Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai kl2 lk20 và klt a3

Trang 1

BO CONG THUONG

TONG CONGTY GIAY VIETNAM

VIEN NGHIEN CUU CAY NGUYENLIEU GIAY

BAO CAO TIEN DO DE TAI

CAP BO NAM 2012

TEN DE TAL

NGHIEN CUU NUOI CAY MO INVITRO BA DONG KEO LAI KL2, KL20 VA KLTA3

CHỦ NHIỆM ĐẺ TÀI: ThS PHAMDUC HUY

Trang 2

BO CONG THUONG

TONG CONGTY GIAY VIETNAM

VIEN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIAY

TEN DE TA

NGHIEN CUU NUOI CAY MO INVITRO BA DONG KEO LAI

KL2, KL20 VÀ KLTA3

Thực hiện theo Hợp đồng số 143.12.RD/HĐ-EHCN ngày 29/02/2012 giữa Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

Th.S PHAMBUC HUY

CN NGUYỄN THANH BÌNH

KS PHAM VAN HUNG

Trang 3

Mục lục

Mục lục i

Biểu thông tín ii

Danh mục đăng ký sản phẩm của đề tài iv

Quyết định Hội đồng nghiệm thu v

Bai phan bién 1 va 2 vi

Danh muc bang biéu 9

Tóm tắt đề tài 5

Chương 1

Tổng quan tài liệu 11

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 11 1.1.1 Trong nước 1 1.1.2 Ngoài nước, 12 1.2 Cơ sở lý thuyết 13 Chương 2 Thực nghiệm 15

2.1 Mục tiêu của đề tài 15

2.2 Nội dụng và phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nội dàng nghiên cứu 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng 16 2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hưởng của mùa vụ cây mẫu và tuÃ¡ mẫu cấy 1 2.2.2.3 Phương pháp nghiên cửu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguận vật liệu ban đâu 18 2.2.2.4 Thụ thập và xử lý số liệu 19 2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 20 Chương 3 Kết quả và bình luận 21

1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng, 21 3.1.1 kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với

đàng KL2 21

3.1.2 kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với

Trang 4

3,1,3, Kết quả nghiên cứu ảnh huông của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với

đồng KLTA3 24

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và hổi mẫu cấy 26 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuôi mẫu cấy đối với dàng KL2 26

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuỗi mẫu cấy đối với dòng KL20 2? 3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh huông của thời vụ cấy mẫu và tỗi mẫu cây đối với dòng KLTA3 28

3.3, Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguồn vật liệu ban đầu 29

3.3.1 Kết quả nghiên cửu xác định môi trưởng tải sinh chỗi và tạo nguân vật liệu ban

đầu đái với dòng K12 29

3.3.2 kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chải và tạo ngun vật liệu ban đâu

đắi với dòng KL20 30

3.3.3 kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chải và tạo ngun vật liệu ban đâu

đắi với dàng KLTA3 31

Trang 5

BIEU THONG TIN

1 Tên đề tài: Nghién citu nudi cấy md invitro ba dong keo | 2 Mã số :

lai KL2, KL20 vat KLTA3

3 Thời gian thực hiện : 12 tháng

'Từ tháng 1 năm 2012 đến thang 12 năm 2012 4 Kinh phí : 160.000.000 đồng (Một trăm sáu mươi triệu đồng chấn) 5 Họ và tên chủ nhiệm để tài: PHẠM ĐỨC HUY Họcvị: - Thạcs7 ChŨc danh : Phú THIng phiiog Điện thoại : 0977.942.884; Email: duchuyfrc@gmail.com Địa chỉ cơ quan : xã Phil Ninh —Phi Ninh —Phé Tho

6 Cơ quan chủ trì : Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

[in thoili : 02103.829.241; Fax: 02103.829.384 Email: nlgiay_pnpt@vnn.vn Địa chỉ cơ quan : xã Phù Ninh — Phù Ninh — Phú Thọ 7 Danh sách những người thực hiện chính Hoc vị, học hàm

TT Họ và tên chuyên môn Cơ quan

1 Phạm Đức Huy Thạc sĩ Lâm nghiệp Viện NC cây NLG

2 Nguyễn ThanhBình Cử nhân Sinhhọc 'Viện NC cây NLG

3 Nguyễn Thị Thìn Kỹ sư Lâm nghiệp 'Viện NC cây NLG

4 Phạm Văn Hưng Ky sw Lâm nghiệp Viện NC cây NLG 5 Pham Thị Hạnh Kỹ sư CN sinh học Viện NC cây NLG

7 Mục tiêu của để tài

- Xác định được kỹ thuật, điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai

đoạn tạo chổi nuôi cấy mô invifro cho ba đòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chỗi từ 5-79

- _ Xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguồn vật liệu ban đầu

3 Nội đung nghiên cứu chính

Trang 6

~_ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng - _ Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cầy mẫu

- _ Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu

Trang 7

DANH MỤC DANG KY SAN PHAM CUA DE TAI TT hung công [Dự kiến kết quả đạt được| Kết quả đạt được 1 | Nghiên ảnh hưởng của chất khử cứu trùng và thời gian khử trùng Xác định được chất kina trùng mẫu, thời gian kia trùng, phương pháp khử| trùng mẫu thích hợp dat tý 5-79% Xác định được chất khử| trùng mẫu, thời gian Khử| trùng, phương pháp kha trùng mẫu thích hop dat tỷ] 8,7-13,0% 2 | Nghién céu anh huéng da bể nấu đụng

thời vụ cấy mẫu

Xác định được mùa lấy| mẫu và tuổi mẫu thích| hợp Xác định được mùa lấy mẫu thích hợp là vụ hè và tuổi mẫu hiệu quả là 2 tuần| tuổi 3 | Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và

tạo nguồn vật liệu

Xác định môi trường

tái sinh và tạo nguồn

vật liệu ban đầu

Trang 8

Mở đầu

Hiện nay, gỗ là nguồn nguyên liệu chính phục vụ cho sản xuất của Tổng công ty giấy Việt Nam Nhu cầu nguyên liệu hàng năm của Tổng công ty là khoảng 500.000m), trong khi đó các công ty lâm nghiệp mới chỉ cung cấp được khoảng 60% nhu cầu trên Thêm vào đó điện tích đất trồng các loài cây nguyên

liệu giấy ngày càng bị thu hẹp do nhu cầu trồng các lồi cây cơng nghiệp và

nông nghiệp khác Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao năng suất và chất lượng

rừng ngày càng cấp thiết Trong khi đó nhiều diện tích rừng trồng trong Tổng

công ty giấy còn thấp và không đạt yêu cầu, một trong những nguyên nhân chính là giống đưa vào trồng rừng sản xuất có chất lượng không cao Do đó việc tăng năng suất rừng trồng bằng sử dụng nguồn giống có chất lượng là việc làm

cần thiết

Trong những năm gần đây, bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã

công nhận ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 do tập thé cán bộ Trung tâm

nghiên cứu cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy chọn tạo là giống tiền bộ kỹ thuật Đây là những giống rất thích hợp cho trồng rừng vùng Trung tâm Bắc Bộ và các vùng có điều kiện sinh thái tương tự Thực tế cho thấy rừng trồng các dòng keo lai nêu trên tại vùng Trung tâm Bắc Bộ cho năng suất cao, chất lượng rừng đồng đều và ôn định hơn tương đối nhiều

so với các loài khác

Khi đã có giống năng suất cao thì việc nhân nhanh và đưa các giống đã

được chọn lọc và trồng rừng sản xuất là vô cùng quan trọng Trong các kỹ thuật

nhân giống hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuối cấy mô cho hiệu qua cao nhất, đặc biệt là chất lượng di truyền của cây giống được đảm bảo và khả năng cung cấp số lượng lớn cây giống ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, ba giống keo lai nêu trên chưa được tiến hành nghiên cứu bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để góp phần nâng cao năng suất và

duy trì tính ổn định của rừng trồng thì việc làm chủ công nghệ nuôi cấy mô ba

đòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là thiết Do vậy cần sớm thực hiện nội

dung nghiên cúu: “4Vgiuiên cứu nuôi cậy mô uvữro ba đồng keo kẻ KL2, KL20

vờ KLT.43” là cần thiết

Trang 9

Danh mục bảng biểu

Bang 01 Công thức khử trùng mẫu cấy 1

Bảng 02 Công thức thí nghiệm tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy 18

