Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cây mai mù u mammea siamensis var odoratissimus

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 31-5-2013) KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ CÂY MAI MÙ U (MAMMEA SIAMENSIS VAR ODORATISSIMUS) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGÔ TRANG NHƯ NGỌC CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: Khảo sát thành phần hóa học của vỏ mai mù u (Mammea siamensis var Odoratissimus) Chủ nhiệm đề tài: Ngô Trang Như Ngọc Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 24 tháng Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng Kinh phí đã cấp: theo TB số: TB-SKHCN ngày Mục tiêu: Cô lập và nhận danh các hợp chất có vỏ mai mù u (Mammea siamensis var Odoratissimus), tập trung vào các hợ p chất có hoạt tính kháng ung thư và xây dựng sở khoa học cho việc khảo sát dược tính của loài này Nội dung: - Điều chế cao - Sàng lọc cao thô - Sắc ký cột cao thô thu được các phân đoạn khác - Khảo sát các phân đoạn bằng sắc ký cột, cô lập chất ở dạng tinh khiết - Xác định cấu trúc các hợp chất thu được - Thử độc tính tế bào đối với một số dòng tế bào ung thư người các hợp chất cô lập Sản phẩm của đề tài - hợp chất tinh khiết - Có kết quả thử độc tính tế bào một số dòng tế bào ung thư người - Một báo cáo tại hội nghị Khoa học - Một bài báo đăng tạp chí khoa học chuyên ngành CHƯƠNG I: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lời nói đầu Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có thảm thực vật phong phú với nhiều loại thực vật quý hiếm, nhiều loài thảo dược dân gian sử dụng làm thuốc chữa bệnh Họ Bứa (Măng cụt, Guttiferae hay Clusiaceae) họ thực vật lớn nước ta, có nhiều ứng dụng y học cổ truyền để trị dị ứng, lở loét, sốt rét, tiêu chảy, sán lãi, bỏng sưng tấy Các hợp chất phân lập từ họ Bứa có hoạt tính sinh học đa dạng kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa kháng HIV [1, 2] Chi Mammea thuộc họ Bứa có hai lồi Việt Nam trau tráu (Mammea siamenis T Anders) mai mù u (Mammea siamensis var Odoratissimus Pierre) Các nghiên cứu giới nước cho thấy dẫn xuất coumarin therapin B, therapin C, surangin C lập từ trau tráu có hoạt tính kháng nhiều dòng tế bào ung thư ung thư vú (MCF-7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H460) ung thư biểu mô miệng (KB) [3] Tuy vậy, chưa có báo cáo thành phần hóa học hoạt tinh sinh học mai mù u Vì đề tài này, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học vỏ mai mù u (Mammea siamensis var odoratissimus Pierre) thử hoạt tính sinh học hợp chất cô lập từ nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm hoạt chất kháng ung thư từ nguồn thực vật nước ta 1.2 Tổng quan 1.2.1 Chi Mammea 1.2.1.1 Đặc điểm thực vật Họ Bứa hay Măng cụt, tên khoa học Guttiferae hay Clusiaceae, có khoảng 50 chi với 1000 loài [4] Trước nhà thực vật học xếp Mammea Ochrocarpus (hay Ochrocarpos) thành hai chi riêng biệt thuộc họ Bứa Nhưng đến năm 1956, De Wilde xếp tất loài chi Ochrocarpus vào chi Mammea [5] Năm 1961 Kostermans đăng tổng quan chi Mammea đồng ý với De Wilde, xếp hai chi vào chi Mammea [6] Tuy nhiên năm 1964, Mechior Werdermann xếp Mammea Ochrocarpus làm hai chi riêng biệt [7] Chi Mammea có khoảng 50 lồi, mọc chủ yếu vùng nhiệt đới, khu vực Đông Nam Á Châu Phi Ở nước ta chi có hai phụ lồi Mammea siamensis var siamensis T Anders (trau tráu) Mammea siamensis var odoratissimus Pierre (bạch mai hay mai mù u) [8] Hầu hết loài chi Mammea thân gỗ, mọc đối, có nhiều điểm khác biệt kích thước hình dạng Hoa có hai đài có bốn, sáu tám cánh hoa [9, 10] Chi Mammea có nhiều ứng dụng y học cổ truyền Ở Thái Lan, hoa trau tráu (M siamensis) dùng làm thuốc bổ tim [11] Ở số nước Châu Phi, M africana dùng trị bệnh da, cao huyết áp [12] Ở Ấn Độ, M longifolia dùng thực phẩm làm thuốc trị bệnh [13] Chi Mammea đa dạng thành phần hóa học Các nghiên cứu giới cho thấy chi chứa nhiều coumarin xanthon; bên cạnh cịn có số terpenoid, flavonoid, biflavanoid steroid Dưới nghiên cứu số loài chi Mammea Các kết cho thấy nhiều hợp chất chi có hoạt tính sinh học đáng quan tâm 1.2.1.2 Mammea americana Khoảng 120 dẫn xuất mammea coumarin cô lập từ M americana