi tảo H pluvialis có suất tạo astaxanthin cao hệ thống nhỏ theo phương ngang 41 3.2.1 Công việc 1: Thu thập kiểm tra chủng vi tảo H Pluvialis 41 3.2.2 Công việc 2: Lựa chọn chủng vi tảo H pluvialis phù hợp nuôi hệ thống nhỏ 45 3.2.3 Công việc 3: Tối ưu hóa q trình ni cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống nhỏ theo phương ngang 48 3.3 Nội dung 3: Thiết kế, chế tạo, tối ưu hóa hệ thống nuôi trồng vi tảo H pluvialis hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang để sản xuất sinh khối khô 54 3.3.1 Tính tốn thiết kế, chế tạo mơ hình thiết bị nuôi vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang (hệ thống lớn) từ nguyên vật liệu có sẵn nước 54 3.3.2 Tối ưu hóa q trình ni cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống lớn theo phương ngang 58 3.3.3 Kết sản xuất sinh khối khô vi tảo H pluvialis hệ thống lớn 68 Phần – KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 69 4.1 Kết luận 69 4.2 Kiến nghị 69 Tài liệu tham khảo 71 PHỤ LỤC 10 Hình 3.36 Chamber lớn có gắn quạt thơng gió khơng có ẩm đọng nắp (a) tượng đọng ẩm nắp khơng có quạt thơng gió (b) 3.3.1.6 Chọn lựa vật liệu hai lớp màng cho hệ thống lớn phù hợp với điều kiện Việt Nam Các loại vật liệu sau chọn để sử dụng cho hệ thống lớn tương tự hệ thống nhỏ: - Lớp nguồn: sử dụng sợi thủy tinh không dệt - Lớp chất nền: Giấy kraft 3.3.2 Tối ưu hóa q trình ni cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống lớn theo phương ngang Các yếu tố cần tối ưu nuôi hệ thống lớn theo phương ngang tương tự hệ thống nhỏ, dựa kết khảo sát hệ thống nhỏ Các yếu tố cần tối ưu nuôi hệ thống nhỏ theo phương ngang gồm: - Xác định mật độ giống vi tảo ban đầu cố định lên lớp màng chất (tính số gram sinh khối khô.m-2) - Phương thức bổ sung CO2: phương thức cung cấp khí khác cho vi tảo quang hợp khảo sát: (1) sục khí CO2 vào dung dịch môi trường dinh dưỡng; (2) sục khơng khí vào mơi trường dinh dưỡng; (3) sục khí CO2 lên bề mặt màng ni; (4) sục khơng khí lên bề mặt màng ni; (5) kết hợp sục khí CO2 vào môi trường lên bề mặt màng nuôi; (6) kết hợp sục khơng khí vào mơi trường lên bề mặt màng ni - Cường độ sáng: tính tốn vị trí lắp đặt đèn natri cho cường độ ánh sáng vùng nuôi điểm nhỏ 200 μmol photon.m− 2.s− cao 1015 μmol photon.m− 2.s− đèn LED Các hệ thống đèn sử dụng cho thí nghiệm: + Đèn 400W x + Đèn 400W x + Đèn 250W x + Đèn 250W x 58 *Tiêu chuẩn so sánh, đánh giá: - Khả tăng sinh khối khơ sau 10 ngày ni - Khả tích lũy astaxanthin sinh khối khô sau 10 ngày nuôi 3.3.2.1 Kết khảo sát ảnh hưởng mật độ giống ban đầu đến tăng sinh vi tảo hệ thống lớn - Trong thí nghiệm này, bốn mật độ giống ban đầu khảo sát: g.m-2; 7,5 g.m-2; 10 g.m-2 12,5 g.m-2 - Chế độ chiếu sáng: đèn natri cao áp 400W đảm bảo cường độ ánh sáng vị trí cố định tảo 200 μmol photon.m−2.s−1 sục CO2 vào môi trường nuôi để đảm bảo pH môi trường nằm khoảng 6,5 – 7,5 Hình 3.37 Tảo hệ thống lớn với mật độ khác ngày ngày 10: a1 a10: g/m2; b1 b10: 7,5 g/m2; c1 c10: 10 g/m2; d1 d10: 12,5 g/m2 Lớp tế bào mật độ 5g/m2 ban đầu mỏng sau 10 ngày nuôi lớp dày lên trơng thấy phủ hết tồn lớp giấy nền, màu sắc chuyển pha đỏ rõ rệt Ở mật độ 7,5g lớp tế bào tăng sinh dày lên màu đỏ tươi hơn, rìa mép cịn màu xanh chưa chuyển pha hoàn toàn 59 