Đảng 03 Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi 19 Đảng 04 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL2 21 Đảng 05 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20 23 Đảng 06 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3 25

Trang 10

Tom tắt đề tài

Ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là những giống năng suất cao đã

được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật Nhằm tạo cây giống chất lượng cao của những giống trên vào trồng rừng sản xuất, năm 2012 đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba đòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3” đá được phê duyệt và thực hiện, đề tài dự kiến thực hiện trong 3 năm từ 2012-2014

Năm 2012, đề tài tiến hành nghiên cứu một số bước của giai đoạn tạo

nguồn vật ban đâu gồm: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng mẫu va thoi

gian khử trùng; Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu và thời vụ cấy mẫu; Nghiên

Trang 11

Chương1

Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu

1.1.1 Trong nước

Cây keo lai tự nhiên đã được phát hiện tại Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Austratia, nam Trung Quốc và một số nước khác ở vùng Châu Á - Thái Bình Dương, ở vĩ độ 8 - 22° Bắc, độ cao 5 - 300 m trên mặt biển, nơi có lượng mưa hàng năm 1500 - 2500 mm/năm, nhiệt độ trung bình năm 23 - 27° C,

nhiệt độ tối cao trung bình tháng nóng nhất 31 - 34° C, nhiệt độ tối thấp trung

bình tháng lạnh nhất 15 - 22” C

‘Ving trồng Keo lai thích hợp là các tỉnh từ Bắc Trung Bộ đến Nam Bộ

(đặc biệt là các tỉnh Nam Bộ) và Tây Nguyên Keo lai cũng sinh trưởng tốt ở vùng tháp các tỉnh Bắc Bộ Ở những nơi đất tốt và trồng thâm canh có thể đạt

năng suất 25- 35 m`/ha/năm

Cây keo lai được xác định là một trong những loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng hiện nay ở Việt Nam (Cẩm nang lâm nghiệp, Chương: Chọn loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng ở Việt Nam, 2004) Hiện nay, có rất nhiều dòng keo lai đã được công nhận giống quốc gia là BVI0,

BV16, BV32, cic dòng được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật là BV5, BV29,

BV33, TB6, TB12, KL2, KL20 va KLTA3 Trong đó, có 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 là 3 dòng được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tuyển chọn và nhân giống đưa vào sản xuất phục vụ trồng rừng

Các dòng keo lai KL2, KL20 và KUTA3 được công nhận là giống tiến bộ

kỹ thuật theo Quyết định số 2722 QĐ/BNN-KHCN, ngày 07/09/2004; Quyết định số 1773 QĐ/ BNN-KHCN, ngày 17/07/2005 và Quyết định số 1686

QĐ/BNN-KHCN, ngày 09/06/2006

Kết quả khảo nghiệm ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 (Nguyễn Quang Đức, 2005) cho thấy rừng trông dòng KLTA3 đạt năng suất trung bình 40 mÌ/ha/năm (vượt đối chứng keo tai tượng 3.3 lần), rừng trồng dòng KL2 đạt năng suất 38.6 m'/ha/năm (vượt đối chứng 3.2 lần), dòng KL20 đạt năng suất 27

mỶha/năm (vượt đối chứng 3 lần)[5] Tuy nhiên, hiện nay mới chỉ sản xuất được cây giống 3 dòng keo lai nói trên bằng phương pháp giâm hom, vẫn còn chưa có các nghiên cứu nuôi cấy mô cho 3 dòng trên

Đoàn Thị Thanh Nga và Phạm Thị Kim Thanh (2000) đã nghiên cứu ảnh i chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chỗi cây keo lai Báo cáo cho thấy, chổi mẫu cây keo lai được đưa vào ống nghiệm trong điều kiện xử lý với HgCl; 0.1% trong 15 phút với tỷ lệ đạt 5% Môi trường nhân chỗi hữu hiệu là môi trường M;z;¿ bổ sung 3% saccharose, CHsm, PVP, 0.3 mg/l IAA, 5 mg/l KT va 0.3 mg/l IBA Méi tring tao ré hoan chinh cay keo lai trong

Trang 12

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2007) đã nhân thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô cho một số dòng keo lai mới chợn tạo như BV71, BV73 và BV75 Báo cáo cho thấy (i) điều kiện khử trùng mẫu hữu hiệu 18 HgCl; 0.1% trong 8

phút ở lệ đạt khoảng 10%, /i¡) môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường

MS cai tién bé sung BAP 1.5 mg/l va NAA 0.5 mg/l, (iii) mỗi trường ra rễ thích

hợp là % MS cdi tién bd sung IBA 1.5 mg/l

Ngoài ra, hiện nay cây keo lai mầm mô các dong BV10, BV16, BV32 đã được ứng dụng nhân giống và sản xuất thành công tại nhiều cơ sở trong nước như Trung tâm Ứng dụng khoa học và sản xuất lâm - nông nghiệp Quảng Ninh, công ty TNHH Nguyên Hạnh ở Bình Định (my mô 4 triệu cây/năm), Trung tâm Ứng dụng - chuyển giao công nghệ Phú Yên

Cây keo lai nhãn giống bằng công nghệ nuôi cấy mô có những ưu điểm như các cây cơn đông nhất về mặt & truyền, mang day đủ những wu thé lai của cây mẹ, hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất, trong Im?

nên có thể để được 18,000 cây Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với

các nguồn bệnh nên đảm bảo các cây giống sạch bệnh Cây keo lai cấy mô sau khi trồng có tốc độ sinh trưởng nhanh và dong đều, thân lên thẳng, ít phân nhánh, không chẻ thân, có rễ cọc chắc chắn, thân không giòn, chịu được gió mạnh, ít đổ ngã nên có thể trồng thành cây lâu năm lấy gỗ, nâng cao giá trị kinh tế Cây Keo lai cấy mô khắc phục được những nhược điểm của Keo lai hom như dễ đỗ (cây mô có dễ cọc), mục ruột (cây mô khử trùng không có mầm bệnh)

1.1.2 Ngoài nước

Keo lai Acacia hybrid là tên gợi của giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá trầm (Acacia auriculijfÐrmis) Keo lai là cây gỗ thường xanh, cao 25 - 30 m, đường kính 30 - 40 cm Thân thẳng, cành nhánh nhỏ, đoạn thân dưới cành lớn Vỏ màu xám, hơi nút đọc Lá, hoa, quả và hạt đều

có tính trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm Lá (giả) đơn, mọc cách 3 - 4 gân song song xuất phát từ góc lá Hoa tự bông đuôi sóc nhỏ, màu trắng vàng

Quả đậu, mặt cất ngang hình bằu dục Quả chín tự khai Hạt đen, hình dlip, đài 4 - 5 mm, rộng 2.5 - 3.5 mm Sinh trưởng nhanh hơn Keo tai tượng và Keo lá tràm Gỗ giác màu xám trắng, gỗ lối màu nâu nhạt, tỷ trọng gỗ khô tự nhiên 0.56

- 0.63, tỷ trọng gố khô kiệt 0.48 - 0.54, hiệu suất bột giấy 0.49 - 0.52 Gỗ keo lai rất thích hợp để làm giấy, làm ván dăm và ván MDF, có thể làm gỗ xẻ và đồ mộc Rễ có nhiều nót sản rất thích hợp để cải tạo đất, hoa đùng để nuôi ong

