Đánh giá khả năng kháng fusarium oxysporum phytopthora palmivora gây bệnh trên cây trồng từ dịch chiết nuôi cấy một số dòng bacillus sp phân lập từ khu vực suối nước nóng bình châu

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM VÀ PHYTOPTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH TRÊN CÂY TRỒNG TỪ DỊCH CHIẾT NUÔI CẤY MỘT SỐ DÒNG BACILLUS SP PHÂN LẬP TỪ KHU VỰC SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU CHỦ NHIỆM NDNC (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) i TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ngày nay, chủng vi sinh vật ứng dụng phổ biến để sản xuất chất bảo vệ sinh học, ngăn chặn mầm bệnh, phân bón sinh học, bổ sung chất dinh dưỡng, chất kích thích sinh học, kích thích sản xuất hormone gồm Bacillus, Paenibacillus Steptomyces, Pseudomonas, Burkholderia Agrobacterium, …Trong nội dung nghiên cứu ngày, sử dụng 39 dòng vi khuẩn Bacillus phân lập từ khu vực suối nước nóng Bình Châu có khả chịu nhiệt độ cao để đánh giá khả kháng nấm Fusarium oxysporum Phytopthora palmivora gây bệnh trồng Các dịng phục hồi, tăng sinh mơi trường lỏng, thu dịch lỏng tế bào vi khuẩn Phần tế bào ly trích DNA sàng lọc gen Iturin operon gen surfactin Dịch chiết đem đánh giá khả đối kháng với nấm F oxysporum P palmivora, chọn lọc dịch chiết cho tính kháng mạnh để thử tính ổn định dịch chiết qua điều kiện pH, nhiệt độ chiếu sáng khác Dịch chiết cho băng DNA cho khả kháng nấm đem xác định hàm lượng Iturin A surfactin phương pháp LC/MS để khẳng định mối tương quan phương pháp sàng lọc Trong 39 dịch chiết từ dòng vi khuẩn khảo sát, nồng độ dịch chiết thu mức thời gian khác khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê khác biệt loại dịch chiết Dòng B39 cho khả kháng F oxysporum mạnh khả kháng P palmivora mạnh Kết định lượng phát nồng độ Iturin A dịch chiết 13 ppm, nồng độ surfactin dịch chiết 148 ppm Kết PCR khuếch đại vùng Iturin operon có kích thước kb với dự đoán gen dịng vi khuẩn lại khơng phát vùng gen surfactin chúng Dịng B39 cho tính kháng ổn định xử ly mức nhiệt độ 4oC, 25 oC, 37 oC, 100 oC hoạt tính 121 oC Đồng thời, qua mức pH khác (3-11) điều kiện chiếu sáng khác nhau, khả kháng chúng gần không thay đổi ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Tóm tắt đề tài ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Thơng tin đề tài xi Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 1.1.1 Kiểm soát sinh học 1.1.2 Quản lý sinh học bệnh 1.1.3 Tương tác sinh học quản lý sinh học 1.1.3.1 Kháng sinh 1.1.3.2 Enzyme 1.1.3.3 Cạnh tranh môi trường chất dinh dưỡng 1.1.4.3 Tăng cường khả kháng bệnh cho 1.1.4 Sơ lược bệnh 1.1.4.1 Tác hại 1.1.4.2 Sơ lược Phytophthora 1.1.4.3 Sơ lược Fusarium 1.1.5 Tiềm sử dụng tác nhân vi sinh vật kiểm soát sinh học nơng nghiệp 1.1.5.1 Lợi ích thuốc trừ sâu sinh học 1.1.5.2 Thuốc trừ sâu sinh học quản lý côn trùng gây hại 1.1.6 Những nghiên cứu thực nước 10 1.1.6.1 Những nghiên cứu thực nước 10 1.1.6.2 Những nghiên cứu nước 10 1.2 Tính cấp thiết nội dung nghiên cứu khoa học iii 11 1.3 Ý nghĩa khoa học khả áp dụng thực tiễn 12 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 12 1.3.2 Khả áp dụng thực tiễn 12 CHƯƠNG II NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nội dung 1: Phục hồi, tăng sinh khối, thu sinh khối thu dịch chiết từ môi trường