Nghiên cứu tổng hợp erlotinib dược dụng cho thuốc điều trị bệnh ung thư

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ERLOTINIB DƯỢC DỤNG CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH UNG THƯ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 06/2016 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu điều chế ứng dụng trị bệnh ung thư erlotinib cho phương pháp điều trị công bố patent số 5,747,498 (1998) từ Cơng ty dược Pfizer thương mại hóa công ty dược OSI PHARMACEUTICALS tên Tarceva Trong phương pháp điều trị nhắm đích, erlotinib loại thuốc có khả qua màng bào, ngăn cản trình tăng sinh mạch, “bắt” tế bào phải chết theo chương trình lập sẵn, giảm khả di bệnh nhân, giảm phát triển tế bào ung thư tăng độ nhạy với thuốc hóa trị Do erlotinib cơng ty dược đầu tư nghiên cứu sản xuất Trong năm gần có nhiều patent, báo đăng ký cơng bố quy trình cải tiến để tổng hợp erlotinib Trên sở tham khảo nhiều tài liệu công bố giới, việc chọn quy trình tổng hợp có hiệu cao để tổng hợp chất trung gian, tổng hợp nối tiếp chất trung gian không qua tinh chế tổng hợp sản phẩm cuối - Tổng hợp ethyl 3,4-bis-(2-methoxyethoxy)benzoat từ ethyl 3,4-dihydroxy benzoat với hiệu suất 80% Độ tính khiết 95,4% (HPLC) - Tổng hợp ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoat với Hiệu suất đạt 87,3%) Độ tinh khiết 95,6% (HPLC) - Tổng hợp nối tiếp ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoat từ ethyl 3,4dihydroxybenzoat không qua tinh chế chất trung gian Hiệu suất 91,2% Độ tinh khiết 92 5% (HPLC) - Tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)benzoat sở khử in situ dẫn xuất nitro benzoat Hiệu suất 91,7% Độ tinh khiết 94,7% (HPLC) - Nghiên cứu quy trình tổng hợp nối tiếp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2methoxyethoxy)benzoat từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoat không qua tinh chế chất trung gian Hiệu suất 82,34% Độ tinh khiết 93,5% (HPLC) I -Tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazolon sở phản ứng đóng vịng với ammonium format formamid Hiệu suất 87% Độ tinh khiết 94,5% (HPLC) - Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazolin điều kiện êm dịu với oxalyl chlorid Hiệu suất 82,7% Độ tinh khiết 95% (HPLC) - Tổng hợp erlotinib hydrochloride Hiệu suất 87,6% Độ tinh khiết 98,2% (HPLC) - Tổng hợp nối tiếp từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoat đến sản phẩm ethyl 2-amino4,5-bis-(2-methoxyethoxy)benzoat thông qua phản ứng trung gian làm quy mô lớn so với phản ứng trước với lần lặp lại Hiệu suất tổng hợp toàn phần vươn lên cao 53,26% so với tổng hợp tương tự quy mô nhỏ (52%) - Để đạt hiệu suất độ tinh khiết cao (đạt 98,4%) trình tinh chế erlotinib cần sử dụng tỉ lệ dung môi EtOAc/nHex 1:1 đến 2:1 Khi tăng số lần kết tinh lặp lại độ tinh khiết sản phẩm tăng hiệu suất giảm nhẹ - Sản phẩm erlotinib có hiệu trị ức chế 50% phát triển tế bào ung thư (ung thư phổi không tế bào nhỏ) NCI-H460 phương pháp SRB (Sulforhodamine B): IC50 = 0,84 ± 0,02 µg/mL - Kết xây dựng phương pháp thẩm định đánh giá độ tinh khiết sản phẩm erlotinib thực máy HPLC Phương pháp sử dụng điều kiện trình bày có tính tương thích cao Phương pháp có độ đặc hiệu độ xác cao Với kết thu cho thấy tổng hợp thành công chất trung gian sản phẩm cuối với hiệu suất độ tinh khiết cao Ngoài ra, nghiên cứu hoàn thiện quy trình tổng hợp nâng cao độ tinh khiết sản phẩm, quy trình tinh chế erlotinib để đạt độ tinh khiết cao xây dựng phương pháp đánh giá độ tinh khiết sản phẩm erlotinib II SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Several initial researches