Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất naja kaouthia và hổ chúa ocpgs tsphiophagus hannah trên thỏ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ VIỆN PASTEUR TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU (đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội Đồng nghiệm thu ngày 5/11/2009) NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TẠO HUYẾT THANH KHÁNG ðA ðỘC TỐ HAI LOẠI RẮN HỔ ðẤT (Naja kaouthia), VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ Chuû nhiệm đề tài: PGS.TS NGUYỄN LÊ TRANG Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2009 BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (Naja kaouthia) hổ chúa (Ophigophagus hannah) thỏ Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS NGUYỄN LÊ TRANG Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU Cơ quan chủ trì: VIỆN PASTEUR TP.HCM Thời gian thực đề tài: 23 tháng (11/2007- 9/2009) Kinh phí duyệt: 320.000.000 đồng Kinh phí cấp đợt 1: 240.000.000 đồng theo TB 224 -12/11/2007 Kinh phí cấp đợt 2: 48.000.000 đồng theo TB 83 - 21/4/2009 Danh sách người tham gia đề tài: Họ tên STT Học hàm, học vị Cơ quan Võ Thị Mỹ Duyên Th.S Sinh học Viện Pasteur TP.HCM Đỗ Thị Châm CN Sinh học ” Lạc Ngọc Thêm CN Xét nghiệm ” Dương Ngọc Diễm CN Sinh học ” Doãn Thị Sim ” Mục tiêu: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (Naja kaouthia) hổ chúa (Ophigophagus hannah) thỏ Nội dung: Công việc dự kiến Công việc thực Xác định độc lực nọc rắn hổ - Độc lực nọc rắn hổ đất: đất hổ chúa LD50= 5,93 µg/chuột 18-20 gam - Độc lực nọc rắn hổ chúa: LD50= 9,44 µg/chuột 18-20 gam I Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ - Đã tiến hành tinh chế độc tố qua hai giai đoạn đất hổ chúa xác định độc sắc ký lọc Sephadex G-50 sắc ký trao lực độc tố đổi ion Biorex-70 - Đã xác định thành phần gây độc nọc hai loại rắn Kết tóm tắt bảng (trang 20) bảng (trang 24) * Độc lực độc tố peak 3.1 (sau sắc ký trao đổi ion) nọc hổ đất: LD50 = 0,77µg/chuột 18-20 gam * Độc lực độc tố peak (sau sắc ký lọc) nọc hổ chúa: LD50 = 3,02 µg/chuột 18-20 gam Tạo huyết kháng độc tố - Lô I: thỏ (đánh số 17, 18, 19) gây hai loại rắn thỏ miễn dịch với độc tố peak 3.1 nọc rắn hổ đất - Lô II: thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) gây miễn dịch với độc tố peak nọc rắn hổ chúa - Lô III: thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) gây miễn dịch với hai loại độc tố Sau trình gây miễn dịch, thu nhận kháng huyết lưu trữ kháng thể dạng tủa ammonium sulfate bão hòa 50%, 40C II Theo dõi đáp ứng miễn dịch - Tất thỏ có kháng thể đặc hiệu đối phản ứng ELISA với thành phần kháng nguyên đưa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng dần cao huyết sau lần tiêm thứ giảm huyết sau lần tiêm thứ - Sử dụng huyết sau lần tiêm thứ thứ tư để thực phản ứng trung hòa chuột Xác định khả trung hòa - Huyết kháng độc tố thần kinh rắn hổ huyết kháng độc tố đất có khả trung hòa với nọc rắn hổ đất nọc toàn phần chuột nọc rắn hổ chúa - Huyết kháng độc tố thần kinh rắn hổ chúa khơng có khả trung hịa với nọc hổ chúa (theo qui trình gây miễn dịch đề tài) Đây vấn đề cần nghiên cứu thêm - Huyết kháng đa độc tố hai loài rắn hổ đất rắn hổ chúa có khả trung hòa với nọc rắn hổ đất nọc rắn hổ chúa Kháng huyết đa giá cải thiện hiệu giá trung hòa nọc