nuôi cấy dòng Bacillus 13 2.1.1 Mục tiêu 13 2.1.2 Bố trí – Phương pháp thí nghiệm 13 2.2 Nội dung 2: Sàng lọc dịng Bacillus có iturin operon gen sfp 14 2.2.1 Mục tiêu 14 2.2.2 Bố trí – Phương pháp thí nghiệm 14 2.2.2.1 Ly trích DNA dòng Bacillus phân lập từ khu vực suối nước nóng Bình Châu 2.2.2.2 Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng iturin operon gen sfp 2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả kháng lại vi sinh vật gây bệnh dịch chiết in vitro 14 14 17 2.3.1 Mục tiêu 17 2.3.2 Bố trí – Phương pháp thí nghiệm 17 2.3.2.1 Đối với vi sinh vật gây bệnh 17 2.3.2.2 Đối với dịch chiết 17 2.4 Nội dung 4: Thử độ bền dịch chiết 18 2.4.1 Mục tiêu 18 2.4.2 Bố trí – phương pháp thí nghiệm 18 2.1.3.1 Kiểm tra khả chịu nhiệt độ dịch chiết 18 2.1.3.2 Kiểm tra khả chịu pH dịch chiết 18 2.1.3.3 Kiểm tra khả chịu ánh sáng dịch chiết 19 2.5 Nội dung 5: Định tính định lượng iturin A surfactin có dịch chiết ni cấy kháng F oxysporum P palmivora iv 19 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Phục hồi, tăng sinh khối, thu sinh khối thu dịch chiết từ mơi trường ni cấy dịng Bacillus 3.2 Nội dung 2: Sàng lọc dịng Bacillus có iturin operon gen sfp 3.3 Nội dung 3: Đánh giá khả kháng lại vi nấm gây bệnh dịch chiết in vitro 3.3.1 Đánh giả khả kháng lại F oxysporum dịch chiết in vitro 3.3.2 Đánh giá khả kháng lại P palmivora dịch chiết in vitro 3.4 Kết thử độ bền dịch chiết 3.4.1 Thử độ bền dịch chiết khả kháng F oxysporum 21 21 21 23 23 24 28 28 3.4.1.1 Nhiệt độ 28 3.4.1.2 pH 29 3.4.1.3 Ánh sáng 31 3.4.2 Thử độ bền dịch chiết dòng vi khuẩn khả kháng Phytopthora palmivora 32 3.4.2.1 Nhiệt độ 32 3.4.2.2 pH 33 3.4.2.3 Ánh sáng 36 3.5 Nội dung 5: Định tính định lượng Iturin A surfactin có dịch chiết ni cấy kháng F oxysporum P palmivora 37 3.5.1 Xây dựng đường chuẩn Iturin A 37 3.5.2 Xây dựng đường chuẩn Surfactin 41 3.5.3 Kết định lượng Iturin A Surfactin 44 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải thích thuật ngữ Chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction UV Ultra violet BA Bacillus agar BB Bacillus broth DDT Dichlorodiphenyl trichloroethane ET Ethylene JA Jasmonic acid ISR Induced systemic resistance SA Salicylic acid SAR Systemic acquired resistance PGPR Plant growth promotion PDA Potato dextrose agar LC/MS Liquid chromatography–mass spectrometr vi DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Bảng 1.1 Một số chế phẩm Bacillus có khả đối kháng với tác Trang nhân gây bệnh Bảng 2.1 Thành phần môi trường BA BB 13 Bảng 2.2 Trình tự mồi phát vùng iturin operon gen sfp 14 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng iturin operon 14 gen sfp Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại iturin operon gen 15 sfp Bảng 2.5 Các dòng vi khuẩn Bacillus phân lập từ khu vực Suối nước 16 nóng Bình Châu Bảng 2.6 Các mức nhiệt độ thời gian xử lý thử độ bền dịch chiết 18 Bảng 2.7 Kiểm tra khả chịu sáng dịch chiết 19 Bảng 3.1 Phân loại khả kháng nấm F oxysporum từ dịch chiết nuôi 24 cấy Bảng 3.2 Phân loại khả kháng nấm P palmivora từ dịch chiết ni 25 cấy dịng vi khuẩn Bacillus Bảng 3.3 Khả kháng Fusarium oxysporum từ dịch chiết theo nhiệt 28 độ Bảng 3.4 Khả kháng Fusarium oxysporum từ dịch chiết theo pH 30 Bảng 3.5 Khả kháng Fusarium oxysporum từ dịch chiết theo ánh 31 sáng Bảng 3.6 