on preparation erlotinib and use in cancer treatment were done and published in patent number 5,747,498 in 1998 by Pfizer pharmaceutical company The drug was commercialized by the company OSI PHARMACEUTICAL named Tarceva In targeted drug delivery application, erlotinib is the drug traveling through the cell membrane, inhibiting cancer cell proliferation, thus, “force” the cancer cells to die follow a pre-established program (Apoptotic pathways), and decrease the chance of metastasis Therefore, aspects on the researching and developing erlotinib to improve its synthesis method and bring forward many patents and research papers have been focused by many pharmaceutical companies in recent years Based on several reference materials published in the world, the most efficiency procedure to synthesize intermediates, continuous synthesize intermediates without purifying to produce the final product is established - Synthesis of ethyl 3,4-bis-(2-methoxyethoxy)benzoate from ethyl 3,4-dihydroxy benzoate with 80% yield Purity is 95,4% (HPLC) - Continuous synthesis of ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoate from ethyl3,4-dihydroxybenzoate without purifying intermediate We achieved 91,2% yield, purity is 92,5% (HPLC) - Synthesis of ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)benzoate based on redox reaction of nitro benzoate derivative Yield is 91,7% Purity is 94,7% (HPLC) - Research on continuous synthesis method of ethyl 2-amino-4,5-bis-(2methoxyethoxy)benzoate from ethyl 3,4-dihydroxybenzoate without purifying intermediates Yield is 82,34% Purity is 93,5% (HPLC) - Synthesis of 6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazoline based on ring closing metathesis with ammonium formate and formamide Yield is 87% Purity is 94,5% (HPLC) III - Synthesis of 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazoline with oxalyl chloride in amber condition Yield is 82,7% Purity is 95% - Synthesis of erlotinib hydrochloride, we achieved 87,6% yield and 98,2% purity (HPLC) The obtained results indicated that we had successfully synthesized all the intermediates and the final product with high yield and purity Presently, we are continuing to improve the synthetic methods - Synthesis of ethyl 3,4-dihydroxybenzoate, ethyl 2-amino-4,5-bis-(2- methoxyethoxy)benzoat products through three intermediate reactions, which was made on a large scale The total yield of the large-scale combined synthesis was 53,26% higher than synthesis in small-scale synthetic method (about 52%) The purity of the product was 98,4% - Obtained erlotinib has been shown a good cytotoxic activity against nonsmall lung cancer cell line NCI-H460 with IC50 = 0,84 ± 0,02 µg/mL Regarding results, the intermediates and final products of erlotinib hydrochloride successfully have been synthesized with high performance and high purity The synthesis and purification processes have also been upgraded to achieve high purity erlotinib hydrochloride product IV MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU TIẾNG VIỆT I TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU TIẾNG ANH II MỤC LỤC IV DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT X DANH SÁCH BẢNG XI DANH SÁCH HÌNH XIII PHẦN MỞ ĐẦU 01 Tóm tắt nội dung cơng việc đăng ký theo đề cương kết đạt 03 Sản phẩm đạt dạng 1-2 05 Sản phẩm đạt dạng 3-4 05 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 06 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 06 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.3 Các phương pháp tổng hợp hiệu thực cho