Thành lập bộ sưu tập giống vi sinh vật phục vụ sản xuất nông nghiệp

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU THÀNH LẬP BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI SINH VẬT PHỤC VỤ SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP Mã số: VS03/13 – 15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Mai Châm Cán thực hiện: TS Phạm Nguyễn Đức Hoàng KS Ngô Thùy Trâm TS Phan Mỹ Hạnh KS Nguyễn Thị Ánh Nguyệt ThS Lê Thị Mai Châm KS Nguyễn Thị Thùy Dương ThS Nguyễn Xuân Đồng KS Trần Thùy Trang ThS Nguyễn Tấn Đức CN Vũ Thùy Dương ThS Đặng Hoàng Quyên CN Trần Chí Hiếu KS Lê Thị Thùy Nhi TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH BẢNG .iv DANH SÁCH HÌNH vi TÓM TẮT viii II ĐẶT VẤN ĐỀ 2.1 Tính cấp thiết đề tài .4 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 2.3 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn .5 III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Tình hình lưu giữ ng̀n vi sinh vật Tt CNSH TP HCM 3.2 Tổng quan cách thiết lập máy nhân mơ hình hoạt động các Ngân hàng giống nước quốc tế .7 3.3 Tổng quan các phương pháp bảo quản vi sinh vật thông dụng các Ngân hàng giống nước quốc tế .8 3.4 Tổng quan xây dựng sở liệu Bộ sưu tập giống vi sinh vật 13 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 4.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .15 4.2 Nội dung nghiên cứu 18 4.3 Phương pháp nghiên cứu 18 4.3.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật chủng phịng Cơng nghệ Vi sinh 18 4.3.2 Tham khảo ý kiến từ các chuyên gia nước để xây dựng máy quản lý giớng, quy trình bảo quản giớng .22 4.3.3 Xây dựng quy trình bảo quản tới ưu cho các chủng vi sinh vật sàng lọc 22 4.3.4 Xây dựng vận hành sở liệu giống vi sinh vật 22 4.3.4.1 Thiết kế biểu mẫu 23 4.3.5 Bước đầu xây dựng vận hành cấu trúc máy quản lý giống .31 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 5.1 Kết sàng lọc các chủng vi sinh vật chủng phịng Cơng nghệ Vi sinh 36 5.1.1 Kết sàng lọc chủng vi nấm 36 Bộ chủng Trichoderma spp 36 Bộ chủng Purpureocillium spp 44 Bộ chủng nấm ký sinh côn trùng Metarhizium spp Beauveria spp 53 Nấm Phanerochaete chrysosporium .57 Bộ chủng nấm gây bệnh thực vật 58 5.1.2 Kết sàng lọc chủng vi khuẩn 61 Bộ chủng Bacillus spp .61 Bộ chủng vi khuẩn phân giải lân cố định đạm 70 Bộ chủng Komagataeibacter nataicola 73 Bộ chủng Lactobacillus spp .79 5.2 Kết tham khảo ý kiến từ các chuyên gia nước để xây dựng máy quản lý giớng, quy trình bảo quản giớng phần mềm lưu giữ sở liệu giống82 i 5.2.1 Phương pháp bảo quản vi sinh vật 82 5.2.2 Xây dựng hệ thống quản lý sưu tập giống vi sinh vật 83 Phương pháp kết xây dựng quy trình bảo quản cho các chủng vi sinh vật sàng lọc .83 5.3.1 Phương pháp bảo quản vi sinh vật 83 5.3.2 Kết xây dựng quy trình bảo quản các chủng vi sinh vật 85 5.4 Kết xây dựng sở liệu giống vi sinh vật 91 5.4.1 Thiết lập quy trình lưu trữ chủng giống vi sinh vật chung 91 5.4.2 Xây dựng và vận hành sở liệu vi sinh vật .95 5.5 Kết bước đầu xây dựng cấu trúc vận hành máy quản lý Bộ sưu tập giống vi sinh vật 103 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106 6.1 Kết luận 106 6.2 Đề nghị .107 6.2.1 Đề xuất mơ hình vận hành mơ hình máy quản lý giớng năm 2016 107 6.2.2 Đề xuất tiêu chí tiếp nhận giống vi sinh vật năm 2016 109 6.2.3 Đề xuất tiêu chí xuất giống vi sinh vật năm 2016 109 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC CBS DSMZ NBRC NCTC UK CBS BC PCR DNA ITS NCBI MS GPS BLAST GB DRBC TSM CMC CFU WA PDA CSDL Tt CNSH TP HCM VSV American Type Culture Collection Center vor Braunsveitzer Deutsche Sammlung von Mikroorgnaismen und Zellkulturen National Board for Respiratory Car National Collection of Type Cultures United of Kingdom Center vor Braunsveitzer Biotechnological Center Polymerase Chain Reaction Deoxyribonucleic Internal Transcribed Spacer National Center for Biotechnology Information Microsoft Global Positioning System Basic Local Alignment Search Tool Gigabyte Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Trichoderma Selected Medium Caboxy Methyl Cellulose Colony Forming Unit Water Agar Potato Dextrose Agar Cơ sở liệu Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Vi sinh vật iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Tiêu chí lựa chọn phần mềm xây dựng CSDL 13 Bảng 2: Thành phần môi trường DRBC 15 Bảng 3: Thành phần môi trường thử hoạt tính protease, chitinase lipase 16 Bảng 4: Thành phần môi trường Water Agar 16 Bảng 5: Thành phần môi trường PDA 16 Bảng 6: Thành phần môi trường CDA 16 Bảng 7: Thành phần môi trường TSA 17 Bảng 8: Thành phần môi trường Pikovskayas Agar .17 Bảng 9: Thành phần môi trường MYA 17 Bảng 10: Thành phần môi trường GY 17 Bảng 11: Thành phần môi trường Nitrogen Free Agar 17 Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 13: Biểu mẫu thông tin vi sinh vật .24 Bảng 14: Diễn giải quy trình thực hiện, phạm vi áp dụng các phương pháp bảo quản vi sinh vật 27 Bảng 15: Danh sách số lượng chủng vi sinh vật sàng lọc 36 Bảng 16: Khả phân hủy số chất hữu các chủng Trichoderma spp điều kiện phòng thí nghiệm 37 Bảng 17: Khả đối kháng với số chủng nấm gây bệnh thực vật các chủng Trichoderma spp sàng lọc 38 Bảng 18: Hình ảnh đại thể vi thể 20 chủng Trichoderma spp chọn 39 Bảng 19: Hoạt tính enzyme ngoại bào khả ký sinh tuyến trùng các chủng P lilacinum chọn 46 Bảng 20: Hình thái khuẩn lạc hình thái vi thể 22 chủng nấm P lilacinum chọn .47 Bảng 21: Hiệu lực diệt trùng phịng thí nghiệm các chủng nấm Metarhizium spp Beauveria spp 54 Bảng 22: Hình thái khuẩn lạc hình thái vi thể các chủng nấm Metarhizium spp Beauveria spp 55 Bảng 23: Hình thái khuẩn lạc hình thái vi thể các chủng nấm Phanerochaete chrysosporium .58 Bảng 24: Hình thái khuẩn lạc hình thái vi thể các chủng nấm gây bệnh thực vật .59 Bảng 25: Khả phân giải lân các chủng Bacillus spp tuyển chọn 61 Bảng 26: Hình thái vi thể khuẩn lạc các chủng Bacillus spp sàng lọc 62 Bảng 27: Khả phân giải lân cố định đạm các chủng vi khuẩn sàng lọc 71 Bảng 28: Hình thái vi thể khuẩn lạc các chủng vi khuẩn Nguyenibacter vanlangesis 72 Bảng 29: Hình thái vi thể khuẩn lạc các chủng Komagataeibacter spp sàng lọc 76 Bảng 30: Khả kháng số chất kháng sinh các chủng Lactobacillus spp 80 Bảng 31: Khả ức chế vi khuẩn đường ruột, kháng coliform phân sớng mơi trường có pH thấp các chủng Lactobacillus spp .80 iv Bảng 32: Hình thái vi thể khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp 81 Bảng 33: Hoạt tính enzyme khả gây bệnh các chủng vi nấm trước bảo quản .86 Bảng 34: Thời gian theo dõi tỉ lệ sớng sót hoạt tính sinh học vi nấm theo phương pháp bảo quản giấy lọc tiệt trùng 87 Bảng 35: Thời gian theo dõi tỉ lệ sớng sót hoạt tính sinh học vi nấm theo phương pháp bảo quản hạt silica gel 87 Bảng 36: Thời gian theo dõi tỉ lệ sớng sót hoạt tính sinh học vi nấm theo phương pháp bảo quản dầu khoáng .88 Bảng 37: Thời gian theo dõi thử nghiệm bảo quản các chủng vi khuẩn các phương pháp khác 89 Bảng 38: Khả tạo màng chủng Komagataeibacter nataicola (BC-B0007) tương ứng với các nghiệm thức bảo quản khác 89 Bảng 39: Quy trình thực hiện, phạm vi áp dụng thời hạn bảo quản các phương pháp bảo quản vi sinh vật 91 v DANH SÁCH HÌNH Hình 1:Cơ cấu tổ chức DSMZ Hình 3: Các bước thực để xây dựng vận hành sở liệu vi sinh vật .23 Hình 4: Sơ đờ bớ trí các tủ lạnh lưu trữ chủng giống sưu tập 28 Hình 5: Các giai đoạn xây dựng sở liệu 29 Hình 6: Danh mục các chủng vi sinh vật chia theo nhóm phụ trách .30 Hình 7: Cơ cấu máy nhân Bộ sưu tập giống 33 Hình 8: Mơ hình hoạt động Bộ sưu tập giống 34 Hình 9: Cây phát sinh lồi các chủng Trichoderma spp sàng lọc 39 Hình 10: Cây phát sinh loài các chủng Purpureocillium spp chọn 46 Hình 11: Cây phát sinh lồi các chủng nấm xanh, nấm trắng .54 Hình 12: Cây phát sinh lồi chủng BC-F0074 58 Hình 13: Cây phát sinh loài chủng BC-F0043 BC-F0042 59 Hình 14: Cây phát sinh lồi sử dụng trình tự các chủng với mã sớ BC-B0063, BCB0064, BC-B0066, BC-B0067 71 Hình 15: Cây phát sinh lồi sử dụng trình tự chủng Komagataeibacter nataicola với mã số từ BC-B0001 đến BC-B0015 chủng Nguyenibacter vanlangesis mã số BC-B0021 đến BC-B0026 75 Hình 16: Khả phân hủy CMC chủng BC-F0002 (A), phân hủy chitin chủng BC-F0014 khả gây bệnh trái ớt chủng BC-F0070 (C) .86 Hình 17: Các giai đoạn bảo quản vi nấm giấy lọc tiệt trùng 87 Hình 18: Các giai đoạn bảo quản vi nấm hạt silica gel tiệt trùng .87 Hình 19: Bảo quản vi nấm dầu khoáng 88 Hình 20: Vịng phân giải cellulose chủng BC-B0017 môi trường CMC (A) khả cố định đạm chủng BC-B0066 môi trường NFA (B) 89 Hình 21: Các cơng đoạn quá trình bảo quản vi khuẩn phương pháp lạnh sâu -800C 90 Hình 22: Bảo quản chủng vi khuẩn Bacillus sp dầu khoáng 90 Hình 23: Bảo quản chủng Streptomyces sp phương pháp giữ hạt silica gel (A) giấy lọc (B) 91 Hình 24: Danh mục các chủng vi sinh vật đăng ký theo nhóm phụ trách .94 Hình 25: Nhãn chèn mã QR code giúp truy cập nhanh lý lịch chủng .94 Hình 26: Chức chia sẻ quyền quản trị liệu 95 Hình 27: Biểu mẫu nhập liệu trực tuyến chủng BC-F0001 .96 Hình 28: Dữ liệu lưu trữ theo thư mục ứng với mã sớ chủng vi sinh vật .97 Hình 29: Thông tin cập nhật thư mục BC-B0001 97 Hình 30: Mới quan hệ các bảng quan hệ CSDL Access 98 Hình 31: Biểu mẫu nhập liệu thiết kế linh hoạt theo kích cỡ hình máy tính 99 Hình 32: Biểu mẫu nhập liệu thiết kế linh hoạt theo kích cỡ hình máy tính 99 Hình 33: Dữ liệu từ Google Drive lưu trữ theo ổ cứng máy tính phục vụ cho CSDL Access truy xuất thông tin ngoại tuyến 100 Hình 34: Giao diện quản trị website bao gờm các tính quản lý