Khả kháng Phytopthora palmivora từ dịch chiết theo 32 nhiệt độ Bảng 3.7 Khả kháng Phytopthora palmivora từ dịch chiết theo pH 34 Bảng 3.8 Khả kháng P palmivora từ dịch chiết theo điều kiện 36 chiếu sáng Bảng 3.9 Thời gian lưu tỷ lệ thu hồi mẫu Iturin A 38 Bảng 3.10 Nồng độ diện tích píc dãy chuẩn Iturin A 38 vii Bảng 3.11 Bảng phân tích phương sai đường chuẩn mẫu Iturin A 40 Bảng 3.12 Nồng độ diện tích pic dãy chuẩn surfactin 42 Bảng 3.13 Phân tích phương sai đường chuẩn mẫu surfactin 43 Bảng 3.14 Kết định lượng Iturin A Surfactin LC/MS 44 Bảng 3.15 Bảng tóm tắt kết thí nghiệm 45 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 3.1 Khuẩn lac số dịng Bacillus mơi trường BA 21 Hình 3.2 Hình điện di DNA tổng số dòng vi khuẩn Bacillus gel 21 agarose Hình 3.3 Hình điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng Iturin operon 22 dòng vi khuẩn Bacillus Hình 3.4 Hình điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen surfactin 23 dòng vi khuẩn Bacillus Hình 3.5 Hình kháng F oxysporum dịch chiết vi khuẩn 25 Hình 3.6 Hình kháng P palvivora dịch chiết vi khuẩn 26 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh đường kính trung bình vịng kháng nấm P 27 palmivora F oxysporum loại dịch chiết Hình 3.6 Hình kháng F oxysporum dịch chiết vi khuẩn theo nhiệt 28 độ Hình 3.7 Biểu đồ kháng F oxysporum từ dịch chiết theo nhiệt độ 29 Hình 3.8 Biểu đồ kháng Fusarium oxysporum từ dịch chiết theo pH 29 Hình 3.9 Hình kháng F oxysporum dịch chiết vi khuẩn theo pH 30 Hình 3.10 Biểu đồ kháng F oxysporum từ dịch chiết theo điều kiện 31 chiếu sáng Hình 3.11 Hình kháng F oxysporum từ dịch chiết theo điều kiện chiếu 32 sáng Hình 3.12 Biểu đồ kháng P palmivora từ dịch chiết theo nhiệt độ 32 Hình 3.13 Hình kháng P palmivora từ dịch chiết theo điều kiện nhiệt độ 33 Hình 3.14 Biểu đồ kháng Phytopthora palmivora từ dịch chiết theo pH 34 Hình 3.15 Hình kháng P palmivora từ dịch chiết theo điều kiện pH 35 Hình 3.16 Sơ đồ khả kháng Phytopthora palmivora từ dịch chiết 37 theo điều kiện chiếu sáng ix Hình 3.17 Hình kháng P palmivora từ dịch chiết theo điều kiện ánh 37 sáng Hình 3.18 Đường chuẩn Iturin A 41 Hình 3.19 Đường chuẩn surfactin 42 Hình 3.20 Khả kháng nấm P palmivora Iturin A Surfactin 42 nồng độ ppm x CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong 39 dịch chiết từ dòng vi khuẩn khảo sát, nồng độ dịch chiết thu mức thời gian khác khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê khác biệt loại dịch chiết Dòng B39 cho khả kháng F oxysporum mạnh khả kháng P palmivora mạnh Kết định lượng phát nồng độ Iturin A dịch chiết 13 ppm, nồng độ surfactin dịch chiết 148 ppm Kết PCR khuếch đại vùng Iturin operon có kích thước kb với dự đốn gen dịng vi khuẩn lại không phát vùng gen surfactin chúng Dịng B39 cho tính kháng ổn định xử ly mức nhiệt độ 4oC, 25 oC, 37 oC, 100 oC hoạt tính 121 oC Đồng thời, qua mức pH khác (3-11) điều kiện chiếu sáng khác nhau, khả kháng dịch chiết gần không thay đổi 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B39 phương pháp nuôi cấy lỏng lắc để thu nhận dịch chiết đánh giá khả kháng nấm bệnh F oxysporum, P palmivora điều kiện thực tế Thử nghiệm loại môi trường khác bổ sung thành phần dinh dưỡng thích hợp để tăng cường khả sinh hợp chất Iturin A surfactin dịch chiết ni cấy vi khuẩn