đề tài 14 KẾ HOẠCH TRIỂN KHAI 16 CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 17 Hóa chất 17 Dụng cụ thiết bị 18 2.2 Tổng hợp tiền chất dược dụng erlotinib 18 2.2.1 Tổng hợp ethyl 3,4-bis-(2-methoxyethoxy)-benzoat từ ethyl 3,4dihydroxybenzoat 2-chloromethoxy ethan 18 Thuyết minh quy trình 19 2.2.2 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp ethyl 3,4-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat 19 Khảo sát yếu tố nhiệt độ 19 Khảo sát yếu tố lượng tác chất 20 Khảo sát yếu tố thời gian 20 Khảo sát yếu tố dung môi 21 2.2.3 Tổng hợp 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)-2-nitrobenzoat 21 Thuyết minh quy trình 21 2.2.4 Nghiên cứu quy trình tổng hợp nối tiếp ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)-2nitrobenzoat từ ethyl 3,4 dihydrobenzoat không qua tinh chế trung gian 22 Thuyết minh quy trình 22 2.2.5 Tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis(2-methoxyethoxy)-benzoat sở khử in situ dẫn xuất nitro benzoate 22 Thuyết minh quy trình 22 V 2.2.6 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)-benzoate 23 Khảo sát lượng tác chất 23 Khảo sát dung môi 23 2.2.7 Nghiên cứu quy trình tổng hợp nối tiếp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2methoxy ethoxy)-benzoat từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoat không qua tinh chế chất trung gian 24 Thuyết minh quy trình 24 2.2.8 Tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy-ethoxy)-quinazolon sở phản ứng đóng vịng với ammonium format formamid 25 Thuyết minh quy trình 25 2.2.9 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy-ethoxy)-quinazolon 25 Nhiệt độ phản ứng 26 Thời gian phản ứng 26 Lượng tác chất ammonium format 26 2.2.10 Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxy-ethoxy)-quinazolin điều kiện êm dịu với oxalyl chlorid 26 2.2.11 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 27 Ảnh hưởng dung môi DMF đến hiệu suất phản ứng 27 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng 27 Ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất phản ứng 27 2.2.12 Tổng hợp Erlotinib hydrochlorid 28 2.2.13 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 29 Ảnh hưởng dung môi phản ứng lên hiệu suất thu hồi sản phẩm 29 Tổng hợp Erlotinib dung môi isopropanol với xúc tác pyridine 29 Ảnh hưởng lượng tác chất 4-ethynylphenylamin lên hiệu suất phản ứng 30 2.3 Ổn định quy trình tổng hợp nâng cao độ tinh khiết sản phẩm dựa kết từ q trình thăm dị điều kiện phản ứng 30 2.3.1 Thực thí nghiệm lặp lại để đánh giá độ ổn định tồn quy trình tổng hợp Erlotinib 30 - Tổng hợp nối tiếp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoat không qua tinh chế chất trung gian 30 Thuyết minh quy trình 31 - Tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy-ethoxy)-quinazolon sở phản ứng đóng vịng với ammonium format formamid 31 Thuyết minh quy trình 32 - Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxy ethoxy)-quinazolin điều kiện êm dịu với oxalyl chlorid 32 Thuyết minh quy trình 32 - Tổng hợp Erlotinib hydrochlorid 33 VI Thuyết minh quy trình 33 2.3.2 Nghiên cứu quy trình tinh chế erlotinib để đạt độ tinh khiết cao 33 2.4 Xây dựng tiêu chuẩn 33 2.4.1 Xây dựng phương pháp đánh giá độ tinh khiết sản phẩm Erlotinib 33 Điều kiện sắc ký 34 Tính tương thích hệ thống 34 Thẩm định phương pháp 34 Tính đặc hiệu 34 Khoảng tuyến tính 35 Độ xác 35 Độ 35 Giới hạn định lượng (LOD) 36 2.4.2 Kết thử nghiệm độc tính tế bào theo nồng độ (cơ sở để xác định giá trị IC50) với dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 37 Nguyên tắc phương pháp đánh giá 37 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc phương pháp SRB 37 Thiết kế khảo sát 38 Xử lý kết 38 2.