Các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học đáng ý kháng côn trùng, kháng nấm, kháng ung thư, kháng HIV kháng khuẩn [1] Năm 2005, nhóm nghiên cứu Kennelly Mỹ cô lập 15 dẫn xuất mammea coumarin từ hạt M americana mammea B/BA hydroxycyclo F (1), mammea E/BC (2), mammea E/BD (3), mammea A/AA (4), mammea A/AA vòng D (5), mammea A/AA vòng F (6), mammea A/AC vòng D (7), mammea A/AD vòng D (8), mammea B/BA (9), mammea B/BA vòng F (10), mammea B/BB (11), mammea B/BC (12), mammea B/BD (13), mammea E/BA (14), mammea E/BB (15) Các chất có khả gây độc dòng tế bào ung thư ruột kết SW-480, HT-29 HCT-116 Trong 1-3 9-15 có khả kháng trùng trừ sâu bệnh [1] HO H O H R O OH O HO O O HO O O O O R (2) R: (14) R: (3) R: (15) R: (1) R: OH (10) R: H O O OH OH O OH O O O OH (6) (4) O OH O OH R HO O O O O O O (5) R: (7) R: R (9) R: (12) R: (11) R: (13) R: (8) R: Bên cạnh đó, nhóm cịn lập hai flavanol (+)-catechin (16) (-)epicatechin (17) [14] OH OH OH HO OH O HO O OH OH OH (16) OH (17) 1.2.1.3 Mammea siamensis (Trau tráu) Các nghiên cứu trước cho thấy hợp chất cô lập từ trau tráu (M siamensis) phần lớn dẫn xuất coumarin xanthon Ở Thái Lan, người ta dùng trau tráu làm thuốc, có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học [15] Năm 2002, nhóm nghiên cứu Ruchirawat cô lập số mammea coumarin từ hoa trau tráu mammea E/BA vòng D (18), mammea E/BC vòng D (19), mammea E/BD vòng D (20), mammea E/AC vòng D (21) [15] OAc O OAc OH O HO O O O O R O (18) R: (21) O (19) R: O (20) R: O Sau đến năm 2005, Subhadhirasakul cộng thực nghiên cứu hoa trau tráu xác định hỗn hợp gồm β-sitosterol (22), stigmasterol (23) friedelin (24) Trong đó, β-sitosterol có hoạt tính kháng khuẩn [2] (22) HO (23) HO O (24) Năm 2007, nhóm nghiên cứu Laphookhieo khảo sát hạt trau tráu cô lập hai xanthon 1,7-dihydroxyxanthon (25) 1-hydroxy-5-metoxyxanthon (26) bốn dẫn xuất coumarin mammea E/BB vòng D (27), mammea E/BA vòng D (28), surangin C (29) therapin B (30) Các khảo sát hoạt tính cho thấy surangin C therapin B có khả gây độc số dòng tế bào ung thư ung thư ruột kết (HT-29), ung thư biểu mô miệng (KB), ung thư vú (MCF-7) ung thư cổ tử cung (HeLa) [3] O R O OH HO OH O R O HO O R1 O HO O R1 O O O O R2 (25) R1: H R2: OH (26) R1: OMe R2: H (27) R1: CH3 R 2: H (28) R1: H R2:CH3 (29) R: (30) R: Năm 2010, nhóm nghiên cứu chúng tơi khảo sát vỏ trau tráu thu hái lâm trường Mã Đà, tỉnh Đồng Nai cô lập hợp chất surangin D (31) 11 hợp chất biết có surangin C (29), therapin B (30) therapin C (32) Qua thử hoạt tính sinh học cho thấy dẫn xuất coumarin có khả gây độc lên dòng tế bào ung thu ruột kết DLD-1 [16] OH OH HO O OH OH HO O O O O O (32) (31) 1.2.1.4 Mammea longifolia Cây M longifolia tìm thấy nhiều vùng tây nam Ấn Độ, sử dụng làm gia vị thực phẩm, nụ hoa dùng làm thuốc trị chứng khó tiêu hóa bệnh trĩ [13] Năm 1969, Joshi cộng cô lập hai dẫn xuất coumarin surangin A (33) surangin B (34) [17] Năm 2002 nhóm nghiên cứu Yoshida thuộc Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia Nhật Bản tìm thấy số flavonoid từ chồi M longifolia kaempferol (35) quercetin (36) [13] R2 OH O HO OR1 OH O (35) R1 = R2 : H (36) R1: H R2: OH 1.2.1.5 Mammea africana Cây M africana có nhiều Châu Phi, đặc biệt Cameroon, sử dụng phương thuốc cổ truyền để trị cao huyết áp, thấp khớp, đau dày, bệnh ho, ghẻ số bệnh da Một số dẫn xuất coumarin 4-n-propylcoumarin (37), 4phenylcoumarin (38) nhóm nghiên cứu Dongmo lập từ vỏ có hoạt tính kháng virus HIV, gây độc tế bào kháng vi trùng [18, 12] Ngoài ra, coumarin mammea coumaria A/AA (4), mammea coumarin B/BA (9) mammea coumarin B/BB (11) tìm thấy vỏ [18] O O O (37) (38) O 1.3 Cây mai mù u (Mammea siamensis var Odoratissimus Pierre) 1.3.1 Đặc điểm thực vật Mai mù u có tên khoa học Mammea siamensis var odoratissimus Pierre, gọi mai mù u Cây thuộc loại đại mộc, nạc vỏ đỏ, nhánh non vng; to có đầu trịn, thường lõm; hoa có từ 6-8 cánh trắng, trịn, dày, cọng dài 2.5 cm, có mùi thơm Quả hình xoan, hạt cứng, cọng dài, đầu nhọn nhọn [8] Ở miền Nam nước ta ba mai mù u cổ thụ ở: • 161/85/20 Lạc Long Qn, Quận 11, thành phố Hồ Chí Minh • 26 Hùng Vương, Quận 11, thành phố Hồ Chí Minh • Đình Phú Tự, Bến Tre Hình Hình mai