Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây bắt ruồi drosera indica l nhằm thu nhận plumbagin

TĨM TẮT TĨM TẮT TIẾNG VIỆT Lồi bắt ruồi Drosera đƣợc chứng minh có giá trị dƣợc tính điều trị bệnh nhƣ: lao, ung thƣ, HIV, tim mạch, ho gà, hen suyễn…kể bệnh đột biến [Samaj J., 1999] Thế nhƣng, tự nhiên Drosera tƣơng đối hiếm, lồi có nguy tuyệt chủng, nhiều quốc gia phải ban hành luật để bảo vệ chúng [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984].Ở Việt Nam, có lồi Drosera [Phạm Hồng Hộ, 1995]; chƣa loài đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học nhƣ dƣợc tính [Đỗ Tất Lợi] Do vậy, đề tài đời với nhu cầu thiết yếu nhằm bảo tồn nguồn Drosera vốn khan hiếm; khai thác tiềm dƣợc tính loài hoang dại Việt Nam; đáp ứng nhu cầu thực vật nhƣ dƣợc chất cách chủ động Với đại diện bắt ruồi D burmanii Vahl đƣợc thu hái Việt Nam, chúng tơi thiết lập thành cơng quy trình vi nhân giống; sàng lọc, thu nhận chứng minh cấu trúc plumbagin, vốn hoạt chất có giá trị dƣợc tính cao từ nguồn ngun liệu in vitro lồi Drosera Trong đề tài này, tập trung nghiên cứu tạo hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmanii (thông qua mô sẹo trực tiếp từ lớp mỏng tế bào) ứng dụng số kỹ thuật tăng sinh plumbagin dịch huyền phù tế bào: điều kiện ni cấy thích hợp (ủ tối, tốc độ lắc 125 vịng/phút, mật độ tế bào ni cấy ban đầu 2,6×104 tế bào/ml), bổ sung tiền chất (phenylalanine 0,3mM hay tyrosine 0,3mM); chất cảm ứng (acid salicylic 1,5mg/l ngày dịch huyền phù tế bào đƣợc ngày tuổi); loại bỏ 2,4-D thành phần môi trƣờng nuôi cấy kỹ thuật giúp gia tăng tích lũy plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii Trong đó, việc loại bỏ 2,4-D (từ ngày thứ trở đi) có ảnh hƣởng rõ đến khả tích lũy plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii, giúp tăng hàm lƣợng plumbagin lên gấp 2,58 lần i TÓM TẮT TÓM TẮT TIẾNG ANH Species of Drosera have been proved to have important phamacognostical evaluation in treatment of ailments like: tuberculosis, cancer, HIV, cardiovascular, asthma, whooping cough, without exception of mutation related diseases [Samaj J., 1999] Beingrelatively rare in nature, Droseraare such endangered species that many countries have enacted legislation to protect them [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984] However, among three known species of Drosera in Vietnam [Pham Hoang Ho, 1995], it is the fact that there has been no publication studying these species on the chemistry, pharmacology [Do Tat Loi] There is an urgent need to adopt conservation measure regionally, which may preserve these valuable species from being vanished Moreover, studying in specific potential medicinal properties of these wild plants may suggest a source of fresh biomass and their extracted substances for interesting industrial employment Focusing on D burmani Vahl collected inVietnam, the micro propagation has been successfully established From these in vitro materials, the screening, isolating and elucidating (both structural and bioactive properties) of quercertine and plumbagin have also been carried out.Especially in this thesis is successful application of cell suspension cultures strategies for D burmani(via callus and directly via thin cell layers of tissue) to improve plumbagin yields:choosing appropriate culture conditions (dark incubation, shaking speed 125 round/minute, cell concentration 2,6×104 cells/ml), precursor addition (phenylalanine 0,3mM or tyrosine 0,3mM); elicitation (salicylic acid 1,5mg/l in days) on day old cell suspension;2,4-D elimination from media of day old cell suspesion.Among these, the last strategy is reported to increasing plumbagin yield to the highest level (2.58 times than control) ii MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x PHẦN MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm giống thực vậtDrosera 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc tính sinh học 12 1.1.5 Hiện trạng Drosera giới [112] 14 1.1.6 Thành phần hóa học 15 1.1.7 Giá trị tầm quan trọng 18 1.1.8 Tình hình nghiên cứu 21 1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 23 1.2.1 Sự phát sinh quan 23 1.2.2 Sự phát sinh phôi thể hệ 24 VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 26 2.1.1 Vật liệu 26 iii MỤC LỤC 2.1.2 Phƣơng pháp 26 2.2 Sàng lọc thu nhận plumabgin từ nguồn nguyên liệu in vitrocủa D.burmani: tìm hợp chất có khả ức chế tăng sinh tế bào phƣơng pháp Sulforhodamine B (SRB)28 2.2.1 Các bƣớc tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro D burmani 30 2.2.2 Xác định cấu trúc hàm lƣợng hợp chất 31 2.3 Nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù tế bàoD burmani nhằm thu nhận plumbagin33 Vật liệu 33 Phƣơng pháp 33 2.3.1 Tạo mô sẹo 33 2.