Tạo ống ghép mạch máu có nguồn gốc dị loại hướng tới ứng dụng trong công nghệ tim mạch

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CÓ NGUỒN GỐC DỊ LOẠI HƢỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ TIM MẠCH Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Tô Minh Quân Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CĨ NGUỒN GỐC DỊ LOẠI HƢỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ TIM MẠCH Chủ nhiệm nhiệm vụ ThS Tô Minh Quân Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu PGS TS Lê Huyền Ái Thúy Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU .1 MỤC TIÊU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu tạo mạch máu 1.2 Căn bệnh xơ vữa mạch máu 1.3 Các phƣơng pháp chữa trị .6 1.4 Ống ghép mạch máu vô bào 1.5 Các phƣơng pháp tạo mảnh ghép mạch máu vô bào .8 1.6 Kết hợp tế bào gốc trung mô vào phục hồi mạch máu 11 1.6.1 Tế bào gốc trung mô .11 1.6.2 Ứng dụng tế bào gốc trung mô phục hồi mạch máu .12 VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 14 2.1 Mẫu vật 14 2.2 Nội dung 1: Khảo sát quy trình khử tế bào động mạch cảnh heo .14 Phƣơng pháp 1: Thu nhận động mạch cảnh heo 14 Phƣơng pháp 2: Phƣơng pháp khử tế bào động mạch cảnh .14 Phƣơng pháp 3: Đánh giá hiệu khử tế bào 14 2.3 Nội dung 2: Khảo sát độc tính động mạch cảnh vơ bào điều kiện in vitro 15 Phƣơng pháp 4: Phƣơng pháp đánh giá độc tính tế bào in vitro 15 2.4 Nội dung 3: Khảo sát độc tính động mạch cảnh vơ bào điều kiện in vivo .16 Phƣơng pháp 5: Phƣơng pháp đánh giá độc tính ống ghép động mạch ảnh vô bào thể chuột 16 2.5 Nội dung 4: Khảo sát tăng sinh tế bào gốc trung mô động mạch cảnh vô bào 17 Trang i HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân Phƣơng pháp 7: Phƣơng pháp cấy tế bào gốc trung mô (MSC) ống ghép mạch máu 17 Phƣơng pháp 8: Phƣơng pháp đánh giá tăng sinh tế bào MSC động mạch cảnh vô bào .17 KẾT QUẢ 18 3.1 Kết qủa khảo sát quy trình khử tế bào động mạch cảnh heo .18 3.1.1 Kết khảo sát động mạch cảnh tự nhiên 18 3.1.2 Kết khử tế bào nƣớc cất 24 20 3.1.3 Kết khử tế bào peracetic acid 24 21 3.1.4 Kết khử tế bào Triton X100 22 3.1.5 Kết khử tế bào SDS 0,5% 24 23 3.1.6 Kết khử tế bào kết hợp SDS nƣớc cất .24 3.2 Kết khảo sát độc tính động mạch cảnh vô bào điều kiện in vitro 27 3.3 Kết khảo sát độc tính động mạch cảnh vô bào điều kiện in vivo 30 3.3.1 Kết đánh giá đáp ứng viêm ngày 31 3.3.2 Kết đánh giá đáp ứng viêm ngày 14 32 3.3.3 Kết đánh giá đáp ứng viêm ngày 28 34 3.4 bào Kết khảo sát tăng sinh tế bào gốc trung mô động mạch cảnh vô 36 Bàn luận: 39 KẾT LUẬN .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC a Trang ii HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ĐMC Động mạch cảnh HE Haematoxylin Eosin MSCs Mesenchymal stem cells ECs Endothelial cells SMCs Smooth muscle cells SDS Sodium Dodecyle Sulfate SEM Scan electronic microscope MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide OD Optical density 10 ECM Extracellular matrix Trang iii HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tơ Minh Qn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp mạch máu Hình 1.2 Động mạch xơ vữa Hình 1.3 Cấu tạo mảng xơ vữa Hình 1.4 Xơ vữa động mạch vành Hình 1.5 Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch vành Hình 1.6 Ống ghép Dacron Hình 1.7 Phương pháp loại tế bào Hình 1.8 Ống ghép SIS 11 Hình 3.1 Động mạch heo sau xử lý 18 Hình 3.2 Kết nhuộm mô học động mạch cảnh heo chưa xử lý (x200) 19 Hình 3.3 Kết nhuộm mô học ĐMC heo xử lý với bước cất 24 (x200) 20 Hình 3.4 Kết nhuộm mô học ĐMC xử lý với PAA 5% 24 (x200) 21 Hình 3.5 Kết nhuộm mơ học ĐMC xử lý với Triton X100 0,1% 24 (x200) 23 Hình 3.6 Kết nhuộm mô học ĐMC xử