viết, đếm lượt truy cập, phân quyền quản lý cho cộng tác viên 100 vi Hình 35: Giao diện website thiết kế theo định hướng tra cứu theo từ khóa .101 Hình 36: Chức tìm kiếm nâng cao theo ứng dụng theo thời gian đăng 101 Hình 37: Giao diện trình bày thông tin vi sinh vật 102 Hình 38:Cấu trúc máy nhân quản lý giống 2015 103 Hình 39: Cấu trúc máy nhân quản lý giống dự kiến năm 2016 108 vii TÓM TẮT Đề tài “Thành lập Ngân hàng giống vi sinh vật phục vụ sản xuất Nông nghiệp, Thủy sản, Môi trường”, mã số VS03/13-15 ThS Lại Hà Tố Hoa với KS Bùi Cẩm Tú bắt đầu thực năm 2013 với mục tiêu ban đầu xây dựng giống vi sinh vật phục vụ cho mục đích nghiên cứu sản xuất lĩnh vực nông nghiệp, thủy sản, môi trường Như dự kiến ban đầu, đề tài gồm nội dung sau: Nội dung 1: Thu thập các chủng vi sinh vật các viện nghiên cứu, các trường đại học, các ngân hàng giống vi sinh Việt Nam giới Nội dung 2: Xây dựng các điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật Nội dung 3: Xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa các chủng vi sinh vật Nội dung 4: Định danh xác định tên lồi Nội dung 5: Thiết lập quy trình bảo quản giống vi sinh vật Nội dung 6: Kiểm tra tỷ lệ sống vi sinh vật sau bảo quản Nội dung 7: Xây dựng hệ thống quản lý giống vi sinh vật Tuy nhiên, sau năm thực đề tài không đạt kết dự kiến ban đầu Nguyên nhân nhân thực đề tài hạn chế mà phải làm nhiều nội dung Trong đó, nhóm thực khơng xác định mục tiêu tiếp nhận lưu giữ nguồn giống ban đầu, không đưa phương pháp bảo quản thích hợp, khơng trọng vào việc mã hóa dán nhãn mẫu lưu trữ, khơng có cách thức xây dựng lưu giữ sở liệu phù hợp,… Đến tháng 4/2015, ThS Lê Thị Mai Châm tiếp nhận đề tài, đề xuất thay đổi tên đề tài thành “Thành lập Bộ sư tập giống vi sinh vật phục vụ sản xuất Nông nghiệp” đề xuất số lượng nhân thực đề tài 12 cán Nhóm thực đề tài phân tích các nhược điểm các nội dung cũ đề xuất thay đổi nội dung thực đề tài theo hướng trọng đến cấu trúc máy nhân mơ hình hoạt động Bộ sưu tập giống, xây dựng vận hành sở liệu phương pháp bảo quản các chủng vi sinh vật có nội phịng Cơng nghệ Vi sinh Tt CNSH (Tờ trình đề xuất thay đổi chủ nhiệm đề tài nội dung thực đề tài phần phụ lục) Theo đó, nội dung đề tài thay đổi gồm nội dung chia làm giai đoạn thực hiện: Giai đoạn Nội dung 1: Sàng lọc các chủng vi sinh vật có chủng phịng Công nghệ Vi sinh Nội dung 2: Tham khảo ý kiến các chuyên gia từ các trường đại học phía Nam Việt Nam để xây dựng máy quản lý giống, phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Nội dung 3: Cử người đào tạo nước quốc tế Giai đoạn Nội dung 4: Thử nghiệm tìm quy trình bảo quản tới ưu cho các chủng vi sinh vật chọn lọc Nội dung 5: Thiết kế phần mềm để xây dựng sở liệu giống Nội dung 6: Bước đầu xây dựng cấu trúc máy quản lý mơ hình hoạt động Bộ sưu tập giống Theo nội dung đã thay đổi, cấu trúc máy nhân Bộ sưu tập giớng gờm các nhóm Tư vấn, Quản lý hệ thống, Quản lý sở liệu giống nhóm Chun mơn (bảo quản định danh vi sinh vật) Các nhóm đảm nhiệm các vai trị khác cá nhân đảm nhận nhiều vai trị mơ hình Nhóm chun mơn tiếp viii nhận 450 chủng vi sinh vật từ các nghiệp vụ chun mơn phịng Cơng nghệ Vi sinh sàng lọc 127 chủng vi sinh vật dựa vào các tiêu chí sàng lọc ban đầu Trong đó, có 20 chủng Trichoderma spp., 22 chủng Purpureocillium lilacinum, chủng Paecilomyces marquandii, chủng Pochonia chlamydosporium, chủng Penicillium simplicissium, chủng Metarhizium anisopliae, chủng Beauveria bassiana, chủng Phanerochaete chrysosporium, chủng Collectotrichum spp., chủng Fusarium solani, chủng Rhizoctonia solani, 31 chủng Bacillus spp., chủng Nguyenibacter vanlangensis, chủng Lactobacillus spp., 15 chủng Komagataeibacter nataicola, chủng Streptomyces spp., chủng Burkholderia spp., chủng Agrobacterium tumefaciens, chủng Rhizobium sp., chủng Azotobacter spp Nhóm chun mơn đã bớ trí nhiều thí nghiệm để xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa định danh chủng vi sinh vật Các nhóm phụ trách đã bảo quản tất các chủng theo protocol (bảo quản ống thạch nghiêng điều kiện 40C) Ngồi ra, nhóm đã thử nghiệm bảo quản các chủng vi nấm phương pháp khác nhau: bảo quản giấy lọc (protocol 3), bảo quản hạt silica gel (protocol 4), bảo quản dầu khoáng (protocol 5) Đối với vi khuẩn, chúng tơi chia làm nhóm (có khơng có nội bào tử) lựa chọn phương pháp bảo quản phù hợp đới với nhóm Tuy nhiên, phải bảo quản nhóm vi khuẩn các dung dịch chất bảo vệ khác với các nồng độ khác điều kiện âm sâu -800C (protocol 6) Đới với nhóm có bào tử phát triển nhanh (Bacillus spp.) bảo quản theo protocol 6; bảo quản xạ khuẩn Streptomyces theo protocol 3, 4, Các mẫu lưu trữ vào các kho chứa phù hợp theo protocol dán nhãn siêu dính với tên đã mã hóa Chúng tơi xây dựng kho liệu vi sinh vật Google Drive Các nhóm