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở 39 Phương pháp đánh giá 39 Tính chất 39 Định tính 39 Định lượng 40 Xác định hàm lượng kim loại nặng 41 Điều kiện bảo quản 41 CHƢƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết tổng hợp sản phẩm trung gian Erlotinib 42 3.1.1 Tổng hợp ethyl 3,4-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat từ ethyl 3,4dihydroxybenzoat 2-chloromethoxy ethan 42 3.1.2 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 45 Kết khảo sát yếu tố nhiệt độ 45 Kết khảo sát yếu tố lượng tác chất 46 Kết khảo sát yếu tố thời gian 47 Kết khảo sát yếu tố dung môi 48 3.1.3 Tổng hợp 4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)-2-nitrobenzoat 49 3.1.4 Nghiên cứu quy trình tổng hợp nối tiếp ethyl 4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)2-nitrobenzoat từ ethyl 3,4 dihydrobenzoat không qua tinh chế trung gian 51 3.1.5 Tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat sở khử in situ dẫn xuất nitro benzoat 53 3.1.6 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 55 VII Kết khảo sát yếu tố lượng tác chất 55 Kết khảo sát yếu tố dung môi 56 3.1.7 Kết ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat tạo thành sau phản ứng kết hợp giai đoạn không tinh chế 56 3.1.8 Kết tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy ethoxy)-quinazolon sở phản ứng đóng vịng với ammonium format formamid 57 3.1.9 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy ethoxy)-quinazolon 59 Nhiệt độ phản ứng thời gian phản ứng 59 Lượng tác chất ammonium format 60 3.1.10 Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxy ethoxy)-quinazolin 61 3.1.11 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 63 Ảnh hưởng xúc tác (dung môi dimethyl formamid-DMF) đến hiệu suất phản ứng 63 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng 65 Ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất phản ứng 65 3.1.12 Tổng hợp Erlotinib hydrochlorid 66 3.1.13 Khảo sát yếu tố lượng tác chất, nhiệt độ dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 69 Ảnh hưởng dung môi 69 Ảnh hưởng lượng tác chất 4-ethynylphenylamin lên hiệu suất phản ứng 69 3.2 Ổn định quy trình tổng hợp nâng cao độ tinh khiết sản phẩm dựa kết từ trình thăm dò điều kiện phản ứng 70 3.2.1 Tổng hợp nối tiếp thí nghiệm lặp lại quy trình tổng hợp erlotinib hydrochloride 70 - Tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxy ethoxy)-benzoat từ ethyl 3,4dihydroxybenzoat không qua tinh chế chất trung gian 70 - Tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxy-ethoxy)-quinazolon 71 - Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxy ethoxy)-quinazolin điều kiện êm dịu với oxalyl chlorid 71 - Tổng hợp Erlotinib hydrochlorid 71 3.2.2 Kết nghiên cứu quy trình tinh chế erlotinib tổng hợp để đạt độ tinh khiết cao 72 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn 73 3.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá độ tinh khiết sản phẩm Erlotinib 73 Thẩm định phương pháp 74 Tính đặc hiệu 74 Khoảng tuyến tính 75 Độ xác 76 Độ 76 Giới hạn phát (LOD) 77 VIII 3.3.2 Kết thử nghiệm độc tính tế bào theo nồng độ (cơ sở để xác định giá trị IC50) 77 3.