Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và hỗ trợ điều trị đái tháo đường của rau trai

BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CƠ SỞ 2019 KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA RAU TRAI Chủ nhiệm đề tài ThS Hà Quang Thanh Đơn vị Trung tâm Sâm & Dược liệu Tp HCM Thời gian thực 12/2018 đến tháng 11/2019 Tp.Hồ Chí Minh – 11/2019 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CƠ SỞ 2019 KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA RAU TRAI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TRƯỞNG ĐƠN VỊ VIỆN DƯỢC LIỆU i MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT .ix SUMARY x PHẦN A : CÁC THÔNG TIN CHUNG xii Phần B: NỘI DUNG BÁO CÁO TỔNG KẾT xviii ĐẶT VẤN ĐỀ xviii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RAU TRAI 1.1.1 Phân loại khoa học tên gọi thông thường 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố sinh thái 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Tóm tắt nghiên cứu khoa học thành phần hóa học tác dụng dược lý Rau trai 1.2 Tổng quan tổn thương gan rượu 1.2.1 Cấu tạo gan 1.2.2 Cơ chế bệnh sinh 1.2.2.1 Cơ chế chuyển hóa ethanol .5 1.2.2.2 Cơ chế gây tổn thương gan rượu .7 1.2.3 Mơ hình tổn thương gan rượu 1.2.3.1 Một số mơ hình tổn thương gan giới 1.2.3.2 Silymarin 1.3 Tổng quan bệnh đái tháo đường 10 ii 1.3.1 Định nghĩa đái tháo đường .10 1.3.2 Phân loại chế sinh bệnh .11 1.3.3 Biến chứng 13 1.3.4 Điều trị bệnh đái tháo đường .14 1.3.5 Mơ hình bệnh ĐTĐ động vật thực nghiệm gây streptozotocin .16 1.3.5.1 Giới thiệu streptozotocin 17 1.3.5.2 Cơ chế gây bệnh streptozotocin .18 Mơ hình ĐTĐ 19 Mơ hình ĐTĐ 19 1.3.5.3 Giới thiệu nhóm sulfonylurea 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Vật liệu .22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Động vật nghiên cứu 22 2.1.3 Hóa chất dụng cụ, thiết bị .22 2.2 Phương pháp .23 2.2.1 Chiết xuất cao Rau trai 23 2.2.1.1 Chiết xuất cao nước 23 2.2.1.2 Chiết xuất cao ethanol 24 2.2.1.3 Xác định khối lượng làm khô 24 2.2.2 Khảo sát độc tính cấp đường uống 25 2.2.3 Mơ hình chuột bị gây tổn thương gan mạn ethanol 26 2.2.3.1 Thiết kế thí nghiệm .26 2.2.3.2 Phương pháp xác định hoạt độ GOT, GPT huyết tương chuột 26 2.2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA) glutathione (GSH) gan chuột 27 iii 2.2.4 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai thực nghiệm gây tăng đường huyết chuột nhắt trắng 29 2.2.4.1 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai trên thực nghiệm dung nạp glucose 29 2.2.4.2 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai trên mơ hình gây tăng đường huyết streptozotocin 30 2.2.4.3 Định lượng đường huyết tương theo Kit GOD-PAP Human Diagnostic Ltd.Co (Germany) 31 2.2.5 Đánh giá kết 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 Kết 33 3.1.1 Kết chiết cao Rau trai 33 3.1.1.1 Hiệu suất chiết 33 3.1.1.2 Kết khối lượng làm khô 33 3.1.2 Kết độc tinh cấp đường uống 34 3.1.3 Tác dụng bảo vệ gan mơ hình chuột gây tổn thương gan mạn ethanol 37 3.1.3.1 Trọng lượng thể .37 3.1.3.2 Hoạt độ GOT, GPT huyết tương chuột .38 3.1.3.3 Hàm lượng MDA GSH gan chuột 40 3.1.4 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai thực nghiệm gây tăng đường huyết chuột nhắt trắng 41 3.1.4.1 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai thực nghiệm dung nạp glucose chuột có đường huyết bình thường (normoglycemia) 41 3.1.4.2 Khảo sát tác dụng cao chiết từ Rau trai mơ hình gây tăng đường huyết streptozotocin 42 3.2 Biện luận .46 iv 3.2.1 Tác dụng bảo vệ gan mơ hình chuột gây tổn thương gan mạn ethanol 46 3.2.2 Tác dụng điều hòa đường huyết thực nghiệm gây tăng đường huyết 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 