Trang 13

Hiện nay, đã có rất nhiều các loài cây lâm nghiệp được nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào như các loài Acacia, các loài Eucalyptus, Trong đó, cây keo lai 4czơiz ñybri4 là một trong những đối tượng chính, được nhân giống thành công ở nhiều nước như Malaysia, Ân Độ

R.Yasođha (2004) đã nghiên cứu tái sinh cây keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho kết quả (i) sir dung chat khử trùng HạCl;, (ii) mùa tốt nhất để vào mẫu là tháng 5 và tháng 8, () sử dụng môi trường MS bổ sung

TBA 3.0-5.0 mg/1, NAA 1.0 mgi và IAA 3.0 mgjI là tốt nhất với dòng No.10; sử

dung môi trường MS bổ sung IBA 2.0-4.0 mg/l, NAA 1.0 mgí và IAA 20 - 3.0

mgi là tốt nhất với đòng No.32

S Mohan Jain, Katsuaki Ishii (2003) tổng hợp các kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô các loài keo trong cuốn “Micropropagation of woody trees and fruits” Trong d6 06 din, keo lai.A mangium x A auriculiformis duge nhén tao chéi thanh céng tir chéi nach cy me 1 tháng tuổi trên mỗi trường MS bổ sung, 2.22 HM BA sau 30-60 ngày, ra rễ tạo cây con hồn chỉnh trên mơi trường

Seradix 3 bổ sung 0.8% IBA Những đòng được dẫn về từ cây trưởng thành có thé được nhân giống thành công trên môi trường MS bỏ sung 4.4 _M BA sau 30 - 60 ngày, ra rễ và tạo cây con hồn chỉnh trên mơi trường Seradix 3 bổ sung

0.8% IBA [Darus, 1991]

Christine Le Roux ef al (2009) đã lựa chọn chỗi nách từ cây mẹ 1.5 năm tuổi, các chổi được Khử trùng và vào mẫu thành công Đầu tiên tác giả sử dụng

'Tween 20 đề rửa mẫu, khử trùng trong cồn 70° trong 30s dé khử trùng bề mặt Sau đó tiến hành khử trùng sâu với HgC1; 0.1% trong 1-2 phút Các chéi in vitro

được ra rễ thành công trên mới trường MS giảm 1⁄2 nồng độ muối đa lượng, bổ sung với 0.1 mM NaEe-EDTA, 1.03 HM NAA và 58.4 IiM succharose, pH của môi trường được điều chỉnh ở mức 5.7 và môi trường được ổn định bằng

Phytagel 0.3% Điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy là 28C, 16h chiếu sáng, ở cường độ 60 nmol.m°.s!

1.2 Cơ sở lý thuyết

Nguyên lý cơ bản của nhân giống in vitro là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin đi truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom) Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin đi truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ

e _ Sự phân hoá và phan phan hoá của tế bào

_ Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất

là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó

Trang 14

có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau Các mô có được cấu trúc chun mơn hố nhất định là nhờ vào sự phân hoá

Phân hoá tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá có thể biểu diễn như sau:

Tế bào phổi sinh ——#TÉ bào dễn ——#fÉ bào phân hoá chức năng Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng khơng hồn tồn mắt khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cân thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hóa, quá trình này gợi là sự phản phân hoá của tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Quá trình này xảy ra theo một chương trình đá được mã hoá trong

cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật,

chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rế, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo

một chương trình đã định sẵn trong AND của tế bào

Trang 15

Chương2 Thực nghiệm

2.1 Mục tiêu của để tài e Mục tiêu tổng quát

Ứng dụng quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô invitro để nhân nhanh và tạo thành công cây mắm mô 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 gồm:

- Xác định môi trường đình dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp cho nhân giống ứr vitro 3 đồng keo lai nói trên

- Tạo cây mầm mô keo lai 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 chất lượng cao

phục vụ trồng 2-3ha mô hình

- Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro 3 dong nghién

° Mục tiêu năm 2012

- Xác định được kỹ thuật „ điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai

đoạn tạo chổi nuôi cấy mô invitro cho 3 dòng keo lại KL2, KL20 và KUTA3

nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chỗi từ 5-7%

- Xác định được môi trường tái sinh chỗi và tạo nguồn vật liệu ban đầu

2.2 Nội đung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội đưng nghiên cứa

_ Nhằm đạt được mục tiêu chung của đề tài, các nội dung nghiên cứu dự kiến được thực hiện trong 3 năm từ 2012 đến 2014 như sau:

« _ Nội dungnghiên cứu năm 2012

1) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu đối với

ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

2) Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu cho ba dong keo

lai KL2, KL20 va KLTA3

3) Nghién ctu xéc dinh méi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu cho

ba dong keo lai KL2, KL20 va KLTA3

« _ Nội dung nghién ciru tir 2013-2014

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến nhân nhanh 3 dòng keo

lai KL2, KL20 và KLTA3

2) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường vật lý đến nhân nhanh chồi 3 dòng

keo lai KL2, KL20 và KLTA3

3 Nghiên cứu xác định môi trường tạo rễ 3 đồng keo lai KL2, KL20 và

KLTA3

Trang 16

4) Xây dụng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô cho 3 dòng keo lai KL2,

KL20 và KLTA3

2.2.2, Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh huông của chất khử trùng và thời gian khử trùng

Chéi mẫu keo lai được sử dụng là chồi nach va chéi đỉnh của cây mẹ được trồng tại vườn cấp dòng của đề tài Chỏi có kích thước đài 3-5cm, đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên Mẫu được cắt vào buổi sáng khi không còn sương (hay nước) đọng trên lá (khoảng 8h-9h sáng) và để hạn chế sự nhiễm khuẩn khi đưa mẫu vào ir vitro thì trước khi cắt mẫu trời phải nắng ráo từ

2 ngày trở lên Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cắt

'Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy từ 25-30 ngày tuổi Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 4/2012 đến tháng 10/2012

Chéi được khử trùng bề mặt theo phương pháp khử trùng:

- Rửa nhiều lẫn qua nước sạch, rửa bằng xà phòng và nước cất,

- Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng và tiến hành thao tác khử trùng, cấy mẫu;

+ Khử trùng bề mặt bằng cồn 70” trong 1 phút Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 3-4 lần

+ Khử trùng sâu bằng một trong các công thức: ÿ HgCl; 0.1% hoặc #) HgC1; 0.5% trong các khoảng thời gian khác nhau 2 phút, 5 phút, 8 phút và 10 phút Sau đó, rửa lại bằng nước cát khử trùng 5-6 lần

+ Cay mẫu chdi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm

- Các chổi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở

4°C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối

với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chủi, giảm tỷ lệ nhiễm Sau đó, các chổi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27+2"C, độ âm 30+59%, cường độ ánh sáng 0-5001ux

Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường đỉnh dưỡng cơ bản là môi trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chat vitamin, 3% sacrose và 3.0g/1 Agar Agar (Hải Long) bổ sung 0.5 mg/l hoocmon BAP dé ting khả năng

tái snh chồi Mới trường được khử trùng tại 121C, áp suất 1.4atm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0

Trang 17

Bảng O1 Công thức khử trùng mẫu cấy Ký hiệu Khử trùng sâu công thức thú nghiệm KTL HgCl; 0.1% trong 2 phút KT THgCl; 0.1% trong 5 phút KB THgCl; 0.1% trong 8 phút KH HgC1, 0.1% trong 10 phút KTS HgCl, 0.5% trong 2 phut KT6 HgCl, 0.5% trong 5 phut KT7 THgC; 0.59 trong 8 phút KTS HgCl, 0.5% trong 10 phút