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở 80 Tính chất 80 Định tính 80 Định lượng 82 Xác định hàm lượng kim loại nặng máy AAS 3300 82 Hiệu trị ức chế 50% phát triển tế bào ung thư 82 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 83 PHỤ LỤC 85 THƢ CAM KẾT VỀ SẢN PHẨM BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 IX - Khoảng tuyến tính: Yêu cầu: Hệ số tương quan R2≥0,995 Bảng 37 Các nồng độ erlotinib hydrochloride d ng để lập đường chuẩn Nồng độ (µg/mL) Diện tích peak 59,824 25 304,98 50 618,44 100 1435,1 250 3443,6 ERLOTINIB, DAD1 B Area = 13.8994292*Amt -19.128817 Area Rel Res%(1): 18.773 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Correlation: 0.99951 100 200 Amount[ug/mL] Hình 46 Đường chuẩn erlotinib hydrochloride DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 B, B, B, B, B, Sig=247,16 Sig=247,16 Sig=247,16 Sig=247,16 Sig=247,16 Ref=550,100 Ref=550,100 Ref=550,100 Ref=550,100 Ref=550,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\QUYEN\ERLO0000.D) (C:\HPCHEM\1\DATA\QUYEN\ERLO0001.D) (C:\HPCHEM\1\DATA\QUYEN\ERLO0002.D) (C:\HPCHEM\1\DATA\QUYEN\ERLO0003.D) (C:\HPCHEM\1\DATA\QUYEN\ERLO0004.D) 9.619 mAU 140 120 100 9.768 80 60 9.948 9.891 1.499 1.500 1.501 1.887 1.889 20 9.853 40 10 12 Hình 47 Sắc ký đồ HPLC mẫu lập đường chuẩn Phương trình hồi quy: y = 13,899 x - 19,129 Nhận xét: Phương pháp tuyến tính bậc khoảng từ đến 250 µg/mL với Hệ số tương quan : R2 = 0,9995 75 Độ xác : Yêu cầu: RSD ≤ 2% - Bảng 38 Kết qủa xác định độ xác RSD Mẫu Diện tích 618,40 624,10 620,90 622,70 626,20 622,10 TB 622,40 %RSD 0,43 Nhận xét: Phương pháp có độ xác cao với độ lệch tương đối 0,43% - Độ đúng: Bảng 39 Thông số từ mẫu đo để đánh giá độ xác RSD (%) Mẫu thơ Mẫu thêm chuẩn 80% Mẫu thêm 100% Mẫu thêm 120% KL Nồng Diện Nồng % tỷ lệ (mg) đồ Lý tích pic độ tìm phục thuyết thấy hồi (ppm) (ppm) 5,2 737,4 51,68 4,1 1226,3 86,58 99,62 1227,3 86,92 99,7 4,1 1225,4 86,79 99,55 1354,7 96,09 99,96 1352,5 95,93 99,80 1355,7 96,16 100,04 1484,8 105,45 99,42 1491,5 105,93 99,87 1507,3 107,07 100,95 4,1 6 87,18 96,12 106,06 TB RSD% 99,62 0,001 99,93 0,001 100,08 0,008 Nhận xét: tỉ lệ phục hồi khoảng 99,62 - 100,08 Phương pháp đạt độ xác cao 76 - Giới hạn phát (LOD) Bảng 40 Cơ sở xác định nồng độ LOD LOQ TN Diện tích 618,40 624,10 620,90 622,70 626,20 622,10 TB 622,40 SD 11,16 LOD 2,65 LOQ 8,74 Nhật xét: Phương pháp có LOD 2,65 µg/mL, LOQ 8,74 µg/mL 3.3.2 Kết thử nghiệm độc tính tế bào theo nồng độ (cơ sở để xác định giá trị IC50) Kết thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư khơng nhỏ (NCI-H460) Hoạt chất erlotinib sàng lọc nồng độ thử 10 g/mL Kết sàng lọc ban đầu cho thấy, hoạt chất erlotinib có khả ức chế 50% phát triển tế bào ung thư nồng độ thử chất Vì vậy, hoạt chất erlotinib lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu xác định giá trị IC50 (Inhibition concentration at 50%) giá trị nồng độ hoạt chất bắt đầu ức chế 50% phát triển tế bào ung thư Kết nghiên cứu trình bày bảng 41, bảng 42 77 Bảng 41 Kết hình ảnh khảo sát độc tố tế bào 160,3 (7,5 g/mL) 160,3 (7,5 g/mL) 160,3 (5 g/mL) 160,3 (5 g/mL) 160,3 (2,5 g/mL) 160,3 (2,5 g/mL) 160,3 (0,5 g/mL) 160,3 (0,5 g/mL) 160,4 (10 g/mL) 160,4 (10 g/mL) 78 160,3 (7,5 g/mL) 160,3 (7,5 g/mL) 160,3 (5 g/mL) 160,3 (5 g/mL) 160,3 (2,5 g/mL) 160,3 (2,5 g/mL) 160,3 (0,5 g/mL) 160,3 (0,5 g/mL) 79 Bảng 42 Kết xác định giá trị IC50 hoạt chất erlotinib Phần trăm gây độc tế bào (%) Nồng độ Mẫu Erlotinib (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 10 86,92 84,26 84,00 87,06 ± 1,62 7,5 85,75 87,17 86,73 86,55 ± 0,72 82,48 82,51 82,49 82,49 ± 0,02 2,5 79,06 79,13 78,52 78,90 ± 0,33 0,5 44,59 44,01 43,78 44,12 ± 0,42 IC50 = 0,84 ± 0,02 TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn 3.