lý với SDS 0.5% 24 (x200) 24 Hình 3.7 Kết nhuộm mô học ống ghép mạch máu xử lý kết hợp SDS 0.5% 24 nước cất 24 (x200) 25 Hình 3.8 Mảnh ghép đặt trực tiếp bề mặt tế bào đĩa ni cấy (x100) 27 Hình 3.9 Kết thử nghiệm độc tính trực tiếp sau 24 (x100) 27 Hình 3.10 Kết nhuộm Giemsa tế bào sau đặt mảnh ghép 24 (x100) 28 Hình 3.11 Kết nhuộm MTT tế bào sau tiếp xúc với dịch chiết 24 (x100) 29 Hình 3.12 Ống ghép GelsoftTM Plus 30 Hình 3.13 Kết ghép mảnh ghép ĐMC vô bào vào thể chuột 30 Hình 3.14 Kết nhuộm mô học mảnh ghép đối chứng sau ghép thể chuột ngày 31 Trang iv HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Qn Hình 3.15 Kết nhuộm mơ học mảnh ghép thí nghiệm sau ghép thể chuột ngày 32 Hình 3.16 Kết nhuộm mô học mảnh ghép đối chứng sau ghép thể chuột 14 ngày 33 Hình 3.17 Kết nhuộm mơ học mảnh ghép thí nghiệm sau ghép thể chuột 14 ngày 34 Hình 3.18 Kết nhuộm mô học mảnh ghép đối chứng sau ghép thể chuột 28 ngày 34 Hình 3.19 Kết nhuộm mơ học mảnh ghép thí nghiệm sau ghép thể chuột 28 ngày 35 Hình 3.20 Kết nhuộm HE mảnh ghép cấy với tế bào MSCs mốc thời gian 36 Hình 3.21 Kết chụp SEM tế bào MSC bám dính mảnh ghép ĐMC vơ bào 37 Hình 3.22 Mảnh ghép ĐMC vơ bào cấy với MSCs ngày 37 Hình 3.23 Biểu đồ biểu thị biến động giá trị OD mảnh ghép cấy tế bào đánh giá phương pháp MTT 38 Hình 3.24 Mảnh ghép GelsoftTM Plus 42 DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng tóm tắt hiệu khử tế bào bảo tồn collagen phương pháp xử lý khác 26 Bảng Tóm tắt kết thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp trực tiếp dịch chiết 29 Trang v HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân MỞ ĐẦU Hằng năm, bệnh mạch máu nhƣ xơ vữa phình mạch gây hàng triệu chết quốc gia toàn giới Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2017, năm giới có khoảng 17,7 triệu ngƣời qua đời bệnh tim mạch (chiếm 31% số ca tử vong toàn giới) Theo thống kê Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm 2017, trung bình, số ca tử vong bệnh tim mạch chiếm 1/3 tổng số ca tử vong nƣớc Mỹ (gần 810.000 ca năm), bệnh mạch vành chiếm khoảng 45% số ca tim mạch Khoảng 22.000 ngƣời Mỹ qua đời tim mạch, tƣơng đƣơng với 40 giây ca Nguy hiểm hơn, bệnh xuất ngày phổ biến với triệu chứng ngày nặng độ tuổi mắc bệnh ngày trẻ Tại Việt Nam, chƣa có nghiên cứu thức thống kê số lƣợng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu nhƣng theo ghi nhận nhiều bệnh viện, lƣợng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu ngày gia tăng Theo thống kê Viện Tim Mạch Trung Ƣơng, năm 2003 tỉ lệ bệnh nhân nhập viện bệnh động mạch vành chiếm 11,2%, đến năm 2008 tỉ lệ tăng lên 24% Một số phƣơng pháp chữa trị bệnh mạch máu đƣợc áp dụng nhƣ: sử dụng mạch máu khác làm cầu nối qua đoạn bị tổn thƣơng đặt khung kim loại (stent) để nong lòng mạch bị hẹp xơ vữa Tuy nhiên, phƣơng pháp chƣa chữa trị đƣợc hoàn tồn bệnh mạch máu, khoảng 1/3 bệnh nhân khơng có mạch máu phù hợp, chi phí phẫu thuật cao, tƣợng tái hẹp có khả xảy Do đó, kỹ nghệ mạch máu đời nhằm tạo ống ghép mạch máu nhân tạo phù hợp đƣợc sử dụng làm đoạn mạch bắc cầu qua vị trí bị tổn thƣơng đƣợc sử dụng để thay mạch máu bị tổn thƣơng Một phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu nhiều để tạo ống ghép mạch máu nhân tạo khừ tế bào động mạch tự nhiên để tạo ống ghép mạch máu vô bào Phƣơng pháp có ƣu điểm nhƣ cấu trúc, hình dạng, thành phần ống ghép mạch máu vô bào tƣơng tự với mạch máu tự nhiên, nguồn thu nhận mẫu dồi chi phí sản xuất tƣơng đối thấp Do đó, ống ghép mạch máu vơ bào hứa hẹn đem đến nhiều hy vọng cho nghiên cứu kỹ nghệ mạch máu Trang HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân Hiện nay, công nghệ tế bào đƣợc ứng dụng rộng rãi