Thí nghiệm đo đếm và quan sát 4 tuần sau khi cấy Các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy chồi, số chi tái sinh, hình thái và màu

sắc mẫu

2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hướng của mùa vụ cấy mẫu và

tudi mẫu cấy

Chồi mẫu keo lai được sử dụng là chéi nach va chéi đỉnh của cây mẹ được trồng tại vườn cấp dòng của đề tài Chi mẫu có kích thước đài 3-5cm, đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên Mẫu được cắt vào buổi sáng khi

không còn sương (hay nướ é

nhiém khudn khi dua mau vao in vitro thì trước khi

2 ngày trở lên Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cắt

"Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy ở các tuần tuổi 2, 3 và 4 tuổi Thời vụ

cấy mẫu được được chia làm 2 vụ bao gồm: Vụ hè (từ tháng 4 đến tháng 7/2012)

và vụ thu (từ tháng 8 đến tháng 10 năm 2012) Chỏi được khử trùng như sau:

« Khử trùng bề mặt

- Rửa nhiều lẫn qua nước sạch, rửa bằng xà phòng và nước cắt,

Trang 18

-_ Đồng KL20: HgC1; 0,5%trong 5 phút - Dồng KLUTA3: HạCl; 0,1% trong 10 phút

Sau đó, rửa lại bằng nước cắt khử trùng 5-6 lần

+ Cay mẫu chdi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm

- Các chổi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở

4C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối

với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chỗi, giảm tỷ lệ nhiễm Sau đó, các chổi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27+2"C, độ âm 30+59%, cường độ ánh sáng 0-5001ux

Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường đỉnh dưỡng cơ bản là môi

trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chất vitamin, 3% sacrose và

3.0g/1 Agar Agar (Hải Long) bỏ sung 0.5 mg/1 hoocmon BAP để tăng khả năng

tái sinh chồi Môi trường được khử trùng tại 121C, áp suất 1.4afm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0

Bồ trí thí nghiệm theo đạng 2 nhân tó, khối ngẫu nhiên đầy đủ (bao gồm 6 công thức thí nghiệm) Mỗi công thức thí nghiệm bao gồm 50 mẫu/1 lần lặp và được lặp lại 3 lần Bảng 02 Công thức thí nghiệm tuôi mẫu cây và thời vụ cây mẫu Ký hiệu công thức thí Thời vụ cấy mẫu Tuổi mẫu cấy nghiệm

KT ‘Vu hè (tháng 4-7/2012) 2 tuần tuổi KT1O ‘Vu hè (tháng 4-7/2012) 3 tuan tudi KTI ‘Vu hè (tháng 4-7/2012) 4 tuần tuổi KTL2 'Vụ thu (tháng 8-10/2012) 2 tuần tuổi KT13 ‘Vu thu (tháng 8-10/2012) 3 tuan tudi KTM ‘Vu thu (tháng 8-10/2012) 4 tuần tuổi

_ đo đếm và quan sát 4 tuần sau khi cấy Các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy chỗi, số chởi tái sinh, hình thái và màu

sắc mẫu

2.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguôn vật liệu ban đâu

Những mẫu sống không nhiễm nấm khuẩn và nảy chéi sau 28 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm được cấy chuyên sang môi trường chứa trong bình tam giác 250ml chứa môi trường cơ bản để tiền hành các thí nghiệm về nhân chồi

Trang 19

Các môi trường dinh đưỡng nhân chồi cơ bản được thử nmghiệm là McCOWN’s Woody Plant (WPM), Schenk & Hildebrandt (SH); Murashige & Skoog (MS), 12 MS (môi trường MS giảm 1⁄2 hàm lượng các chất đa lượng), M4 (môi trường tái nh chồi cây bạch đàn) Thành phần chỉ tiết nỏng độ các chất đa lượng, vi lượng, vitamin theo phụ lục 02 Môi trường được khử trùng tại 121C, áp suất 1.4atm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 3.8-6.0

Bồ trí thí nghiệm: các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp thực nghiệm so sánh với 3 lần lặp lại theo thời gian Mỗi công thức thử nghiệm 10 bình x 5 mẫu/bình

Thí nghiệm đo đếm và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy Đo đếm các chỉ tiêu về hệ số nhân chửi, tỷ lệ chỗi hữu hiệu và hình thái chổi Các công thức nghiên cứu được mô tả ở bảng 01 Bằng 03 Công thức thí nghiệm xác định môi trường tai sinh chỗi, Ký hiệu Mỗi trường tái sinh chỗi công thức thí nghiệm

NCL McCOWN’s Woody Plant (WPM)

NŒ Schenk & Hildebrandt (SH)

NG Murashige & Skoog (MS)

NC4 1 MS (môi trường MS giảm 1⁄2 hàm lượng các chất đa lượng) NCS M4 (môi trường tái sinh chỗi cây bạch đàn) 2.2.2.4 Thụ thập và xử lý số liệu «_ Bố trí thí nghiệm

Trang 20

> Số mẫu bị nhiễm

Ty 1émau nhiém (%) = ————————— x100%

= S6 mau đưa vào

Ty 1é mẫu sạch không nảy chdi (“%@) = ———————————— 100

86 miu nay chdi

Tỷ lệ mẫu nảy chổi (%) = —————— x100%

*> Số mẫu đưa vào

5 Số chổi tạo thành

Hệ số nhân chỏi (lần) =

Ty 1é chdi hitu hiéu (%) -———————— x 100 5 Số chồi tạo thành

Chéi hữu hiệu là những chổi có chiều cao từ 1,0 em trở lên, thân, lá và ngọn rõ rằng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus Thu thập tình trạng phát triển của chỗi gồm: hình thái cia chdi, mau sic chéi và mức độ sinh trưởng của chời

Số liệu được xử lý bằng mềm Ecell và chương trình SPSS Trong đó, để

kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tổ thí nghiệm, chúng tối sử dụng phương pháp so sánh K mẫu độc lập

Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả nghiên cứu Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia thành các nhóm khác nhau Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong

cùng một nhóm sự sai khác không có ý nghĩa

Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm ở giữa 2 cấp Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân t6 kiểm tra không lớn)

2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

- Panh, kéo nuôi cấy mô

3 Hóa chất sử dung trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác

Trang 21

Chương $

'KẾết quả và bình luận

1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng

3.11 RẾt quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khả" tràng đối voi dong KL2

khuẩn | nảy chổi | nảy chổi

Trang 22

Kết quả nghiên cứu trong bảng 04 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm

khuẩn, mẫu sạch nảy chỗi và không nảy chổi có sự dao động rất lớn giữa các công thức thí nghiệm

Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng (điệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả điệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chỗi

Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, qua bảng 01 chúng fa nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng tăng, thời gian khử trùng càng kéo đài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao Công thức

khử trùng với HgCl; 0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 56%, các

công thức khử trùng với HgC1; 0.1% trong 2 phút, 5 phút và 8 phút có tỷ lệ mẫu

chết thấp nhát là 1.39

Khi thời gian khử trùng kéo đài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng Như chúng ta đã biết, Hạ” có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với các protein mang (Walsh ef z1 1988) Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng 1ig” thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với mẫu cần xử lý càng cao

Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt khi nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng cùng tăng và khi thời gian khử trùng thay đổi từ 8 phút lên 10

phút thì ta nhận thấy tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt ở các nồng độ chất khử trùng

khác nhau (đối với công thức HgCl, 0.1% thi tỷ lệ này tăng từ 1.3% lên 22% và đối với công thức HgC]; 0.59 thì tỷ lệ này tăng từ 189% lên 569)

Đối với khả năng điệt khuẩn của chát khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết do chất khử trùng càng cao Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức

HgCl, 0.5% trong 10 phút là 40.7% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là

56% và tỷ lệ mẫu sạch đạt thấp nhất là 3.3%

Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chỗi của chất khử trùng qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch

có nảy chổi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl; 0.5% trong 8 phút đạt tỷ

lệ 17.3% Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chỏi thấp nhất là công thức khử trùng với HgCl; 0.5% trong 10 phút đạt tỷ lệ 0.0%

Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ

lệ mẫu sạch có nảy chỗi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau Công thức khử trùng với HgCl;