mù u (Mammea siamensis var odoratissimus Pierre) Đặc điểm thực vật trau tráu mai mù u tương đồng nhiên để phân biệt chúng cần dựa vào hình dạng kích thước hoa Cây trau tráu có nhọn hai đầu; hoa màu trắng vàng, cuống hoa ngắn cm Cây mai mù u: có đầu trịn, thường hay lõm; hoa tròn, dày, cọng dài 2.5 cm 1.3.2 Thành phần hóa học Trên giới chưa có cơng trình nghiên cứu hóa thực vật mai mù u CHƯƠNG II: NỢI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ lập và xác định cấu trúc 2.1.1 Thiết bị và hóa chất SKC thực silica gel (40-63 µm, Merck) hay RP-18 (40-63 µm, Merck) SKC lọc thực Sephadex LH-20 (GE Healthcare) SKBM thực bảng silica gel (Merck) hay RP-18 (Merck) Các cấu tử mỏng phát đèn tử ngoại hay cách cho vào bình đựng iod Phổ tử ngoại ghi quang phổ kế tử ngoại Agilent 8453, pha MeOH EtOH Khối phổ phân giải cao ghi máy Bruker QTOF QII Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi máy Bruker AM 500 [500 MHz (1H) 125 MHz (13C)] hay Varian [300 MHz (1H) 75 MHz (13C)] với TMS chất chuẩn nội (δ= 0.00 ppm) dung môi CDCl3 hay aceton-d6 Tất dung môi chưng cất lại trước sử dụng 2.1.2 Thu hái mẫu xử lý mẫu Vỏ mai mù u (Mammea siamensis var odoratissimus Pierre) thu hái Chùa Giác Viên, 161/85/20 Lạc Long Quân, Phường 13, Quận 3, Tp Hồ Chí Minh Cây ThS Đặng Văn Sơn thuộc Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM định danh lưu giữ phịng thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên Hóa dược, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh Vỏ phơi khô tự nhiên khối lượng không đổi xay nhỏ thu 2.5 kg mẫu 2.1.3 Điều chế cao phân đoạn Trích kiệt mẫu Soxhlet với hexan, thu hồi dung môi thu cao hexan (86.0 g), kí hiệu BM Lấy cao đem sắc kí cột silica gel với hệ dung mơi hexan–EtOAc có độ phân cực tăng dần, dựa kết SKBM gộp lại thành 10 phân đoạn (BM – 10) Bảng Kết SKC cao hexan vỏ mai mù u silica gel (hexan-EtOAc) Phân đoạn Tên Khối lượng (g) BM1 3.00 BM2 4.01 BM3 4.43 BM4 6.51 BM5 3.39 BM6 10.62 BM7 15.73 BM8 12.71 BM9 10.63 10 BM10 10.80 2.1.4 Phân lập chất Khảo sát phân đoạn (BM2) SKC phân đoạn (BM2, 4.01 g) RP-18 với hệ dung môi H2O-aceton thu 11 phân đoạn (BM2.1-11) Tinh chế phân đoạn BM2.4 (45.0 mg) Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH-CHCl3 (1:1) thu BM243 (44) (17,1 mg) Khảo sát phân đoạn (BM5) SKC phân đoạn BM5 (3.39 g) silica gel nhiều lần với hệ dung môi hexan-EtOAc thu phân đoạn BM53 (524.3 mg) Tiếp tục thực SKC phân đoạn silica gel, dung môi hexan-CHCl3, sau tinh chế lại Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH:CHCl3 (1:1) thu hợp chất BM5324 (46) (20.3 mg) Khảo sát phân đoạn (BM6) SKC phân đoạn BM6 (2.99 g) silica gel với hệ dung môi hexan-aceton thu 11 phân đoạn (BM6.1-11) Phân đoạn BM6.2 (320.0 mg) SKC RP-18 hệ dung môi H2O-aceton thu phân đoạn (BM6.2.1-9) Tiếp tục SKC phân đoạn BM6.2.9 (17.5 mg) silica gel với hệ dung môi hexan-CHCl3 thu BM6292 (45) (5.0 mg) Khảo sát phân đoạn (BM7) Thực SKC phân đoạn (BM7, 7.54 g) silica gel với hệ dung môi hexanEtOAc (0 – 20%) thu 20 phân đoạn, dựa kết SKBM gộp lại thành 10 phân đoạn (BM71-710) SKC phân đoạn BM78 (2.96 g) RP-18 với hệ dung môi H2O-MeOH (60 – 100%) thu 20 phân đoạn gộp lại thành phân đoạn (BM781 – 785) Tiếp tục SKC phân đoạn BM782 (0.20 g) silica gel với hệ dung môi CHCl3-EtOAc (0 – 2%) thu BM7821 (30, 35.0 mg) BM7822 (32, 15.0 mg) Thực SKC phân đoạn BM784 (1,27 g) silica gel với hệ dung môi CHCl3–EtOAc (0 – 2%) thu BM7841 (29, 16.3 mg) BM7842 (33, 14.0 mg) 2.2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư ruột kết DLD-1 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Thiết bị - Máy đếm tế bào Coulter Counter Z2 (Beckman Coulter, USA) - Máy lắc - Tủ cấy vô trùng - Tủ ủ 37°C, 5% CO2 - Nồi hấp vô trùng - Flow cytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Denmark) Dụng cụ - Đĩa 96 giếng (Nunc, Cat No 167008; Lot: 104512) - Bình Roux (25 cm2) (Nunc) - Micropipette 0.3-3ul; 1-10ul; 10-100ul; 100-1000ul; - Micropipette 8-kênh - Pipette (2, 10, 20ml) metylen ở δH 1.98 nhóm metyl vinyl δH 1.60 tương quan với tương quan với nối đơi tam hốn [δC 135.1 (s) 124.4 (d)], ngồi proton metylen cho tương quan với C-7′ và một carbon của nhóm metylen