phụ trách tự cập nhật liệu chủng vi sinh vật theo biểu mẫu thiết kế sẵn, đờng thời cung cấp hình ảnh các tài liệu liên quan vào các thư mục Google Drive dựa vào chức Link sharing Có tổng cộng 61 thư mục thư mục lớn FUNGI 66 thư mục thư mục lớn BACTERIA đầy đủ sỡ liệu Dữ liệu sau chuẩn hóa MS Access cơng bớ website www.cnshhomnay.vn Như vậy, việc xây dựng cấu trúc máy nhân Bộ sưu tập giống bước đầu thành công hầu hết thành viên đã hồn thành nhiệm vụ giao Mơ hình thực lộn xộn thiếu kinh nghiệm đã bước đầu vào hoạt động cải thiện dần các năm ix Hình 33: Dữ liệu từ Google Drive lưu trữ theo ổ cứng máy tính phục vụ cho CSDL Access truy xuất thơng tin ngoại tuyến Hình 34: Giao diện quản trị website bao gồm các tính quản lý viết, đếm lượt truy cập, phân quyền quản lý cho cộng tác viên 100 Hình 35: Giao diện website thiết kế theo định hướng tra cứu theo từ khóa Hình 36: Chức tìm kiếm nâng cao theo ứng dụng theo thời gian đăng 101 Hình 37: Giao diện trình bày thông tin vi sinh vật 102 5.5 Kết bước đầu xây dựng cấu trúc và vận hành máy quản lý Bộ sưu tập giống vi sinh vật Việc xây dựng cấu trúc máy quản lý sưu tập giống vi sinh vật quan trọng giống quan trọng máy quản lý quan Do đó, cần phải trọng xây dựng máy quản lý ban đầu để đảm bảo việc sưu tập lưu giữ các chủng vi sinh vật kịp thời Tuy nhiên, tình hình phịng Công nghệ Vi sinh, tất cán thực đồng thời đến nghiệp vụ chuyên môn khác nên việc đảm bảo hoạt động sưu tâp giớng gặp nhiều khó khăn Năm 2015 năm thử nghiệm nên việc vận hành máy nhân Bộ sưu tập giống vi sinh vật gặp nhiều khó khăn khơng tn theo chặc chẽ mơ hình đưa ban đầu Các nhóm thực khơng thơng qua Quản lý hệ thớng mà trực tiếp qua nhóm khác Phụ trách chuyên môn thực các nhiệm vụ Quản lý hệ thớng Nhóm định danh vi sinh vật khơng tờn các nhóm phụ trách nấm vi khuẩn thực việc định danh các chủng vi sinh vật sàng lọc Khi thực nhiệm vụ nhóm khơng đờng thời gian với thiếu thiết bị dụng cụ Tuy nhiên, việc xây dựng cấu trúc máy nhân Bộ sưu tập giống bước đầu thành cơng hầu hết thành viên đã hồn thành nhiệm vụ giao Mơ hình thực lộn xộn thiếu kinh nghiệm đã bước đầu vào hoạt động cải thiện dần các năm Cấu trúc máy nhân quản lý giống năm 2015 khác với mơ hình ban đầu: Nhóm tư vấn Phạm Nguyễn Đức Hồng Phan Mỹ Hạnh Lê Thị Mai Châm Nguyễn Tấn Đức Nguyễn Xuân Đồng Phụ trách chuyên môn Phụ trách sở liệu Lê Thị Mai Châm Nguyễn Tấn Đức Nấm Vi khuẩn Lê Thị Mai Châm Lê Thị Thùy Nhi Nguyễn Xuân Đồng Ngô Thùy Trâm Nguyễn Thị ánh Nguyệt Nguyễn Thị Thùy Dương Đặng Hoàng Quyên Phan Mỹ Hạnh Trần Thùy Trang Trần Chí Hiếu Vũ Thùy Dương Hình 38: Cấu trúc máy nhân quản lý giống 2015 103 Nhóm tư vấn: gờm Phạm Nguyễn Đức Hồng, Phan Mỹ Hạnh, Lê Thị Mai Châm, Nguyễn Tấn Đức, Nguyễn Xn Đờng Trách nhiệm nhóm là: - Định hướng tiêu chí sàng lọc giớng Xác định các phương pháp bảo quản phù hợp cho loại nấm, vi khuẩn,… Định hướng đào tạo cho thành viên nhóm liên hệ để gửi người đào tạo (trong nước nước) Ngoại giao với chuyên gia viện, trường đại học Phụ trách sở liệu: Nguyễn Tấn Đức Trách nhiệm người phụ trách sở liệu: - Thiết kế biểu mẫu đăng ký mã số giống, lưu giữ sở liệu giống Lập sở liệu giống Phụ trách chuyên môn: Lê Thị Mai Châm Trách nhiệm người phụ trách chuyên môn: - - - Tiếp nhận giống thông tin giớng từ các đề tài phịng Cơng nghệ Vi sinh Sau phân chia cơng việc cho nhóm thực đớc thúc (nếu cần) để hồn thành cơng việc tiến độ Kết hợp với nhóm tư vấn đề xuất các phương pháp bảo quản kiểm tra hoạt tính giớng sau bảo quản để đề xuất quy trình bảo quản phù hợp cho chủng giớng Nhận báo cáo từ nhóm chun mơn nhỏ Phụ trách cở sở liệu để hoàn thành báo cáo Các nhóm chun mơn gờm: Nhóm nấm: Lê Thị Mai Châm, Lê Thị Thùy Nhi, Nguyễn Xuân Đồng, Ngô Thùy Trâm, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Thị Thùy Dương - - - Mỗi cá nhân nhóm chịu trách nhiệm sàng lọc chủng vi nấm giao, xác định đặc điểm hình thái vi thể, đại thể, đặc điểm sinh hóa, định danh (nếu các đặc điểm chủng khác xa so với ban đầu) của chủng nấm sàng lọc đồng thời bảo quản chủng nấm ống thạch nghiêng Thử nghiệm tìm phương pháp bảo quản thích hợp (bảo quản giấy lọc tiệt trùng, hạt silica gel dầu khoáng) cho chủng nấm đại diện Trichoderma virens (BC-F0002), Colletotrichum acutatum (BC-F0070) Metarhizium anisopliae (BC-F0014) Theo đó, Lê Thị Mai Châm Nguyễn Thị Thùy Dương phụ trách bảo quản chủng BC-F0002, Lê Thị Thùy Nhi Nguyễn Thị Ánh Nguyệt phụ trách bảo quản chủng BC-F0014, Ngô Thùy Trâm Nguyễn Xuân Đồng phụ trách chủng BC-F0070 Báo cáo cho Phụ trách chun mơn sau đã hồn thành cơng việc (bao gờm tiến độ hồn thành cơng việc, thơng tin giớng sau bảo quản) Nhóm vi khuẩn: Phan Mỹ Hạnh, Đặng Hoàng Quyên, Trần Thùy Trang, Trần Chí Hiếu, Vũ Thùy Dương - Mỗi cá nhân nhóm chịu trách nhiệm sàng lọc chủng vi khuẩn