0.5% trong 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với đòng keo lai KL2 với

tỷ lệ mẫu sạch nảy chỗi là 17.3% Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu

được tổng hợp trong phụ lục 03

Trang 23

3.12 KẾT quả nghiên cứu ảnh hưởng cũa chất khủ: tùng và thời giai khả" tràng dối với dong KL20

IHgCl, 0.1% trong] Sé mau 0 146 3 1 150 [2 phút Tÿylệ% | 0%| 97.394 ots 2.0%) .794|100.094| IHgC1; 0.1% trong| Số mẫu 19 125 4, 3| 150) |5 phút ẹ Tÿlệ% |1279| 83.394 .79) 3.39⁄4|100.094| IHgCl; 0.1% trong| Số mẫu 35 106 4 5| 150 8 phút E Tỷ lệ% |23.39| 70.7% 2.7%) 3.39⁄4|100.094| IHgCl; 0.1% trong| Số mẫu 40 101 2| 7) 150} 110 phút Tỷlệ% |26.7%| 67.34 Ta 1.3% 4.79⁄4|100.094| IHgCl; 0.5% trong| Số mẫu 5 134 5 6| 150 | phút R Tÿlệ% | 3.3%| 89.394 3.3%| 4.094|100.094| IHgC1; 0.5% trong| Số mẫu 28| 108} hộ 13] 150) |5 phút e Ty18% | 18.7% 72.094 .7%| 8.79|100.0%4| IHgCl; 0.5% trong| Số mẫu 37 104 3 6| 150 8 phút LÊN Tỷylệ% |247%| 6939| — 2.094 4.096|100.094| IHgC1; 0.5% trong| Số mẫu 55 86 4 5| 150) 110 phat Tỷ lệ% | 36.7%| 57.34 Ta 2.7%) 3.39⁄4|100.094| Tổng Só mẫu 219 910| 23 48| 1200 Tỷlệ% |1829| 75.894 1.9%| 4.094|100.094|

khuẩn, mẫu sạch nảy chồi và không nảy chỗi đối với dòng keo lai KL20 cũng

tương tự như đối với đòng KL2, các chỉ tiêu theo dõi có sự dao động rất lớn giữa

các công thức thí nghiệm

Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng, (điệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm

Trang 24

chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả điệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chỗi

khử trùng với HgCl; 0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 36.79, các công thức khử trùng với HgCl; 0.1% trong 2 phút có tỷ lệ mẫu chết thấp

nhất là 0.09

Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng Như chúng ta đã biết, Hg” có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với các protein mang (Walsh ef al., 1988) Khi thoi gian khử trùng kéo dài thì lượng 1ig” thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết

mẫu cần xử lý càng cao

Đối với khả năng điệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng tháp thì tỷ lệ mẫu chết do chất khử trùng càng cao Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức

HgŒ1; 0.5% trong 10 phút là 57.3% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là

36.7%

Đối với hiệu quả fạo mẫu sạch vô trùng có nảy chỗi của chất khử trùng qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch

lệ 8.7% Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là công thức khử trùng với HgCl; 0.1% trong 2 phút đạt tỷ lệ 0.7

Kết quả cho thầy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ lệ mẫu sạch có nảy chổi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau Công thức khử trùng với HgCl;

0.5% trong 5 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KL20

với tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 8.7% Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu

được tổng hợp trong phụ lục 03

3.1.3 NẾt quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khi tring và thời gian Khir trùng dối với dong KLTA3

khuẩn, mẫu sạch nảy chỗi và không nảy chỏi đối với dòng keo lai KLTA3 cũng tương tự như đối với dòng KL2, các chỉ tiêu theo doi có sự dao động rất lớn giữa iệm Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng (diệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích va so sánh theo các nhóm chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệt

u, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi

Trang 25

Bảng 06 Kết quả nghiên cứa ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối voi dong KLTA3 CTTN " a a Tổng chết | nhiễm | và không

IHgCl; 0.1% trong| Số mẫu 3 137 10 o} 150 [2 phút ẹ Tÿlệ% | 2.0%| 91.394 6.7%) .0%|100.0%| IHgCl, 0.1% trong] Sé mau 6 118 6 20] 150) |5 phút R Ty18% | 4.0%| 787% 4.09] 13.39|100.0%4| IHgC1; 0.1% trong| Số mẫu 16 107 6 21| 150 8 phút = Ty18% | 10.7% 71.394 4.09] — 14.0%|100.0%4| HgCl, 0.1% trong 33 96 9| 12| 150 10 phút Ty 18% | 22.0%| 64.094 ae 6.0%) 8.09|100.0%4 HgCl, 0.5% trong 25 122 0| 3] 130 [2 phút Ty 18% | 16.7%| 81.394 ots .0%| 2.09⁄|100.094| IHgCl; 0.5% trong| Số mẫu 61 82 2 5} 150 |5 phút z Ty18% | 40.7%| 54.7% 1.3% 3.39⁄4|100.094| IHgCl; 0.5% trong| Số mẫu 76 67 4 3| 150| 8 phút p Tỷlệ% |50.7%| 44.7% 2.7%) 2.09⁄4|100.094| HgCl, 0.5% trong| Số mẫu 83 63 4 o| 130 110 phat Ty18% | 55.3%| 42.0% ¬a 2.7%) .0%|100.0%| Tong, Só mẫu 303 792 41 64| 1200 Tỷlệ% |25.29| 66.0% 3.49) 3.39⁄4|100.094|

khử trùng với HgCl; 0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 55.39, các công thức khử trùng với HgC1; 0.19 trong 2 phútcó tỷ lệ mẫu chết thấp nhất

là 2.0% Khi thời gian khử trùng kéo đài thì tỷ lệ ứ Như chúng ta đã biết, Hg” có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với các protein màng (Walsh ef al., 1988) Khi thời gian khử trùng kéo đài thì lượng, Hạ thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với

3ã

Trang 26

mẫu cần xử lý càng cao

Đối với khả năng điệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, ta nhận tháy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng tháp thì tỷ lệ mẫu chết do chất khử trùng càng cao Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức

HgCl, 0.5% trong 10 phút là 42.0% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là

353%

Đối với hiệu quả fạo mẫu sạch vô trùng có nảy chỗi của chất khử trùng qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch

lệ 14.0% Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chỏi thấp nhất là công thức khử trùng với HgCl; 0.5% trong 10 phút đạt tỷ lệ 0.0%

Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt bii

là

lệ mẫu sạch có nảy chỗi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử

trùng trong các khoảng thời gian khác nhau Công thức khử trùng với HgCl: 0.1% trong 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KLTA3 với tỷ lệ mẫu sạch nảy chỗi là 14.0% Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ

tiêu được tổng hợp trong phụ lục 03

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cây mẫu và tuổi mẫu cấy

3.2.1 NghiÊn cứu ảnh huởng của thời vụ cấy mẫu và tuôi mẫu cấy dối với

đồng KE2

Kết quả tổng hợp về ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy

được thể hiện ở bảng 07 Bảng 07 cho tháy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn,

mẫu sạch nảy chồi và không nảy chéi giữa các công thức thí nghiệm có sự khác nhau giữa các công thức

Trong bồn chỉ tiêu nghiên cứu nêu trên thì chỉ tiêu mẫu mẫu sạch và nảy chỗi là chỉ tiêu đánh giá hiệu quả của quá trình vào mẫu tạo vật liệu ban đầu

Bang 07 cho tha 1 sạch khuẩn và nảy chỗi biến động từ 12% đến 18%

ở các công thức thí nghiệm

Công thức cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chôi tốt nhất là công thức KT9 (vụ hè +2 tuần tuổi) ở công thức này tỷ lệ mẫu sống và nảy chỗi bình quân

là 18% Tiếp đến là công thức KT10 và KT11 cho tỷ lệ mẫu sạch và nảy chổi bình quân là 16% Điều này cho thấy khi vào mẫu ở mùa hè tốt nhất là tuổi mau