4.1 Kết luận .51 4.2 Kiến nghị 52 Tài liệu tham khảo 53 PHỤ LỤC i v DANH MỤC HÌNH Hình 1 Hoa, thân Rau trai Hình 1.2 Cấu trúc bên ngồi tế bào gan .4 Hình 1.3 Chuyển hóa rượu theo đường alcohodehydrogenase (ADH) Hình 1.4 Chuyển hóa rượu đường enzyme cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) .6 Hình 1.5 Chuyển hóa rượu theo đường catalase Hình 1.6 Giai đoạn trình chuyển hóa rượu Hình 1.7 Giai đoạn q trình chuyển hóa rượu Hình 1.8 Cơng thức hóa học silymarin Hình 1.9 Các biểu lâm sàng bệnh đái tháo đường 13 Hình 1.10 Cấu trúc STZ 18 Hình 1.11 Cơ chế tác động STZ 19 Hình 1.12 Thời gian bán thải thời gian tác động sulfonylure 21 Hình 1.13 Cơ chế tác dụng glibenclamid 21 Hình 2.1 Phản ứng MDA thuốc thử TBA 29 Hình 2.2 Phương trình loại bỏ gốc tự glutathione 29 Hình 2.3 Phương trình phản ứng glutathione với thuốc thử .30 Hình 2.4 Phương trình phản ứng glucose với thuốc thử 33 Hình 3.1 Phổi gan chuột bị tổn thương 37 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các isoenzyme ADH người Bảng 1.2 Một số nghiên cứu tổn thương gan rượu thực nghiệm Bảng 2.1 Định lượng hoạt độ GOT huyết tương chuột 28 Bảng 2.2 Định lượng hoạt độ GPT huyết tương chuột 28 Bảng 2.3 Các lơ thử nghiệm mơ hình STZ 32 Bảng 2.4 Hỗn hợp phản ứng định lượng glucose 34 Bảng 3.1 Kết chiết xuất cao từ Rau trai 35 Bảng 3.2 Kết khối lượng làm khô 35 Bảng 3.3 Kết độc tính cấp đường uống 48 Bảng 3.4 Kết xác định LD0 cao nước cao ethanol 50% 38 Bảng 3.5 Liều thử nghiệm an toàn cao chiết 51 Bảng 3.6 Trọng lượng thể chuột mơ hình tổn thương gan ethanol 39 Bảng 3.7 Hoạt độ GOT (UI/ml) huyết tương chuột lô thử nghiệm 41 Bảng 3.8 Hoạt độ GPT (UI/ml) huyết tương chuột lô thử nghiệm 41 Bảng 3.9 Hàm lượng MDA GSH gan chuột 42 Bảng 3.10 Tác dụng cao chiết Rau trai thực nghiệm dung nạp glucose chuột có đường huyết bình thường 43 Bảng 3.11 Trọng lượng thể chuột 14 ngày thí nghiệm mơ hình gây tăng đường huyết 44 Bảng 3.12 Tác dụng cao chiết Rau trai đường huyết lô chuột bình thường.45 Bảng 3.13 Tác dụng cao chiết Rau trai đường huyết lô chuột gây tăng đường huyết STZ 46 Bảng 3.14 Tác dụng cao chiết Rau trai thực nghiệm dung nạp glucose chuột gây tăng đường huyết STZ 47 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên kí hiệu, Tiếng Anh chữ viết tắt Tiếng Việt ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphotphate DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ĐTĐ Đái tháo đường EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid FAD2+ Flavin adenine dinucleotide GLUT2 Glucose transporter Kênh vận chuyển glucose HLA Human leucocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% IDF International Diabetes Federation Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế LD Lethal dose Liều gây chết MDA Malondialdehyde NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide ROS Reactive oxygen species Oxy hoạt tính SEM Standard error of the mean Sai số chuẩn giá trị trung bình SU Sulfonylureas STZ Streptozotocin ADH Alcohol dehydrogenase ALDH Aldehyde dehydrogenase GOT Glutamate oxaloacetate transaminase GPT Glutamate pyruvate transaminase GSH Glutathione CYP2E1 Cytochrome P450 2E1 MDA Malonyl dialdehyde viii TÓM TẮT Rau trai (Commelina diffusa) loại nhiệt đới thân thảo, sử dụng nhiều y học cổ truyền nhiều nước giới Nghiên cứu khảo sát tác dụng bảo vệ gan cao chiết từ Rau trai mơ hình chuột nhắt trắng bị tổn thương gan trình sử dụng rượu mãn tính đánh giá tác dụng ổn định đường huyết thực nghiệm dung nạp glucose, thực nghiệm gây bệnh cảnh đái tháo đường chuột nhắt trắng streptozotocin Kết tiêu liên quan tới gan cho thấy việc cho uống cao chiết cồn 96% từ Rau trai làm giảm đạt ý nghĩa thống kê hoạt độ GOT GPT