khác (δC 26.9) Từ các dữ liệu phổ này ta th iết lập được nối giữa C -7′/C-6′ (δH 2.05; δC 26.9), C-6′/C-5′ (δH 1.98; δC 39.86), C-5′/C-4′ (δC 135.1), C-4′/C-3′ (δH 5.14; δC 124.4 và nhóm metyl gắn vào C-4′ Proton của nhóm metylen xuất hiện ở δH 2.05 tương quan với C -3′, C-4′ carbon của nhóm metylen ở δC 39.92 Như vậy C-3′ nối với C-2′ (δH 2.05; δC 26.8), C2′/C-1′ (δH 1.65 1.54; δC 39.92) Vậy BM5324 có chứa dây nhánh 4′,8′,12′-trimetyl3′,7′,11′-tridecatrienyl phân tử Do C-14′ (δC 16.0) C -15′ (δC 15.9) đều xuất hiện ở vùng từ trường cao nên nối đôi giữa C -3′/C-4′ C -7′/C-8′ có cấu hình E Tương quan HMBC dây nhánh được mô tả ở Hình 11 14' 2' 1' 16' 15' 6' 3' 5' 10' 7' H H 9' 11' 13' H Hình Tương quan HMBC dây nhánh 4′, 8′, 12′-trimetyl-3′,7′,11′tridecatrienyl Trong phổ HMBC , proton nhóm metyl [δH 1.26 (H3-9)] diện dạng mũi đơn cho tương quan với C -1′, carbon sp3 mang oxygen [δC 75.5 (s)] nhóm metylen (δC 31.6) nên nhóm metyl C -1′ gắn vào c arbon mang oxygen (C-2) thiết lập nối C-2/C-3 [δH 1.80 1.73, δC 31.6] Nhóm metylen benzyl (δH 2.70) tương quan với C -2 C-3, vậy nhóm này là C -4 nối với C -3 Tương quan của H 2-3 với carbon hương phương trí hoán [δC 121.3 (s, C-4a)] giúp xác định v ị trí nhóm metylen benzyl nới với nhân benzen Trong phở HMBC, H2-4 cịn tương quan với hai carbon hương phương (δC 112.8 146.1) có carbon mang oxygen (δC 146.1) Vậy hai carbon C-5 C-8a thiết lập nối C-8a/O/C-2 tạo vòng pyrano Dựa vào kiểu mẫu ghép cặp của H -5 [δH 6.38 (1H, d, J = 3.0 Hz)] và bằng phổ HSQC xác định được H -7 (δH 6.84) C-7 (δC 115.7) Proton của nhóm metyl còn lại (δH 2.13) cho tương quan với C-7, C-8a c arbon hương phương trí hoán (δC 127.4), vậy carbon này là C -8 mang nhóm metyl Carbon hương phương trí hoán mang oxygen còn lại là C -6 (δC 147.8) mang nhóm –OH tự Cấu trúc của hệ thống vòng chroman đã được xác định Các tương quan HMBC của vòng được biểu diễn ở Hình 12 32 H HO 4a H 8a O 1' 10 Hình 10 Tương quan HMBC vòng chroman-6-ol Vậy BM 5324 2,8-dimetyl-2-(4′,8′,12′-trimetyl-3′,7′,11′-tridecatrienyl)chroman6-ol hay δ-tocotrienol (41), thành phần vitamin E [24] Sớ liệu phổ 1H, 13C NMR và tương quan HMBC của δ-tocotrienol (41, BM5324) được trình bày Bảng 33 Bảng Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR tương quan HMBC δ-tocotrienol (41, BM5324) CDCl3 (trị số ngoặc J tính Hz) Vị trí Tương quan δH δC J J 75.5 1.80 q (7.0) C-2, C-4 C-4a 31.6 1.73 q (7.0) C-2, C-4 C-1′, C-4a 2.69 td (6.0 2.5) C-3, C-4a C-2, C-5, C-8a 22.7 4a 121.4 6.38 d (2.5) C-6 C-7, C-8a 112.8 147.9 6.48 dd (2.5 0.5) C-5, C-8a 115.8 127.5 8a 146.2 1.26 s C-2 24.2 C-1′, C-3 10 2.13 s C-8 C-7, C-8a 16.1 1.65 m C-2 C-3 39.92 1′ 1.54 m C-2 C-3 2.05 m 26.8 2′ C-1′, C-3′ C-4′ 3′(a) 5.14 m C-1′, C-14′ 124.4 135.1 4′ 5′ 1.98 m C-4′, C-6′ C-3′, C-7′,C-14′ 39.86 6′ 2.05 m C-5′, C-7′ C-4′,C-8′ 26.9 7′ 5.11 m C-5′, C-9′, C-15′ 124.5 135.3 8′ 9′ 1.98 m C-8′, C-10′ C-7′, C-15′, C-11′ 39.84 10′ 2.10 m C-9′, C-11′ C-8′ 22.3 11′ 5.11 m C-9′ 124.6 131.4 12′ 13′ 1.68 d (1.0) C-12′ C-11′, C-16′ 25.8 14′ 1.60 s C-4′ C-3′, C-5′ 16.1 15′ 1.60 s C-8′ C-7′, C-9′ 16.0 16′ 6-OH 1.59 s C-12′ C-11′, C-13′ 17.8 4.38 brs 34 3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư ruột kết DLD-1 Bốn coumarin surangin C (29), surangin D (31), therapin B (30) therapin C (32) chiếm khối lượng lớn cao hexan từ phân đoạn phân đoạn Bên cạnh đó, năm 2010, nhóm chúng tơi lập dẫn xuất coumarin từ trau tráu, loài chi với mai mù u khảo sát hoạt tính gây độc hợp chất lên tế bào ung thu DLD-1 phương pháp sulforhodamine B Kết cho thấy hợp chất thể hoạt tính gây độc mạnh với thứ tự therapin C > surangin D > surangin C > therapin B (Bảng 10) [16] Bảng 10 Kết quả IC50 của 29, 30, 31 32 bốn dòng tế bào DLD-1 IC50 (μM) Hợp chất DLD-1 Surangin D (31) 4.7 ± 0.3 Surangin C (29) 5.3 ± 0.2 Therapin C (32) 1.6 ± 0.1 Therapin B (30) 6.5 ± 0.5 3.2.1 Khảo sát khả kháng phân bào coumarin 29-32 dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 phương pháp Flow Cytometry Cảm ứng tế bào DLD-1 với bốn dẫn xuất coumarin nồng độ IC50 chất thu mẫu thời gian 48 Mẫu đối chứng thực tương tự, nghĩa tế bào ni mơi trường bình thường thu mẫu thời điểm với mẫu thử