lĩnh vực mạch máu nhân tạo Tế bào nội mô, tế bào trơn đối tƣợng ứng dụng đƣợc nghiên cứu loại tế bào tự nhiên mạch máu Tuy nhiên, nguồn tế bào bị hạn chế thể ngƣời trƣởng thành Do đó, loại tế bào gốc nhƣ tế bào gốc trung mô đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực Tế bào gốc trung mô thu nhận từ nguồn tự thân, có khả biệt hóa thành tế bào nội mơ, tế bào trơn Do đó, nguồn tế bào đƣợc nghiên cứu kỹ để tạo thành mạch máu nhân tạo Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CÓ NGUỒN GỐC DỊ LOẠI HƢỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ TIM MẠCH” để tiến hành đánh giá tiềm sử dụng ống ghép động mạch cảnh có nguồn gốc dị loại lĩnh vực mạch máu MỤC TIÊU Mục tiêu tổng quát: - Tạo đƣợc ống ghép mạch máu phù hợp ứng dụng kỹ nghệ mạch máu phƣơng pháp khử tế bào động mạch cảnh heo Mục tiêu cụ thể: - Tạo đƣợc ống ghép mạch máu cách khử hoàn toàn tế bào động mạch cảnh heo - Đánh giá đƣợc tƣơng hợp sinh học ống ghép mạch máu vô bào Trang HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu tạo mạch máu Phần lớn động mạch, tĩnh mạch thể đƣợc đƣợc cấu tạo lớp: lớp ngoài, lớp lớp - Lớp ngồi lớp mơ liên kết đƣợc cấu thành từ nguyên bào sợi, dây thần kinh mạch máu nhỏ Thành phần ECM (ExtraCellular Matrix) chủ yếu lớp sợi collagen elastin Những sợi collagen lớp ngồi đƣợc định hƣớng theo chiều dọc Nhờ đó, động mạch có độ bền cần thiết để ngăn chặn tƣợng giãn mạch máu mức thể vận động (45) - Lớp bao gồm tế bào trơn sợi protein nhƣ collagen, elastin Tế bào trơn sợi protein đƣợc tổ chức thành vòng tròn đồng tâm xoay quanh trục mạch máu Ranh giới lớp lớp phiến đàn hồi đƣợc cấu tạo từ sợi elastin (30, 48) - Lớp (còn gọi lớp nội mô hay lớp nội mạc) bao gồm lớp tế bào nội mô Tế bào nội mô bao phủ hồn tồn lịng tất mạch máu thể Ranh giới lớp lớp phiến đàn hồi đƣợc cấu tạo từ phân tử elastin (30, 48) Lớp Lớp Phiến đàn hồi Phiến đàn hồi Tế bào nội mơ ngồi Lớp ngồi Tế bào trơn Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp mạch máu (http://iupucbio2.iupui.edu) Trang HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ 3.4 Tô Minh Quân Kết khảo sát tăng sinh tế bào gốc trung mô động mạch cảnh vô bào A B C D E F Hình 3.20 Kết nhuộm HE mảnh ghép cấy với tế bào MSCs mốc thời gian A: ngày (x100), B: ngày (x200), C: ngày (x100), D: ngày (x200), E: ngày (x100), F: ngày (x200) (Mũi tên: tế bào) Kết nhuộm mô học HE cho thấy tế bào bám vào lịng mảnh ghép sau ngày ni cấy Tuy nhiên, diện tích tế bào bám Kết nhuộm HE mảnh ghép cấy tế Trang 36 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân bào ngày sau (5, ngày) (Hình 3.20) cho thấy diện tích bao phủ tế bào tăng lên Tuy nhiên, đến ngày thứ 7, tế bào chƣa bao phủ hồn tồn lịng mảnh ghép Kết chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy tế bào bám dính thành cơng lên mảnh ghép ĐMC vơ bào (Hình 3.21) B A Hình 3.21 Kết chụp SEM tế bào MSC bám dính mảnh ghép ĐMC vơ bào A: Mẫu đối chứng, B: Mẫu thí nghiệm (1 ngày) (Mũi tên: tế bào) A B Hình 3.22 Mảnh ghép ĐMC vô bào cấy với MSCs ngày (Mũi tên: mảnh ghép cấy tế bào, mũi tên đứt quãng: mảnh ghép không cấy) Thử nghiệm tăng trƣởng MTT cho thấy, mảnh ghép cấy tế bào có lắng đọng tinh thể bên mảnh ghép nên mảnh ghép có màu tím Đối với mảnh ghép khơng có tế bào, mảnh ghép giữ nguyên bào ban đầu, không xuất tinh thể bên (Hình 3.22) Giá trị OD gia tăng nhanh chóng từ ngày đến ngày 5, gia tăng chậm Trang 37 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân từ ngày đến ngày (ngày có giá trị cao nhất) giảm từ ngày đến ngày Kết cho thấy tế bào EPC tăng trƣởng bề mặt mảnh ghép mạch máu vô Mật độ quang OD bào 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Hình 3.23 Biểu đồ biểu thị biến động giá trị OD mảnh ghép cấy tế bào đánh giá phương pháp MTT Dựa vào kết HE, chụp SEM MTT cho thấy tế bào MSC bám dính tăng trƣởng lịng ĐMC vơ bào Trang 38 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân Bàn luận: Mảnh ghép dị loại có số lƣợng dồi dào, chức sinh học tƣơng tự nhƣ ngƣời nhƣng nhƣợc điểm lớn có khả kích ứng miễn dịch Do đó, phƣơng pháp khử tế bào đƣợc sử dụng để tạo mảnh ghép nhân tạo có cấu trúc tƣơng tự nhƣ mơ tự nhiên Mơ, quan sau loại bỏ hồn tồn tế bào, mơ/cơ quan cịn giữ lại khn ngoại bào có chất protein, lipid, polysaccharide (14, 21) Đây đƣợc gọi mảnh ghép nhân tạo vô bào Vì vậy, chất mảnh ghép nhân tạo đƣợc tạo phƣơng pháp khử tế bào khn ngoại bào mơ/cơ quan Trong lĩnh vực mạch máu, nhiều loại mạch đƣợc thử nghiệm khử tế bào nhƣ động mạch vành, động mạch cảnh, động mạch cuống rốn, động mạch phổi… Động mạch cảnh động mạch xuất phát từ động mạch chủ, di chuyển bên cổ lên não Động mạch cảnh bao gồm động mạch chung nằm bên cổ Sau đó, động mạch chia làm nhánh: động mạch cảnh (cung cấp máu cho vùng não) động mạch cảnh (cung cấp máu cho vùng cổ, mặt) Dựa theo cấu trúc kích thƣớc, động mạch cảnh thuộc nhóm động mạch đàn hồi (6, 17) So với loại mạch máu khác thể, động mạch cảnh có khả chịu lực lớn, nhánh nên dễ dàng thu đƣợc đoạn mạch dài sản phẩm tạo (ống ghép mạch máu nhân tạo) có độ bền học lớn Do đó, động mạch cảnh đƣợc nghiên cứu nhiều nhóm nghiên cứu giới (9, 15) Trong nghiên cứu này, sử dụng động mạch cảnh thu từ heo làm đối tƣợng nghiên cứu Đoạn mạch thu nhận đƣợc có chiều dài khoảng 5-13 cm, độ dày trung bình mm Động mạch có đƣờng kính giảm dần, đƣờng kính ngồi đầu lớn khoảng 5-7 mm, đƣờng kính đầu lại khoảng 2-4 mm Hiện nay, nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để khử tế bào nhƣ vật lý, hóa học, enzyme Phƣơng pháp vật lý sử dụng tác nhân học để phá vỡ tế bào hỗ trợ phá vỡ tế bào: áp suất nén, hình thành tinh thể đá, khuấy lắc… Các tác nhân hóa học thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất: sử dung chất hóa học phá vỡ hịa tan thành phần protein, lipid… màng tế bào, màng nhân… Các tác nhân Trang 39 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tơ Minh Qn enzyme nhƣ prtease (trypsin) có khả loại bỏ tế bào Mỗi tác nhân có hiệu loại tế bào khác hiệu bảo tồn khuôn ngoại bào khác Hiệu tùy thuộc chất mô quan (14, 22) Trong nghiên cứu này, tác dụng khử tế bào động mạch cảnh chất khử phổ biến Triton X100, SDS, nƣớc cất, PAA nhƣ đƣợc khảo sát Từ đƣa phƣơng pháp kết hợp để tạo thành phƣơng pháp khử tế bào riêng biệt so với giới (14, 20) Bốn hóa chất đại diện cho bốn nhóm chất loại tế bào thƣờng đƣợc tiến hành nghiên cứu: PAA (chất loại có tính acid mạnh) (41) , nƣớc cất (dung dịch nhƣợc trƣơng) (37) , Triton X100 (nhóm chất tẩy có hoạt tính yếu) (51), SDS (nhóm chất tẩy hoạt tính mạnh) (35) Phƣơng pháp khử tế bào hiệu phƣơng pháp loại bỏ hoàn toàn tế bào động mạch (tế bào nội mô, trơn, nguyên bào sợi) bảo tồn tốt khn ngoại bào mạch máu (collagen elastin (44) ) Do đó, phƣơng pháp đánh giá hiệu khử tế bào bắt buộc đối đáng tin cậy khử tế bào mạch máu phƣơng pháp nhuộm HE nhuộm Trichrome Phƣơng pháp nhuộm HE cho thấy thành phần tế bào, cấu trúc mơ cịn lại, phƣơng pháp nhuộm Trichrome cho thấy cấu trúc mô collagen (protein chiếm ƣu mạch máu) lại sau xử lý Kết nhuộm HE Trichrome cho thấy hóa chất chƣa xử lý hết tế bào bên mạch gây tổn thƣơng khuôn mức độ khác Tổng hợp kết nghiên cứu loại tế bào động mạch vành hóa chất Kết cho thấy phƣơng pháp loại tế bào SDS 0,5% 24 giờ, Triton X100 0,1% 24 giờ, nƣớc cất 24 giờ, PAA 5% 24 phƣơng pháp tối ƣu để loại tế bào động mạch vành Trong đó, SDS 0,5% 24 phƣơng pháp tốt nhất: loại bỏ gần hết tế bào bảo tồn tốt thành phần collagen, elastin Tuy nhiên, SDS 0,5% 24 chƣa loại bỏ hoàn toàn tế bào SDS chất loại tế bào mạnh, đồng thời SDS có khả gây biến tính protein, phá vỡ liên kết protein-protein Nếu thời gian xử lý động mạch vành với SDS gia tăng, khả phá hủy protein khung nâng đỡ ngoại bào SDS gia tăng theo (21) Để tăng tính hiệu quả, SDS đƣợc kết hợp với chất hiệu khử tế bào yếu nhƣng bảo tồn khuôn tốt nƣớc cất Kết cho thấy kết hợp SDS 0,5% 24 với nƣớc cất 24 đƣợc kết tốt Do đó, phƣơng pháp kết hợp SDS 0,5% Trang 40 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân 24 với nƣớc cất 24 đƣợc lập lại thêm nhiều lần để đánh giá hiệu phƣơng pháp xử lý Trong thí nghiệm tiến hành sau, tiêu để đánh giá phƣơng pháp khử tế bào thành cơng loại bỏ hồn tồn 100% thành phần tế bào mẫu Do đó, cần quan sát thấy tế bào mẫu nhuộm HE Trichrome mạch máu sau xử lý đợt thí nghiệm đƣợc xem thất bại Thí nghiệm tiến hành lập lại 20 lần, số lần thành công 19 (mẫu nhuộm không chứa tế bào nào) thất bại lần (vẫn vài vết nhân mờ mẫu) Kêt cho thấy hiệu thành cơng quy trình 95% Ống ghép vơ bào có tính đáp ứng miễn dịch thấp so với động mạch ban đầu Tuy nhiên, tiềm gây kích thích miễn dịch cịn (29, 50) Đồng thời, q trình xử lý mạch máu dẫn tới tồn dƣ chất xử lý chứa yếu tố gây độc với tế bào (15) Do đó, kiểm tra tính an tồn sinh học mảnh ghép đóng vai trị định tiềm ứng dụng ghép vơ bào Độc tính ống ghép mạch máu vô bào in vitro đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn ISO 10093-5 Đối với phƣơng pháp đánh giá trực tiếp, nguyên bào sợi đƣợc cấy vào đĩa nuôi Sau ngày, mảnh ghép mạch máu (đƣợc cắt từ ống ghép) đƣợc đặt trực tiếp nguyên bào sợi (tiêu chuẩn ISO 10993-12) Nếu mảnh ghép gây độc tế bào làm cho tế bào biến dạng chết, chí tróc khỏi bề mặt nuôi cấy Đối với phƣơng pháp dịch chiết, mảnh ghép đƣợc ngâm môi trƣờng nuôi cấy để tạo dịch chiết (tiêu chuẩn ISO 10993-12), sau dịch chiết dùng để nuôi nguyên bào sợi, phƣơng pháp đánh giá tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp gián tiếp Hình dạng tế bào đƣợc đánh giá quan sát kính hiển vi phƣơng pháp nhuộm Giemsa, tỉ lệ tế bào chết đánh giá MTT Kết nhuộm Giemsa MTT cho thấy mức độ độc tính mảnh ghép mức (98% phƣơng pháp trực tiếp 108% phƣơng pháp dịch chiết) Kết thí nghiệm cho thấy mảnh ghép mạch máu vô bào không gây độc tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993 Để đánh giá độc tính mảnh ghép in vivo, mảnh ghép đƣợc cấy dƣới da lƣng chuột Trong thí nghiệm sử dụng mảnh ghép Dacron (GelsoftTM Plus) mẫu đối chứng Mảnh ghép GelsoftTM Plus đƣợc ghép vào theo khuyến cáo nhà sản xuất GelsoftTM Plus có chất mảnh ghép Dacron (một dạng polyester) đƣợc phủ Trang 41 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân gelatin để chống đông máu liên kết với kháng sinh phổ rộng Rifampicin để chống viêm GelsoftTM Plus có khả tƣơng hợp sinh học tốt, chống đông máu, chống lại giãn nỡ sau cấy ghép chống viêm (23) Mẫu thí nghiệm (mảnh ghép vô bào) mẫu đối chứng (GelsoftTM Plus) đƣợc ghép dƣới da hai bên lƣng chuột (mảnh đối chứng ghép bên trái cột sống, mạch thí nghiệm đƣợc ghép bên phải cột sống) Quá trình viêm đƣợc quan sát sau 1, 2, tuần cấy ghép cách quan sát biểu chuột ngày nhuộm HE Kết cho thấy chuột khơng có biểu hiện tƣợng viêm, sƣng mủ, chảy máu vết thƣơng Chuột sinh hoạt bình thƣờng sau ngày động so với trƣớc cấy ghép hết thời gian khảo sát Kết nhuộm HE cho thấy đáp ứng viêm chuột mảnh ghép GelsoftTM Plus thí nghiệm tƣơng tự nhau: tuần có xâm nhập tế bào viêm nhƣ monocyte, lymphocyte bắt đầu có xâm nhập mơ sợi Các tế bào viêm giảm dần từ tuần tới tuần hoàn toàn hẳn tuần Các mô sợi xâm nhập tăng dần Hai trình trình