rắn hổ chúa so với tác dụng trung hòa chéo huyết kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất Tuy nhiên tác dụng trung hòa nọc rắn hổ đất bị giảm Viết báo cáo Hoàn thành báo cáo III Sản phẩm đề tài: Kết xác định độc lực nọc rắn hổ đất hổ chúa chuột nhắt trắng Độc tố nọc rắn hổ đất hổ chúa sau tinh chế Các thành phần gây độc nọc hổ chúa hổ đất sau tinh chế Kết xác định độc lực thành phần gây độc Kháng thể thỏ kháng độc tố rắn hổ đất hổ chúa dạng tủa ammonium sulfate bão hòa 50% Kết xác định hiệu lực trung hịa nọc tồn phần loại kháng thể thỏ (kháng độc tố hổ đất, kháng độc tố hổ chúa, kháng độc tố hỗn hợp) sau tinh chế chuột Báo cáo nghiệm thu đề tài IV TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH ĐA ĐỘC TỐ KHÁNG HAI LOÀI RẮN HỔ ĐẤT (Naja kaouthia) VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ Các phân đoạn độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp tinh chế từ nọc hai loài rắn hổ đất hổ chúa Đây phân đoạn độc tố gây chết chủ yếu nọc Kháng huyết chế tạo cách gây miễn dịch lô thỏ: lô I- gây miễn dịch với độc tố thần kinh nọc rắn hổ đất; lô II- gây miễn dịch với độc tố thần kinh nọc hổ chúa lô III- gây miễn dịch với phức hợp hai loại độc tố Huyết kháng độc tố rắn hổ đất thỏ lơ I có khả trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá 60 LD50/mL huyết thanh, đồng thời có tác dụng trung hòa chéo nọc rắn hổ chúa với hiệu giá 13,3 LD50/mL huyết Huyết kháng đa độc tố thỏ lơ III có khả trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá 35 LD50/mL huyết trung hòa nọc hổ chúa với hiệu giá 25 LD50/mL huyết Huyết kháng độc tố rắn hổ chúa thỏ lơ II khơng có khả trung hòa nọc hổ chúa phân đoạn độc tố hổ chúa V SUMMARY OF RESEARCH CONTENT PRODUCTION OF ANTI-POLYTOXINS AGAINST TWO ELAPID VENOMS : Naja kaouthia AND Ophiophagus hannah Low molarcular weigh neurotoxin fractions were isolated from the venom of Naja kaouthia and Ophiophagus hannah These fractions were the major lethal toxin fractions in these venoms Antisera were prepared by immunizing rabbits with the Naja kaouthia neurotoxin fraction (group I), the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction (group II) and the mixture of both neurotoxin fractions (group III), respectively The potency of sera from group I and group III rabbits against the toxicity of the Naja kaouthia venom were 60 LD50 and 35 LD50/ml serum The serum of group II rabbits gave no protection against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom as well as of the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction The potency of sera from group I and group III against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom were 13 LD50 and 25 LD50/ml serum VI MỤC LỤC Trang Tóm tắt báo cáo I Mục lục VII Danh sách chữ viết tắt X Danh sách bảng XI Danh sách hình XI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm nọc độc rắn 1.2 Độc tố nọc rắn hổ 1.3 Huyết kháng nọc rắn hổ 1.4 Huyết đơn giá huyết đa giá kháng nọc rắn 1.5 Tình hình sản xuất huyết kháng nọc giới Việt Nam Đặt vấn đề CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp xác định độc lực nọc rắn hổ đất hổ chúa 3.1.1 Vật liệu 3.1.2 Phương pháp 3.1.2.1 Các thông số kỹ thuật 3.1.2.2 Gây nhiễm 3.2 Phương pháp tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất nọc rắn hổ chúa 3.2.1 Vật liệu 3.2.2 Phương pháp 3.3 Phương pháp tạo huyết kháng độc tố hai loài rắn hổ đất 1.6 hổ chúa 3.3.1 Vật liệu 3.3.2 Phương pháp 10 VII 3.4 Phương pháp kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch thỏ 10 3.4.1 Nguyên tắc 10 3.4.2 Vật liệu 10 3.4.3 Phương pháp 11 3.5 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với độc tố 11 phản ứng ELISA 3.5.1 Phương pháp gắn biotin vào độc tố 11 3.5.2 Kỹ thuật ELISA hai kháng nguyên kẹp kháng thể 12 3.6 Phương pháp tách lưu trữ kháng thể kỹ thuật tủa với 13 ammonium sulfate 50% độ bão hòa 3.6.1 Nguyên tắc 13 3.6.2 Vật liệu 14 3.6.3 Tiến hành 14 3.7 Phương pháp xác định hiệu lực trung hịa độc lực nọc tồn phần 15 kháng thể kháng độc tố chuột 3.7.1 Vật liệu thông số kỹ thuật 16 3.7.2 Phản ứng trung hòa 16 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 4.1 Kết 18 4.1.1 Xác định độc lực nọc rắn hổ đất hổ chúa 18 4.1.2 Tinh chế độc tố xác định độc tính 18 4.1.2.1 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) 18 a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 18 b) Tinh chế độc tố nọc rắn hổ đất qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70 19 c) Phân tích độ tinh khiết peak 3.1 điện di gel SDS-PAGE gradient 8- 20 18% 4.1.2.2 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ chúa (Ophigophagus hannah) a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine VIII 21 21 b) Tinh chế độc tố nọc hổ chúa qua sắc ký trao đổi ion Bio-Rex 70 22 c) Phân tích độ tinh khiết độc tố điện di gel SDS- PAGE gradient 8- 23 18% 4.1.3 Gây miễn dịch theo dõi đáp ứng miễn dịch 25 4.1.3.1 Gây miễn dịch lơ thỏ thí nghiệm 25 4.1.3.2 Theo dõi đáp ứng miễn dịch phương pháp khuếch tán miễn dịch kép 25 Ouchterlony 4.1.3.3 Theo dõi đáp ứng miễn dịch phương pháp Elisa 26 4.1.4 Xác định khả trung hòa huyết kháng độc tố nọc 29 toàn phần chuột 4.1.4.1 Khả trung hịa nọc hổ đất tồn phần 29 4.1.4.2 Khả trung hịa nọc hổ chúa tồn phần 29 4.1.4.3 Khả trung hòa độc tố peak nọc hổ chúa 30 4.2 Bàn luận 30 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 37 PHỤ LỤC 44 PHỤ LỤC 47 IX Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO Anuradthani K., A Rajitha W., Nilanthi de Siva, N Kithsiri G., Arunasadam P., Ranjan P., Lorenzo S., David G Lalloo, H Janaka de Silva, 2008 The global burden of snakebite: A literature analysis and modelling based on regional estimates of envenoming and deaths PLoS Medicine Songsumard, S., 1995 Snakebite in Thailand Annual Epidemiology Surveillance Report, Ministry of Public Health, pp 324-333 Karlsson E (1979) Chemistry of protein toxins in snake venoms In Snake Venom (Edited by Lee C Y.),pp 195-212 Springer, Berlin Lee C Y (1972) Chemistry and Pharmacology of polypeptide toxins in snake venoms A Rev Pharmac 12, 265-281 GANTHAVORN, S (1969) Toxicities of Thailand snake venons and neutralization capacity of antivenin Toxicon7, 239 Rojas, G., Bogarin, G.,Gutierrez, J.M., 1997 Snakebite mortality in Costa Rica Toxicon 35, 1639–1643 Theakston RDG, Reid HA Development of a simple assay procedure for the characterisation of snake venoms Bull WHO 1983; 61:949–56 Maldelbaum FR, Assakura MT Antigenic relationship of haemorrhagic factors and proteases isolated from the venoms of three species of Bothrops snakes