nghiệm Sau thu mẫu, huyền phù tế bào cố định etanol 70% ủ qua đêm -20°C Sau ủ, thu cặn tế bào nhuộm với dung dịch propidium iodide 30 phút phân tích hàm lượng DNA máy FACSCalibur, BD Biosciences Kết trình bày Hình 11, 12 Bảng 11 35 Apoptosis DipG1 DipG2 DipS Apoptosis DipG1 DipG2 DipS Fileanalyzed:0uM-2.006 Dateanalyzed:28-Jan-2009 Model:1nn0A_DSD Analysistype:Manualanalysis (A) Diploid:100.00% DipG1:48.56%at30.36 DipG2:13.94%at55.26 DipS:37.50%G2/G1:1.82 %CV:2.66 Diploid:100.00% DipG1:61.95%at28.44 DipG2:15.60%at52.04 DipS:22.45%G2/G1:1.83 %CV:3.65 TotalS-Phase:37.50% TotalB.A.D.:0.00%nodebrisnoaggs TotalS-Phase:22.45% TotalB.A.D.:0.00%nodebrisnoaggs 20 40 60 80 100 Channels(FL2-H) Apoptosis DipG1 DipG2 DipS Debris:% Aggregates:0.00% Modeledevents:8629 Alcycleevents:8338 Cycleeventsperchannel:322 RCS:6.342 20 40 60 Debris:% Aggregates:0.00% Modeledevents:8059 Alcycleevents:4189 Cycleeventsperchannel:170 RCS:8.698 80 Channels(FL2-H) Apoptosis DipG1 DipG2 DipS Fileanalyzed:SD-1.013 Dateanalyzed:28-Jan-2009 Model:1nn0A_DSD Analysistype:Manualanalysis Fileanalyzed:TB-2.009 Dateanalyzed:28-Jan-2009 Model:1nn0A_DSD Analysistype:Manualanalysis Diploid:100.00% DipG1:66.54%at30.21 DipG2:14.94%at55.29 DipS:18.52%G2/G1:1.83 %CV:3.52 Diploid:100.00% DipG1:59.69%at30.23 DipG2:15.62%at54.41 DipS:24.69%G2/G1:1.80 %CV:3.05 TotalS-Phase:18.52% TotalB.A.D.:0.00%nodebrisnoaggs TotalS-Phase:24.69% TotalB.A.D.:0.00%nodebrisnoaggs (C) (B) Apoptosis:48.02%Mean:1.26 Apoptosis:3.37%Mean:1.85 Fileanalyzed:SC-2.015 Dateanalyzed:28-Jan-2009 Model:1nn0A_DSD Analysistype:Manualanalysis (D) Apoptosis:10.15%Mean:1.91 Apoptosis:3.74%Mean:1.80 20 40 60 80 100 Channels(FL2-H) 20 40 60 80 Channels(FL2-H) Debris:% Aggregates:0.00% Modeledevents:7956 Alcycleevents:7149 Cycleeventsperchannel:274 RCS:8.906 Hình 11 Biểu đồ histogram biểu diễn tần số giá trị FL2-H vùng tế bào thuộc giai đoạn sub-G1, G0/G1, S G2/M (A) Mẫu tế bào không xử lý sau 48 mơi trường bình thường (B), (C), (D) (E) Mẫu tế bào xử lý với surangin C, surangin D, therapin B therapin C nồng độ IC50 chất sau 48 Bảng 11 Tỉ lệ % tế bào giai đoạn khác chu trình phân bào Apoptosis DipG1 DipG2 DipS (E) Debris:% Aggregates:0.00% Modeledevents:8408 Alcycleevents:8094 Cycleeventsperchannel:321 RCS:7.770 Fileanalyzed:TC-1f.010 Dateanalyzed:28-Jan-2009 Model:1nn0A_DSD Analysistype:Manualanalysis Diploid:100.00% DipG1:62.95%at29.93 DipG2:9.02%at55.37 DipS:28.03%G2/G1:1.85 %CV:2.51 TotalS-Phase:28.03% TotalB.A.D.:0.00%nodebrisnoaggs Apoptosis:8.19%Mean:1.89 20 40 Channels(FL2-H) 60 80 Debris:% Aggregates:0.00% Modeledevents:8209 Alcycleevents:7537 Cycleeventsperchannel:285 RCS:7.905 0uM G0/G1 51.09 ± 3.58 S 35.74 ± 2.49 G2/M 13.17 ± 1.09 apoptosis 3.75 ± 0.53 SC 60.32 ± 2.30 24.21 ± 2.50 15.47 ± 0.19 59.81 ± 16.67 48hr SD 57.39 ± 1.00 26.10 ± 2.00 15.00 ± 0.87 6.25 ± 3.55 36 TB 64.87 ± 2.35 20.35 ± 2.62 14.73 ± 0.30 10.15 ± 0.30 TC 60.54 ± 3.41 27.95 ± 0.11 11.51 ± 3.51 7.95 ± 0.34 Hình 12 Biểu đồ thể tỉ lệ % tế bào giai đoạn khác chu trình phân bào sau 48 giờ cảm ứng Từ biểu đồ phân tích histogram số liệu cho thấy sau 48 cảm ứng với dẫn xuất coumarin, % tế bào giai đoạn G0/G1 tăng so với mẫu tế bào không xử lý (tăng khoảng từ 6-13%) Bên cạnh đó, mẫu cảm ứng với surangin C cho thấy % subG1 tăng rõ rệt so với mẫu tế bào không xử lý khoảng 59%, chứng tỏ quần thể tế bào vào trình apoptosis, DNA bị phân cắt, tạo mũi sub-diploid đặc trưng cho q trình Với kết trên, chúng tơi kết luận, sau 48 giờ, surangin C cảm ứng tế bào DLD-1 theo hướng trình khác với dẫn xuất coumarin lại, giống hướng apoptosis 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng therapin C surangin D lên tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 người Hai dẫn xuất coumarin 31 32 kiểm tra khả ức chế tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 người phương pháp Coulter Counter Sự tăng sinh phát triển tế bào DLD-1 sau cảm ứng với hoạt chất cô lập khảo sát 24 48 Tế bào cho vào giếng đĩa 24 giếng với mật độ 3.5x104 tế bào/giếng 24 trước cảm ứng Cảm ứng hoạt chất với nồng độ khác lên mẫu tế bào ủ sau 24 Thí nghiệm lặp lại lần Số liệu số lượng tế bào giếng trích từ phần mềm hỗ trợ Multisizer program AccuComp máy đếm tế bào hiệu Coulter R Partilke count & size analyser Z2 (Beckmann Coulter Inc.) Số liệu đường kính trung bình tế bào xác định phần mềm Fitter BJ Kết trình bày Bảng 12 13, Hình 13, 14 15 37 Số tế bào sống cảm ứng với surangin D () (tế bào ± STD) Số tế bào sống cảm ứng với therapin C () (tế bào ± STD) Bảng 12 Ảnh hưởng therapin C (32) surangin D (31) nồng độ khác lên tăng sinh tế bào DLD-1 sau 24 48 cảm ứng Thời gian cảm ứng 24 48 229916.3 ± (DMSO) 32208.7± 1587.8 74058.7 ± 3798.2 13348.6 32208.7± 1587.8 183719.3 ± 75280.5 ± 2678.7 1.25 µM 14397.5 32208.7± 1587.8 126492.8 ± 61382.3 ± 3979.1 2.5 µM 6834.3 3.75 µM 32208.7± 1587.8 45607.5 ± 5029.3 75159.0 ± 9374.6 32208.7± 1587.8 46849.5 ± 2022.6 57210.7 ± 4928.4 5.0 µM 32208.7± 1587.8 23818.5 ± 2092.4 49920 ± 7000.0 7.5 µM 42235.9 ± 78085.1 ± 213203.3 ± (DMSO) 4125.2 16027.8 26186.9 42235.9 ± 78719.6 ± 203766.8 ± 1.875 µM 4125.2 15340.9 27478.6 42235.9 ± 63613.1 ± 145548.0 ± 3.75 µM 4125.2 18455.3 25226.6 42235.9 ± 56880.0 ± 7611.3 88297.9 ± 8811.8 5.0 µM 4125.2 42235.9 ± 50609.3 ± 41088.4 ± 6193.6 7.5 µM 4125.2 10627.8 42235.9 ± 32924.3 ± 5624.7 29802.4 ± 3733.7 15.0 µM 4125.2 300000 300000 0uM 2.5uM 200000 3.75uM 150000 5uM 7.5uM 100000 0uM 1.875uM 250000 1.25uM Số tế bào sống Số tế bào sống 250000 50000 3.75uM 200000 5uM 7.5uM 150000 15uM 100000 50000 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian cảm ứng tế bào DLD-1 với theraphin C (giờ) 0 10 20 30 40 50 Thời gian cảm ứng tế bào DLD-1 với surangin D (giờ) 60 Hình 13 Đồ thị biểu thị đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian ảnh hưởng therapin C surangin D nồng độ khác 38 Đường kính trung bình tế bào (mẫu cảm ứng surangin D) (µm ± STD) Đường kính trung bình tế bào (mẫu cảm ứng therapin C) (µm ± STD) Bảng 13 Ảnh hưởng therapin C surangin D nồng độ khác lên kích thước tế bào DLD-1 sau 24 48 cảm ứng Thời gian cảm ứng 24 48 15.99 ± 0.04 15.67 ± 0.12 15.66 ± 0.02 (DMSO) 15.99 ± 0.04 15.60 ± 0.08 15.22 ± 0.07 1.25 µM 15.99 ± 0.04 15.31 ± 0.19 14.26 ± 0.25 2.5 µM 15.99 ± 0.04 14.94 ± 0.14 13.88 ± 0.20 3.75 µM 15.99 ± 0.04 14.78 ± 0.10 13.78 ± 0.14 5.0 µM 15.99 ± 0.04 14.63 ± 0.13 13.44 ± 0.20 7.5 µM 15.74 ± 0.05 15.67 ± 0.31 15.44 ± 0.15 (DMSO) 15.74 ± 0.05 15.59 ± 0.38 14.98 ± 0.23 1.875 µM 15.74 ± 0.05 15.44 ± 0.32 14.65 ± 0.27 3.75 µM 15.74 ± 0.05 15.31 ± 0.15 14.48 ± 0.15 5.0 µM 15.74 ± 0.05 14.84 ± 0.17 14.39 ± 0.12 7.5 µM 15.74 ± 0.05 14.61 ± 0.12 14.11 ± 0.05 15.0 µM 16 16 15.5 Đường kính tế bào (µm) Đường kính tế bào (µm) 16.5 15.5 15 14.5 15 14.5 14 0hr 24hr 13.5 0hr 14 24 hr 48hr 48 hr 13.5 13 Nồng độ theraphin C (µM) 8 10 12 14 16 Nồng độ surangin D (µM) Hình 14 Ảnh hưởng therapin C surangin D lên đường kính tế bào DLD-1 sau 24 48 39 Therapin C Surangin D DMSO DMSO 1.25 µM 1.875 µM 2.5 µM 3.75 µM 3.75 µM 5.0 µM 5.0 µM 7.5 µM 7.0 µM 15.0 µM Hình 15 Tế bào DLD-1 ảnh hưởng therapin C surangin D sau 48 40 Kết chứng minh hai hợp chất therapin C (32) surangin D (31) có khả ức chế tăng sinh tế bào mạnh Số tế bào sống giảm dần theo thời gian nồng độ cảm ứng thuốc Sau 24 giờ, số lượng tế bào sống mẫu tế bào chứng mẫu tế bào cảm ứng với hợp chất nồng độ thấp (therapin C: 1.25µM surangin D: 1.875µM) chưa thay đổi đáng kể Sau 48 giờ, tế bào bắt đầu thay đổi hình dạng, tính bám dính, lượng tế bào sống giảm xuống rõ rệt, đặt biệt nồng độ ≥ 3.75 µM therapin C ≥ 5.0 µM surangin D có tỉ lệ tế bào sống nhỏ 50% so với mẫu tế bào chứng Từ khẳng định lại khả ức chế therapin C lớn hẳn surangin D lớn resveratrol chất đối chứng với nồng độ khoảng 27.0 µM có tỉ lệ tế bào sống 50% [25] Những số liệu phù hợp với kết quan sát tính tốn từ hình thái tế bào Với nồng độ thấp (therapin C: 1.25µM surangin D: 1.875µM), đường kính tế bào thay đổi khơng đáng kể, nhiên tăng nồng độ lên có giảm rõ rệt đường kính Xét theo thời gian, hình dạng tế bào co nhỏ lại, đường kính giảm rõ rệt, tế bào dần tính bám dính, bong tróc khỏi đáy giếng chết Nếu so therapin C surangin D với chất chuẩn resveratrol có tác dụng ngược nhau, resveratrol có khả ảnh hưởng lên tăng sinh tế bào, lại làm kích thước tế bào tăng lên sau 48 cảm ứng [25, 26] Trong đó, Rapamycin, chất