Đánh giá khả năng sinh phytase từ một số dòng bacillus sp chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng bình châu

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH PHYTASE CỦA MỘT SỐ DÒNG BACILLUS SP CHỊU NHIỆT PHÂN LẬP TỪ SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU CHỦ NHIỆM NDNC (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2015 TĨM TẮT ĐỀ TÀI Từ 37 dịng Bacillus sp chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng Bình Châu sàng lọc dịng có khả sinh phytase (B61, A76, B63, A44, B64, B78, B88, B39, A95), dịng Bacillus subtilis B61 Bacillus pumilus A76 cho đường kính phân giải lớn 8,98 ± 0,81 mm 7,77 ± 0,29 mm Trong nghiên cứu này, dòng Bacillus subtilis B61 Bacillus pumilus A76 sử dụng để khảo sát môi trường ni cấy thích hợp để thu nhận hàm lượng phytase Kết khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy cho thấy, môi trường chứa bột đậu nành 2%, maltose 0,5%, cao nấm men 0,2% với giá trị pH = 4, nhiệt độ ủ 450C 120h thích hợp để dịng B61 sinh phytase có hoạt độ cao 246,53 ± 12,2 U/ml Dòng A76 sinh phytase có hoạt độ cao 171,53 ± 9,85 U/ml môi trường chứa bột bắp 2%, tinh bột 0,5%, cao nấm men 0,2%, pH = 6, nhiệt độ ủ 450C 72h Sự ảnh hưởng pH, nhiệt độ, trypsin pepsin hoạt độ phytase nghiên cứu Kết cho thấy phytase tổng hợp dòng Bacillus bị ảnh hưởng nồng pH thấp, nhiệt độ 800C loại trypsin pepsin ABSTRACT 37 strains of thermotolerant Bacillus sp were evaluated to produce phytase and the suitable medium for Bacillus sp to synthesize high activity of phytase was studied Based on the clear peripheral hydrolytic zones of phytase, strains of Bacillus sp were found as phytase producers including B61, A76, B63, A44, B64, B78, B88, B39 and A95 Bacillus subtilis B61 Bacillus pumilus A76 gave the highest clear zones were 8,98 ± 0,81 mm 7,77 ± 0,29 mm The results show that the synthesis of phytase with suitable conditions such as corn tinh bột 2%, maltose 0.5%, yeast extract 0.2%, pH 4, incubation temperature (450C) in 120h producing the highest activity of phytase from Bacillus subtilis B61 (246.53 ± 12.2 U/ml) while suitable medium for Bacillus pumilus A76 to synthesis the highest phytase activity (171.53 ± 9.85 U/ml) containing soybean i 2%, tinh bột 0.5%, yeast extract 0.2%, pH 6, incubation temperature at 45 in 72h In addition, the effect of pH, temperature, trypsin and pepsin to synthesized phytase was studied The activity of phytase was produced from B61 and A76 were significantly impacted by low pH and high temperature at 800C and were sensitive to trypsin and pepsin ii MỤC LỤC TÓM TẮT ĐỀ TÀI i MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ix THƠNG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Axit phytic 1.2 Phytase 1.3 Các nguồn thu nhận phytase 1.4 Vai trò phytase 10 1.5 Vi khuẩn Bacillus sp chịu nhiệt 11 1.6 Những nghiên cứu thực nước 14 1.6.1 Những nghiên cứu nước 14 1.6.2 Những nghiên cứu nước 16 Chương - NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nội dung 1: Sàng lọc dịng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh 18 phytase 2.1.1.Vật liệu 18 2.1.2 Phương pháp thí nghiệm 18 2.2 Nội dung 2: Khảo sát mơi trường ni cấy Bacillus sp thích hợp 19 để tổng hợp phytase có hoạt độ cao iii 2.2.1.Vật liệu 19 2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 19 2.2.2.1 Khảo sát chất 19 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon 19 2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ 20 2.2.2.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 20 2.2.2.5 Khảo sát gia trị pH thích hợp 20 2.2.2.6 Khảo sát thời gian ủ thích hợp 20 2.3 Nội dung 3: Khảo sát điều kiện nhiệt độ độ pH ảnh hưởng đến 21 hoạt độ phytase 2.3.1.Vật liệu 21 2.3.2 Phương pháp thí nghiệm 21 2.3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ phytase 21 2.3.2.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 21 2.