Toxicon 1998; 26(4):379–85 Schöttler WH Antigen–antibody relations in the present antivenom production of Brazil Am J Trop Med 1951;31:500 10 Theakston RDG The application of immunoassay techniques including the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to snake venom research Toxicon 1983; 21:341–52 11 Leera Chinonavanig Antigenic relationships and relative immunogenicities of venom proteins from six poisonous snakes of Thailand, Toxicon 1988, 26:883890 -33- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ 12 Patcharee Suntrornan Preparation, characterization and immunogenicity of various polymers and conjugates of elapid postsynaptic neurotoxins Molecular Immunology 1992, 29:501-510 13 Campbell C H Symptomatology, pathology, and treatment of the bites of elapid snakes In Snake Venoms (Edited by Lee C.Y.), 1979; 898-921 Springer, Berlin 14 Campbefl C H Clinical aspects of snake bite in the Pacific area Toxicon 1969,7:25-28 15 Reid H A Symptomatology, pathology and treatment of the bites of sea snakes In Snake Venom (Edited by Lee C Y.), 1979, 922-955 Springer, Berlin 16 Li, Q and Ownby, C.L Evaluation of four different immunogens for the production of snake antivenoms Toxicon 1992, 30:1319 -1330 17 Malasit P, Warrell DA, Chanthavanich P, Viravan C, Mongkolsapa J,Singhthong B, et al Prediction, prevention and mechanism of early (anaphylactic) antivenom reactions in victims of snake bites Br MedJ (Clin Res Ed) 1986; 292:17–20 18 Tan NH Improvement of Malayan cobra (Naja naja sputatrix) antivenin Toxicon 1983; 21(1):75-9 19 Liau MY Preparation of highly potent Naja naja atra (Formosan cobra) antivenin Zhonghua Min Guo Wei Sheng Wu Xue Za Zhi 1978 Dec; 11(4):117-21 20 Pratanaphon R, Akesown S, Khow O, Sriprapat S, Ratanabanangkoon K Production of highly potent horse antivenom against the Thai cobra (Naja koautia) Vaccine 1997, Oct;15(14):1523-8 21 Liau MY Enhancement of Naja naja atra antivenin production in horses Zhong Min Guo Wei Sheng Wu Ji Mian Yi Xue Za Zhi 1982 Nov; 15(4):1949 -34- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ 22 Viravan, C., Veeravat, U., Warrell, M.J., Theakston, R.D., Warrel, D.A., 1986 ELISA confirmation of acute and past envenoming by the monocellate Thai cobra (Naja kaouthia) Am J Trop Med Hyg 35, 173–181 23 Boquet, P., 1979 Immunological properties of snake venoms, in: Lee, C.Y (Ed.), Snake Venoms Springer, Berlin, pp 751–824 24 Rutai Raweerith, Kavi Ratanabanangkoon, 2005 Immunochemical and biochemical comparisons of equine monovalent and polyvalent snake antivenoms Toxicon 45:369–375 25 Trịnh Xuân Kiếm - Nghiên cứu phát triển sản xuất ứng dụng lâm sàng đa trung tâm nhằm xác định tính an tồn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ chúa (King Cobra antivenom) - báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học - Sở khoa học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh 26 Sản xuất huyết kháng độc tố thần kinh α, Nguyễn Thị Nguyệt Thu cộng sự, Tạp chí Y học Dự phịng, X(3): 17-23, 2000 27 Nghiên cứu thử nghiệm người huyết kháng noc rắn hổ đất (Naja kaouthia), huyết kháng nọc rắn lục tre tinh chế (Trimeresus albolabris) Viện Vắcxin chế phẩm sinh học sản xuất, Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ giai đoạn 1996-2000 28 Joubert, F