giao, xác định đặc điểm hình thái vi thể, đại thể, đặc điểm sinh hóa, định danh 104 - - (nếu các đặc điểm chủng khác xa so với ban đầu) của chủng vi khuẩn sàng lọc đồng thời bảo quản chủng vi khuẩn ống thạch nghiêng Thử nghiệm tìm phương pháp bảo quản thích hợp (bảo quản giấy lọc tiệt trùng, hạt silica gel, dầu khoáng bảo quản âm sâu -800C) cho nhóm vi khuẩn khác Báo cáo cho Phụ trách chun mơn sau đã hồn thành cơng việc (bao gờm tiến độ hồn thành cơng việc, thơng tin giớng sau bảo quản) Mơ hình hoạt động Bộ sưu tập năm 2015: Nguồn giống từ các đề tài phịng Cơng nghệ Vi sinh Phụ trách chuyên môn Vi khuẩn Nấm Phụ trách sở liệu Vì năm 2015, nhiệm vụ Bộ sưu tập giống sàng lọc xây dựng liệu các chủng vi sinh vật nên mơ hình hoạt động nhập giớng Thuyết minh quy trình nhập giống năm 2015 sau: Bước Tiếp nhận thông tin kiểm tra liệu đầu vào: Phụ trách chuyên môn tiếp nhận thông tin các giống từ các đề tài phịng Cơng nghệ Vi sinh kiểm tra toàn liệu các chủng (1) Bước Sàng lọc giống cập nhật liệu chủng sàng lọc: Phụ trách chun mơn giao cho các nhóm chun mơn nhỏ (nấm, vi khuẩn) kiểm tra tỉ lệ sống các chủng vi sinh vật sàng lọc các chủng theo tiêu chí đưa ban đầu Nếu các chủng đã sàng lọc thiếu liệu (hình thái vi thể, đại thể, đặc tính sinh lý, sinh hóa, định danh,…) các thành viên nhóm tự bớ trí các thí nghiệm để cập nhật liệu chủng (2, 3) Bước Bảo quản vi sinh vật: Các thành viên các nhóm chun mơn tự cấy truyền các chủng phụ trách vào ống môi trường thạch nghiêng lưu giữ 0C Ngoài ra, các nhóm chun mơn nhỏ thử nghiệm bảo quản vi sinh vật các phương pháp khác để tìm phương pháp bảo quản tới ưu cho nhóm vi sinh vật cập nhật thơng tin cho Phụ trách chuyên môn hàng tháng (4, 5) Bước Đăng ký mã số cập nhật liệu chủng cho Phụ trách sở liệu: Các chủng vi sinh vật sàng lọc đăng ký mã sớ, tình trạng bảo quản,…trên BO 105 SUU TAP VSV ver 1.0.xlsx theo định dạng Excel hỗ trợ Google Docs thành viên phụ trách các nhóm chun mơn nhỏ, đờng thời thành viên tự cập nhật đầy đủ thông tin chủng vi sinh vật vào các thư mục có tên tương ứng với mã số chủng vi sinh vật Phụ trách sở liệu sau tổng hợp lập sở liệu chủng (6, 7, 8, 9) Phụ trách chuyên môn phụ trách sở liệu viết báo cáo gửi cho chủ nhiệm đề tài hoàn thành báo cáo nghiệm thu đề tài Nhược điểm: Bộ máy nhân có cấu trúc rõ ràng thiếu Quản lý hệ thống trường hợp Phụ trách chuyên môn làm các nhiêm vụ Quản lý hệ thống Việc thiếu Quản lý hệ thớng gây khó khăn trở ngại cho việc tiếp nhận chủng giớng từ các phịng chun môn khác nội Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM hay từ các đơn vị, cá nhân bên ngồi Ngồi ra, mơ hình hoạt động năm 2015 theo chiều nhập giống Một Bộ sưu tập giớng phát triển việc xuất giớng bên cần thiết ng̀n thu để trì các hoạt động Bộ sưu tập Nếu áp dụng mơ hình việc xuất giớng gặp nhiều khó khăn Cần phải cải tổ cấu trúc máy xác định vị trí Quản lý hệ thớng Trong mơ hình này, cá nhân đảm nhận nhiều vị trí khác khối lượng công việc nhiều nên thời gian thực các nhiệm vụ (sàng lọc, định danh, bảo quản,… vi sinh vật) các nhóm khơng thớng với Khắc phục: Xây dựng cấu trúc Bộ máy quản lý Bộ sưu tập giống mơ hình hoạt động đề xuất ban đầu, đó, có sớ thay đổi vị trí các thành viên mơ hình ban đầu để phù hợp với tình hình thực tế VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận - Đã tiếp nhận 450 chủng vi sinh vật từ các nghiệp vụ chun mơn phịng Cơng nghệ Vi sinh - Sàng lọc 127 chủng vi sinh vật từ 450 chủng ban đầu Trong đó, có 20 chủng Trichoderma spp., 22 chủng Purpureocillium lilacinum, chủng Paecilomyces marquandii, chủng Pochonia chlamydosporium, chủng Penicillium simplicissium , chủng Metarhizium anisopliae, chủng Beauveria bassiana, chủng Phanerochaete chrysosporium, chủng Collectotrichum spp., chủng Fusarium solani, chủng Rhizoctonia solani, 31 chủng Bacillus spp., chủng Nguyenibacter vanlangensis, chủng Lactobacillus spp., 15 chủng Komagataeibacter nataicola, chủng Streptomyces spp., chủng Burkholderia spp., chủng Agrobacterium tumefaciens, chủng Rhizobium sp., chủng Azotobacter spp - Bảo quản tất 127 chủng vi sinh vật theo protocol Ngoài ra, thử nghiệm bảo quản vi nấm theo các protocol 3, 4, vi khuẩn theo protocol 3, 4, - Xây dựng kho liệu vi sinh vật Google Drive Có tổng cộng 61 thư mục thư mục lớn FUNGI 66 thư mục thư mục lớn BACTERIA đầy đủ 106 sỡ liệu Dữ liệu sau chuẩn hóa MS Access công bố website www.cnshhomnay.vn - Việc xây dựng cấu trúc máy nhân Bộ sưu tập giớng bước đầu thành cơng hầu hết thành viên đã hoàn thành nhiệm vụ giao Mơ hình thực hoạt động chưa thật hiệu cải thiện các năm Đề tài đã hoàn thành 100 % so với tiến độ đề đề cương nghiên cứu, đề nghị Hội đồng nghiệm thu đồng ý nghiệm thu đề tài 6.2 Đề nghị Bắt đầu từ năm 2016, đề tài phát triển thành Nghiệp vụ thường