ở 2 tuần tuổi sau đó là 3 và 4 tuần tuổi cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chéi 1a như nhau Tiếp đến tỷ lệ mẫu sạch và nảy chi lần lượt là các công thức KTI2,

KT13 và KTI4 với tỷ lệ mẫu sạch và nảy chỗi lần lượt là 14%, 14% và 12% Tỷ

lệ mẫu sạch và nảy chỗi này là tương đối cao so với các nghiên cưu về nuôi cấy mô cây keo lai

Để xem xét sự sai khác giữa các kết quả nghiên cứu có ý nghĩa về mặt thống kê hay không, đề tài tiến hành phân tích thống kê cho các chỉ tiêu nghiên

cứu Kết quả phân tích thống kê cho thấy (phụ lục 04), tỷ lệ mẫu chết, mẫu

nhiễm khuẩn, mẫu sạch nảy chổi và không nảy chổi giữa các công thức thí 26

Trang 27

nghiệm có sự sai khác nhau rõ rệt về mặt thống kê vì giá tị Sig đều nhỏ hơn 0,05 Bang 07 Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuôi mẫu cấy đối với dòng KL2 Mẫu Mẫu

aay x sae va | sachva | pang

khuẩn | ` hề, ny chổi | chổi it KT Số mẫu 27 90 6 27| 150 (Vụ hè, 2 tuần tuổi) | Tỷlệ(%) | 180| 60,0 40 18,0 | 100,0 KT10 Số mẫu 24 93 9 24| 150 (Vụ hè, 3 tuần tuổi) | Tỷlệ(%) | 160| 62/0 60 16,0 | 100,0 KTH Số mẫu 21 93 12 24| 150 (Vụ hè, 4 tuần tuổi) T lệ (%) 140| 62,0 80 16,0 | 100,0 KTI2 27 90 12 21| 150 (Vụ thu, 2 tuần tuổi) 180| 60,0 80 14,0 | 100,0 KT13 30 95 4 21| 150 (Vụ thu, 3 tuần tuổi) 20,0| 63,3 37 14,0 | 100,0 KTM 33 89 10 18| 150 (Vụ thu, 4 tuần mỗi) | Tỷ lệ @%) | 220| 593 67 12,0 | 100,0

Như vậy với dòng keo lai KL2 khi vào mẫu vụ hè thì mẫu 2 tuần tuổi cho hiệu quả cao nhất khi vào mẫu ở vụ thu thì tốt nhất là mẫu 3 tuần tuổi Đồng thời kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy đối với dòng keo lai KL2 khi vào mẫu giữa 2 vụ là vụ thu và vụ hè thì vụ hè cho hiệu quả quá trình vào mẫu cao hơn rõ rệt

3.2.2 KẾI quả nghiên cứu ảnh hưởng cũa thời vụ cấy mẫu và tôi mẫu cập đãi với đồng KL20

Kết quả nghiên cứu về thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng

KL20 được tổng hợp ở bảng 08 Bảng 08 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm

khuẩn, mẫu sạch nảy chỗi và không nảy chỗi giữa các công thức thí nghiệm có sự khác nhau tương đối lớn giữa các công thức

Công thức cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chỗi tốt nhá

KT9 (vu hè +2 tuần tuổi) ở công thức này tỷ lệ mẫu sống và nay ct

là 12,7% Tiếp đến là công thức KTI0 cho tỷ lệ mẫu sạch và nay chdi là 9,39 Tiếp theo là các công thức KT12, KT11, KT13 và KT14 với tỷ lệ mẫu sạch và nảy chỗi là 8,79%, 7,39, 7,396 và 4,79,

là công thức

Trang 28

Bảng 08 Kết quả nghiên cứu thời vụ cây mẫu và tuôi mẫu cấy đối với dòng KL20 ạ, | Mẫu | Mẫn | Mẫn

CTTN Man | nhiệm | Sch va | sachva | rặng chế | Tondn | KbOng_ | có nay nay chỗi | chdi KTS Số mẫu 29 98 4 19} 150 (Vụ hè, 2 tuần tuổi) | Tỷ lệ (%) 193| 653 27| 12,7 | 100.0 KT10 Số mẫu 31 104 1 14| 150 (Vụ hè, 3 tuần tuổi) | Tỷ lệ (94) 207) 693 07 9,3 | 100,0 KTM Số mẫu 28 105 6 11| 150 (Vụ hè, 4 tuần tuổi) | Tỷ lệ (%) 187| 70,0 4,0 73| 1000 KT12 Số mẫu 30 106 1 13| 150 (Vụ thu, 2 tuần tuổi) | 'Tỷ lệ (9%) 200| 70,7 0,7 8,7 | 100.0 KT13 Số mẫu 30 106 3 11| 150 (Vụ thu, 3 tuần tuổi) | 'Tỷ lệ (%) 20,0} 70,7 2,0 73| 1000 KTM Số mẫu 30 110 3 7| 150 (Vụ thu, 4 tuần môi) | Tỷ lệ (96) 200| 73,3 20| 47|1000

Nhằm xem xét sự sai khác giữa các kết quả nghiên cứu có ý nghĩa về mặt thống kê hay không, đề tài tiến hành phân tích thống kê cho các chỉ tiêu nghiên cứu Kết quả phân tích thống kê cho thấy (phụ lục 04), tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch nảy chổi và không nảy chổi giữa các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau rõ rệt về mặt thống kê vì giá trị Sig đều nhỏ hơn 0,05

Như vậy với đòng keo lai KL20 khi vào mẫu ở cả vụ hè và vụ thu thì mẫu

2 tuần tuổi cho hiệu quả cao nhất Đồng thời kết quả phân tích thống kê cũng

cho thấy khi vào mẫu ở vụ hè và vụ thu cho hiệu quả khác nhau rõ rệt

3.2.3 KẾT quả nghiên cứu ảnh hưởng cũa thời vụ cấy mẫu và tôi mẫu cập đối với dong KLTA3

Kết quả nghiên cứu về thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với đòng

KLTA3 được tổng hợp ở bảng 09

Tương tự với đòng keo lai KL2 và KL20, đòng keo lai KLTA3 cũng cho tỷ lệ mẫu sạch và nảy chổi cao nhất ở công thức KT9 với tỷ lệ mẫu sạch và đạt 11,39% và thấp nhất là công thức KT14 đạt 6,0%

Trang 29

Kết quả phân tích thống kê cho thấy (phụ lục 04), tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch nảy chổi và không nảy chồi giữa các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau rõ rệt về mặt thống kê vì giá trị Sig đều nhỏ hơn 0,05

Như vậy với dòng keo lai KL20 khi vào mẫu ở vụ hè thì mẫu có độ tuổi 2

tuần là tốt nhất và vụ thu thì mẫu 3 tuần tuổi cho hiệu quả cao nhất

3.3 Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguôn vật liệu

ban đâu

3.3.1 KẾT quả nghiên cứu xác định môi tường tái sinh chỗi và tạo nguén vật liệu ban đầu đối với dong KL2

Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả quá trình nhân chỗi đòng keo lai KL2 được thể hiện ở bảng 10

Bảng 10 cho thấy, hệ số nhân chổi cia dong KL2 ở các công thức thí nghiệm đã có sự khác nhau nhiều Công thức cho hệ số nhân chổi cao nhát là

môi trường MS (đạt 1,24 lần), cao gấp 2 lần so với công thức M4 (0,61 lần)

Tiếp theo là các công thức SH, WPM và 1⁄2 MS, ở các công thức này hệ số nhân

Trang 30

Bằng 10 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chỗi dong KL2

Môi trường| Số chổi | Số chồihữu | Hệ số nhản | Tỷ lệ chồi hữu

tạo thành hiệu chỗi đẳn) hiệu (99), 'WPM 140 7 0,93 5,00 SH 155 7 1,03 4,52 MS 186 39 124 20,97 1/2MS 112 Zz 0,75 6,25 M4 91 1 061 1,10