J (1973) The amino acid sequences of two toxins from Ophiophagus hannah (King Cobra) venom Biochim biophys Acta 317, 85 29 Lee, C Y (1972) Chemistry and pharmacology of polypeptide toxins in snake venoms Ann Rev Pharmac 12, 265 30 Karlsson, E (1979) Chemistry of protein toxins in snake venoms In Snake Venoms Handbook of Experimental Pharmacology, Vol 52, C.Y.Lee (ed.) Springer – Verlag, Berlin, 159 – 222 31 O.M.S : Caracteùration des venins et standardisation des sérums antivenimeux: progrès réalisés Pull.offset n°58, 49p (1981) -35- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ 32 Latifi, M.: Variation in yield and lethality of venom from Iranian snakes Toxicon, 22, 373 – 380 (1984) 33 Bouche, J., Chippaux, J.P., and Courtois, B : Contribution l’étude des variations biochimiques des venins de serpents d’Afrique de l’Ouest Bull.Soc.Pathol Exot 74, 356 – 366 (1981) 34 Chippaux, J.P et Goyffon, M (1991) Production and Use of Snake Antivenin Handbook of natural Toxins, 35 Schottler, W.H.A.: Problems of antivenin standardization Bull.Wld.Hlth.Org, 5, 293 -320 (1952) 36 Krifi, M.N., El Ayeb, M et Dellagi, K.: New procedures and parameters for better evaluation of Androtonus australis garzonii (Aag) and Buthus occitanus tunetanus (Bot) scorpion envenomations and specific serotherapy treatment Toxicon, 34, 257 - 266 (1996) 37 Goyffon, M., Chippaux, J.P., et Choumet, V.: Seùrums antivenimeux et Bases de la seùrotherapie Bull Soc Herp Fr., 75 -76 (1995) 38 Trịnh Xuân Kiếm, Trần Thúy Hạnh: “Nghiên cứu triển khai sản xuất ứng dụng lâm sàng đa trung tâm nhằm xác định tính an toàn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ chúa” 12/2004 – 7/2007 -36- Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ PHỤ LỤC QUI TRÌNH TINH CHẾ ĐỘC TỐ TỪ NỌC RẮN I VẬT LIỆU: - Nọc rắn (do Trung tâm Nuôi trồng Nghiên cứu Chế biến Dược liệu Quân khu 9, Tiền Giang cung cấp): Nọc rắn dạng tinh thể có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm - Nguyên liệu đầu vào xác định độc lực theo phương pháp LD50 chuột nhắt trắng Swiss 18-20g Đối với nọc rắn hổ đất, LD50 khoảng 6-12µg Nọc hổ chúa, LD50 từ 10-20µg Nếu đạt yêu cầu trên, nọc rắn đưa vào nghiên cứu - Gel sắc ký lọc Sephadex G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) - Gel sắc ký trao đổi ion BioRex 70 (Biorad) - Các hóa chất khác sử dụng mức độ phân tích II PHƯƠNG PHÁP: Q trình tinh chế độc tố từ nọc rắn tiến hành theo phương pháp Karlsson [30] qua hai giai đoạn sắc ký : - Sắc ký lọc Sephadex G - 50 Superfine - Sắc ký trao đổi ion BioRex 70 Trong nọc rắn chứa số men ly giải protein Vì trình sắc ký thực nhanh tốt, tiến hành nhiệt độ thấp (4°C) để tránh tác dụng men phân tử độc tố cần tinh chế Phân tử độc tố bền vững nhờ vào tỷ lệ cầu nối SS phân tử cao Nồng độ protein đoạn sắc ký xác định quang phổ kế 280 nm Đệm ammonium acetate thường dùng phương pháp sắc ký tinh chế độc tố chất bay cô đặc mẫu trình hút chân khơng loại muối -37- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ II.1 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất: II.1.1 Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine: Cho qua cột Sephadex G-50 (5.5 x 27 cm) 300 mg nọc khô rắn hổ đất Naja kaouthia mL đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Đẩy protein