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng trypsin pepsin đến hoạt 21 độ phytase 2.4.1 Vật liệu 21 2.4.2 Phương pháp thực 21 Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nội dung 1: Sàng lọc dòng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh 23 phytase 3.2 Nội dung 2: Khảo sát môi trường nuôi cấy Bacillus sp thích hợp 24 để tổng hợp phytase có hoạt độ cao 24 3.2.1 Khảo sát chất iv 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon 25 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ 26 3.2.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 27 3.2.5 Khảo sát giá trị pH thích hợp 28 3.2.6 Khảo sát thời gian ủ thích hợp 28 3.3 Nội dung 3: Khảo sát điều kiện nhiệt độ độ pH ảnh hưởng đến 29 hoạt độ phytase 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ phytase 29 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 30 3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng trypsin pepsin đến hoạt 31 độ phytase Chương - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 4.1 Kết luận 32 4.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 38 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT BB Bacillus broth BPP β- propeller phosphatase HAP histidine acid phosphatases PAP Purple acid phosphatase PMS Phytase screening medium vi DANH SÁCH CÁC BẢNG TÊN BẢNG SỐ TRANG Danh sách tên dòng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ 1.1 suối nước nóng Bình Châu dựa kết giải trình tự vùng 11 16S rRNA dùng primer 27F/ 1552R tra NCBI/BLAST 3.1 Đường kính vịng phân giải dòng Bacillus sp 23 3.2 Kết ảnh hưởng chất đến khả sinh phytase 25 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Kết ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh phytase Bacillus sp Kết ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh phytase Bacillus sp Kết ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh phytase Kết ảnh hưởng pH đến khả sinh phytase Kết ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh phytase 26 27 29 30 31 3.8 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ phytase 33 3.9 Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ phytase 34 3.10 Kết ảnh hưởng trypsin pepsin đến hoạt độ phytase 35 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH SỐ TÊN HÌNH 1.1 Cấu trúc phân tử axit phytic 1.2 Sự thủy phân phytate xúc tác phytase thành inositol, phosphate chất hóa trị khác 1.3 Phản ứng xúc tác enzyme 3- , 4/6-, 5-phytase 3.1 TRANG Đường kính vịng phân giải dịng A76 có khả phân giải cao dịng A95 có khả phân giải thấp viii 24 ix Bảng 3.8: Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ phytase Nhiệt độ Hoạt độ phytase lại Hoạt độ phytase lại dòng B61 (%) dòng A76 (%) 40 100 100 50 100 93,2 60 93,8 85,9 70 70,8 66,9 80 55,3 37,6 Ghi chú: Trong cột chữ số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Kết khảo sát cho thấy, nhiệt độ cao hoạt độ phytase tổng hợp từ dòng Bacillus subtilis B61 Bacillus pumilus A76 giảm Sau ủ phytase thu nhiệt độ 80oC thi hoạt độ phytase tổng hợp từ dòng B61 cịn lại 50% hoạt độ phytase từ dòng A76 lại 37,6% ( bảng 3.8) Tuy nhiên kết tương đương với kết nghiên cứu Utkarsh J cộng tác động nhiệt lên hoạt độ phytase tổng hợp từ Bacillus cereus MTCC 10072, nhiệt độ 60oC, hoạt độ phytase ổn định với 98% so với hoạt độ ban đầu hoạt độ phytase giảm dần 78% bị tác động nhiệt độ 70oC [23] 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase Ngoài bị tác động nhiệt độ, hoạt tính phytase sau thu nhận bị ảnh hưởng pH Sau ủ 30 phút dịch phytase thô thu giá trị pH khác từ đến 6, hoạt độ phytase lại dòng Bacillus subtilis B61 90% ủ với pH nồng độ 4, hoạt độ giảm mạnh ủ với pH nồng độ 2, 43,3% Đối với dịng Bacillus pumilus A76 hoạt độ bền ủ với pH nồng độ 5,0 6,0 (bảng 3.9) Trong nghiên cứu Utkarsh J cộng phytase sản xuất từ Bacillus cereus 10072 ổn định dãy giá trị pH từ 30 đến bổ sung 5mM CaCl2 khơng có bổ sung CaCl2, hoạt độ phytase giảm 69% pH [23] Bảng 3.9: Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ phytase Hoạt độ phytase lại Hoạt độ phytase lại dòng B61 (%) dòng A76 (%) 43,3 73 92,9 73 pH 100 73,1 85 96,3 81,1 100 3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng trypsin pepsin đến hoạt độ phytase Trypsin pepsin hai enzyme quan trọng đường tiêu hóa nên việc