Kết quan sát kính hiển vi cho thấy với mật độ ban đầu 5g/m2 7,5g/m2 tế bào đỏ chiếm ưu (Hình 3.38) Hình 3.38 Hình thái tế bào tảo H pluvialis ngày thứ 10 (10x): a 5g/m2 ; b 7,5g/m2; c 10 g/m2; d 12,5 g/m2 Kết đo lượng sinh khối khô vi tảo sau 10 ngày ni cho thấy mật độ tảo có tăng sinh khối Mật độ ban đầu cao suất sinh khối ban đầu tăng nghiệm thức 5g/m2 cho tăng suất thấp (2,288 g/ngày/m2) có khác mặt thống kê so với nghiệm thức lại (lần lượt 3,184, 3,345 3,034 g/ngày/m2) Năng suất sinh khối ngày nghiệm thức cịn lại khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (Phụ lục 9) Điều cho thấy tỷ lệ dày cản trở hấp thu mặt dinh dưỡng, trao đổi khí, tiếp nhận ánh sáng cho q trình quang hợp hệ thống quang sinh học hai lớp màng dẫn đến khả tăng sinh khối thấp nên khơng có khác biệt mật độ giống ban đầu 7,5, 10 12,5 g/m2 Tuy nhiên, với mật độ ban đầu g/m2 lại mỏng nên chiếu sáng với cường độ cao, lớp tế bào mỏng nên đa phần bị chuyển pha đỏ dẫn đến khả tăng sinh khối thấp Với nghiệm thức cịn lại, lớp tế bào phía sau bị chuyển pha khả tăng sinh lớp tế bào bên có khả tăng sinh đảm bảo cho tăng sinh khối tảo đạt g/ngày/m2, tăng so với nghiệm thức ni hệ thống nhỏ cịn thấp nhiều Hình 3.39 Biểu đồ thể gia tăng sinh khối khô mật độ tảo ban đầu khác sau nuôi hệ thống lớn 60 Hình 3.40 Biểu đồ thể tỉ lệ astaxanthin sinh khối khô mật độ tảo ban đầu khác sau nuôi hệ thống lớn Kết tách chiết đo hàm lượng astaxanthin sinh khối khô cho thấy tỉ lệ astaxanthin tảo cịn thấp khơng có khác nhiều nghiệm thức Tuy nhiên, kết bước đầu chưa tối ưu điều kiện lại để tăng tỉ lệ astaxanthin Trong nghiệm thức, với lượng mẫu ban đầu 5g/m2 cho tỉ lệ astaxanthin cao (0,864%), sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (Phụ lục 9) so với nghiệm thức lại (lần lượt 0,753%, 0,703% 0,667%), phù hợp với kết quan sát tổng thể màu sắc tảo tỉ lệ tế bào tảo chuyển pha đỏ quan sát kính hiển vi Tỉ lệ astaxanthin sinh khối tảo khô nghiệm thức cịn lại khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (Phụ lục 9) Tuy nhiên, so sánh tổng lượng astaxanthin thu nghiệm thức g/m2 7,5 g/m2 lượng astaxanthin thu từ nghiệm thức 5g/m2 0,241 g/m2 nhỏ so với 0,296 g/m2 nghiệm thức mật độ ban đầu 7,5 g/m2 Như vậy, kết tính lượng sinh khối khơ, tỉ lệ astaxanthin tổng lượng astaxanthin thu từ nghiệm thức cho thấy mật độ tảo ban đầu để thu tổng lượng astaxanthin cao từ lượng tảo xanh ban đầu mật độ 7,5 g/m2 Mật độ sử dụng cho nghiệm thức 3.3.2.2 Ảnh hưởng phương thức bổ sung CO2 q trình ni Trong thí nghiệm này, ánh sáng cung cấp đèn 400W để đảm bảo cường độ ánh sáng 200 µmol photon.m-2.s-1, chu kỳ sáng tối 14:10 61 Hình 3.41 Các phương thức bổ sung CO2 hệ thống lớn: (A) Phun khí bổ sung CO2 1% lên bề mặt; (B) Phun khơng khí lên bề mặt; (C) Sục khí bổ sung CO2 1% mơi trường ni + phun khơng khí lên bề mặt Kết đo lượng sinh khối thu sau 10 ngày nuôi cấy cho thấy suất sinh khối khô thu cao nghiệm thức sục khí bổ sung CO2 mơi trường ni kết hợp với phun khơng khí lên bề mặt (Hình 3.41) Kết phù hợp với kết nghiên cứu tương tự hệ thống nhỏ Trong phương thức bổ sung CO2, phương thức bổ sung CO2 dạng hòa tan môi trường cách sục trực tiếp giúp trì pH mơi trường khơng tăng lên q kiềm, đạt mức 6,5 – 7,5 tốt cho tăng sinh tế bào tảo Việc bổ sung CO2 lên bề mặt cho thấy có ảnh hưởng đến tăng sinh khối khô vi tảo hiệu không cao lượng CO2 bị thất lớn, có lớp bề mặt tiếp xúc với khơng khí bổ sung CO2 lớp tảo bề mặt lớp sớm bị chuyển pha đỏ nên việc cung cấp CO2 cho lớp không cần thiết Khi sục CO2 dạng hịa tan mơi trường, CO2 theo dịng mơi trường phân bổ cho tế bào từ phía lên đảm bảo tế bào lớp lẫn tiếp nhận nguồn CO2, đặc biệt cần thiết cho lớp tăng sinh lớp tế bào bề mặt chuyển pha, tổng hợp astaxanthin 62 Hình 3.42 Biểu đồ suất sinh khối khô H pluvialis bổ sung CO2 theo phương thức khác Hình 3.43 Biểu đồ thể tỉ lệ astaxanthin sinh khối khô phương thức bổ sung CO2 hệ thống lớn (LayerCO2: Phun khí bổ sung CO2 1% lên bề mặt; Layerair: Phun khơng khí lên bề mặt; MedCO2: Sục khí bổ sung CO2 1% mơi trường ni + phun khơng khí lên bề mặt) Kết phân tích hàm lượng astaxanthin sinh khối khô vi tảo cho thấy phương thức bổ sung CO2 vào môi trường dinh dưỡng kết hợp với phun khơng khí lên bề mặt cho tỉ lệ cao (0,843%) so với hai phương thức cịn lại, sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05, Phụ lục 10) Như vậy, phương thức bổ sung CO2 vào môi trường dinh dưỡng kết hợp với phun khơng khí lên bề mặt lớp vi tảo phương thức tối ưu để đảm bảo việc cung cấp CO2 cho vi tảo H Pluvialis nuôi tự dưỡng với cường độ ánh sáng cao hệ thống lớn theo phương nghiêng 3.3.2.3 Kết khảo sát ảnh hưởng hệ thống chiếu sáng lên tăng sinh tích lũy astaxanthin vi tảo hệ thống lớn 3.3.2.3.1 Hệ thống đèn natri cao áp 400W 63 Trong thí nghiệm hai hệ thống chiếu sáng thử nghiệm để so sánh hiệu giúp tăng sinh khối tảo tích lũy astaxanthin: - Hệ thống 1: đèn 400W - Hệ thống 2: đèn 400W Hình 3.44 Hệ thống lớn với hệ thống chiếu sáng: A đèn Na 400W; B đèn Na 400W Các đèn Natri công suất 400W cho cường độ ánh sáng cao đặt độ cao đảm bảo cường độ chiếu sáng chiếu lên bề mặt màng tảo nằm khoảng 200 – 1015 µmol photon.m-2.s-1 Tuy nhiên, với thời gian chiếu sáng mạnh liên tục 14 giờ, số vị trí có tượng tảo bị “photo-bleaching” (tế bào chết ánh sáng cao) (Hình 3.44) Hình 3.45 Hiện tượng photo-bleaching vị trí ánh sáng cao ngày thứ 64 Hình 3.45 Kết suất sinh khối khô vi tảo thử nghiệm hai hệ thống chiếu sáng Kết tăng sinh khối khô cho thấy lượng sinh khối khô thu từ hệ thống chiếu sáng đèn 400W cho suất cao Ánh sáng từ đèn 400W chưa đủ cho tăng sinh tảo Hình 3.46 Biểu đồ thể tỉ lệ astaxanthin sinh khối khô thử nghiệm hai hệ thống chiếu sáng đèn 400W đèn 400W Kết phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ astaxanthin nghiệm thức chiếu sáng đèn 400W cao so với chiếu sáng đèn Na 400W, sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (Phụ lục 11) Như vậy, hệ thống chiếu đèn Na 400W đảm bảo cung cấp ánh sáng cho tảo sinh trưởng chuyển pha đỏ, tích lũy astaxanthin hiệu Tuy nhiên, hệ thống cần có biện pháp để khắc phục tượng tế bào chết ánh sáng vượt ngưỡng để đảm bảo tăng sinh khối tốt 3.3.2.3.2 Hệ thống đèn natri cao áp 400W x2 có biện pháp chắn bớt ánh sáng vượt ngưỡng Hệ thống chiếu đèn Na 400W đảm bảo cung cấp đủ ánh sáng cho tảo sinh trưởng chuyển pha đỏ, nhiên, số vị trí có cường độ ánh sáng cao vượt ngưỡng 65 (thường vị trí dây tóc bóng đèn chiếu xuống) làm cho tảo bị chết làm giảm suất Do đó, thí nghiệm