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở (tham khảo phụ lục 1-2) Tính chất Erlotinib hydrochloride thu sau kết tinh: dạng bột màu trắng ngà hay màu vàng nhạt Định tính - Nhiệt độ nóng chảy: 225,5-227 °C - Phổ hấp thụ UV-Vis hợp chất xuất peak hấp thu bước sóng: 247nm 345 nm Hình 48 Phổ hấp thụ UV-Vis hợp chất erlotinib hydrochloride - Phổ 1H-NMR (Dung mơi DMSO) cho tín hiệu đặc trưng: 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,13 (s,1H, NH), 8,70 (s,1H, HAr), 8,14 (s,1H, H-Ar), 7,707,81 (m,2H, H-Ar), 7,28-7,51 (m,3H, HAr), 4,31-4,32 (m,4H,2 CH2O), 3,743,77 (m,4H,2 CH2O), 3,67 (s,1H, ethynyl), 3,32-3,34 (d,6H,2x OCH3) 80 Hình 49 Phổ đồ 1H-NMR hợp chất erlotinib hydrochloride - Khối phổ HRMS (ES-API-MS) với peak ion phân tử: [M+35Cl]- 428,0; 37 - [M+37Cl-H]- 429,0; [M+ Cl] 430,9 phù hợp với khối lượng phân tử MLT = 429,9 đặt điểm cấu trúc Hình 50 Khối phổ HR-MS hợp chất erlotinib hydrochloride Ion clorid Có phản ứng hóa học Ion clorid Mất khối lượng làm khơ Mất khối lượng làm khô không 0,5% Tro Sulfat Hàm lượng tro sulfat mẫu erlotinib hydrochlorid không 0,1% 81 Định lượng Mẫu pha dung mơi methanol phân tích bước sóng 247 nm với pha động: dung dịch 0,1% Formic Acid: Acetonitril cho thời gian lưu 9,904 phút Hình 51 Sắc ký đồ HPLC mẫu erlotinib hydrochloride Xác định hàm lượng kim loại nặng máy AAS 3300: Pb: 4,82 ppm Cd: KPH (LOD = 0,0005) Hg: KPH (LOD = 0,002) Kết xác định hàm lượng kim loại nặng Palladium (Pd), Cadmium (Cd) Mercury (Hg) tồn đọng sản phẩm erlotinib hydrochloride xác định nằm mức độ giới hạn cho phép đồng thời đảm bảo độ an toàn sử dụng sản phẩm sử dụng y dược (USP 35-NF 30) [20-22] Hiệu trị ức chế 50% phát triển tế bào ung thư (ung thư phổi với không tế bào nhỏ NCI-H460 phương pháp SRB (Sulforhodamine B): IC50 = 0,84 ± 0,02 µg/mL 82 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Dựa kết phân tích định tính, phương pháp phân tích cấu trúc khác phương pháp phân tích định lượng, nhóm thực hện đề tài xác định tổng hợp thành công năm tiền chất ethyl 3,4-bis-(2methoxyethoxy)benzoat, ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoat, ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)benzoat,6,7-bis-(2methoxyethoxy)quinazolon,4-chloro-6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazolin sản phẩm erlotinib hydrochlorid Nhóm thực hện đề tài khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp tương ứng với quy trình tổng hợp bốn tiền chất lượng tác chất, dung môi, nhiệt độ, thời gian để chọn thông số cho hiệu suất cao Đồng thời quy trình tổng hợp nối tiếp khơng qua tinh chế số giai đoạn nghiên cứu Các nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết sản phẩm quy trình đánh giá độ ổn định sản phẩm thực hiện, cụ thể: - Tổng hợp ethyl 3,4-bis-(2-methoxyethoxy)benzoate với hiệu suất 80% Độ tính khiết 95,4% (HPLC) -Tổng hợp ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoate với Hiệu suất đạt 87,3%) Độ tinh khiết 95,6% (HPLC) - Tổng hợp nối tiếp ethyl 4,5-bis-(2-methoxyethoxy)2-nitrobenzoate từ ethyl 3,4dihydroxybenzoate không qua tinh chế chất trung gian Hiệu suất 91,2% Độ tinh khiết 92,5% (HPLC).0 - Tổng hợp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)benzoate sở khử in situ dẫn xuất nitro benzoate Hiệu suất 91,7% Độ tinh khiết 94,7% (HPLC) - Nghiên cứu quy trình tổng hợp nối tiếp ethyl 2-amino-4,5-bis-(2methoxyethoxy)benzoate từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoate không qua tinh chế chất trung gian Hiệu suất 82,34% Độ tinh khiết 93,5% (HPLC) - Tổng hợp 6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazolone sở phản ứng đóng vịng với ammonium formate formamide Hiệu suất 87% Độ tinh khiết 94,5% (HPLC) 83 - Tổng