Như vậy, hệ số nhân chồi ở các môi trường nghiên cứu rất thấp Chỉ có môi trường MS là tương đối thích hợp cho tái sinh chỗi dòng keo lai KL2 và đạt được hệ số nhân chỗi lớn hơn 1 lần Các môi trường khác không cho thấy không, thích hợp với đòng keo lai này, chổi cấy vào các môi trường này chết dần hoặc không phát triển Ví dụ như môi trường M4 là môi trường nuôi cấy cây bạch đàn thì 40% mẫu cấy vào bị chết do không thích hợp

Cùng với hệ số nhân chổi thì tỷ lệ chỗi hữu hiệu cũng là chỉ tiêu quan trọng đánh giá sự thích hợp giữa ch: cấy Bảng 10 cho thay, tỷ lệ chổi hữu hiệu ở các môi trường nuôi cấy rất thấp Cao nhất là môi

trường MS với tỷ lệ chồi hữu hiệu là 20,9%, các môi trường khác biến động từ 1,1% đến 6,259

Quan sát hình thái chỗi ở các công thức thí nghiệm cho thấy, hình thái chỗi nuôi cấy ở môi trường MS xanh và có xu hướng phát triển tốt Các môi trường khác có nhiều chỏi bị chết và hẳu kết chồi có màu vàng và không có triển vọng phát triển

So với các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây keo lai thì hệ số nhân chỗi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu đề tài đã đạt được là tương đối thấp Do vậy cần tiếp tục thử nghiệm bổ sung các chất Khác nhau trên nền là môi trường MS để có được hệ số nhân chỗi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu cao hơn

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, 5 công thức thí nghiệm về môi trường cơ bản đã cho hệ số nhân chôi và tỷ lệ chồi hữu hiệu khác nhau rõ rệt và có ý nghĩa về mặt thống kê vì giá trị Sig thu được đều nhỏ hơn 0,05 (0,01 với chỉ tiêu hệ số nhân chdi và 0,032 đối với chỉ tiêu tỷ lệ chỗi hữu hiệu) Nhằm xác định công thức cho hệ số nhân chởi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu tốt nhất đề tài tiến hành phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan Kết quả phân nhóm cho thấy môi trường MS là thích hợp nhất với độ tin cậy 95%

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguẫn vật liệu ban đầu đối với dong KL20

Sau 4 tuần nuôi cấy chỗi trong 5 loại môi trường cơ bản, đề tài tiến hành

đo đếm và đánh giá Kết quả được tổng hợp ở bảng 11

Trang 31

Bảng 11 Ảnh hướng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chỗi dong KL20

Môi trường| Số chổi | Số chồihữu | Hệ số nhản | Tỷ lệ chồi hữu

tạo thành hiệu chỗi đẳn) ệu (9) WPM 152 10 1,01 6,58 SH 167 10 11 5,99 MS 198 42 132 21,21 1/2Ms 124 10 0,83 8,06 M4 103 4 069 3,88

Kết quả ở bảng 11 cho tháy, hệ số nhân chồi của dòng KL20 ở các công đã có sự khác nhau tương đối lớn Công thức cho hệ số nhân mồi trường MS (đạt 1,32 lân), cao hơn hẳn so với công thức M4 (0,69lần) Tiếp theo là các công thức SH, WPM và 1⁄2 MS, ở các công thức này hệ số nhân chỗi lần lượt là 1,11 lần; 1,01 lần và 0,83 lần

| Tương tự như đối với dòng KL2, dòng KL20 cũng cho hệ số nhân chỗi

thấp Ngồi mơi trường MS tương đối thích hợp, các môi trường khác chỗi sinh

trưởng, phát triển kém

Bảng 11 cũng cho thấy, tỷ lệ chổi hữu hiệu đạt được khi nuôi cấy trong

môi trường MS đạt 21,21% cao hơn rõ rệt so với các môi trường còn lại Ở công thức này chỗi sinh trưởng ở mức trung bình, chổi có màu xanh và có xu hướng phát triển

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, 5 công thức thí nghiệm về môi trường cơ bản đã cho hệ số nhân chỗi và tỷ lệ chồi hữu hiệu khác nhau rõ rệt và

có ý nghĩa về mặt thống kê vì giá trị Sig thu được đều nhỏ hơn 0,05 Môi trường MS là thích hợp nhất cho tái sinh chổi dòng keo lai KL20

3.3.3 KẾt quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chỗi và tạo nguôn vật liệu ban đầu đôi với dong KLTA3

Hệ số nhân chồi và tỷ lệ chổi hữu hiệu của dòng keo lai KLTA3

trong 5 loại môi trường cơ bản được tổng hợp và thể hiện ở bảng 12 Bảng 12

cho tháy, hệ số nhân chỏi bình quân cao nhất đạt được ở môi trường MS là 13 lần Thấp nhất ở công thức môi trường M4 với hệ số nhãn chỗi đạt 0,58 lần Trong 5 công thức thí nghiệm, có 3 môi trường cho hệ số nhân chỏi thấp dưới 1 lần là mỗi trudng WPM, 1/2MS và M4, ba mỗi trường này là hoàn toàn không thích hợp cho đòng keo lai KLTA3 vì mẫu cấy vào môi trường này không những không phát triển được mà còn bị chết dân

Trang 32

Bằng 12 Ảnh huỏng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chối dòng KLTA3

Méitrwéng| Số chồi | Số chồ hữu | Hệ số nhân | Tỷ lệ chổi hữu

tạo thành hiệu chỗi đẳn) hiệu (9) WPM 135 z 0,90 5,19 SH 155 7 1,03 4,52 MS 195 39 130 20,00 12MS 104 1 0,69 0,96 M4 87 0 058 0,00

Với dòng KUTA3 thì hệ só nhân chỏi thu được khi cấy trong môi trường

SH đứng ở mức thứ 2 sau môi trường MS Đây cũng là môi trường có thể có triển vọng nếu được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cũng như một số chất hữu cơ khác

Cùng với việc đánh giá hệ số nhân chỏi thì tỷ tỷ lệ chỏi hữu hiệu cũng là tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả của môi trường nuối cấy Bảng 12 cũng cho thay tỷ lệ chỗi hữu hiệu thu được của các công thức là thấp Cao nhất là môi trường MS với tỷ lệ chồi hữu hiệu là 20,0% Các mồi trường khác tỷ lệ chỗi hữu

higu rat thấp, trong đó đặc biệt là môi trường M4 và môi trường 1⁄2 MS tỷ lệ chỗi

hữu hiệu bằng không (không có chéi hữu hiệu) hoặc không đáng kể (0,96%) Từ kết quả này cho thấy với dòng KLTA3 chỉ có môi trường MS là thích hợp cho tái sinh chỗi

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, hệ số nhân chỏi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu ở 5 công thức thí nghiệm về môi trường cơ bản đã cho khác nhau rõ rệt và có ý nghĩa về mặt thống kê vì giá trị Sig thu được đều nhỏ hơn 0,05 ( lần lượt là 0,011 với chỉ tiêu hệ số nhân chồi và 0,018 đối với chỉ tiêu tỷ lệ chồi hữu hiệu) Như vậy, dòng keo lai KUTA3 đã cho phản ứng khác nhau đối với môi trường nuôi cấy 3.3.4 So sánh về hệ số nhân chỗi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu giữa các dòng nghiên cứu

Đồng thời nhằm kiểm tra khả năng tạo mẫu vô trùng của các dòng nghiên cứu, đề tài so sánh hệ số nhân chổi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu giữa 3 đòng nghiên cứu Kết quả cho thấy, hệ số nhân chởi và tỷ lệ chỗi hữu hiệu của các dòng nghiên cứu ở các công thức thí nghiệm không có sự sai khác nhau về mặt thống kê Như vậy, khả năng nuôi cấy invitro của các dòng là tương đương nhau (phụ lục 06)