xuyên Một số đề xuất cho phát triển Bộ sưu tập giống năm 2016: 6.2.1 Đề xuất mơ hình và vận hành mơ hình máy quản lý giống năm 2016 Cấu trúc máy nhân quản lý giống vi sinh vật: gờm nhóm tư vấn, quản lý hệ thớng, quản lý sở liệu, phụ trách chun mơn Nhóm tư vấn: gờm Phạm Nguyễn Đức Hồng, Phan Mỹ Hạnh, Lê Thị Mai Châm, Nguyễn Tấn Đức, Nguyễn Xuân Đồng Trách nhiệm nhóm là: - Định hướng phát triển giớng tiêu chí nhận lưu giữ giống Xác định các phương pháp bảo quản phù hợp cho loại nấm, vi khuẩn,… Giải các khó khăn vận hành hệ thớng Định hướng đào tạo cho thành viên nhóm liên hệ để gửi người đào tạo (trong nước nước) Ngoại giao với chuyên gia viện, trường đại học Quản lý hệ thống: Phan Mỹ Hạnh Trách nhiệm người quản lý hệ thống: - Tiếp nhận giống thông tin giống từ người gửi (các thông tin giống phải đầy đủ, giớng phải thuần) Nếu cần hới thúc các đơn vị/cá nhân gửi giớng Quản lý vịng lưu chuyển giớng Phân chia cơng việc cho nhóm thực Nêu các khó khăn, trở ngại từ các nhóm chun mơn lên nhóm tư vấn để tìm cách giải Nhận báo cáo các nhóm chun mơn sau đã lưu giữ giống Cung cấp thông tin cho người viết báo cáo để tổng kết Phụ trách sở liệu: Nguyễn Tấn Đức Trách nhiệm người phụ trách sở liệu: - Thiết kế biểu mẫu phiếu yêu cầu giữ giống/mua giống, hợp đồng giữ giống/mua giống Lập sở liệu giống Phụ trách chun mơn: Phạm Nguyễn Đức Hồng Trách nhiệm người phụ trách chuyên môn: 107 - - Kết hợp với nhóm tư vấn đề xuất các phương pháp bảo quản kiểm tra hoạt tính giớng sau bảo quản để đề xuất quy trình bảo quản phù hợp cho chủng giớng Nhận báo cáo từ nhóm chun mơn nhỏ Nhóm tư vấn Phạm Nguyễn Đức Hồng Phan Mỹ Hạnh Lê Thị Mai Châm Nguyễn Tấn Đức Nguyễn Xuân Đồng Quản lý hệ thống Phan Mỹ Hạnh Phụ trách sở liệu Nguyễn Tấn Đức Nấm Nguyễn Xuân Đồng Ngô Thùy Trâm Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Nguyễn Thị Thùy Dương Phụ trách chuyên môn Phạm Nguyễn Đức Hoàng Vi Khuẩn Phan Mỹ Hạnh Đặng Hoàng Quyên Trần Thùy Trang Trần Hiếu HìnhChí Cơ cấu Định danh Lê Thị Mai Châm Lê Thị Thùy Nhi Vũ Thùy Dương Hình 39: Cấu trúc máy nhân quản lý giớng dự kiến năm 2016 Các nhóm chun mơn gờm: Nhóm nấm: Nguyễn Xn Đờng, Ngơ Thùy Trâm, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Thị Thùy Dương - Thử nghiệm tìm phương pháp bảo quản thích hợp cho chi nấm Chịu trách nhiệm bảo quản giống nấm Phụ trách chuyên môn đưa Báo cáo cho Phụ trách chun mơn sau đã hồn thành cơng việc (bao gờm tiến độ hồn thành cơng việc, thơng tin giống sau bảo quản, phương pháp bảo quản giống đó) Nhóm vi khuẩn: Phan Mỹ Hạnh, Đặng Hồng Qun, Trần Thùy Trang, Trần Chí Hiếu 108 - Thử nghiệm tìm quy trình bảo quản thích hợp cho chi vi khuẩn Chịu trách nhiệm bảo quản giống vi khuẩn Phụ trách chuyên môn đưa Báo cáo cho Phụ trách chun mơn sau đã hồn thành cơng việc (bao gờm tiến độ hồn thành cơng việc, thơng tin giống sau bảo quản, phương pháp bảo quản giống đó) Nhóm định danh vi sinh vật: Lê Thị Mai Châm, Lê Thị Thùy Nhi, Vũ Thùy Dương - Xây dựng quy trình định danh (hình thái sinh học phân tử) nấm vi khuẩn Định danh chủng vi sinh vật (nếu cần) Mơ hình hoạt động: giớng mơ hình đề ban đầu 6.2.2 Về vấn đề liên quan tới sở liệu - - - - Hiện dung lượng lưu trữ 160 chủng khoảng GB Trong tương lai cần thêm dung lượng lưu trữ mạng chức bảo mật tốt Đề tài cần nâng cấp lên dịch vụ cần thiết Thiết kế quy tắc ứng xử thành viên nhóm thực nhập liệu, thay đổi chỉnh sửa liệu lý lịch giống nhằm đảm bảo thớng tồn vẹn liệu CSDL chạy thử nghiệm địa www.cnshhomnay.vn, sau kết thúc giai đoạn chuyển liệu địa website Trung tâm CNSH TP HCM Đề tài thiết lập đường dẫn đến mã số chủng website tương ứng với thông tin ống giữ giống nhằm giúp người sử dụng kiểm tra lý lịch giống Vị trí lưu trữ, thời gian bảo quản, chu kỳ cấy chuyền cần nghiên cứu để đờng hóa với thơng tin website (thơng tin dành cho nhóm quản trị) nhằm mục đích quản lý tồn diện chủng giớng theo thời gian thực 6.2.3 Đề xuất tiêu chí tiếp nhận giống vi sinh vật năm 2016 - Đối với chủng vi sinh vật chưa có Bộ sưu tập: tiếp nhận tồn Đới với chủng đã có Bộ sưu tập: tiếp nhận có ng̀n gớc phân lập khác với chủng có có nhiều đặc tính trội các chủng có Khi tiếp nhận giớng từ các phịng khác Cơng nghệ Vi sinh bên ngồi Tt CNSH phải có giấy chứng nhận chuyển nhượng giớng hợp đờng mua giớng 6.2.4 Đề xuất tiêu chí xuất giống vi sinh vật năm 2016 Các chủng vi sinh vật lưu trữ ngân hàng BC chia thành nhóm: nhóm dành riêng cho các nghiên cứu ứng dụng Tt CNSH (các chủng vi sinh vật biến đổi gen các chủng vi sinh vật có có đặc tính tớt nhất) nhóm cịn lại cung cấp các Viện, trường, cơng ty tư nhân Cần có chính sách cụ thể cho việc ký gửi, mua bán chủng VSV với các đơn vị có nhu cầu 6.2.5 Đề xuất bảo quản vi sinh vật - Đối với chủng vi sinh vật bảo quản theo protocol 2: tiếp tục cấy chuyền