hợp 4-chloro-6,7-bis-(2-methoxyethoxy)quinazoline điều kiện êm dịu với oxalyl Chloride Hiệu suất 82,7% Độ tinh khiết 95% (HPLC) - Tổng hợp 12.5g erlotinib hydrochloride Hiệu suất 87,6% Độ tinh khiết 98,2% (HPLC) - Hiệu suất phản ứng tổng hợp erlotinib qua trình tinh chế sau phản ứng cho hiệu suất toàn phần 43% - Hiệu suất phản ứng tổng hợp erlotinib sử dụng bước nối tiếp trình tổng hợp chất trung gian khơng qua tinh chế sau phản ứng cho hiệu suất toàn phần 53,26% với độ tinh khiết đạt 98,4% (sau lần kết tinh) - Sản phẩm erlotinib có hiệu trị ức chế 50% phát triển tế bào ung thư (ung thư phổi không tế bào nhỏ) NCI-H460 phương pháp SRB (Sulforhodamine B): IC50 = 0,84 ± 0,02 µg/mL - Đã xây dựng phương pháp thẩm định đánh giá độ tinh khiết sản phẩm erlotinib HPLC Phương pháp sử dụng điều kiện trình bày có tính tương thích, độ đặc hiệu độ xác cao Độ tinh khiết sản phẩm số tiêu hóa lý thẩm định Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM Kiến nghị Sở Khoa học Cơng nghệ tiếp tục tài trợ kinh phí để nhóm thực hện đề tài nâng cấp quy trình phản ứng lên quy mô pilot 84 PHỤ LỤC STT Nội Dung Phiếu kiểm nghiệm kiểm tra chất lượng – xác định tiêu chuẩn cở Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM cho mẫu Erlotinib hydrochloride Phiếu kết kiểm nghiệm xác định hàm lượng kim loại nặng máy AAS 3300 Viện Cơng Nghệ Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam Sản phẩm báo: “Nghiên cứu tổng hợp toàn phần erlotinib làm nguyên liệu cho thuốc điều trị ung thư” (7/2015) đăng Tạp Chí Dược Học, số 471 Năm 55, trang 43-49 Sản phẩm báo: “IMPROVED SYNTHESIS OF ERLOTINIB PHARMACEUTICAL INGREDIENT BY ONE-POT SYNTHETIC SEQUENCES” (2015) đăng Tạp Chí Hóa Học – Vietnam Journal of Chemistry, số 53(4e3), trang 158-161 Sản phẩm đào tạo: Quyết định việc giao đề tài luận văn thạc sĩ - Trường Đại học Cần Thơ (4010/QĐ-ĐHCT) ký ngày 27 tháng 10 năm 2015 Học viên cao học: Vương Xuân Mai Tên đề tài: Nghiên Cứu Hồn Thiện Quy Trình Tồng Hợp Thuốc Erlotinib Sản phẩm đào tạo: Báo cáo khóa luận tốt nghiệp sinh viên Trần Thị Cẩm Tú Trường Đại học: Tôn Đức Thắng Tên đề tài: Nghiên Cứu Cách Điều Chế 4-Chloro-6,7-Bis(2-Methoxy Ethoxy)Quinazoline Làm Nguyên Liệu Tổng Hợp Dược Chất Erlotinib Sản phẩm đào tạo: Báo cáo khóa luận tốt nghiệp sinh viên Bùi Thị Thúy Hạnh Trường Đại học: Tôn Đức Thắng Tên đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp Tiền Chất Của Dược Chất Erlotinib Sản phẩm đào tạo: Báo cáo nghiên cứu khoa học sinh viên Nguyễn Thị Hường Trường Đại học: Lạc Hồng Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp tiền chất dược chất Erlotinib Sản phẩm đào tạo: Hợp đồng hướng dẫn khóa luận tốt nghiệp Trường Đại học Quốc Tế - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 10 Sinh viên: Trịnh Hải My Tên đề tài: Synthesis of Erlotinib Hydrochloride from 4-chloro-6,7 bis-(2-methoxyethoxy)quinazoline 85 CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc -o0o - THƢ CAM KẾT Kính gửi Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM Tôi tên Trần Ngọc Quyển công tác phịng Vật liệu Hóa dược Viện Khoa học Vật liệu ứng Dụng chủ nhiệm đề tài: Nghiên cứu tổng hợp Erlotinib dược dụng làm nguyên liệu cho thuốc điều trị ung thư Đề tài tài trợ Sở Khoa học Công nghệ Tp.HCM Một số sản phẩm đề tài công bố báo kết đề tài Tuy nhiên báo thiếu mã số hợp đồng tài trợ thiếu đơn vị tài trợ cam đoan báo kết nghiên cứu tài trợ từ Sở Khoa học Công nghệ TpHCM Trân trọng cảm ơn Sở Khoa học Cơng nghệ Tp.HCM tài trợ kinh phí cho nhóm nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài TS Trần Ngọc Quyển 