dung dịch đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Hứng đoạn 10ml/ đoạn Nồng độ protein đoạn sắc ký xác định quang phổ kế 280 nm Độc lực phân đoạn protein sau sắc ký đánh giá chuột nhắt trắng 18-20 gam Đánh giá độ tinh khiết phân đoạn protein sau sắc ký phương pháp điện di gel polyacrylamide (PAGE) gradient 8-18% với Sodium dodecylsulfate (SDS) sau xử lý protein dithiothreitol (DTT) Chọn phân đoạn sắc ký có độc lực cao để tiến hành bước tinh chế cột sắc ký trao đổi ion Biorex 70 II.1.2 Tinh chế qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70: Cho 1052 mg phần có độc tính (peak 3) tinh chế qua cột sắc ký lọc G50 Superfine vào cột sắc ký trao đổi ion BioRex-70 (3 x 63 cm) cân trước với dung dịch ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Sau nạp xong toàn protein lên cột, rửa giải hấp phân đoạn qua bước sau: 50 ml đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Đẩy 1,6 lít gradient thẳng đệm ammonium acetate pH 7.2 có nồng độ muối thay đổi từ 0.05 M đến 1M Nồng độ protein đoạn sắc ký xác định quang phổ kế 280 nm Độc lực phân đoạn protein sau sắc ký đánh giá chuột nhắt trắng 18-20 gam Đánh giá độ tinh khiết phân đoạn protein sau sắc ký kỹ thuật điện di gel PAGE gradient 8-18% với SDS sau xử lý protein DTT -38- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ II.2 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ chúa: II.2.1 Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine: Cho qua cột G-50 (5.5x27cm) 577mg nọc khô rắn hổ chúa Ophigophagus hannah 10 ml đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Đẩy protein dung dịch đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Hứng đoạn 10ml/ đoạn Nồng độ protein đoạn sắc ký xác định qua quang phổ 280nm Độc lực phân đoạn protein sau sắc ký đánh giá chuột nhắt trắng 18-20 gam Đánh giá độ tinh khiết phân đoạn protein sau sắc ký kỹ thuật điện di gel PAGE gradient 8-18% với SDS sau xử lý protein DTT Chọn phân đoạn sắc ký có độc lực cao tiến hành bước tinh chế cột sắc ký trao đổi ion Biorex 70 II.2.2 Tinh chế qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70: Cho 84 mg phần có độc tính (peak 3) tinh chế qua cột sắc ký lọc G -50 Superfine vào cột sắc ký trao đổi ion BioRex 70 (2 x 20 cm) cân trước với dung dịch ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Sau nạp xong toàn protein lên cột, giải hấp protein với: 50 ml đệm ammonium acetate 0.05M pH 7.2 Đẩy 300 ml đệm ammonium acetae pH 7.2 có nồng độ muối thay đổi từ 0.1 M đến 1M Nồng độ protein đoạn sắc ký xác định quang phổ kế 280 nm Độc lực phân đoạn protein sau sắc ký đánh giá chuột nhắt trắng 18 – 20 gam -39- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ Đánh giá độ tinh khiết phân đoạn protein sau sắc ký kỹ thuật điện di gel PAGE gradient 8-18% với SDS sau xử lý protein DTT II.3 Xác định thành phần gây độc nọc rắn qua điện di: Protein sau tinh chế phân tích qua điện di gel PAGE gradient 8-18% với SDS II.3.1 Vật liệu: - Acrylamide; Bis acrylamide - Ammonium persulfate - TEMED - Sodium dodecyl sulfate - Coomassie brilliant blue - Các hóa chất khác đạt mức độ phân tích II.3.2 Tiến hành: a)Pha dung dịch: - (1): Dung dịch 40% T: Acrylamide ……………………………… 38,93 g N,N’–Methylene-bis-acrylamide……… 1,07 g Hòa tan khoảng 80ml nước cất, cộng MB1 xoay với