giống từ ống thạch nghiên đã lưu trữ tủ mát tháng lưu trữ lại sau Đối với chủng thử nghiệm bảo quản theo protocol 3, 4, 5, 6: tiếp tục theo dõi thời hạn 109 - Thử nghiệm bảo quản các phương pháp khác đối với nấm lớn vi nấm không tạo bào tử môi trường nhân tạo 110 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu từ trang web http://www.atcc.org/en/About/About_ATCC.aspx http://www.access-programmers.co.uk/ https://www.dsmz.de/fileadmin/Bereiche/ChiefEditors/Pictures/Press/Organigram m/D SMZ-Organigramm_2014.pdf https://www.dsmz.de/about-us.html http://jcm.brc.riken.jp/en/aboutjcme http://nbaim.org.in/pages/organizational-set-up-administration http://www.netmarketshare.com/operating-system-marketshare.aspx?qprid=10&qpcustomd=0 http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn/ Tài liệu tiếng việt Lê Thị Mai Châm, Lê Thị Thùy Nhi, 2014 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp hồ tiêu Báo cáo tiến độ đề tài sởTrung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Lê Thị Mai Châm, 2013 Phân lập tác nhân gây bệnh chọn lọc dịng Bacillus spp có khả đới kháng tốt với tác nhân gây bệnh lở cổ rễ cà tím thành phớ Hờ Chí Minh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Khoa học tự nhiên TP HCM Bùi Đức Cường, Phạm Nguyễn Đức Hồng, Dương Hoa Xơ 2011 Hình thành giớng chủng Trichoderma Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Nguyễn Văn Dĩnh, Đỗ Tấn Dũng, Hà Quang Hùng, Phạm Văn Lầm, Phạm Bình Quyền, Ngơ Thị Xun, 2004 Giáo trình biện pháp sinh học bảo vệ thực vật Bộ GD&ĐT, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Xn Đờng, Hờng Phước Tồn, 2014 Nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme tái tổ hợp để hướng đến sản xuất cồn sinh học từ lignocellulose Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Nguyễn Tấn Đức, Trần Thùy Trang, 2015 Tuyển chọn dòng vi khuẩn Bacillus spp để phòng trừ bệnh thán thư nấm Collectotrichum spp gây hại giống sừng trâu thuộc loài Capsicum annuum Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Phan Mỹ Hạnh, Lê Thị Thùy Nhi, Trần Chí Hiếu, Bùi Văn Tân, 2016 Khảo sát tạo cellulose vi sinh từ chủng Gluconacetobacter spp Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Vũ Kim Ngọc Khánh, Bùi Cẩm Tú, Hờng Phước Tồn, 2012 Phân lập tuyển chọn số chủng Lactobacillus để sản xuất probiotics bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Thị Thùy Dương, 2015 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học từ nấm xanh (Metarhizium anisopliae), nấm trắng (Beauveria bassiana) phòng trị sâu ăn tạp (Spodoptera litura) bọ nhảy sọc vỏ lạc (Phyllotora striolata) gây hại rau Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 10 Đặng Hoàng Quyên, Trần Thị Thanh Thuần, 2013 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật cố định đạm phân giải lân phục vụ sản xuất phân bón hữu vi sinh Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 111 11 Ngô Thùy Trâm, Vũ Thùy Dương, Lê Thị Mai Châm, 2012 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh thối rễ, lở cổ rễ nấm Phytophthora sp Fusarium sp gây cho rau Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 12 Ngô Thùy Trâm, Nguyễn Xuân Đồng, 2016 Khảo sát khả sử dụng chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ số loại nấm gây mục gỗ xanh đường phố TP.HCM Đề tài sở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 13 Nguyễn Văn Tuấn, Nguyễn Thị Huệ, 2014 Tuyển chọn định danh kỹ thuật sinh học phân tử số chủng nấm Trichoderma spp đối kháng mạnh với nấm gây bệnh trồng Khóa luận tớt nghiệp trường đại học cơng nghiệp TP HCM Tài liệu tiếng anh Bailey J A & Jeger M J., 1992 Colletotrichum: Biology, pathology and control Diana B and Helmut V., 2006 Effect of protective agents on the viability of Lactococcus lactis subjected to freeze-thawing and freeze-drying Scientia Pharmaceutica (Sci Pharm.) 74, 137-149 Domsch K H., Gams W and Anderson T H., 1980 Compendium of Soil Fungi.London New York: Academic Press, pp 809 Draganova S., Takov D., Pilarska D., Doychev D., Mirchev P., Georgiev G., 2013 Fungal Pathogens on Some Lepidopteran Forest Pests in Bulgaria, 65(2), 179–186 Elbandy M., 2009 α-Pyrones and Yellow Pigments from the Sponge-Derived Fungus Paecilomyces lilacinus Bull Korean Chem Soc 30(1): 188-192 Fakas G J., 2011 A novel keyword search paradigm in relational databases: Object summaries, Data Knowl Eng.,70: 208–229 Felsenstein J., 1985 Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap Evolution 39: 783-791 Giovanna, Felis and Dellaglio F., 2004 Taxonomy of Lactobacilli and Bifdobacteria Curr Issues Intestinal Microbiol, 8: 44–61 Hertel and Hammes, 2003 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3: The Firmicutes 10 Huong T L V., Pattaraporn Y., Winai C., Taweesak