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 34 2.3.3 Ứng dụng số kỹ thuật tăng suất thu nhận plumbagin lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 36 2.4 Xử lý thống kê 39 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 40 3.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 40 3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 40 3.1.2 Nhân giống chồi bên 40 3.1.3 Nhân giống tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 43 3.1.4 Tạo rễ phát triển hoàn chỉnh 45 3.2 Sàng lọc thu nhận plumbagin từ nguồn nguyên liệu in vitro 46 3.2.1 Xử lý mẫu điều chế loại cao chiết 46 3.2.2 Sàng lọc cô lập hợp chất có khả ức chế tăng sinh tế bàoin vitrotheo phƣơng pháp Sulforhodamine B (SRB) 47 iv MỤC LỤC 3.3 Khảo sát việc ứng dụng số kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 52 3.3.1 Tạo mô sẹo 52 3.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 59 3.3.3 Ứng dụng số kỹ thuật tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 63 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 77 4.1 Kết luận 77 4.2 Đề nghị 77 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC a v DANH MỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid ABS : Absorbent BA : 6-benzylaminopurine BSA : Bovine Serum Albumine COSY : COrelation SpectroscopY DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DLD-1 : dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DMSO : Dimethyl sulphoxide DTT : 1, 4-DiThioTreitol DW : Dry weight (trọng lƣợng khô) FBS : Fetal Bovine Serum FW : Fresh weight (trọng lƣợng tƣơi) GB5 : Gamborg B5 HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) I : tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào (%) IAA : indoleacetic acid IBA : 3-indolebutyric acid IR : Infrared KN : Kinetine LB : Luria – Bertani MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : Naphthalene Acetic Acid NMR : Nuclear Magnetic Resonance vi DANH MỤC OD : Optical Density PAL : Phenylamine ammonia lysase PBS : Phosphate Buffer Saline PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone SRB : SulfoRhodamine B TAL : Tyrosine ammonia lyase TBS : Tris Buffered Saline TCA : Trichloroacetic acid TTC : TriphenylTetrazolium Chloride UV : Ultra Violet KÍ HIỆU J : Hằng số ghép cặp MHz : Megahertz s, d, t : Singlet (mũi đơn), Doublet (mũi đôi), Triplet (mũi ba) vii DANH MỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin 7-methyljuglone [99] 16 Bảng 1.2 Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin 7-methyljuglone [99] .16 Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng tách chiết từ Drosera [99] 16 Bảng 1.4 Dược tính hoạt tính ứng dụng khác dịch chiết Drosera [99] 19 Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần D burmani [73] .20 Bảng 1.6 Những nghiên cứu nhân giống in vitro giống Drosera 21 Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật thu nhận hoạt chất từ loài thực vật họ với Drosera 22 Bảng 2.1 Các nghiệm thức bố trí việc bổ sung hay khơng bổ sung 2,4-D 38 Bảng 3.1 Ảnh hưởng BA (mg/l) lên nhân chồi bên .41 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA (mg/l) lên tạo chồi bất định từ phát hoa .43 Bảng 3.3 Phần trăm nước hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro (%) 46 Bảng 3.4 Thu suất loại cao từ bột D.burmani .46 Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau cảm ứng 48 cao chiết (100µg/ml) .47 Bảng 3.6 Kết sắc ký cột silica gel cao chloroform D burmani 48 Bảng 3.7 Tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau cảm ứng 48 phân đoạn (100µg/ml) 49 Bảng 3.8 Kết sắc ký cột phân đoạn bảng 3.14 50 Bảng 3.9 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR HMBC hợp chất B .51 Bảng 3.10 Ảnh hưởng khoáng, nồng độ đường lên khả sống lớp mỏng tế bào .53 viii DANH MỤC Bảng 3.11 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ D burmani 54 Bảng 3.12 Tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo từ ảnh hưởng 2,4-D, KN, NAA .56 Bảng 3.13 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ ảnh hưởng 2,4-D, KN, NAA 57 Bảng 3.14 Hàm lượng plumbagin tích lũy loại mô khác 63 Bảng 3.15 Ảnh hưởng mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng trưởng dịch huyền phù tế bào rễ Drosera 64 Bảng 3.16 Ảnh hưởng ánh sáng tốc độ lắc lên tăng trưởng tích lũy plumbagin 66 Bảng 3.17 Ảnh hưởng 2,4-D lên tăng trưởng tích lũy plumbagin dịch huyền phù tế bào .68 Bảng 3.18 Ảnh hưởng phenylalanine tyrosine lên tăng trưởng tích lũy plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmani 71 Bảng 3.19.