dịng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B39 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Lưu Thế Hùng Trần Vũ Phến (2014), “Khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus spp phân lập từ tỉnh Hậu Giang bệnh đốm vằn hại lúa (Rhizoctonia solani Kuhn) điều kiện in vitro”, Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt 13, trang 249-257 [2] Nguyễn Văn Nam, Đào Thị Lan Hoa, Đỗ Thị Kiều An (2014), “Ảnh hưởng enzyme chitinase sinh tổng hợp từ nấm Trichoderma harzianum T7 đến khả ký sinh trứng tuyến trùng Pratylenchus sp Meloidogyne sp gây hại cà phê tái canh Tây Nguyên”, Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt 13, trang 268-278 [3] Đỗ Văn Tuân, Lê Thị Thiên Nga, Trịnh Thị Trang, Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Hồi Nam, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Đức Bách (2014), “Phân lập khảo sát khả kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum nấm Helminthosporium maydis vi tảo Scenedesmus quadricauda”, Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt 13, trang 55-65 Tiếng Anh [4] Agrios, G (2004), Plant pathology ed Elsevier, London [5] André, D., and Barbara, S., (2001), Practice guide to dectection and identification of Phytophthora Pp [6] Bull, C.T., Shetty, K.G., and Subbarao, K.V (2002), Interactions between Myxobacteria, plant pathogenic fungi, and biocontrol agents Plant Disease, 86, pp 889-896 [7] Cawoy, H., Bettiol, W., Fickers, P., and Ongena, M (2011), Bacillus-Based Biological Control of Plant Diseases Pesticides in the Modern WorldPesticides Use and Management, pp 273-302 [8] Cohn, B., Wolff, M., Cirillo, P., and Sholtz, R (2007), DDT and breast cancer in young women: new data on the significance of age at exposure Environmental Health Perspective, 115, pp 1406-1412 47 [9] Cook, R.J., and Baker, K.F (1983), The nature and practice of biological control of plant pathogens The American Phytopathology Society [10] Francis, I., Holsters, M., Vereecker, D (2010), The Gram-positive side of plant-microbe interactions Environmental Microbiology, 12(1), pp 1-12 [11] Hawksworth, D.L., Kirt, P.M., Sutton B.C., and Pegler, D.N (1995), Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the fungi 8th ed Wallingford, UK : CAB International [12] Hoornstra, D (2003), A new method for in vitro detection of microbially produced mitochondrial toxins Tox in Vit., 17, 745-751 (2003) [13] Kiss, L (2003), A review of fungal antagonists of powdery mildews and their potential as biocontrol agent Pest Management Science, 59, pp 1259-1266 [14] Makumba, B.A.N., Mwaua, F.B., Mutidu, E.W (2009), In vitro and in vivo tests of Bacillus licheniformis MGrP1 antibiotics culture filtrate as a potential biocontrol agent against bean anthracnose East African Journal of Pure and Appiled Science Vol 2, pp 1-16 [15] Ongena, M., and Jacque, P (2008), Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol Trends in Microbiology, Vol 16, No.3 pp 115125 [16] Pal, K.K., and McSpadden, G.B (2006), Biological Control of Plant Pathogens The Plant Health Instructor, pp 1117-1202 [17] Tanja, B., Milan, K., Slaviša, S., Liubiša, T., Giuliano, D., Michael, M., Vittorio, V., and Djordje, F (2012).