bình thƣờng trình lành thƣơng ghép (2, 18, 28) Đều cho thấy mảnh ghép hồn tồn khơng gây độc với thể chuột sau tháng Hình 3.24 Mảnh ghép GelsoftTM Plus (https://www.vascutek.com) Tế bào nội mô tế bào trơn đóng vai trị quan trọng kỹ nghệ mạch máu Các nghiên cứu tác giả chứng minh tế bào nội mô hạn chế xuất máu đơng lịng mạch tế bào trơn giúp làm gia tăng độ bền học ống Trang 42 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ ghép nhân tạo (4, 34) Tô Minh Quân Tuy nhiên, nguồn ECs SMCs tự thân thể trƣởng thành hạn chế (27) Hiện nay, dòng tế bào MSCs tự thân nguồn tế bào tiềm cơng nghệ mạch máu tế bào MSCs có khả biệt hóa thành ECs, SMCs có khả chống đông máu thời gian ngắn (10, 36),(39) Tế bào MSCs có khả biệt hóa thành tế bào trơn dƣới tác động TGFb1(39) Tế bào nội mơ đƣợc biệt hóa mơi trƣờng chứa EGF kích thích học dịng chảy (13, 54),(19) Các nghiên cứu cấy ghép chuột chó cho thấy mảnh ghép nhân tạo đƣợc cấy với MSCs chƣa biệt hóa có khả thơng máu thời gian dài, tái tạo tốt lớp nội mô trơn tổng hợp sợi elastin (24),(52) Do đó, tiếp tục thử nghiệm đánh giá tăng trƣởng tế bào MSCs từ mơ mỡ lịng ống ghép nhân tạo Tế bào đƣợc cung cấp Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, đƣợc xác nhận tế bào MSCs (49) Kết nhuộm HE cho thấy tế bào bám dính vào lịng mạch mật độ tăng lên sau ngày Kết chụp bề mặt kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào bám dính vào lịng mạch máu sau ngày Kính MTT cho thấy mật độ tế bào vào ngày đỉnh điểm gấp lân ban đầu Tổng hợp lại, tế bào MSCs bám dính tăng sinh lòng mạch máu Tuy nhiên, tế bào chƣa lắp đầy hồn tồn diện tích lịng mạch Điều phƣơng pháp ni cấy trƣờng hợp nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy động Một số tác giả chứng minh trƣờng hợp nuôi cấy động, tế bào ECs bao phủ hồn tồn diện tích lịng mạch đƣợc nuôi cấy bioreactor (25, 53) Trong khuôn khổ đề tài, nghiên cứu đạt đƣợc kết nhỏ ban đầu Nhiều thử nghiệm quan trọng chƣa đƣợc đánh giá nhƣ tính chất học, khả chịu đựng áp lực, thời gian phân hủy in vitro đánh giá thử nghiệm độc tính in vivo thể chuột với nhiều thông số hơn, thời gian lâu hơn, …vv để đƣa liệu thuyết phục tính chất ống ghép mạch máu vơ bào Sau đến thử nghiệm chức động vật lớn Tuy nhiên, kết sơ khởi ban đầu cho thấy phƣơng pháp khử tế bào nghiên cứu đƣợc tạo ống ghép mạch máu từ động mạch cảnh heo ống ghép không độc với tế bào, thể Đây tảng cho nghiên cứu ứng dụng sau Trang 43 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân KẾT LUẬN  Tạo đƣợc ống ghép mạch máu cách khử hoàn toàn tế bào động mạch cảnh heo cách kết hợp SDS 0,5% 24 nƣớc cất 24  Ống ghép mạch máu có tính tƣơng hợp sinh học tốt với tế bào điều kiện in vitro với thể điều kiện in vivo  Ống ghép mạch máu vơ bào hồn toàn phù hợp để ứng dụng kỹ nghệ mạch máu Trang 44 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Amiel G E., et al (2006) Engineering of blood vessels from acellular collagen matrices coated with human endothelial cells 12: 2355-65 Arrigoni C., et al (2006) Vascular tissue engineering 15 Suppl 1: S119-25 Atalan Anthony, Principles of regenerative medicine 2008: Academic Press Bajpai V K., et al (2012) Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration 18: 405-25 Banyard D A., et al (2015) Implications for human adipose-derived stem cells in plastic surgery 19: 21-30 Baroncini L A., et al (2007) Histological composition and progression of carotid plaque 5: Benjamin E J., et al (2017) Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association 135: e146-e603 Berliner Judith A (1995) Atherosclerosis: Basic Mechanisms 91: 24882496 Boer U., et al (2015) Effect of Intensified Decellularization of Equine Carotid