sử dụng cản sáng (giấy nhôm) cản nhiệt để đảm bảo cường độ ánh sáng không bị vượt ngưỡng, đảm bảo tăng sinh khối tốt Kết quan sát bề mặt tảo sau 10 ngày ni thể Hình 3.45 kết tăng sinh khối tỉ lệ astaxanthin thể Bảng 3.12 Quan sát lớp tảo cho nhận thấy tăng sinh khối khơ Sự chuyển pha đỏ ngày thứ 3, đến ngày thứ lớp bề mặt có màu đỏ đậm Trên bề mặt tảo khơng cịn có tượng photobleaching gây chết tảo thí nghiệm trước chưa chắn bớt ánh sáng số vị trí Kết tăng sinh khối khơ hàm lượng astaxanthin cho thấy hàm lượng astaxanthin đạt mức cao 1,1 – 1,75% sinh khối khơ Hình 3.47 Bề mặt tảo sau 10 ngày nuôi với hệ thống đèn 400W x Bảng 3.6 Tóm tắt kết ni vi tảo hệ thống đèn 400W x Sinh khối Sinh khối Năng suất Tỉ lệ % tươi (g) khô (g) (g/ngày/m ) astaxanthin Lần 58,225 13,13 5,33 1,1 Lần 48,284 10,67 6,08 1,75 3.3.2.4.3 So sánh hệ thống đèn natri cao áp 250W x 250W x với 400W x2 để chiếu sáng Trong thí nghiệm này, nhằm đánh giá, so sánh hiệu tăng sinh khối khơ, khả tích lũy astaxanthin sử dụng đèn cao áp hướng tới việc tiết kiệm điện năng, giảm chi phí sản xuất astaxanthin chúng tơi tiến hành thí nghiệm so sáng hệ thống chiếu sáng: (1) Hệ thống đèn natri cao áp 250W x 2, (2) Hệ thống 250W x (3) hệ thống 400W x Cường độ ánh sáng đo nghiệm thức phải tối thiểu đạt mức 200 µmol photon.m-2.s-1 Kết quan sát bề mặt tảo qua ngày nuôi cho thấy chuyển pha, màu sắc bề mặt tảo chuyển đỏ quan sát thấy sớm nghiệm thức chiếu đèn 400W x vào ngày thứ 3, nghiệm thức lại thay đổi màu sắc bề mặt tảo quan sát rõ từ ngày thứ Đến ngày thứ 10, màu sắc bề mặt tảo đỏ tươi, khơng có sai khác nghiệm thức (Hình 3.46) Tuy nhiên, độ dày lớp tảo nhìn thấy 66 khác biệt rõ rệt nghiệm thức chiếu đèn 400W, lớp tảo dày hẳn so với nghiệm thức cịn lại Hình 3.48 Bề mặt tảo ba nghiệm thức chiếu sáng hệ thống đèn a) đèn 250W; b) đèn 250 W c) đèn 400W Hình 3.49 Kết suất sinh khối tảo hệ thống chiếu sáng khác hệ thống lớn Kết cho thấy tăng sinh khối khô đạt cao nghiệm thức chiếu sáng đèn 400W (đạt 5,29 g/ngày/m2), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hai nghiệm thức lại (lần lượt đạt 2,83 3,21 g/ngày/m2) (p < 0,05) Hai hệ thống chiếu sáng đèn sai khác sinh suất khối ngày khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (Phụ lục 12) 67 Hình 3.50 Kết kiểm tra tỉ lệ astaxanthin sinh khối khô vi tảo hệ thống chiếu sáng khác hệ thống lớn Kết phân tích hàm lượng astaxanthin sinh khối khơ vi tảo cho thấy tỉ lệ đạt cao nghiệm thức đèn 400W (đạt 1,39%) khác có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đèn 250W (đạt 0,86%) (p 0,05) (Phụ lục 12) Kết lần khẳng định hệ thống chiếu sáng đèn 400W cho kết tăng sinh tế bào đạt tỉ lệ astaxanthin tốt 3.3.3 Kết sản xuất sinh khối khô vi tảo H pluvialis hệ thống lớn Sinh khối khô vi tảo H pluvialis sản xuất hệ thống lớn với điều kiện: + Đảm bảo nhiệt độ, độ ẩm phù hợp hệ thống làm mát, hút ẩm để đảm bảo sinh trưởng vi tảo + Mật độ tảo ban đầu: 7,5 g sinh khối khơ/m2 + Phương thức bổ sung CO2: sục khí bổ sung CO2 vào môi trường nuôi kết hợp phun khơng khí lên bề mặt + Hệ thống chiếu sáng: Hệ thống đèn natri cao áp 400W + Môi trường nuôi cấy: môi trường BG-11 thay ngày, lần thay 10 L môi trường - Nuôi cấy vi tảo hệ thống lớn với quy trình điều kiện cho thấy kết