kháng sinh công nhận cách phổ biến khả ức chế tăng sinh phát triển tế bào tác dụng hợp chất DLD-1 có phần tương tự: ức chế làm giảm kích thước tế bào khả bám dính sau cảm ứng [27] Điều tạo hy vọng cho tiềm việc điều trị bệnh ung thư hai hợp chất 41 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Trong đề tài khảo sát thành phần hóa học vỏ mai mù u (Mammea siamensis var odoratissimus) thu hái Chùa Giác Viên, 161/85/20 Lạc Long Quân, Phường 13, Quận 3, Tp Hồ Chí Minh thử nghiệm khả gây độc tế bào ung thư coumarin tinh khiết thu Từ cao hexan vỏ mai mù u, thực SKC kết hợp với sắc ký mỏng silica gel pha thường, pha đảo RP-18 Sephadex LH-20, cô lập bảy hợp chất Dựa vào phân tích phổ NMR (1H 13C NMR, DEPT90, DEPT135, HSQC HMBC), HR-MS UV, xác định cấu trúc của h ợp chất gồm: Surangin C (29) Therapin B (30) Therapin C (31) Surangin D (32) ar-Turmeron (39) 3,11-Dioxoolean-12-en (40) δ-Tocotrienol (41) Trong đó, bốn dẫn xuất coumarin tìm thấy nhiều trau tráu, loài chi với mai mù u Ba hợp chất khác ar-turmeron, 3,11-dioxoolean-12en δ-tocotrienol lần cô lập chi Khảo sát khả kháng phân bào dẫn xuất coumarin 29-32 phương pháp Flow Cytometry Kết cho thấy: - Bốn chất làm tăng % tế bào giai đoạn G0/G1 - %SubG1 mẫu cảm ứng với surangin C tăng rõ rệt so với mẫu tế bào không xử lý khoảng 59% Đây dấu hiệu tế bào vào trình apoptosis Vậy surangin C ức chế tế bào DLD-1 theo hướng khác so với dẫn xuất lại, giống hướng apoptosis Khảo sát ảnh hưởng therapin C surangin D lên tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 người phương pháp Coulter Counter - Số lượng tế bào sống giảm rõ rệt tăng thời gian nồng độ cảm ứng thuốc - Hình thái tế bào thay đổi rõ Khi thời gian cảm ứng nồng độ thuốc cảm ứng tăng, hình dạng tế bào co nhỏ lại, đường kính giảm rõ rệt, tế bào dần tính bám dính, bong tróc khỏi đáy giếng chết Các công bố giới cho thấy: 42 - 1,3,5,10-Bisabolatetraen-9-on hay ar-turmeron (39) có khả chống đông tụ máu [28] kháng số loại nấm Phytophthora infestans Erysiphe graminis [21] - δ-Tocotrienol (41) thành phần quan trọng vitamin E, có khả kháng oxid hóa, ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào ung thư vú [29], gây apoptosis lên dòng tế bào ung thư gan Hep3B [30] ức chế lên enzyme telomerase người dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 [31] ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục khảo sát phân đoạn cịn lại - Thử hoạt tính sinh học lên hợp chất lại - Với hàm lượng coumarin chiếm nhiều mẫu cao kết tốt thử hoạt tính gây độc lên tế bào ung thư DLD-1, việc khảo sát chế gây độc hợp chất nên tiến hành - Ngoài ra, mai mù u có Việt Nam có dấu hiệu lão hóa tượng bị nứt, rỗng mục, nhiều cành lớn bị gãy đổ Tình trạng làm ảnh hưởng đến việc thu hái mẫu để khảo sát trì mẫu Do đó, hướng đề nghị nuôi cấy mô cây, vừa tiêu tốn lượng mẫu tươi, vừa dễ dàng khảo sát thành phần hóa thực vật mẫu 43 10 11 12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kennelly E J., Hui Yang, Bei Jiang, Reynertson K A., Basile M J., Comparative analyses of bioactive mammea coumarins from seven parts of Mammea americana by HPLC-PDA with LC-MS, J Agric Food Chem., 2006, 54: 41144120 Subhadhirasakul S., Pechpongs P., A terpenoid and two steroids from the flowers of Mammea siamensis, Songklanakarin J Sci Technol., 2005, 27: 555-561 Laphookhieo S., Promnart P., Syers J K., Kanjana-Opas A., Ponglimanont C., Karalai C., Coumarins and xanthones from the seeds of Mammea siamensis, J Braz Chem Soc., 2007, 18: 1077-1080 Gil Nelson, The shrubs and woody vines of Florida, Pineapple Press Inc., Florida, 1996, 140 De Wilde, Acta Bot Neerl., 1956, 5: 171 Kostermans A J G H., A monograph of the Asiatic and Pacific species of Mammea, Lambaga Pusat Penjelidikan Kehutanan, Bogor, Indonesia, 1961, 26 Melchior H., Werdermann E., A Engler’s Syllabus der Pflanzenfamilien 12th ed., Band 2, Gebruder Borntrager, Berlin, 1964, 170 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, NXB Trẻ, Tp HCM, 1999, 448 Micah Dunthorn, Foliar anatomy and fiber motifs in Mammea (Clusiaceae, Kielmeyeroideae), Plant Syst Evol, 2009, 280: 153-160 Micah Dunthorn, Cryptic dioecy in Mammea (Clusiaceae), Plant