Arteries on Scaffold Biomechanics and Cytotoxicity 43: 2630-41 Cao Y., et al (2005) Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo 332: 370-9 Casadei A., et al (2012) Adipose tissue regeneration: a state of the art 2012: 462543 Chang William G., et al (2017) A short discourse on vascular tissue engineering 2: Colazzo F., et al (2014) Shear stress and VEGF enhance endothelial differentiation of human adipose-derived stem cells 32: 139-49 Crapo P M., et al (2011) An overview of tissue and whole organ decellularization processes 32: 3233-43 Daugs A., et al (2017) Detergent-Based Decellularization of Bovine Carotid Arteries for Vascular Tissue Engineering 45: 2683-2692 Duffy J M., et al (2013) Stent graft types for endovascular repair of abdominal aortic aneurysms Cd008447 Ecker R D., et al (2006) Current concepts in the management of intracranial atherosclerotic disease 59: S210-8; discussion S3-13 Fidkowski C., et al (2005) Endothelialized microvasculature based on a biodegradable elastomer 11: 302-9 Fischer L J., et al (2009) Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells: effects of endothelial cell growth supplement and shear force 152: 157-66 Gilbert T W., et al (2006) Decellularization of tissues and organs 27: 3675-83 Gilbert Thomas W (2006) Decellularization of tissues and organs 27: 36753683 Trang 45 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Tô Minh Quân Gilpin A., et al (2017) Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications 2017: 9831534 Goëau-Brissonnière Olivier A., et al (2002) Comparison of the resistance to infection of rifampin-bonded gelatin-sealed and silver/collagen-coated polyester prostheses 35: 1260-1263 Hashi C K., et al (2007) Antithrombogenic property of bone marrow mesenchymal stem cells in nanofibrous vascular grafts 104: 11915-20 He W., et al (2006) Biodegradable polymer nanofiber mesh to maintain functions of endothelial cells 12: 2457-66 Hiles M C., et al (1993) Porosity of porcine small-intestinal submucosa for use as a vascular graft 27: 139-44 Huang N F., et al (2008) Mesenchymal stem cells for vascular regeneration 3: 877-92 Kaushiva A., et al (2007) A biodegradable vascularizing membrane: a feasibility study 3: 631-42 Lehr E J., et al (2011) Decellularization reduces immunogenicity of sheep pulmonary artery vascular patches 141: 1056-62 Levy Bernard I., et al., Biology of the Arterial Wall, ed 2nd 1999: Kluwer Academic Publishers Lin G., et al (2009) Potential of adipose-derived stem cells for treatment of erectile dysfunction Suppl 3: 320-7 Luz P.L da, et al (2004) Wine, alcohol and atherosclerosis: clinical evidences and mechanisms 37: 1275-1295 Mao Z., et al (2015) Predictors associated with stroke after coronary artery bypass grafting: a systematic review 357: 1-7 Parizek M., et al (2011) The role of smooth muscle cells in vessel wall pathophysiology and reconstruction using bioactive synthetic polymers 60: 419-37 Perea-Gil Isaac, et al (2015) In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization 7: 558-573 Planat-Benard V., et al (2004) Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives 109: 656-63 Pu L., et al (2014) [Comparison of aortic extracellular matrix scaffold by different protocols for decellularization] 28: 1413-21 Ravi Swathi (2010) Biomaterials for vascular tissue engineering 5: 1-21 Rodriguez L V., et al (2006) Clonogenic multipotent stem cells in human adipose tissue differentiate into functional smooth muscle cells 103: 1216772 Ross Russell (1999) Atheroslerosis - An inflammatory Disease 340: 115126 Saghizadeh Mehrnoosh, et al (2013) A Simple Alkaline Method for Decellularizing