tăng sinh khối đạt tối đa 6,08 g/ngày/m2 với tỉ lệ astaxanthin đạt mức 1,75% lượng sinh khối khô tế bào 68 Phần – KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tính tốn thiết kế, chế tạo thành công hệ thống thiết bị nuôi vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô nhỏ theo phương ngang (hệ thống nhỏ) từ nguyên vật liệu có sẵn nước Tiến hành tuyển chọn khả tăng trưởng sinh astaxanthin từ chủng tảo CCAC 0125, CCAP 34/13, NIES 144 HB cho thấy chủng sinh trưởng cao khả tích lũy astaxanthin gặp điều kiện bất lợi tương đối lớn Kết cho thấy chủng CCAP 34/13 cho khả tích lũy astaxanthin cao đảm bảo cho trình sản xuất thu nhận astaxanthin qui mơ lớn Tối ưu hóa q trình ni cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống nhỏ theo phương ngang, xác định số điều kiện nuôi hệ thống nhỏ: bổ sung CO2 1,0% vào môi trường dinh dưỡng cường độ chiếu sáng 470 – 790 µmol photon m-2 s-1 phù hợp để đạt mức tăng sinh khối khô 4,92 g/ngày/m2 với tỉ lệ astaxanthin chiếm 1,53% sinh khối khơ - Tính tốn thiết kế, chế tạo thành công hệ thống thiết bị nuôi vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng quy mô lớn theo phương ngang (hệ thống lớn) từ nguyên vật liệu có sẵn nước - Tối ưu hóa quy trình ni cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống lớn theo phương ngang: + Đảm bảo nhiệt độ, độ ẩm phù hợp hệ thống làm mát, hút ẩm để đảm bảo sinh trưởng vi tảo + Mật độ tảo ban đầu phù hợp 7,5 g sinh khối khô/m2 + Phương thức bổ sung CO2 cho vi tảo phù hợp: sục khí bổ sung CO2 vào mơi trường ni kết hợp phun khơng khí lên bề mặt + Hệ thống chiếu sáng hệ thống lớn cho kết tăng sinh khối hàm lượng astaxanthin cao nhất: Hệ thống đèn natri cao áp 400W - Xây dựng quy trình cấy chủng H pluvialis có suất cao chọn hệ thống lớn theo phương ngang - Nuôi cấy vi tảo hệ thống lớn với quy trình điều kiện cho thấy kết tăng sinh khối đạt tối đa 6,08 g/ngày/m2 với tỉ lệ astaxanthin đạt mức 1,75% lượng sinh khối khơ tế bào 4.2 Kiến nghị Hồn thiện quy trình ni Haematococcus pluvialis hệ thống màng đơi Twin – layer Tối ưu hóa điều kiện khảo sát, bổ sung thêm điều kiện khác để tăng tốc độ sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin Hạn chế kiểm sốt nhân tố tạp nhiễm 69 Cần tiến hành khảo sát kiểm tra astaxanthin phương pháp HPLC kết độ tinh cậy cao Kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm sinh khối khô tảo thu sau nuôi cấy chất lượng astaxanthin 70 Tài liệu tham khảo Ngơ Thị Hồi Thu, Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Thị Minh Hiền, Hoàng Thị Lan Anh, ThS Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đinh Thị Ngọc Mai, Bùi Đình Lãm, Vũ Văn Cảnh, 2012 Nghiên cứu cơng nghệ nuôi vi tảo Haematococcus Pluvialis công nghệ chiết xuất Astaxanthin, Cấp Nhà nước thuộc đề án phát triển CNSH thủy sản Bộ NN PTNT quản lý Tống Kim Thuần, 2008 Nghiên cứu sản xuất sử dụng nấm men biển Phaffia rhodozyma chứa astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho nuôi trồng thủy sản Viện Công nghệ sinh học, 73 tr Baker, B.R., Saling, P., 2003 Comparing natural with chemical additive production Feed Mix 11, 12–14 BCC Research, 2015 Boom in Astaxanthin Supplements Boosting Global Carotenoid Market [WWW Document] URL http://www.bccresearch.com/market