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] David Harding, Gaining market share in the generic drug industry through acquisitions and partnerships, Thomson Reuter, 2010 [2] Caicun Z and al., Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: a multicentre, open-label, randomised, phase study, Lancet Oncol, 2011, 12: 735-42 [3] Rodney Caughren Schnur, Lee Daniel Arnold, Anlkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines, United Stases Patent, Appl, 1998, No: 653-786 [4] Petr Knesl, Dirk Röseling and Ulrich Jordis, Improved Synthesis of Substituted 6,7-Dihydroxy-4-quinazolineamines: Tanduerlotinib, Erlotinib and Gefierlotinib, Molecules, 2006, 11: 286-297 [5] Venkateshappa Chandregowda, Gudapati Venkateswara Rao, Goukanapalli Chandrasekara Reddy, Improved Synthesis of Gefierlotinib and Erlotinib Hydrochloride‐ Anticancer Agents, Vittal Mallya Scientific Research Foundation, Bangalore, India, 2007 [6] Venkateshappa Chandregowda, Gudapati Venkateswara Rao, and Goukanapalli Chandrasekara Reddy, Convergent Approach for Commercial Synthesis of Gefierlotinib and Erlotinib, Organic Process Research & Development, 2007, 11: 813-816 [7] Levin, J I., Turos, E., Weinreb, S M., Syn Com., 1982, 12 [8] Amidation of esters and nitriles with aluminum alkyls, Technical Bulletin, 2008 [9] Leila Barghi, Ayuob Aghanejad, Hadi Valizadeh, Jaleh Barar, Davoud Asgari, Modified Synthesis of Erlotinib Hydrochloride, Advanced Pharmaceutical Bulletin, 2012, 2(1): 119-122 87 [10] Gengzhen Zhang, Linlin Zha., Isolation of highly pure Erlotinib hydrochloride by recrystallization after nucleophilic substitution of an impurity with piperazine, Res Chem Inter, 2012, Doi 10 1007/s11164-0120757-9 [11] Oncology Symposium on Lung and Liver Cancer, Vietnamese Oncology Association, 2013, Hanoi, Vietnam [12] Eunyoung Byun, Bomi Hong, Kathlia A De Castro, Minkyung Lim, and Hakjune Rhee, One-Pot Reductive Mono-N-alkylation of Aniline and Nitroarene Derivatives Using Aldehydes, J Org Chem., 2007, 72: 9815 9817 [13] Kothakonda Kiran Kumar, Rey Allan W, Guntoori Bhaskar Redd, WO2010040212 processes for the preparation of erlotinib hydrochloride, 2012 [14] Chen Yan-Ping, Tsai Feng-Nien, Tien Yao-Jun, TW201100390 Crystalline polymorph of erlotinib hydrochloride nanoparticles and the manufacturing process thereof, 2011 [15] Parthasaradhi reddy, Bandi and al., Novel Hydrated Form of Erlotinib Free Base and a Process for Preparation of Erlotinib Hydrochloride Polymorph Form a Substantially Free of Polymorph Form B, United States patent application 20120022256, 2012 [16] Grands, J R., Sok, J C., Signaling through the epidermal growth factor receptor during the development of malignancy, Pharmacol Ther., 2004, 37:102 [17] Chandregowda V., Kush A K., Chandrasekara Reddy G., Synthesis and in vitro antitumor activities of novel 4-anilinoquinazoline derivatives, European Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 44(7): 3046-3055 [18] Elliot R Alexander, Ruth Bowman Wildman, Studies on the Mechanism of the Leuckart Reaction, J Am Chem Soc., 1948, 70 (3): 1187-1189 [19] Jones, G., Stanforth, S P., Org React., 2000, 56: 355 88 [20] Q3D Elemental Impurities Guidance for Industry, U S Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 2015 [21] Elemental Impurities—Limits - Chemical Tests, Second Supplement to USP 35-NF 30 [22] Guideline on The Specification Limits for Residues of Metal Catalysts, Committee for Human Medicinal Products (CHMP), European Medicines Agency, Pre-Authorisation Evaluation of Medicines For Human Use, London, 2007 89