Ảnh hưởng acid salicylic lên lên tăng trưởng tích lũy plumbagin dịch huyền phù tế bào 74 Bảng 3.20 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmani ứng dụng kỹ thuật làm tăng suất thu nhận plumbagin HPLC .75 ix DANH MỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây phát sinh lồi phân giống thuộc giống Drosera dựa trình tự DNA chloroplast rbcL DNA nhân 18S ribosome [122] .5 Hình 1.2 Sự phân bố Drosera giới (vùng có màu xanh lá) [121] Hình 1.3 Các dạng cấu trúc thân Drosera Hình 1.4 Các hình dạng khác lơng tuyến Drosera [127] Hình 1.5 Màu sắc đa dạng hoa Drosera [130] 10 Hình 1.6 Mặt cắt ngang hoa Drosera .10 Hình 1.7 Các dạng nang chứa hạt Drosera [125] 11 Hình 1.8 Hình thái hạt Drosera [56] .11 Hình 1.9 Phương tiện chế bắt côn trùng D indica L 13 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học naphthoquinone naphthoquinone-glucoside tách chiết từ loài Drosera [22] 17 Hình 1.11 Một số flavonoid flavonoid glucoside có Drosera 17 Hình 1.12 Một số hình thái lạ mắt Drosera [131] 20 Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhân giống chồi bên [7] 27 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nhân giống chồi bất định [64] 28 Hình 2.3 Buồng đếm tế bào quy tắc đếm ô lớn tích 0,1mm3 37 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng BA lên tạo chồi bên D burmani 41 Hình 3.2.Ảnh hưởng BA lên nhân chồi bên từ đốt thân D burmani sau tuần 42 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng BA lên tạo chồi bên D burmani 44 Hình 3.4 Sự tái sinh chồi bất định từ phát hoa D burmani 44 x PHỤ LỤC Phụ lục 2.4: Kết chạy phổ xác định cấu trúc hợp chất plumbagin Phụ lục 2.5.6 Phổ HMBC plumbagin k PHỤ LỤC Phụ lục 2.5 Kết định lƣợng plumbagin mô mô rễ D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.5.1 Kết định lƣợng plumbagin mô mô rễ D burmanibằng HPLC l PHỤ LỤC Phụ lục 2.5 Kết định lƣợng plumbagin mô mô rễ D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.5.2.Sắc ký đồ plumbagin chuẩn m PHỤ LỤC Phụ lục 2.5 Kết định lƣợng plumbagin mô mô rễ D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.5.3.Sắc ký đồ plumbagin diện mô D burmaniin vitro n PHỤ LỤC Phụ lục 2.5 Kết định lƣợng plumbagin mô mô rễ D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.5.4.Sắc ký đồ plumbagin diện mô rễ D burmaniin vitro o PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.1 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tế bàoD burmaniđã đƣợc ứng dụng kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất p PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.2.Sắc ký đồ plumbagin chuẩn q PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.3.Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmanini điều kiện thích hợp (NT1) r PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.4.Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bàoD burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp (NT1) s PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.5.Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmaniđƣợc nuôi cấy điều kiện thích hợp loại bỏ 2,4-D (NT2) t PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.6.Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp loại bỏ 2,4-D (NT2) u PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.11.7.Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp bổ sung phenyalanine 0,3M (NT3) v PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.11.8.Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bàoD burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp bổ sung phenyalanine 0,3M (NT3) w PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.9.Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp vàcảm ứng acid salicylic 1,5mg/l ngày (NT4) x PHỤ LỤC Phụ lục 2.6 Kết định lƣợng plumbagin dịch huyền phù tếbào D burmanibằng HPLC Phụ lục 2.6.10.Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmaniđƣợc ni cấy điều kiện thích hợp vàcảm ứng acid salicylic 1,5mg/l ngày (NT4) y