máy khuấy từ 30 phút Chỉnh 100ml Lọc qua giấy lọc Whatman số Cho vào chai nâu bảo quản 4°C - (2): Dung dịch 9,5 % T: Acrylamide ……………………………… 6,3 g N,N’–Methylene-bis-acrylamide…… 3,2 g Làm theo với dung dịch (1) - (3): Dung dịch đệm phân giải ( 1,5 M Tris): Tris–base ………………18,15g Trộn với khoảng 70 ml nước cất Dùng dung dịch HCl đậm đặc, hòa tan chỉnh pH xuống 8.8 Chỉnh 100 ml Bảo quản 4°C - (4): Dung dịch đệm tập trung: Tris–base……………………….3,0 g -40- Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thoû Trộn với khoảng 35 ml nước cất Dùng dung dịch HCl đậm đặc, hòa tan chỉnh pH xuống 6.8 Chỉnh 50 ml Bảo quản 4°C - (5): Dung dịch SDS 10% : 10 g/ 100 ml Giữ nhiệt độ bình thường - (6): Dung dịch đệm bình điện di: Tris –base ……………………12,0 g Glycine……….…………… 57,6 g Hòa tan chỉnh 1000 ml Bảo quản 4°C Khi dùng pha lỗng ¼ cộng 1% dung dịch ( 4ml/400ml) - (7): Dung dịch cố định: Sulfosalicylic acid 4g + 100ml Trichloroacetic acide 12.5% - (8): Dung dịch nhuộm: Coomassie R250 ……………….2.5 g Methanol ……………… …… 600 ml Acid Acetic………………………90 ml Trộn bột màu với hai dung môi hữu để hòa tan trước cho nước vào 300 ml nước (Có số bột màu có giá bột thủy tinh không tan được, cần lọc qua giấy lọc Whatman số ) - (9): Dung dịch tẩy : Methanol ………………………… 50 ml Acid Acetic……………………… 75ml Nước cho đến…………………… 1000 ml -(10): Dung dịch glycerol: d=1,25g/ml 1g= 0,8ml ( Nếu không dùng 1g Glycerol, dùng 0.8ml nước cất hai lần) - (11): Dung dịch DTT : M.W :154 10mM =1,54mg/ml - (12): Dung dịch xử lý mẫu xanh SDS – DTT: Dung dịch glycerol ………………… ml Dung dịch SDS 10% ………………2,5 ml Dung dịch đệm tập trung … 2ml DTT … 15 mg Màu Bromophenol .80 µl Nước cất vừa đủ 10 ml -41- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ GRADIENT %T 25 20 18 16 14 12 10 10(g) 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 (ml) 1 1 1 1 1 5(µl) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 (ml) 2,5 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 H2O (ml) 0,06 0,16 0,36 0,56 0,76 0,96 1,16 1,36 1,56 1,76 Dung dịch Temed µl/4ml Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng thể tích lên cao APS/KPS (A/K persulfate): 100mg/ml, pha trước dùng Chỉ dùng dung dịch pha 15µl / 4ml Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng lên cao Để hãm tốc độ polymer hóa, dung dịch monomer cần cho xuống 4°C, trước thực gradient Gel tụ chụm: 2ml dung dịch 2+1ml dung dịch 4+40 µl dung dịch 5+0.96ml H2O+4 µl Temed+30 µl APS Bề mặt gel phân giải: Isobutanol hoặc: 0,5 dung dịch 3+20 µl dung dịch 5+1,48 ml H2O b) Đổ gel chạy điện di: - Pha hai dung dịch gel có nồng độ acrylamide 8% 18% (có SDS) bảng - Dùng dụng cụ tạo gradient tạo bảng gel phân giải có nồng độ gradient – 18% acrylamide -42- Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ Hình 1: Dụng cụ tạo gradient - Đổ gel tụ chụm có nồng độ acrylamide tổng số 4% - SDS Đặt lược vào gel để tạo giếng Khi gel đơng lấy lược lắp gel vào bình điện di - Cho dung dịch đệm vào bình điện di - Cho mẫu sau xử lý với DTT vào giếng - Lắp nguồn điện Chạy điện di - Khi vạch xanh đến đáy thùng Tắt nguồn Nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassive 15 phút Tẩy gel với dung dịch tẩy -43- Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ PHỤ LỤC QUI TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG HUYẾT THANH I VẬT LIỆU: - Súc vật dùng để gây miễn dịch thỏ - Chọn thỏ non khoảng tháng tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng khoảng 1-1,5 kg, ni trước theo dõi vịng tháng Sau tháng chọn thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2kg để gây miễn dịch - Độc tố nọc rắn hổ đất hổ chúa sau tinh chế - Tá chất Freund toàn phần (complete Freund’s complete adjuvant) (SigmaAldrich) - Tá chất Freund bán phần (incomplete Freund’s incomplete adjuvant) (SigmaAldrich) II PHƯƠNG PHÁP: - Trước gây miễn dịch, lấy thỏ 2- ml máu tai Cho máu đông 4°C 12 Tách huyết cho chất bảo quản (NaN3 0,05%) Giữ huyết 4°C làm mẫu chứng (huyết trước gây miễn dịch) - Thỏ gây miễn dịch cách tiêm da nhiều mũi kháng nguyên lên lưng thỏ (khoảng 50 µL/mũi) Mỗi lần tiêm cách tháng - Lần tiêm thứ 1: tiêm vào thỏ ml huyền dịch kháng nguyên tá chất Freund hoàn toàn - Lần tiêm thứ lần tiêm sau: tiêm vào thỏ ml huyền dịch kháng nguyên tá chất Freund bán phần - Huyết thỏ lấy khoảng 12 -14 ngày sau lần gây miễn dịch, bảo quản -20°C Huyết dùng để theo dõi đáp ứng miễn dịch thỏ -44- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ suốt trình gây miễn dịch phương pháp khuếch tán kép thạch phương pháp ELISA - 14 ngày sau lần tiêm thứ 3, 4, lấy máu thỏ (50 ml), tách huyết thanh, tinh chế kháng thể cách tủa với muối ammonium sulfate Bảo quản tủa sau tinh chế 40C II.1 Tạo huyết kháng độc tố nọc rắn hổ đất hổ chúa: • Lô I: thỏ (đánh số 17, 18, 19) gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 nọc rắn hổ đất để tạo huyết kháng độc tố rắn hổ đất Liều tiêm mũi thứ 32 µg/thỏ giảm ½ liều mũi tiêm nhằm chọn lọc dòng tế bào B sản xuất kháng thể có lực cao • Lơ II: thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) gây miễn dịch với độc tố peak nọc rắn hổ chúa để tạo huyết kháng độc tố rắn hổ chúa Liều tiêm mũi thứ 50 µg/thỏ giảm ½ liều mũi tiêm II.2 Tạo huyết kháng đa độc tố hai loài rắn hổ đất hổ chúa: • Lơ III: thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) gây miễn dịch với hai loại độc tố để tạo huyết kháng đa độc tố Liều tiêm mũi thứ 32 µg độc tố peak 3.1 nọc rắn hổ đất/thỏ 50 µg độc tố peak nọc rắn hổ chúa/thỏ giảm ½ liều mũi tiêm II.3 Phương pháp kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch thỏ kỹ thuật khuếch tán kép thạch: Đây kỹ thuật cổ điển, dùng để phân tách kháng thể mẫu thử nghiệm tính đặc hiệu với kháng nguyên II.3.1 Nguyên tắc: Làm thạch agar 1% phiến kính Đục giếng vị trí định Cho dung dịch kháng nguyên, kháng thể vào giếng định Kháng nguyên kháng thể khuếch tán gel Khi gặp chúng hình thành phức hợp -45- Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thoû tủa nồng độ kháng nguyên kháng thể tương ứng Hình vết tủa cho phép phân tách phản ứng thành phần giếng II.3.2 Vật liệu: - Agarose - Dung dịch huyết thỏ trước gây miễn dịch - Dung dịch huyết thỏ sau gây miễn dịch lần - Hóa chất khác đạt mức độ phân tích II.3.3 Tiến hành: - Làm thạch agar 1% (6 x x 0,2cm) đệm Veronal 20 mM pH 8.6 - Đục giếng (thể tích giếng khoảng 20 µl) thạch cho mẫu vào giếng - Để thạch vào hộp đóng kín: 100% độ ẩm 0C Quan sát kết sớm sau 24 -46- Sở Khoa Học & Công Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa thỏ PHỤ LỤC Đề tài nghiên cứu đăng số (105) tạp chí Y Học Dự Phịng xuất vào tháng 10/2009 -47-