research/food-and-beverage/carotenoidsglobal-market-report-fod025e.html (accessed 1.5.2017) Chien, Y.H., Jeng, S.C., 1992 Pigmentation of kuruma prawn, Penaeus japonicus Bate, by various pigment sources and levels and feeding regimes Aquaculture 102, 333–346 doi:10.1016/0044-8486(92)90186-O Christiansen, R., Lie, O., Torrissen, O.J., 1994 Effect of astaxanthin and vitamin A on growth and survival during first feeding of Atlantic salmon, Salmo salar L Aquacult Fish Manag 25, 903–914 Domínguez-Bocanegra, a R., Ponce-Noyola, T., Torres-Moz, J a., 2007 Astaxanthin production by Phaffia rhodozyma and Haematococcus pluvialis: A comparative study Appl Microbiol Biotechnol 75, 783–791 doi:10.1007/s00253-007-0889-9 Industry Experts, 2015 Global Astaxanthin Market – Sources , Technologies and Applications [WWW Document] URL http://industry experts.com/verticals/files/articles/ph009-global-astaxanthin-market-sources technologies-and-applications.pdf (accessed 1.5.2017) Kiperstok, A.C., Sebestyén, P., Podola, B., Melkonian, M (2017): Biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis enables a highly productive one-phase process for astaxanthin production using high light intensities Algal Research 21: 213-222 doi.org/10.1016/j.algal.2016.10.025 10 Kumi Tominaga, Nobuko Hongo, Mariko Karato, Eiji Yamashita Cosmetic benefits of astaxanthin on humans subjects Acta Biochim Pol 2012; 59(1): 43– 47 11 Lorenz, R.T., Cysewski, G.R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin Trends Biotechnol 18, 60–167 doi:10.1016/S0167-7799(00)01433-5 71 12 Naumann, T., Cebi, Z., Podola, B., Melkonian, M (2013): Growing microalgae as aquaculture feeds on twin-layers: a novel solid-state photobioreactor Journal of Applied Phycology 25: 1413-1420 13 Tsubokura, A., Yoneda, H., Mizuta, H., 1999 Paracoccus carotinifaciens sp nov., a new aerobic Gram-negative astaxanthin-producing bacteriurn Int J Syst Bacteriol 49, 277–282 14 Wan, M., Hou, D., Li, Y., Fan, J., Huang, J., Liang, S., Wang, W., Pan, R., Wang, J., Li, S., 2014 The effective photoinduction of Haematococcus pluvialis for accumulating astaxanthin with attached cultivation Bioresour Technol 163, 26– 32 doi:10.1016/j.biortech.2014.04.017 15 Wang, B., Zarka, A., Trebst, A., Boussiba, S., 2003 Astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis (Chloropyceae) as an active photoprotective process under high irradiance J Phycol 39, 1116–1124 doi:10.1111/j.00223646.2003.03-043.x 16 Yin, S., Wang, J., Chen, L., Liu, T., 2015 The water footprint of biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis is greatly decreased by using sealed narrow chambers combined with slow aeration rate Biotechnol Lett 37, 1819– 1827 doi:10.1007/s10529-015-1864-7 17 Zhang, D., Wan, M., del Rio-Chanona, E.A., Huang, J., Wang, W., Li, Y., Vassiliadis, V.S., 2016 Dynamic modelling of Haematococcus pluvialis photoinduction for astaxanthin production in both attached and suspended photobioreactors Algal Res 13, 69–78 doi:10.1016/j.algal.2015.11.019 18 Zhang, W., Wang, J., Wang, J., Liu, T., 2014 Attached cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production Bioresour Technol 158, 329–335 doi:10.1016/j.biortech.2014.02.044 72