khảo sát ảnh hưởng hai enzyme hoạt độ cần thiết Theo kết nghiên cứu cho thấy pepsin trypsin ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ phytase, sau ủ 1% trypsin với dịch phytase thơ thu hoạt độ giảm xuống 37,3% dòng Bacillus subtilis B61 62,6% dòng Bacillus pumilus A76 Khi ủ pepsin 1% với dịch phytase thô, sau 1h hoạt độ phytase bị ảnh hưởng giảm 56,8% phytase dòng B61 59,5% phytase dòng A76 Bảng 3.10: Kết ảnh hưởng trypsin pepsin đến hoạt độ phytase Hoạt độ phytase lại Hoạt độ phytase lại dòng B61 (%) dòng A76 (%) Trypsin 37,3 62,6 Pepsin 56,8 59,5 Enzyme Như kết cho thấy phytase thu bị ảnh hưởng có mặt hai enzyme trypsin pepsin với nồng độ 1% 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 37 dòng Bacillus sp chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng Bình Châu sàng lọc dịng có khả sinh phytase Bacillus subtilis B61 Bacillus pumilus A76 cho đường kính phân giải lớn 8,98 ± 0,81 mm 7,77 ± 0,29 mm Thành phần mơi trường thích hợp để Bacillus subtilis B61 sinh tổng hợp phytase có hoạt độ cao 246,5 ± 12,2 U/ml bột đậu nành 2%, maltose 0,5% cao nấm men 0,2% Điều kiện thích hợp để ni vi khuẩn cho tổng hợp phytase nhiệt độ 450C 120h giá trị pH Phytase thô sau thu nhận bị ảnh hưởng với nhiệt từ 600C trở lên hoạt độ 55,3% ủ với 800C 20 phút Ở giá trị pH hoạt độ phytase bị tác động 50% Hoạt độ phytase bị ảnh hưởng loại enzyme pepsin trypsin trypsin ảnh hưởng mạnh làm cho hoạt độ giảm xuống 37,3% Bacillus pumilus A76 sinh tổng hợp phytase có hoạt độ cao 171,53 ± 9,85 U/ml môi trường chứa bột bắp 2%, tinh bột 0,5% cao nấm men, nhiệt độ nuôi cấy 450C với giá trị pH thích hợp ủ vịng 72h Hoạt tính phytase thơ sau tổng hợp bị ảnh hưởng ủ nhiệt độ cao giá trị pH thấp, hoạt độ phytase 37,6% bị tác động nhiệt 800C Trypsin pepsin ảnh hưởng đến hoạt độ phytase sinh dòng A76 bền so với phytase tổng hợp dòng B61 4.2 Đề nghị Tùy theo nhóm vi sinh vật vi khuẩn tùy vào giống loại ảnh hưởng đến suất hoạt tính enzyme, cần phải nghiên cứu nhiều để tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật sinh tổng hợp phytase khối lượng thành 32 phần môi trường bổ sung vào khảo sát ảnh hưởng Ca2+ đến hoạt độ phytase để làm tăng tính ổn định phytase Đồng thời khảo sát môi trường dòng Bacillus sp xác định có khả sinh phytase khác 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Thị Hồng Hà, Trương Nam Hải, Nguyễn Thùy Châu, (2007), Tinh xác định tính chất phytase tái tổ hợp, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 5(3), pp 331-336 [2] Ngơ Hữu Tồn, (2012), Vai trị tác dụng enzyme phytase thức ăn thủy sản, http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=2152 [3] Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào, Đinh Quang Hiếu, Đặng Ngọc Bích, Trần Thị Cẩm Tú, Bùi Thị Hằng, (2013), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp phytase ngoại bào, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(4), pp 558-564 [4] Phan Thị Thu Mai, (2012), Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase, Luận văn thạc sĩ , Trường đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM [5] Võ Đức Tuấn, Nguyễn Thị Thanh Trúc, Lê Thị Ngọc Hân Trương Phước Thiên Hoàng, (2013), Nghiên cứu tổng hợp enzyme phytase từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Viện Công nghệ Sinh học môi trường, Đại học Nông Lâm TP.HCM Tài liệu Tiếng Anh [6] Cabrera, O., Martinez, C and Ortiz, G., (2013), Soybean: Non-Nutritional Factors and Their Biological Functionality, Soybean-Bio-Active Compounds, Agricultural and Biological Sciences [7] Edward, M and Abul, U., (2003), The term phytase comprises several different classes of enzymes, Biochemical and Biophysical Research Communications 312, pp 179–184 [8] Frank, L., (2001), Biosynthesis of phytate in food grain and seeds, Food phytates [9] Gulati, H., Chadha, B., Saini, H., (2007), Production and characterization of thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolacticus isolated from 34 rhizosphere soil, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 34, pp 91-98 [10] Lisbeth, B., (2008), Phytate: impact