\, Antimicrobial activity of Bacillus sp natural isolates and their Potential use in the Biocontrol of Phytophthogenic bacteria Biocontrol of Phytophthogenic Bacteria by Bacillus sp., Food Technol Biotechnol 50(1), pp 25-31 [18] Tjamos, E.C., Tjamos, S.E., and Antoniou, P.P (2010), Boilogical management of plant diseases : highlights on research and application Journal of Plant Pathology, 92, pp 17-21 [19] Yu, G.Y., Sinclair, J.B., Hartman, G.L., and Bertagnolli, B.L (2002), Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizotocnia solani Soil Biology and Biochemistry.34, pp 955-963 48 PHỤ LỤC Data file: KHANG2712 Title: 39 dong vi khuang khang phy doi sl sang arsin(x)^1/2 Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no to 469 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to 39 Factor B (Var 3: TG) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 1.534 T A B L E Grand Sum = 718.100 O F Total Count = 468 M E A N S Total * * 1.333 16.000 * * 1.458 17.500 * * 2.358 28.300 * * 1.158 13.900 * * 1.783 21.400 * * 1.700 20.400 * * 1.200 14.400 * * 1.092 13.100 * * 1.133 13.600 * 10 * 1.533 18.400 * 11 * 1.892 22.700 * 12 * 1.142 13.700 * 13 * 1.283 15.400 * 14 * 1.375 16.500 * 15 * 1.117 13.400 * 16 * 2.292 27.500 * 17 * 1.408 16.900 * 18 * 1.092 13.100 * 19 * 1.283 15.400 * 20 * 1.200 14.400 * 21 * 1.967 23.600 * 22 * 2.317 27.800 * 23 * 1.425 17.100 * 24 * 2.075 24.900 * 25 * 1.358 16.300 * 26 * 2.292 27.500 * 27 * 1.400 16.800 * 28 * 1.525 18.300 * 29 * 1.425 17.100 * 30 * 1.533 18.400 * 31 * 2.233 26.800 * 32 * 2.017 24.200 * 33 * 1.442 17.300 * 34 * 1.450 17.400 * 35 * 1.183 14.200 * 36 * 1.717 20.600 * 37 * 1.042 12.500 * 38 * 1.217 14.600 * 39 * 1.392 16.700 * * 1.546 180.900 * * 1.528 178.800 * * 1.513 177.000 * * 1.550 181.400 * 1 1.500 4.500 * 1.433 4.300 49 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 10 10 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 13 14 14 14 14 15 15 15 15 16 16 16 16 17 17 17 17 18 18 18 18 19 19 19 19 20 20 20 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1.367 1.033 1.533 1.433 1.433 1.433 2.367 2.367 2.333 2.367 1.100 1.233 1.300 1.000 1.567 1.900 1.867 1.800 1.700 1.767 1.767 1.567 1.167 1.133 1.200 1.300 1.033 0.967 1.267 1.100 1.300 1.333 0.833 1.067 1.567 1.467 1.567 1.533 1.833 1.933 1.833 1.967 1.267 1.100 1.100 1.100 1.300 1.367 1.167 1.300 1.467 1.167 1.467 1.400 1.100 1.133 1.167 1.067 2.300 2.233 2.300 2.333 1.300 1.367 1.500 1.467 1.100 1.100 1.067 1.100 1.400 1.367 0.900 1.467 1.200 1.300 1.000 4.100 3.100 4.600 4.300 4.300 4.300 7.100 7.100 7.000 7.100 3.300 3.700 3.900 3.000 4.700 5.700 5.600 5.400 5.100 5.300 5.300 4.700 3.500 3.400 3.600 3.900 3.100 2.900 3.800 3.300 3.900 4.000 2.500 3.200 4.700 4.400 4.700 4.600 5.500 5.800 5.500 5.900 3.800 3.300 3.300 3.300 3.900 4.100 3.500 3.900 4.400 3.500 4.400 4.200 3.300 3.400 3.500 3.200 6.900 6.700 6.900 7.000 3.900 4.100 4.500 4.400 3.300 3.300 3.200 3.300 4.200 4.100 2.700 4.400 3.600 3.900 3.000 50 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 20 21 21 21 21 22 22 22 22 23 23 23 23 24 24 24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 27 28 28 28 28 29 29 29 29 30 30 30 30 31 31 31 31 32 32 32 32 33 33 33 33 34 34 34 34 35 35 35 35 36 36 36 36 37 37 37 37 38 38 38 38 39 39 39 39 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1.300 1.967 2.000 1.933 1.967 2.333 2.333 2.300 2.300 1.400 