Trang 33

Chương4

'Kết hiận và kiến nghị 4.1 Kết luận

Đề tài đá thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cúu theo đúng tiến độ và phương pháp của đề cương nghiên cứu và hợp đồng Qua các thử nghiệm đã bước đầu xác định được kỹ thuật và mổi trường cơ bản cho tao chỗi và tái sinh chỗi của các đòng nghiên cứu:

1 Với đồng KL2

Khử trùng mẫu tốt nhất là HgC12 0.5% trong 8 phút cho hiệu quả tạo mẫu vô trùng cao nhất đạt 17.3% Mẫu cấy ở vụ hè và 2 tuần tuổi là thích hợp nhất

với tỷ lệ mẫu sạch và nảy chồi đạt 18% Môi trường MS là thích hợp nhất trong 5 loại mỗi trường nghiên cứu với hệ số nhân chỗi đạt 1,24 lần và tỷ lệ chỗi hữu hiệu là 20,97%

2 Với dòng KL20

Mẫu cấy được khử trùng với HgCl2 0.5% trong 5 phút cho hiệu quả tạo mẫu vô trùng cao nhất đạt 8,79 cấy vào vụ hè và 2 tuần tuổi cho tỷ lệ ấu nảy chồi tốt nhất đạt 12,7% Môi trường MS là thích hợp nhất cho tái sinh chỗi với hệ số nhân chồi đạt 1,32 lần và tỷ lệ chéi hữu hiệu là 21,21%

$ Với đồng KLTA$

Công thức khử trùng với HgCl2 0.1% trong 8 phút cho hiệu quả tạo mẫu vô trùng cao nhất đạt 14.0% Cấy mẫu là vụ hè và mẫu ở 2 tuần tuổi cho hiệu quả tốt nhất, với công thức này, tỷ lệ mẫu sạch và nảy chỗi đạt 11,39 Môi trường MS là thích hợp nhát cho tái sinh chồi với hệ số nhân chởi đạt 1 3 lần và tỷ lệ chỗi hữu hiệu là 20,0%

42 Kiếnnghị

Do thời gian cũng như số lượng các thử nghiệm còn hạn chế nên đề tài mới đạt được những kết quả bước đầu Năm tiếp (heo đề tài cản thực hiện các nghiên cứu cụ thể như:

'VỀ khử trùng mẫu: Cần thử nghiệm đối với các chất khử trùng khác như NaClO, Ca(C1O); và H;O;, đồng thời có các thử nghiệm đối với giai đoạn khử trùng bề mặt bằng côn ở một số nồng độ và thời gian khác nhau

Về thời vụ lẫy mẫu: Vì năm 2012 đề tài được phê duyệt muộn nên chưa thể thử nghiệm lây mẫu vào vụ xuân Do vậy năm 2013 cần thử nghiệm lấy mẫu tạo chi invitro ở vụ xuân, từ đó xác định thời vụ lấy mẫu tốt nhát trong năm cho các dòng nghiên cứu

VỀ mỗi trường nuôi cấy cơ bản: Do các môi trường thử nghiệm còn hạn

chế (mới thí nghiệm được 5 loại mối trường) nên hệ số nhân chỏi và tỷ lệ chỗi

hữu hiệu còn thấp Năm 2013, đề tài cần tiếp tục thử nghiệm các mỗi trường

Trang 35

Tài liệu tham khảo

1 Tiếng việt

1 Lê Văn Chỉ Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng và vi lượng hiệu

quả cao Nhà xuất bản Khoa học — Kỹ thuật, trang 5 — 23, 1992

2, CE, Harwood, Lé Dinh Kha, Hà Huy Thịnh, Phí Hồng Hải Báo cáo tổng quan về nguồn giống và phương pháp nhân giống cho các loài Keo phục vụ trồng rừng cung cấp gỗ xẻ ở Việt Nam Báo cáo đề tài, Trung tâm nghiên cửu giống cây rừng Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Hà Nội, 2005

3 Lễ Đình Khả và cộng sự Chọn tạo giống và nhân giống cho một số loài cây trồng chủ yếu ở Việt Nam Nhỏ xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2003

4 Đoàn Thị Mai và cộng sự Nghiên cứu nhân nhanh giống keo lãi tự nhiên, keo lai nhân tạo, bạch đàn Uro, bach dan lai nhân tạo và lát hoa mới chọn tạo bằng công nghệ tế bào áo cáo đề đài, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng- Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Hà NỘI, 2008, 2009

5 Huỳnh Đức Nhân và cộng sự Báo cáo kết quả trồng thí nghiệm một số đòng vô tính bạch đàn và Keo lai ở vùng trung tâm Bắc bộ và miền Đông Nam Bộ nhằm công nhận giống mới để phục vụ sản xuất lâm nghiệp Báo cáo đề tai,

Thúng tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, 2005

6 Nguyễn Quang Thạch và

Công nghệ sinh học tế bào Nhà xị ø sự, Cơ sở công nghệ sinh học Tập ba - bản giáo dục, Hà Nội, 2009

7 Phạm Thị Kim Thanh và cộng sự : Nghiên cứu nhân giống một số dòng Bạch đàn và xuất xứ Keo Tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào và giảm hom Báo cáo đề tài, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, 2008

IL Tiéng Anh

8 A.Galianaat al Micropropagation of Acacia mangium x A.auriculiformis hybrids in Sabah Bois et jorests des tropiques, 2003, n° 275 (1)

9 Christine Le Roux et al Bradyrhizobia Nodulating the Acacia mangium x A auriculiformis Interspecific Hybrid Are Specific and Differ from Those Associated with Both Parental Species Appl Environ Microbiol 2009

10 Darus H Ahmad Multiplication of Acacia mangium by stem cutting and tissue culture techni ques Advances in tropical acacia research, p 32-34, 1994

11 Olivier Monteuuis & Marie-Claude Bon Influence of auxins and darkness on in vitro rooting of micropropagated shoots from mature and juvenile Acacia mangium Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: p 173-177, 2000

12 Razali, A K and Mohd, S.Hh Procssing and utilization of acacia

focussing on acacia mangium Proceeding of first meeting of the consultative growp for research and development of acacia in thailand, pp.86-91, 1992

Trang 36

13 R.Vasodha et aL Micropropagation for quality propagule production in plantation forestry Jndian Journal of Biotechnology, Vol.3, April 2004, pp 159- 170

14 Sedley, M_ and Habard J Hybridisation techniques for acacia Aciar technical reports no 20, canberra, 11 pp, 1992

Trang 37

Phụ lục 01 Một số hình ảnh tro quá trình nghiên cứu của dé tai Phụ lục 1.1 Một số hình ảnh kết quả khử trùng mẫu Mẫu chỗi keo lai dòng KLTA3 khử Mẫu chỗi keo lai dòng KLTA3 khử trùng bằng HgCl; 0.1% trong 8 phút trùng bằng HgCl; 0.1% trong 5 phút Mẫu chỗi keo lai dòng KL2 khử trùng Mẫu chỗi keo lai dòng KL2 khử trùng bằng HgCl; 0.5% trong 8 phút bằng HgCl; 0.5% trong 5 phút MU lì

Miu chéi keo lai dòng KL20 khử trùng _ Mẫu chỗi keo lai dòng KL20 khử trùng

bằng HgCI; 0.5% trong 5 phút bằng HgCI; 0.1% trong 8 phút

Trang 38

Phụ lục 2.2 Một số hình ảnh kết quả thử nghiệm môi trường cơ bản

Dòng keo lai KL2 được Dòng keo lai KL2 được Dòng keo lai KLTA3 được

Trang 39

Mẫu keo lai dòng KL20 nuôi cấy ở Mẫu keo lai dòng KLTA3 nuôi cấy ở môi

môi trường WPM: trường WPM

Cây chuyển mẫu nhân chổi dòng keo lai KLTA3 ởmôi trường MB

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	6,73 MB