huyết tương Đồng thời làm giảm nồng độ MDA (malondialdehyde) tăng nồng độ GSH (glutathione) gan chuột, tác dụng tương đương thuốc đối chiếu silymarin Cao chiết cồn 50% cao chiết nước chưa thể tác dụng dược lý tiêu khảo sát Kết nồng độ đường huyết máu nhóm chuột uống cao chiết nước cao chiết ethanol 50% liều khảo sát không ảnh hưởng nồng độ đường huyết chuột thực nghiệm gây tăng đường huyết Các lô chuột uống cao chiết ethanol 96% thể tác dụng hạ đường huyết tương tự thuốc đối chiếu glibenclamid Kết nghiên cứu cho thấy có cao chiết cồn 96% từ Rau trai hai liều thử nghiệm 0,21 g/kg 0,42 g/kg thể tác dụng bảo vệ gan hạ đường huyết mơ hình khảo sát ix TRỌNG LƯỢNG NHÓM STZ (+) SAU KHI TIÊM NGÀY (g) CHỨNG CAO NƯỚC 0,36 g/kg CAO NƯỚC 0,72 g/kg CAO CỒN 50 0,49 g/kg CAO CỒN 50 0,98 g/kg CAO CỒN 96 0,21 g/kg CAO CỒN 96 0,42 g/kg GLIBENCLAMIDE 29 21 29 27 28 25 24 26 29 28 27 27 22 24 29 22 22 27 19 24 25 29 22 27 24 26 22 23 19 24 23 25 23 24 30 26 27 24 20 24 22 24 25 23 27 23 21 26 21 30 20 23 26 26 25 23 23 24 27 25 26 28 23 28 TB 24.13 25.50 24.88 24.75 25.00 25.38 23.38 25.13 SEM 1.11 1.00 1.46 0.62 1.07 0.75 0.98 0.72 12 xxiv TRỌNG LƯỢNG NHÓM STZ (+) SAU NGÀY ĐIỀU TRỊ (g) CAO CỒN CAO CỒN CAO CỒN 50 0,98 96 0,21 96 0,42 g/kg g/kg g/kg CHỨNG CAO NƯỚC 0,36 g/kg CAO NƯỚC 0,72 g/kg CAO CỒN 50 0,49 g/kg 26 23 26 25 24 23 19 21 24 22 25 23 24 20 21 23 23 23 22 25 23 23 25 23 26 23 21 26 26 26 25 25 22 25 27 22 23 19 19 25 24 19 26 25 21 25 25 24 26 26 24 24 25 27 29 25 19 28 23 27 20 28 26 28 TB 23.75 23.63 24.25 24.63 23.25 23.88 23.63 24.25 SEM 0.86 0.96 0.75 0.56 0.70 1.14 1.27 0.73 STT xxv GLIBENCLAMIDE TRỌNG LƯỢNG NHÓM STZ (-) TRƯỚC KHI TIÊM (g) CAO CỒN CAO CỒN CAO CỒN 50 0,98 96 0,21 96 0,42 g/kg g/kg g/kg CHỨNG CAO NƯỚC 0,36 g/kg CAO NƯỚC 0,72 g/kg CAO CỒN 50 0,49 g/kg 26 28 25 26 26 23 19 29 29 26 25 22 24 22 25 19 20 25 19 24 18 26 25 27 26 24 23 25 29 23 25 24 27 27 27 27 16 26 19 24 24 24 23 21 26 29 28 25 25 25 26 23 25 25 27 25 20 26 25 26 25 28 24 27 26 27 24 23 26 25 23 24 10 26 20 27 27 27 23 26 26 TB 24.90 25.20 24.40 24.40 24.20 25.00 24.10 25.00 SEM 0.91 0.50 0.77 0.75 1.55 0.88 1.18 1.05 STT xxvi GLIBENCLAMIDE TRỌNG LƯỢNG NHÓM STZ (-) SAU KHI TIÊM NGÀY (g) CAO CỒN CAO CỒN CAO CỒN 50 0,98 96 0,21 96 0,42 g/kg g/kg g/kg CHỨNG CAO NƯỚC 0,36 g/kg CAO NƯỚC 0,72 g/kg CAO CỒN 50 0,49 g/kg 26 25 23 26 26 24 30 29 27 23 26 23 26 23 23 23 25 25 30 23 24 28 23 25 23 25 25 26 26 28 27 26 28 27 27 25 23 30 27 25 28 26 26 27 25 24 25 23 25 29 25 24 26 26 26 25 26 30 25 28 27 28 24 25 27 24 26 25 24 25 25 25 10 25 27 24 27 25 24 26 27 TB 26.00 26.10 25.70 25.40 25.20 26.00 25.60 25.30 SEM 0.49 0.82 0.63 0.65 0.46 0.89 0.84 0.67 STT xxvii GLIBENCLAMIDE TRỌNG LƯỢNG NHÓM STZ (-) SAU NGÀY ĐIỀU TRỊ (g) CAO CỒN CAO CỒN CAO CỒN 50 0,98 96 0,21 96 0,42 g/kg g/kg g/kg CHỨNG CAO NƯỚC 0,36 g/kg CAO NƯỚC 0,72 g/kg CAO CỒN 50 0,49 g/kg 30 25 24 24 25 25 32 26 26 27 23 27 24 28 23 31 24 27 27 31 31 25 28 24 25 24 30 26 24 27 27 30 24 23 29 27 25 32 23 23 26 25 24 23 23 24 23 25 25 26 31 26 24 25 25 25 29 26 23 23 30 28 26 28 29 30 25 26 26 22 26 27 10 25 25 27 21 23 25 25 22 TB 26.30 25.80 26.30 25.40 25.50 26.10 25.80 26.10 SEM 0.70 0.50 1.04 0.93 1.06 0.92 1.11 1.02 STT xxviii GLIBENCLAMIDE ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC    MAI HUỲNH XUÂN TRÚC KHẢO SÁT TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ RAU TRAI (Commelina diffusa) KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS DƯỢC HỌC NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 xxix TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ RAU TRAI (COMMELINA DIFFUSA) TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO ETHANOL Hà Quang