1.433 1.367 1.500 2.067 2.100 2.100 2.033 1.300 1.300 1.233 1.600 2.300 2.233 2.300 2.333 1.500 1.333 1.367 1.400 1.367 1.600 1.567 1.567 1.300 1.467 1.467 1.467 1.700 1.467 1.567 1.400 2.300 2.167 2.233 2.233 2.000 1.967 2.033 2.067 1.433 1.533 1.367 1.433 1.600 1.433 1.300 1.467 1.233 1.067 1.033 1.400 1.767 1.733 1.733 1.633 1.033 1.033 1.033 1.067 1.333 1.133 1.100 1.300 1.267 1.167 1.533 1.600 3.900 5.900 6.000 5.800 5.900 7.000 7.000 6.900 6.900 4.200 4.300 4.100 4.500 6.200 6.300 6.300 6.100 3.900 3.900 3.700 4.800 6.900 6.700 6.900 7.000 4.500 4.000 4.100 4.200 4.100 4.800 4.700 4.700 3.900 4.400 4.400 4.400 5.100 4.400 4.700 4.200 6.900 6.500 6.700 6.700 6.000 5.900 6.100 6.200 4.300 4.600 4.100 4.300 4.800 4.300 3.900 4.400 3.700 3.200 3.100 4.200 5.300 5.200 5.200 4.900 3.100 3.100 3.100 3.200 4.000 3.400 3.300 3.900 3.800 3.500 4.600 4.800 51 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 38 71.095 1.871 31.3833 0.0000 Factor B 0.105 0.035 0.5882 AB 114 4.396 0.039 0.6468 -7 Error 312 18.600 0.060 Total 467 94.196 Coefficient of Variation: 15.91% s_ for means group 2: y 0.0705 Number of Observations: 12 s_ for means group 4: y 0.0226 Number of Observations: 117 s_ for means group 6: y 0.1410 Number of Observations: Data file: PHYND Title: DICH CHIET KHANG PHY THU DO BEN NHIET DO Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no to 61 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to Factor B (Var 3: ND) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 16.997 T A B L E Grand Sum = 1019.800 O F Total Count = 60 M E A N S Total * * 21.787 326.800 * * 13.140 197.100 * * 16.687 250.300 * * 16.373 245.600 * * 23.592 283.100 * * 25.075 300.900 * * 27.067 324.800 * * 7.017 84.200 * * 2.233 26.800 * 1 27.933 83.800 * 26.833 80.500 * 31.133 93.400 * 21.033 63.100 * 2.000 6.000 * 20.400 61.200 * 2 18.900 56.700 * 21.600 64.800 52 * 2.800 8.400 * 2.000 6.000 * 23.100 69.300 * 27.667 83.000 * 3 28.667 86.000 * 2.000 6.000 * 2.000 6.000 * 22.933 68.800 * 26.900 80.700 * 26.867 80.600 * 4 2.233 6.700 * 2.933 8.800 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 574.539 191.513 2514.3937 0.0000 Factor B 6332.578 1583.144 20785.2515 0.0000 AB 12 604.316 50.360 661.1764 0.0000 -7 Error 40 3.047 0.076 Total 59 7514.479 Coefficient of Variation: 1.62% s_ for means group 2: y 0.0713 Number of Observations: 15 s_ for means group 4: y 0.0797 Number of Observations: 12 s_ for means group 6: y 0.1593 Number of Observations: Data file: FU1 Title: 39 DONG VI KHUAN KHANG FU Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no to 469 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to 39 Factor B (Var 3: TG) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 1.401 T A B L E Grand Sum = 655.630 O F Total Count = 468 M E A N S Total * * 1.593 19.120 * * 1.482 17.780 * * 2.226 26.710 * * 1.401 16.810 * * 1.150 13.800 * * 1.483 17.800 * * 1.267 15.210 53 * * 1.223 14.680 * * 1.232 14.780 * 10 * 1.273 15.280 * 11 * 1.215 14.580 * 12 * 1.150 13.800 * 13 * 1.184 14.210 * 14 * 1.349 16.190 * 15 * 1.400 16.800 * 16 * 1.527 18.320 * 17 * 1.407 16.880 * 18 * 1.391 16.690 * 19 * 1.327 15.920 * 20 * 1.389 16.670 * 21 * 1.362 16.350 * 22 * 1.491 17.890 * 23 * 1.368 16.420 * 24 * 1.521 18.250 * 25 * 1.408 16.900 * 26 * 1.691 20.290 * 27 * 1.275 15.300 * 28 * 1.307 15.690 * 29 * 1.248 14.980 * 30 * 1.359 16.310 * 31 * 2.174 26.090 * 32 * 1.765 21.180 * 33 * 1.150 13.800 * 34 * 1.210 14.520 * 35 * 1.463 17.560 * 36 * 1.462 17.540 * 37 * 1.273 15.280 * 38 * 1.252 15.030 * 39 * 1.185 14.220 * * 1.393 162.980 * * 1.401 163.940 * * 1.389 162.460 * * 1.421 166.250 * 1 1.637 4.910 * 1.623 4.870 * 1.543 4.630 * 1.570 4.710 * 1.490 4.470 * 2 1.487 4.460 * 1.493 4.480 * 1.457 4.370 * 2.207 6.620 * 2.220 6.660 * 3 2.227 6.680 * 2.250 6.750 * 1.240 3.720 * 1.250 3.750 * 1.447 4.340 * 4 1.667 5.000 * 1.150 3.450 * 1.150 3.450 * 1.150 3.450 * 1.150 3.450 * 1.537 4.610 * 1.470 4.410 * 1.440 4.320 * 1.487 4.460 * 1.237 3.710 * 1.400 4.200 * 1.210 3.630 * 1.223 3.670 * 1.283 3.850 * 1.310 3.930 * 1.150 3.450 * 1.150 3.450 * 1.260 3.780 * 1.223 3.670 * 1.217 3.650 * 1.227 3.680 * 10 1.280 3.840 * 10 1.267 3.800 * 10 1.300 3.900 54 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 10 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 13 14 14 14 14 15 15 15 15 16 16 16 16 17 17 17 17 18 18 18 18 19 19 19 19 20 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 22 23 23 23 23 24 24 24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 27 28 28 28 28 29 29 29 29 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1.247 1.207 1.240 1.223 1.190 1.150 1.150 1.150 1.150 1.227 1.150 1.210 1.150 1.383 1.470 1.377 1.167 1.433 1.423 1.343 1.400 1.487 1.393 1.363 1.863 1.547 1.327 1.283 1.470 1.430 1.387 1.377 1.370 1.187 1.580 1.377 1.163 1.587 1.337 1.283 1.350 1.220 1.367 1.150 1.713 1.473 1.500 1.500 1.490 1.503 1.307 1.247 1.417 1.357 1.680 1.453 1.593 1.450 1.390 1.430 1.363 1.657 1.767 1.720 1.620 1.217 1.243 1.343 1.297 1.270 1.357 1.290 1.313 1.357 1.210 1.240 1.187 3.740 3.620 3.720 3.670 3.570 3.450 3.450 3.450 3.450 3.680 3.450 3.630 3.450 4.150 4.410 4.130 3.500 4.300 4.270 4.030 4.200 4.460 4.180 4.090 5.590 4.640 3.980 3.850 4.410 4.290 4.160 4.130 4.110 3.560 4.740 4.130 3.490 4.760 4.010 3.850 4.050 3.660 4.100 3.450 5.140 4.420 4.500 4.500 4.470 4.510 3.920 3.740 4.250 4.070 5.040 4.360 4.780 4.350 4.170 4.290 4.090 4.970 5.300 5.160 4.860 3.650 3.730 4.030 3.890 3.810 4.070 3.870 3.940 4.070 3.630 3.720 3.560 55 * 30 1.403 4.210 * 30 1.270 3.810 * 30 1.450 4.350 * 30 1.313 3.940 * 31 2.147 6.440 * 31 2.143 6.430 * 31 2.203 6.610 * 31 2.203 6.610 * 32 1.667 5.000 * 32 1.810 5.430 * 32 1.733 5.200 * 32 1.850 5.550 * 33 1.150 3.450 * 33 1.150 3.450 * 33 1.150 3.450 * 33 1.150 3.450 * 34 1.150 3.450 * 34 1.227 3.680 * 34 1.227 3.680 * 34 1.237 3.710 * 35 1.570 4.710 * 35 1.507 4.520 * 35 1.473 4.420 * 35 1.303 3.910 * 36 1.330 3.990 * 36 1.313 3.940 * 36 1.647 4.940 * 36 1.557 4.670 * 37 1.150 3.450 * 37 1.250 3.750 * 37 1.293 3.880 * 37 1.400 4.200 * 38 1.150 3.450 * 38 1.150 3.450 * 38 1.150 3.450 * 38 1.560 4.680 * 39 1.150 3.450 * 39 1.150 3.450 * 39 1.290 3.870 * 39 1.150 3.450 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 38 25.655 0.675 12.2837 0.0000 Factor B 0.072 0.024 0.4377 AB 114 3.824 0.034 0.6103 -7 Error 312 17.148 0.055 Total 467 46.700 Coefficient of Variation: 16.73% s_ for means group 2: y 0.0677 Number of Observations: 12 s_ for means group 4: y 0.0217 Number of Observations: 117 s_ for means group 6: 0.1354 Number of Observations: Data file: FUND Title: DO BEN DICH CHIET KHANG FUSA VOI NHIET DO Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design 56 Data case no to 31 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to Factor B (Var 3: ND) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 13.357 T A B L E Grand Sum = 400.700 O F Total Count = 30 M E A N S Total * * 15.287 229.300 * * 11.427 171.400 * * 18.217 109.300 * * 22.667 136.000 * * 21.900 131.400 * * 2.000 12.000 * * 2.000 12.000 * 1 20.467 61.400 * 23.900 71.700 * 28.067 84.200 * 2.000 6.000 * 2.000 6.000 * 15.967 47.900 * 2 21.433 64.300 * 15.733 47.200 * 2.000 6.000 * 2.000 6.000 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 111.747 111.747 21.0024 0.0002 Factor B 2647.392 661.848 124.3919 0.0000 AB 155.921 38.980 7.3262 0.0008 -7 Error 20 106.413 5.321 Total 29 3021.474 Coefficient of Variation: 17.27% s_ for means group 2: y 0.5956 Number of Observations: 15 s_ for means group 4: y 0.9417 Number of Observations: s_ for means group 6: y 1.3317 Number of Observations: Data file: FUPH Title: DO BEN DICH CHIET KHANG FU VOI PH Function: FACTOR 57 Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no to 55 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to Factor B (Var 3: PH) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 17.826 T A B L E Grand Sum = 962.600 O F Total Count = 54 M E A N S Total * * 20.093 542.500 * * 15.559 420.100 * * 15.733 94.400 * * 16.200 97.200 * * 17.900 107.400 * * 17.917 107.500 * * 16.967 101.800 * * 18.000 108.000 * * 19.750 118.500 * * 19.167 115.000 * * 18.800 112.800 * 1 18.700 56.100 * 18.400 55.200 * 20.667 62.000 * 20.133 60.400 * 20.133 60.400 * 21.467 64.400 * 20.500 61.500 * 20.533 61.600 * 20.300 60.900 * 12.767 38.300 * 2 14.000 42.000 * 15.133 45.400 * 15.700 47.100 * 13.800 41.400 * 14.533 43.600 * 19.000 57.000 * 17.800 53.400 * 17.300 51.900 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 277.440 277.440 246.1676 0.0000 Factor B 85.520 10.690 9.4851 0.0000 AB 40.170 5.021 4.4553 0.0008 -7 Error 36 40.573 1.127 Total 53 443.704 Coefficient of Variation: 5.96% s_ for means group 2: y 0.2043 Number of Observations: 27 58 s_ for means group 4: y 0.4334 Number of Observations: s_ for means group 6: 0.6129 Number of Observations: Data file: FUAS Title: DICH CHIET KHANG FU THU DO BEN ANH SANG Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no to 25 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: LLL) with values from to Factor A (Var 2: VK) with values from to Factor B (Var 3: AS) with values from to Variable 4: DK Grand Mean = 13.967 T A B L E Grand Sum = 335.200 O F Total Count = 24 M E A N S Total * * 16.175 194.100 * * 11.758 141.100 * * 19.750 118.500 * * 12.900 77.400 * * 10.917 65.500 * * 12.300 73.800 * 1 20.500 61.500 * 15.633 46.900 * 13.767 41.300 * 14.800 44.400 * 19.000 57.000 * 2 10.167 30.500 * 8.067 24.200 * 9.800 29.400 - A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 117.042 117.042 33.5323 0.0000 Factor B 279.990 93.330 26.7389 0.0000 AB 17.395 5.798 1.6612 0.2152 -7 Error 16 55.847 3.490 Total 23 470.273 Coefficient of Variation: 13.38% s_ for means group 2: y 0.5393 Number of Observations: 12 s_ for means group 4: y 0.7627 Number of Observations: 59 s_ for means group 6: y 1.0786 Number of Observations: 60