Syst Evol, 2004, 249: 191-196 Poobrasert O., Constant H L., Beecher C W W., Farnsworth N R., Kinghorn A D., Peezuto J M., Cordell G A., Santisuk T., Reutrakul V., Xanthones from the twigs of Mammea siamensis, Phytochemistry, 1998, 47: 1661-1663 Dongmo A B., Azebaze A G B., Nguelefack T B., Nguelefack-Mbuyo P E., Afkir S., Dimo T., Legssyer A., Kamanyi A., Ziyyat A., Anti-hypertensive effect of the methanol/methylene chloride stem bark extrac of Mammea africana in LNAME-induced hypertensive rats, J Ethnopharmaco., 2008, 117: 446-450 Jagan Mohan Rao L., Yada H., Ono H., Yoshida M., Acylated and non-acylated flavonol monoglycosides from the Indian minor spice nagkesar (Mammea longifolia), J Agric Food Chem., 2002, 50: 3143-3146 Kennelly E J., Hui Yang, Bei Jiang, Reynertson K A., Basile M J., Petr Protiva, Gil R R., Baggett S., Weinstein I B., Antioxidant and cytotoxic isoprenylated coumarins from Mammea americana, Planta Med., 2005, 71: 852-860 44 15 Ruchirawat S., Mahidol C., Kaweetripob W., Prawat H., Mammea coumarins from the flowers of Mammea siamensis, J Nat Prod., 2002, 65: 757-760 16 Ngo T.Nhu-Ngoc, Nguyen Thuy-Vy, Vo V Hoa, Ole Vang, Fritz Duus, Ho H Thuy-Duong, Pham D Hung, Nguyen D Lien-Hoa, Cytotoxic coumarins from the bark of Mammea siamensis, Chem Pharm Bull., 2010, 58(11): 1487-1491 17 Joshi B S., Kamat V N., Govindachari T R., Ganguly A K., Isolation and structure of surangin A surangin B, two new coumarins from Mammea longifolia (Wight) Planch and Triana, Tetrahedron, 1969, 25: 1453-1458 18 Dongmo A B., Azebaze A G B , Nguelefack T B , Ouahouo B M., Sontia B., Meyer M , Nkengfack A E., Kamanyi A., Vierling W., Vasodilator effect of the extracts and some coumarins from the stem bark of Mammea africana (Guttiferae), J Ethnopharmaco., 2007, 111: 329-334 19 Win N N., Awale S., Esumi H., Tezuka Y., Kadota S., Novel anticancer agents, kayeassamins A and B from the flower of Kayea asamica of Myanmar, Bioorg Med Chem., 2008, 18: 4688-4691 20 Lee K.-H., Chai H.-B., Tamez P A., Pezzuto J M., Cordell G A., Win K K Tin-Wa M., Biologically active alkylated coumarins from Kayea assamica, Phytochemistry, 2003, 64: 535-541 21 Lee H E, Choi K J., Cho K Y., Ahn Y J., Fungicidal activity of ar-turmerone identified in Curcuma longa rhizome against six phytopathogenic fungi, Agric Chem Biotechnol., 2003, 46: 25-28 22 Fujiwara M., Yagi N., Miyazawa M., Acetylcholinesterase inhibitory activity of volatile oil from Peltophorum dasyrachis Kurz ex Bakar (yellow batai) and bisabolane-type sesquiterpenoids, J Agric Food Chem., 2010, 58: 2824-2829 23 Ferreira E.de O., Dias D.A., Phytochemical investigation of Gomphrena claussenii Moq., Biochem Syst Ecol., 2004, 32: 823-827 24 Goh S H., Hew N F., Ong A S H., Choo Y M., Brumby S., Tocotrienols from palm oil: electron spin resonance spectra of tocotrienoxyl radicals, J Am Oil Chem Soc., 1990, 67: 250-254 25 Kristoffersen P K., Resveratrol induced morphological changes in DLD-1 cells investigated by atomic force microscopy, Master thesis, Department of Science, Systems and Models, Roskilde, 2006 26 Aziz M H., Kumar R., Ahmad N., Cancer chemoprevention by resveratrol: in vitro and in vivo studies and the underlying mechanisms (Review), Int J Oncol., 2003, 23: 17-28 45 27 Oshiro N., Yoshino K., Hidayat S., Tokunaga C., Hara K., Equchi S., Avruch J., Yonezawa K., Dissociation of raptor from mTOR is a mechanism of rapamycininduced inhibition of mTOR function, Genes Cells, 2004, 9(4): 359-366 28 Lee H S., Antiplatelet property of Curcuma longa L rhizome-derived arturmerone, Bioresource Technol., 2006, 97: 1372-1376 29 Nesaretnam K., Guthrie N., Chambers A F., Carroll K K., Effect of tocotrienols on the growth of a human breasts cancer cell line in culture, Lipids., 1995, 30: 1139-1143 30 Wada S., Satomi Y., Murakoshi M., Noguchi N., Yoshikawa T., Nishino H., Tumor suppressive effects of tocotrienol in vivo and in vitro, Cancer Letters, 2005, 229: 181-191 31 Eitsuka T., Nakagawa K., Miyazawa T., Down-regulation of telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells by tocotrienol, Biochem Biophys Res Commum., 2006, 348: 170-175 46