Thanh, Mai Thành Chung, Nguyễn Mai Trúc Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương* Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh - Viện Dược Liệu *Email: huongsam@hotmail.com Tóm tắt Nghiên cứu khảo sát tác dụng bảo vệ gan cao chiết từ Rau trai mơ hình chuột nhắt trắng bị tổn thương gan q trình sử dụng rượu mãn tính Chuột cho uống ethanol theo nồng độ tăng dần ngày (10, 20, 30, 40 %) liên tục sau tuần điều trị dự phòng với loại cao chiết từ Rau trai silymarin (100 mg/kg) thời điểm trước cho uống ethanol Kết cho thấy việc cho uống cao chiết cồn 96% từ Rau trai hai liều 0,21 0,42 g/kg làm giảm đạt ý nghĩa thống kê hoạt độ AST ALT huyết tương Đồng thời, việc cho uống cao chiết cồn 96 % làm giảm nồng độ MDA (malondialdehyde) tăng nồng độ GSH (glutathione) gan chuột, tác dụng tương đương thuốc đối chiếu silymarin Cao chiết cồn 50% (0,49 0,98 g/kg) cao chiết nước (0,36 0,72 g/kg) chưa thể tác dụng dược lý tiêu khảo sát Từ khóa: Tổn thương gan rượu, Rau trai, silymarin Hepatoprotective Effects of Commelina diffusa extracts on alcoholic liver injury in mice Summary The present study was envisaged to investigate the intervention effects of Commelina diffusa extracts on alcoholic liver injury in mice Alcoholic liver injury was induced in the experimental model by ethanol administering with gradually increasing concentrations every days (10, 20, 30, 40 %), continuous administration for weeks and pretreatment by Commelina diffusa extracts and silymarin (100 mg/kg) at hour before ethanol administration The results showed that pretreatment with 96% ethanol extracts of Commelina diffusa (0.21 and 0.42 g/kg) significantly reduced the ethanol-elevated serum level of aspartate transaminase (AST, aspartate aminotransferase), alanine transaminase (ALT, alanine aminotransferase) Besides, malondialdehyde (MDA) was found to significantly decrease while glutathione (GSH) in liver was significantly enhanced, such effects were similar to a reference drug silymarin Both 50% ethanol extracts (0.49 and 0.98 g/kg) and aqueous extracts (0.36 and 0.72 g/kg) of Commelina diffusa did not show any effects on the above parameters Keywords: Alcoholic liver injury, Commelina diffusa, silymarin xxx Đặt vấn đề Báo cáo thực trạng toàn cầu đồ uống có cồn sức khỏe năm 2016 Tổ chức Y tế giới cho biết, mức tiêu thụ rượu bia bình quân đầu người Việt Nam năm lên tới 8,3 lít, tăng tới 118% tăng 30 bậc lên vị trí 64/194 nước Việt Nam nước hàng đầu giới có tỷ lệ bị xơ gan, ung thư gan liên quan đến rượu bia ngày tăng [1] Rau trai (Commelina diffusa Burm.f.) thân thảo, mọc nhiều nơi đất ẩm, ruộng vườn tỉnh đồng bằng, miền núi sử dụng loại rau hay loại dược liệu dân gian Theo đơng y, Rau trai có tác dụng giải nhiệt, kháng sinh, chống viêm, lợi tiểu, tiêu sưng thường dùng toàn để làm thuốc Một số nghiên cứu cho thấy cao chiết Rau trai có tác dụng chống viêm, chống oxy hoá, ức chế ɑ -glucosidase, bảo vệ gan thận [2, 3] Hiện nay, nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu thực nghiệm tác dụng loài theo hướng ngăn ngừa bảo vệ gan Do nghiên cứu tiến hành khảo sát tác dụng dược lý Rau trai nhiều loại cao chiết khác mơ hình tổn thương gan mạn ethanol chuột nhắt trắng, thông qua việc đánh giá tiêu huyết tương AST ALT, tiêu liên quan đến tổn thương oxy hóa gan malondialdehyd (MDA) glutathion (GSH, chất chống oxy hóa) Hướng nghiên cứu đề tài góp phần phát triển định hướng sử dụng dược liệu việc phòng ngừa điều trị tác hại xấu gan bia rượu nói riêng bệnh lý khác gan khác nói chung Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Toàn Rau trai thu hái vào tháng 3/2019 Huyện Hóc Mơn, thành phố Hồ Chí Minh, định danh lưu mẫu môn Tài nguyên Dược liệu- Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM Nguyên liệu sau hái rửa sạch, sau sơ chế cách cắt nhỏ, phơi khơ tự nhiên, đem mẫu khơ xay thành bột có kích thước phù hợp (qua rây 0,2 mm) độ ẩm đạt 11,57 % Bột dược liệu chiết nóng cao nước chiết ngấm kiệt cao cồn 50% 96% với tỉ lệ 1:15, sau quay áp suất giảm để thu hồi dung môi cô cách thủy để thu cao chiết Rau trai Tham khảo từ liều sử dụng dược liệu thực tế người suy liều thử nghiệm cho thí nghiệm dược lý chuột (tương đương 2,5 g g dược liệu) dựa hiệu suất chiết Bảng Liều thử nghiệm cao chiết dựa vào hiệu suất chiết Mẫu Độ ẩm Hiệu suất chiết xxxi Liều tương đương Liều tương đương (%) trừ ẩm (%) 2,5 g dược liệu 5,0 g dược liệu (g/kg) (g/kg) Cao nước 15,43 ± 0,25 14,46 0,36 0,72 Cao ethanol 50% 9,08 ± 0,09 19,61 0,49 0,98 Cao ethanol 96% 6,06 ± 0,40 8,45 0,21 0,42 2.2 Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng giống đực chủng Swiss albino (Mus muscullus var albino) – tuần tuổi, cung cấp Viện Vắc-xin Sinh phẩm y tế Nha Trang Chuột nuôi ổn định vòng tuần trước tiến hành thí nghiệm Chuột ni thực phẩm dạng viên chuyên biệt dành cho chuột thí nghiệm cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế Nha Trang, nước uống đầy đủ Thể tích cho uống mẫu thử nghiệm 10 ml/kg thể trọng chuột 2.3 Thiết kế thí nghiệm Chuột thí nghiệm chia thành nhóm với lơ n= 8-10 chuột Nhóm bệnh lý (ETOH+) cho uống nước cất, cao chiết nước (0,36 0,72 g/kg), cao chiết cồn 50% (0,49 0,98 g/kg) cao chiết cồn 96% (0,21 0,42 g/kg) từ Rau trai bên cạnh thuốc đối chiếu silymarin liều 100 mg/kg Một sau tiếp tục cho chuột uống ethanol (Công ty cổ phần OPC, Việt Nam) theo nồng độ tăng dần tuần (10%, 20%, 30%, 40%) vòng tuần [4] Vào tuần thứ lô lô thực nghiệm cho uống mẫu thử, không cho uống ethanol Thực song song với nhóm bình thường (ETOH-) với lơ thay việc cho uống ethanol nước cất, nhiên loại cao chiết thử nghiệm liều cao Thể tích cho uống ethanol 10 ml/kg thể trọng chuột Chuột lấy máu tĩnh mạch đuôi kiểm tra hoạt độ AST, ALT thời điểm tuần (trước thí nghiệm), tuần thứ thứ thí nghiệm Tiến hành tách gan định lượng hàm lượng MDA GSH vào thời điểm kết thúc thí nghiệm (tuần thứ sau cho uống mẫu thử) 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ AST, ALT huyết tương chuột Hoạt độ AST ALT xác định theo phương pháp hướng dẫn kit định lượng transaminase AST, ALT Human Co Ltd., Germany 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng MDA GSH gan chuột Giải phẫu chuột, tách lấy gan nghiền đồng thể dung dịch đệm KCl 1,15% (tỷ lệ 1:10) với tốc độ 13.000 vịng/phút Sau đó, lấy ml dung dịch đồng thể gan (cho định lượng MDA) ml dung dịch đồng thể gan (cho định lượng GSH), bổ sung thêm dung dịch đệm Tris – HCl; xxxii pH 7,4 vừa đủ ml Ủ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ 37 oC 60 phút (1 giờ) dừng phản ứng với ml acid trichloroacetic 10% Sau đó, đem ly tâm hỗn hợp nhiệt độ oC, tốc độ ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút Định lượng MDA: sau ly tâm, lấy ml dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric (Sigma-Aldrich, Mỹ) 0,8% 100 oC thời gian 15 phút đo quang bước sóng λ= 532 nm Hàm lượng MDA (nM/g protein) tính theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA (Sigma-Aldrich, Mỹ) [5] Định lượng GSH: sau ly tâm, lấy ml dịch cho vào ống nghiệm chuẩn bị sẵn 1,8 ml dung dịch đệm phosphate – EDTA cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman (SigmaAldrich, Mỹ) bổ sung dung dịch đệm phosphate – EDTA vừa đủ ml Để yên vòng phút nhiệt độ phịng đo quang bước sóng λ= 412 nm Hàm lượng GSH (nM/g protein) tính theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn GSH (Sigma-Aldrich, Mỹ) [5] Hàm lượng MDA GSH (nmol/g protein) tính theo phương trình hồi quy chất chuẩn MDA: y = 0,0796x + 0,0035 (R2 = 0,9992) GSH: y = 0,0043x - 0,0033 (R2 = 0,9997) 2.4 Đánh giá kết Các số liệu biểu thị trị số trung bình: M ± SEM (Standard Error of the Mean – sai số chuẩn giá trị trung bình) xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA hậu kiểm Student-Newman-Keuls test (phần mềm SigmaStat-3.5) Kết thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% p < 0,05 so với lô chứng Kết bàn luận 3.1 Hoạt độ AST, ALT huyết tương chuột Ở nhóm chuột khơng cho uống ethanol, hoạt độ AST ALT tất lô cho uống cao chiết nước, cao cồn 50% 96% thời điểm khảo sát không cho thấy khác biệt mặt thống kê so với lô chứng sinh lý Ở nhóm chuột cho uống ethanol, thời điểm bắt đầu tuần sau uống ethanol, hoạt độ AST ALT huyết tương lô nhóm khơng có khác biệt thống kê so với chứng bệnh lý Tại thời điểm tuần khảo sát, hoạt độ AST ALT lô chứng bệnh lý tăng đạt ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý, hai giá trị lô điều trị với cao cồn 96% hai liều 0,21 g/kg 0,42 g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với chứng bệnh lý, tương tự tác dụng lô đối chiếu uống silymarin liều 100 mg/kg Hoạt độ AST ALT lô điều trị với cao cồn 50% cao nước liều khác biệt thống kê so với chứng bệnh lý tăng đạt ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý (Bảng 3) Bảng Hoạt độ AST (UI/ml) huyết tương chuột lô thử nghiệm xxxiii Ban đầu Tuần Tuần Chứng sinh lý 40,90 ± 0,94 43,70 ± 1,45 47,10 ± 1,36 Cao nước liều 0,72 g/kg 41,50 ± 0,96 46,70 ± 1,42 49,40 ± 2,32 ETOH- Cao cồn 50% liều 0,98 g/kg 41,30 ± 1,10 46,40 ± 2,65 48,30 ± 1,57 Cao cồn 96% liều 0,42 g/kg 40,90 ± 0,85 45,90 ± 1,66 47,30 ± 1,70 Silymarin liều 100 mg/kg 40,70 ± 0,76 43,60 ± 1,55 46,00 ± 1,98 Chứng bệnh lý 41,90 ± 1,19 47,80 ± 1,12 60,20 ± 3,44* Cao nước liều 0,36 g/kg 41,20 ± 0,98 48,00 ± 0,83 58,60 ± 1,59* Cao nước liều 0,72 g/kg 41,20 ± 0,85 48,10 ± 1,99 60,80 ± 3,03* ETOH Cao cồn 50% liều 0,49 g/kg 40,60 ± 0,82 47,50 ± 1,56 59,50 ± 2,00* + Cao cồn 50% liều 0,98 g/kg 40,70 ± 0,84 47,00 ± 1,39 58,70 ± 2,00* Cao cồn 96% liều 0,21 g/kg 40,30 ± 0,54 44,00 ± 1,54 52,10 ± 1,85# Cao cồn 96% liều 0,42 g/kg 40,30 ± 0,94 44,60 ± 1,20 50,90 ± 0,60# Silymarin liều 100 mg/kg 41,00 ± 0,89 44,50 ± 1,22 48,60 ± 1,13# Nhóm Tuần/Lơ * p < 0,05 so với chứng sinh lý , # p < 0,05 so với chứng bệnh lý Bảng Hoạt độ ALT (UI/ml) huyết tương chuột lô thử nghiệm Ban đầu Tuần Tuần Chứng sinh lý 44,80 ± 1,62 47,30 ± 2,48 48,30 ± 2,01 Cao nước liều 0,72 g/kg 43,50 ± 1,13 49,30 ± 0.70 51,80 ± 1,37 ETOH- Cao cồn 50% liều 0,98 g/kg 43,60 ± 1,09 47,70 ± 1,82 50,60 ± 1,22 Cao cồn 96% liều 0,42 g/kg 44,60 ± 1,19 45,30 ± 1,35 48,50 ± 1,73 Silymarin liều 100 mg/kg 43,60 ± 0,92 45,50 ± 1,29 46,90 ± 1,53 Chứng bệnh lý 42,90 ± 1,13 50,00 ± 1,63 58,10 ± 1,21* Cao nước liều 0,36 g/kg 44,20 ± 1,04 49,60 ± 1,30 56,90 ± 1,77* Cao nước liều 0,72 g/kg 43,80 ± 1,12 50,10 ± 1,79 58,50 ± 1,27* ETOH Cao cồn 50% liều 0,49 g/kg 44,80 ± 1,10 49,70 ± 2,49 57,00 ± 1,65* + Cao cồn 50% liều 0,98 g/kg 44,50 ± 1,35 48,50 ± 2,09 58,20 ± 1,67* Cao cồn 96% liều 0,21 g/kg 44,90 ± 1,02 49,10 ± 2,27 51,60 ± 2,26# Cao cồn 96% liều 0,42 g/kg 44,40 ± 0,96 48,40 ± 1,54 51,10 ± 0,96# Silymarin liều 100 mg/kg 44,10 ± 1,32 47,40 ± 1,12 49,70 ± 1,30# Nhóm Tuần/Lơ * p < 0,05 so với chứng sinh lý , # p < 0,05 so với chứng bệnh lý xxxiv 3.2 Hàm lượng MDA GSH gan chuột Hàm lượng MDA (nM/g protein) 60 * 50 * * * * 40 # # # 30 20 10 ETOH- ETOH+ Hình Hàm lượng MDA gan chuột * p < 0,05 so với chứng sinh lý , # p < 0,05 so với chứng bệnh lý Hàm lượng GSH (nM/g protein) 8000 7000 * 6000 * * * * # # # 5000 4000 3000 2000 1000 ETOH- ETOH+ Hình Hàm lượng GSH gan chuột * p < 0,05 so với chứng sinh lý , # p < 0,05 so với chứng bệnh lý Hàm lượng MDA GSH gan chuột lô không cho uống ethanol tương tự khơng có khác biệt mặt thống kê Tuy nhiên, nhóm chuột cho uống ethanol, lơ chứng bệnh lý có trị số MDA tăng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý Ở lô uống ethanol điều trị cao chiết cồn 96% Rau trai hai liều 0,21 g/kg 0,42 g/kg có giảm hàm lượng MDA gia tăng GSH gan chuột đạt ý nghĩa thống kê so với xxxv chứng bệnh lý, tương tự tác dụng lô đối chiếu uống silymarin liều 100 mg/kg Trị số MDA GSH lô điều trị với cao cồn 50% cao nước liều không cho thấy khác biệt thống kê so với chứng bệnh lý có trị số MDA tăng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý 3.3 Bàn luận Sau uống rượu bia, ethanol hấp thu nhanh vào máu chuyển hóa gan Bản chất ethanol chất độc mà sản phẩm trung gian q trình chuyển hóa tác nhân gây tổn thương đến tế bào gan điển acetaldehyde gốc tự Với lượng rượu vừa phải chuyển hóa nhờ vào enzym alcohol dehydrogenase (ADH), cytochrom P450 2E1 (CYP2E1), catalase tạo thành acetaldehyd, sau acetaldehyd vào ty thể oxy hóa thành acetat aldehyde dehydrogenase (ALDH) Cuối q trình chuyển hóa hình thành CO2 nước, loại khỏi thể dễ dàng [6] Khi sử dụng với lượng rượu cao, trình chuyển hóa bị q tải tích tụ chất độc hại gây tổn thương đến tế bào gan Khi tế bào gan bị tổn thương dẫn đến rối loạn cấu trúc chức gan Các tế bào gan thực chức gan nhờ vào hệ thống enzym Trong gan enzym có mặt tế bào gan, ngày ln có tế bào chết giải phóng vào máu máu tồn lượng men gan định Khi gan bị tổn thương tế bào gan bị hoại tử giải phóng aminotransferase vào máu với lượng cao bình thường cụ thể AST ALT Hoạt độ AST ALT tăng lên có dấu hiệu tổn thương gan Trong AST enzym tìm thấy nhiều gan, tim, thận tăng giá trị AST khơng phản ánh đặc trưng tình trạng gan ALT enzym tìm thấy chủ yếu gan giá trí trị ALT tăng chẩn đốn tình trạng tổn thương gan Kết nghiên cứu cho thấy trị số AST, ALT tăng rõ rệt lô chứng bệnh lý so với lô chứng sinh lý, chứng tỏ gan bị tổn thương việc cho uống ethanol dài ngày tuần Ngồi lơ chứng bệnh lý có hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý, q trình oxy hóa ethanol CYP2E1 hình thành gốc tự (ROS) ROS công vào phospholipid màng tế bào gây q trình peroxy hóa lipid hình thành malondialdehyde (MDA), ROS làm giảm glutathion (GSH) chất thu nhận gốc tự quan trọng thể Vì hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH nội sinh giảm chứng tỏ mức độ tổn thương gan nặng [7] Ngoài ra, việc định lượng gamma glutamyl transferase (GGT, enzym có vai trị quan trọng tổng hợp GSH) có ích cho việc chẩn đoán sớm lâm sàng tổn thương gan rượu, viêm gan tắt mật số bệnh lý khác bệnh tim mạch [8] Do đó, tiêu GGT cần khảo sát nghiên cứu tiếp xxxvi theo Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Rau trai diện khoáng chất, vitamin, alkaloid, saponin, phenolic, tannin, phytosterol, triterpen, terpenoid flavonoid, glycosid [9] Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng số thành phần đặc biệt flavonoid chế gây tổn thương gan; Wickramasinghe cộng (2006) tác dụng flavonoid, vitamin việc làm giảm nồng độ acetaldehyd bị tăng ethanol nghiên cứu in vitro, cụ thể báo cáo Saeed cộng (2008) cho thấy tác động ức chế flavonoid hoạt động aldehyd oxidase, enzym liên quan đến q trình peroxy hóa lipid gây tổn thương tế bào gan rượu [10, 11] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu chứng minh khả flavonoid kháng viêm chống lại hình thành ROS thơng qua hoạt tính bắt gốc tự do, ức chế enzym nguyên tố tham gia hình thành ROS, kích thích hoạt tính chất chống oxy hóa nội sinh [12, 13] Shibano cộng (2008) báo cáo cao cồn chiết từ Rau trai chứa chủ yếu 11 flavonoid