on environment and human nutrition, Journal of Zhejiang University Science B, 3, pp 165-191 [11] Lee, I., Park, I and Cho, J., (2014), Extracellular phytase production by Bacillus sp T4 using solid state fermentation, Journal of Animal & Plant Sciences, 24(4), pp 1116-1122 [12] Nabil, M., Amany, S and Mariam, M., (2013), Isolation, purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis MJA, African Journal of Biotechnology, 12(20), pp 2957-2967 [13] Ping, Y and Yirun, C., (2013), Purification and characterization of a novel neutral and heat-tolerant phytase from a newly isolated strain Bacillus nealsonii ZJ0702, Yu and Chen BMC Biotechnology, 13(78), pp 2-7 [14] Rande, D., Augusto, Jr., Sharon, N and Christopher, C (2011), Production and characterization of phytase from Bacillus sp as feed additive in aquaculture AACL Bioflux, 4(3), pp 394-403 [15] Shamna, K., Rajamanikandan, K., Mukesh K., Balakumaran, M and Kalaichelvan, P., (2012), Extracellular production of Phytases by a Native Bacillus subtilis Strain, Annals of Biological Research, (2), pp 979-987 [16] Shijun, F., Shijin, G., Zhiqiang, S., Na, Z., Guanggang, Q and Sanyang, G., (2011), Characterization of a Thermostable Alkaline Phytase from Bacillus licheniformis, International Conference on Agricultural and Biosystems Engineering, pp 102-106 [17] Sonali, P., (2005), Alkaline phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties, Archives of Biochemistry and Biophysics 440, pp 133–140 35 [18] Sreedevi, S., (2013), A Review on Role of Microbial Phytases in Agriculture, Online International Interdisciplinary Research Journal, ISSN 2249-9598, 3(5), pp 91-99 [19] Singh, K., Joshi, K and Gupta, K., (2013), Isolation of Phytase Producing Bacteria and Optimization of Phytase Production Parameters, Jundishapur Journal of Microbiology, 6(5) [20] Reddy, N., Pierson, M., Sathe, S., Salunkhe, D., (1989), Phytates in cereals and legumes ISBN, pp 42-47 [21] Sreedevi, S and Reddy, N., (2012), Isolation, Screening and Optimization of phytase production from newly isolated Bacillus sp.c43, International Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2(2), pp 218-231 [22] Ursula, K., Ralf, G., (2004), Bacterial phytase: potential application, in vivo function and regulation of its synthesis, Brazilian Journal of Microbiology, 35, pp 1-2 [23] Utkarsh, J., Nidhi, C., (2014), Bacillus cereus 10072 Phytase - Detection, Purification, Characterization and Physiological Role, International Journal for Scientific Research & Development, 2(9), pp 2321-0613 [24]Vithaya, M., Suthep, W and Duangnate, I, (2000), Research on phytase and nonstarch polysaccharide hydrolase enzymes, Department of Microbiology, Mahidol Univeristy [25] Vikas, K., Amit, S., Harinder, M., Klaus, B., (2010), Dietary roles of phytate and phytase in human nutrition: A review, Food chemistry, 120 (4), pp 945-999 [26] Yang, C., Hyung, S., Jin, K., (2001), Purification and Properties of Extracellular Phytase from Bacillus sp KHU-10, Journal of Protein Chemistry, 20, pp 287292 36 [27] Yao, M., Zhang, Y., Lu, W., Hu, M., Wang, W and Liang, A., (2011) Phytases: crystal structures, protein engineering and potential biotechnological applications, Journal of Applied Microbiology, 112(1), pp 1-14 37 PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU XỬ LÝ THỐNG KÊ Sàng lọc dịng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh phytase 38 Khảo sát chất  Dòng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilusA76 39 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon  Dòng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilusA76 40 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ  Dòng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilus A76 41 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy  Dòng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilus A76 42 Khảo sát giá trị pH thích hợp  Dòng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilus A76 43 Khảo sát thời gian ủ thích hợp  Dịng Bacillus subtilis B61  Dòng Bacillus pumilus A76 44