Human Amniotic Membrane for Cell Culture 8: e79632 Trang 46 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Tô Minh Quân Schaner P J., et al (2004) Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering 40: 146-53 Schmidt Christine E (2000) Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering 21: 2215-2231 Seifu D G., et al (2013) Small-diameter vascular tissue engineering 10: 410-21 Stephan S., et al (2006) Cell-matrix biology in vascular tissue engineering 209: 495-502 Stocum David L., Regenerative Bioloy and Medicine 2006, New York: Elsevier Tanaka Hiroshi (2006) Disruption of the Vascular Prothesis Caused by Aortic Calcification After Replacement of the Thoracoabdominal Aortic Aneurysm 82: 1097-1099 Thubrikar Mano J., Vascular Mechanics and Pathology 2007, New York: Springer Science+Business Media Tran Toai Cong, et al., Adipocytes and Osteoblasts from Human Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for the Production of Compatible and Safe Biomaterial Crucial in Cosmetic, Reconstructive, and Regenerative Medicine, in Stem Cells in Aesthetic Procedures: Art, Science, and Clinical Techniques, M.A Shiffman, A Di Giuseppe, and F Bassetto, Editors 2014, Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg p 85-109 Wang Yujia, et al (2016) Genipin crosslinking reduced the immunogenicity of xenogeneic decellularized porcine whole-liver matrices through regulation of immune cell proliferation and polarization 6: 24779 Xu Haiwei, et al (2014) Comparison of Decellularization Protocols for Preparing a Decellularized Porcine Annulus Fibrosus Scaffold 9: e86723 Zhang L., et al (2008) A novel small-diameter vascular graft: in vivo behavior of biodegradable three-layered tubular scaffolds 99: 1007-15 Zhao F., et al (2005) Perfusion bioreactor system for human mesenchymal stem cell tissue engineering: dynamic cell seeding and construct development 91: 482-93 Zhao Y., et al (2010) The development of a tissue-engineered artery using decellularized scaffold and autologous ovine mesenchymal stem cells 31: 296-307 Trang 47 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tô Minh Quân PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kích thƣớc động mạch cảnh thu nhận Chiều dài Mẫu (cm) 10 11 12 13 14 13.3 6.5 7.8 9.5 6.3 8.4 7.7 8.8 9.7 8.9 5.6 9.3 Độ dày (mm) 0.8 0.8 1.3 1.1 0.7 1.4 0.8 0.9 0.9 1.2 0.8 0.9 1.3 Đƣờng kính lớn (cm) 5.6 7.1 6.3 5.5 7.3 5.8 6.1 6.3 6.6 6.6 Đƣờng kính nhỏ (cm) 1.7 3.5 2.9 4.3 2.5 1.8 3.4 2.3 4.2 3.4 3.9 2.1 Phụ lục 2: Kết độc tính trực tiếp Lần Trung bình Độ lệch chuẩn Mẫu thí nghiệm 0.236 0.228 0.229 0.229 0.203 0.225 0.011366618 Trang a Mẫu đối chứng 0.233 0.234 0.235 0.23 0.216 0.2296 0.007002857 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Tơ Minh Qn Phụ lục 3: Kết độc tính dịch chiết Lần Trung bình Độ lệch chuẩn Mẫu đối chúng 0.233 0.229 0.227 0.226 0.223 0.2276 0.00332265 Mẫu thí nghiệm 0.247 0.25 0.247 0.245 0.24 0.2458 0.003310589 Phụ lục 4: Kết đánh giá MTT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 0.2 0.33 0.54 0.92 0.8 0.31 0.4 0.49 0.92 0.89 0.24 0.35 0.59 0.89 0.63 0.275 0.365 0.54 0.92 0.77333 Lần Lần Lần Trung bình Độ lệch chuẩn 0.055678 0.03606 0.05 0.01732 0.13204 Phục lục 5: Kết xử lý thống kê giá trị MTT Anova: Single Factor SUMMARY Groups Column Column Column Column Column ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Count 3 3 SS 0.912867 0.049267 Sum Average Variance 0.75 0.25 0.0031 1.08 0.36 0.0013 1.62 0.54 0.0025 2.73 0.91 0.0003 2.32 0.773333 0.017433 df MS F 0.228217 46.32273 10 0.004927 Trang b P-value 2.02E06 F crit 3.47805 HĐ: 09/2017/HĐ – KHCN – VƯ Total 0.962133 Tô Minh Quân 14 Trang c