M., Yuki M., Uyen T T B., Somboon T., Kien C., Yasuyoshi N., Ho T P and Yuzo Y., 2013 Nguyenibacter vanlanggensis gen.nov.,sp.nov., an unusual acetic axit bacterium in the αProteobacteria J Gen Appl Microblol., 59: 153-166 11 Izumitsu K., Hatoh K., Sumita T., Kitade Y., Morita A., Gafur A., Ohta A., Kawai M., Yamanaka T., Neda H., Ota Y., Tanaka C., 2012 Rapid and simple preparation of mushroom DNA directly from colonies and fruiting bodies for PCR Mycoscience, 53 (5), p396 12 Jaklitsch W M and Voglmayr H., 2015 Biodiversity of Trichoderma (Hypocreaceae) in Southern Europe and Macaronesia, studies in Mycology 80:1-87 13 Lim, Young W., 2007 Accurate delimitation of Phanerochaete chrysosporium and Phanerochaete sordida by specific PCR primers and cultural approach J Microbiol Biotechnol, 17(3), 468–473 14 Luangsa-ard J., Houbraken J., Doorn V T., Hong S B., Borman M A., Hywel-Jones L N and Samson A R., 2013 Purpureocillium, a new genus for the medically important Paecilomyces lilacinus Federation of European Microbiological Societies Microbiol Lett., 321: 141-149 112 15 Khan A., Williams L.K and Nevalainen K M H., 2006 Infection of plant-parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum BioControl, 51: 659-678 16 Killham K., 1994 Soil Ecology Cambridge University Press New York, pp260 17 Klein D and Eveleigh D E., 1998 Ecology of Trichoderma In Kubicek, C.P.and Harman, G.E (ed) Trichoderma and Glicocladium: Basic biology, taxonomyand genetics, Taylor and Francis Ltd London UK, pp 57-74 18 Meyling N V., Eilenberg J., 2006 Isolation and characterisation of Beauveria bassiana isolates from phylloplanes of hedgerow vegetation Mycological research, 110 (2), 188–195 19 Montri P., Taylor P W J., Mongkolporn O., 2009 Pathotypes of Colletotrichum capsici, the causal agent of chili anthracnose in Thailand, Am Phytopathol Soc 93: 17–20 20 Okafor N., 2007 Modern Industrial Microbiology and Biotechnology Science Publishers http://doi.org/10.1021/ie50036a053 21 Paul M K., Paul F C., David W M and Joost A S., 2008 Dictionary of the Fungi 10th Edition CABI Europe – UK 83 – 84 and 420 – 421 22 Salazar O., Julian M C., Rubio V., 2000 Primers based on specific rDNAITS sequences for PCR detection of Rhizoctonia solani , R solani AG subgroups and ecological types , and binucleate Rhizoctonia, Mycol Res, 104: 281–285 23 Saitou N and Nei M., 1987 The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution, 4: 406-425 24 Samson A R., 1974 Paecilomyces lilacinus and some allied Hyphomycetes Studies in Mycology, 6: 38-40 25 Suseela B R., Remya B., Danesh J., Eapen S J.,2009 In vitro and in planta Assays for Biological Control of Fusarium Root Rot Disease of Vanilla Journal of Biological Control 23(1): 83-86 26 Richard A H, 1997 Manual of techniques in Invertebrate Pathology Biologycal techniques series, p 75-96, 317-327 27 Richard A H., 1997 Manual of techniques in Insect Pathology Biologycal techniques series, p 269-278 28 Road T., 2005 Entomopathogenic Fungal Identification USDA-ARS Plant Protection Research Unit USDA-ARS Plant Protection Research Unit US Plant, Soil & Nutrition Laboratory Tower Road Ithaca, NY 14853-2901 29 Tamura K., Nei M., and Kumar S., 2004 Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 101:11030-11035 30 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A and Kumar S., 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729 31 Than P P., Prihastuti H., Phoulivong S., Taylor P W J & Hyde K D., 2008 Chilli anthracnose disease caused by Colletotrichum species Journal of Zhejiang University Science B, 9(10), 764–78 http://doi.org/10.1631/jzus.B0860007 32 Thom C.,1910 Cultural studies of species of Penicilium Wasington: Government priting office, pp 73-75 113 33 Vintila D., Vintila T., Popescu I., 2007 Stability in real time of some cryopreserved microbial strains with reference to genetically modified microorganisms Biotehnologii, 40 (1) 34 Zachow C., Grosch R., Berg G., 2011 Impact of biotic and a-biotic parameters on structure and function of microbial communities living on sclerotia of the soil-borne pathogenic fungus Rhizoctonia solani, Appl Soil Ecol, 48, 193–200 35 Zdenek H., 2003 Protectants used in the cryopreservation of microorganisms Cryobiology 46, 205–229 36 Yamada Y., Yukphan P., Lan V H T., Muramatsu Y., Ochaikul D., Tanasupawat S & Nakagawa Y., 2012 Description of Komagataeibacter gen nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae) J Gen Appl Microbiol 58, 397–404 TP Hồ Chí Minh, ngày tháng 03 năm 2016 PHÓ GIÁM ĐỐC CHUN MƠN TRƯỞNG PHỊNG TS Phạm Hữu Nhượng Phạm Nguyễn Đức Hoàng GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô 114 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Lê Thị Mai Châm