chứng minh cao phân đoạn nước chiết từ cao cồn 70% từ Rau trai nồng độ 0,4 mg/ml có khả dập tắt gốc tự mạnh [3] Trong nghiên cứu này, việc cho uống cao chiết cồn 96% Rau trai hai liều 0,21 0,42 g/kg cho thấy tác dụng điều hòa gia tăng hoạt độ AST ALT huyết tương chuột bị tổn thương gan mạn ethanol giá trị sinh lý bình thường, kết tương đồng nghiên cứu Sule cộng (2017) cho thấy phục hồi giá trị AST ALT chuột tổn thương gan doxorubicin cho uống cao cồn từ Rau trai liều 200 400 mg/kg [2] Ngoài suy giảm số MDA tăng GSH lô chuột gây tổn thương gan điều trị hai liều cao cồn 96% Rau trai cho thấy tác dụng ức chế tổn thương peroxy hóa lipid tế bào gan hoạt tính trung hịa ROS có hại thể cao chiết có liên quan đến tác dụng bảo vệ gan Rau trai, giúp giảm thiểu tổn thương gan gây việc cho chuột uống ethanol dài ngày Kết luận Cao chiết cồn 96 % từ Rau trai hai liều thử nghiệm 0,21 g/kg 0,42 g/kg (tương đương với 2,5 g g dược liệu) cho thấy tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương oxy hóa ethanol, thơng qua việc làm giảm giá trị AST ALT huyết tương, hồi phục hàm lượng GSH gan làm giảm gia tăng hàm MDA gây hại cho gan Các cao chiết nước hai liều 0,36 0,72 g/kg cao chiết cồn 50% liều 0,49 0,98 g/kg chưa thể tác dụng tiêu khảo sát xxxvii Tài liệu tham khảo Martha Lincoln (2016), Alcohol and drinking cultures in Vietnam: A review, Drug and Alcohol Dependence, 159, 1-8 Sule OJ, Arhoghro EM and Erigbali P(2017), Nephro-protective and hepato-protective property of Commelina diffusa leaf extract in doxorubicin-induced albino rats, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(10), 51-62 Shibano Makio, Kakutani Koji, Taniguchi Masahiko, Yasuda Masahide, and Baba Kimiye (2008), Antioxidant constituents in the dayflower (Commelina communis L.) and their α-glucosidase-inhibitory activity, Journal of Natural Medicines, 62(3), 349 Mustafa altinifiik, Muharrem balkaya, Funda kargin, Hỹmeyra ỗeler, Cengiz ỹnsal (2002), Effects of Alcohol, Passive Smoking and Alcohol Plus Passive Smoking on Some Serum Biochemical Variables in Mice, The Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 26(369-377) Ngô Quốc Hận, Nguyễn Thị Thu Hương (2011), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan polysaccharid chiết xuất từ nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) , Y Học TP Hồ Chí Minh, 15(1), 52-53 Arthur Cederbaum (2012), Alcohol Metabolism, Clinics in Liver Disease, 16(4), 667-685 Shaw S, Jayatilleke E (2000), The role of aldehyde oxidase in ethanol-induced hepatic lipid peroxidation in the rat, Biochemical Journal, 268(3): 579–583 Whitfield JB (2001), Gamma glutamyl transferase Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 38(4), 263–355 Khan Md Ahad Ali, Islam Md Torequl and Sadhu Samir Kumar (2011), Evaluation of phytochemical and antimicrobial properties of Commelina diffusa Burm., Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 11(4), 235-241 10 Saeed P, Jalal H, Seyed R, Mohammad R (2008), Inhibitory effects of flavonoids on aldehyde oxidase activity, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 14-21 11 Wickramasinghe S, Hasan R, Khalpey Z (2006), Differences in the serum levels of acetaldehyde and cytotoxic acetaldehyde-albumin complexes after the consumption of red and white wine: in vitro effects of flavonoids, vitamin E, and other dietary antioxidants on cytotoxic complexes, Alcohol Clinical and Experimental Research, 20(5):799-803 12 Serafini M, Peluso I, Raguzzini A (2010), Flavonoids as anti-inflammatory agents, Proceedings of the Nutrition Society, 69(3):273 13 Panche A, Diwan D, Chandra S (2016), Flavonoids: an overview, Journal of Nutritional Science, 6-8 xxxviii